1 Einleitung

1.1  Das humane Zytomegalievirus

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Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Gruppe der β-Herpesviren. Charakteristisch für Herpesviren sind ein doppelsträngiges DNA-Genom und ihre Eigenschaft, nach der primären Infektion eine latente Infektion des Wirtes zu entwickeln. In diesem Stadium, der Latenz, kann in Geweben des Wirtes zwar Virus-DNA, aber keine infektiösen Viruspartikel nachgewiesen werden (Banks und Rouse, 1992).

Das HCMV infiziert verschiedene Zelltypen wie Endothel- und Epithelzellen, Fibroblasten, neuronale Zellen, glatte Muskelzellen sowie Monozyten, Makrophagen, Granulozyten und dendritische Zellen (Mocarski und Courcelle, 2001). Aber nur Monozyten und CD33+/CD34+ Vorläuferzellen beherbergen HCMV in seiner latenten Form (Beisser et al., 2001;Goodrum et al., 2002;Prosch et al., 1999;Soderberg-Naucler et al., 2001;Taylor-Wiedeman et al., 1991).

Eine Infektion durch das HCMV verläuft bei immunkompetenten Patienten meist asymptomatisch. Im Gegensatz dazu führt die Infektion oder die Reaktivierung des HCMV in immungeschwächten Menschen zu schweren Erkrankungen. Bei einer pränatalen Infektion kann es je nach Entwicklungsstadium des Fötus zu Schädigungen des Gehirns, der Augen oder des Gehörs kommen. Viele Kinder sterben auch in utero oder nach der Geburt. Bei AIDS-Patienten gehört die Infektion mit HCMV zu den am häufigsten vorkommenden opportunistischen viralen Infektionen, die mit einer schweren Lungenentzündung oder Netzhautentzündung einhergeht. Des weiteren zeigen epidemiologische Studien, daß HCMV positive Individuen ein über zweifach erhöhtes Risiko besitzen, vaskuläre Erkrankungen, wie koronare Herzkrankheiten, zu entwickeln (Horvath et al., 2000).

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Das HCMV besitzt mit über 230 Kilobasen, die für über 200 Proteine kodieren, das größte Genom aller bisher bekannten Herpesviren. Das Genom des HCMV besteht aus einer langen und einer kurzen (UL unique long, US unique short) einmalig vorhandenen Genomregion, die an ihren jeweiligen Enden von Wiederholungseinheiten flankiert wird. Nach der Adsorption des Virus an die Zielzelle fusioniert die Virushülle mit der Zellmembran, das Kapsid wird in die Zelle entlassen, zum Kern transportiert und das Genom dort freigesetzt. Die Replikation des Virus erfolgt im Zellkern. Dort werden zunächst die sehr frühen Gene (immediate early,

Abb. 1.1. HCMV-Mechanismen zur Unterwanderung der menschlichen Immunantwort.

Gezeigt ist eine Auswahl von zwei Mechanismen. HCMV-kodierte Proteine sind durch rote Färbung hervorgehoben

IE) mit Hilfe der RNA-Polymerase des Wirtes transkribiert, die als Transaktivatoren für die Expression der E-Gene (early) wirken. Die Transkription der E-Gene erfolgt 4-24 h nach der Infektion. E-Gene kodieren für Proteine, die an der viralen DNA-Replikation, der DNA-Reparatur oder der Manipulation des wirtseigenen Immunsystems beteiligt sind. Die Transkription der L-Gene (late) beginnt 24-36 h nach der Infektion. Sie kodieren für Strukturproteine, die an dem Zusammenbau der Virione beteiligt sind.

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Frühe Studien an Mäusen zeigten, daß zytotoxische T-Zellen an der Erkennung und Beseitigung MCMV-infizierter Zellen beteiligt sind, da der Verlust dieser Zellen zu einer Reaktivierung und Ausbreitung des Virus führte (Jonjic et al., 1990). T-Zellen erkennen mit Hilfe ihres T-Zellrezeptors virale Peptide, die über MHC-Moleküle an der Oberfläche infizierter Zellen präsentiert werden. Nach ihrer Aktivierung vermitteln dann zytotoxische T-Zellen durch die Ausschüttung von Mediatoren den Tod der infizierten Zellen.

Voraussetzung für die Bereitstellung viraler Peptidfragmente ist der proteasomale Abbau viraler Proteine (Reits et al., 2000;Schubert et al., 2000;Yewdell et al., 1999).Die aus dem Abbau hervorgegangenen Proteinfragmente werden durch den TAP-Transporter ins endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo sie unter Mitwirkung von Tapasin mit MHC-Klasse-I-Molekülen assoziieren (Pamer und Cresswell, 1998;Rock et al., 2002;Yewdell et al., 1999;Yewdell und Bennink, 2001).

Das HCMV-Genom kodiert für vier Proteine, die in diesen Prozeß eingreifen (Abb.1.1). Die durch US2 und US11 kodierten Proteine bewirken einen retrograden Transport neu synthetisierter MHC-Klasse-I-Moleküle aus dem ER in das Zytosol, wo sie ubiquitiniert und proteasomal abgebaut werden (Wiertz et al., 1996;Wiertz et al., 1996). Die Expression des US3-Proteins verhindert den Transport der zusammengebauten MHC-Klasse-I-Moleküle an die Zelloberfläche und vermittelt daher ihre Anreicherung in einem ER-assozierten Kompartiment (Ahn et al., 1996;Jones et al., 1996). Das US6-Gen kodiert für ein Transmembran-Protein, das im ER-Lumen an den TAP-Transporter bindet und dadurch die Einschleusung der zu präsentierenden Peptide verhindert (Ahn et al., 1996;Ahn et al., 1997;Hengel et al., 1996).

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Eine verminderte Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen durch die HCMV-kodierten Proteine würde die infizierte Zelle zwar vor einer T-Zell-vermittelten Lyse schützen, aber eine Lyse durch NK-Zellen begünstigen. Die Fähigkeit von NK-Zellen Herpesvirus-Infektionen zu kontrollieren, ist durch Patienten mit einem Mangel an NK-Zellen belegt, da diese eine hohe Anfälligkeit für Herpesvirusinfektionen besitzen (Biron et al., 1989). In der „missing self“-Hypothese postulierten Ljunggren und Karre bereits 1990, daß NK-Zellen Zellen mit einer verminderten Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen erkennen und zerstören (Ljunggren und Karre, 1990). NK-Zellen besitzen an ihrer Oberfläche MHC-Klasse-I-Moleküle-bindende Rezeptoren, die sogenannten „Killer-Zellen-inhibierenden Rezeptoren“ (KIR) und die „Leukozyten immunglobulinartigen Rezeptoren (LIR) (Cosman et al., 1997;Moretta et al., 2001). Die Bindung von KIR oder LIR an MHC-Klasse-I-Moleküle bewirkt in den NK-Zellen eine Hemmung ihrer zytotoxischen Maschinerie und verhindert damit die Lyse der Zielzelle. HCMV-infizierte Zellen exprimieren an ihrer Oberfläche die Proteine UL18 und UL40, welche die inhibierenden Rezeptoren der NK-Zellen binden (Fahnestock et al., 1995;Ulbrecht et al., 2000). Es wird angenommen, daß die Expression von UL18 und UL40 für den Schutz HCMV-infizierter Zellen vor NK-Zellen verantwortlich sind. Interessanterweise wird die Expression von UL18, das humanen MHC-Klasse-I-Molekülen homolog ist, nicht von US2, US3, US6, und US11 inhibiert (Park et al., 2002).

Ein neuartiger Mechanismus, NK-Zell-Aktivität zu hemmen, ist kürzlich für das HCMV-kodierte Protein UL16 beschrieben worden. Dabei verhindert UL16 eine Aktivierung von NK-Zellen, indem es Liganden des aktivierenden Rezeptors NKGD bindet und somit sterisch eine Bindung von NKGD an seine Liganden verhindert (Odeberg et al., 2003;Rolle et al., 2003;Vales-Gomez et al., 2003).

Einen weiteren interessanten Zusammenhang stellt die Beobachtung dar, daß der HCMV-kodierte Chemokinrezeptor US28 für das Entfernen von Chemokinen aus der Umgebung infizierter Zellen verantwortlich ist (Billstrom et al., 1999;Bodaghi et al., 1998). Es wurde vermutet, daß das Virus durch diesen Mechanismus die Chemokin-vermittelte Rekrutierung von Immunzellen an den Ort der viralen Infektion verhindert.

1.2 Das Chemokinsystem

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Seit Beschreibung des ersten Chemokins im Jahr 1987, dem neutrophilen Aktivierungs-Peptid-1 (NAP-1, später umbenannt in IL8, CXCL8), ist die Anzahl der bekannten Chemokine auf knapp 50 und die Zahl ihrer Rezeptoren auf 19 angestiegen (Proudfoot et al., 2003;Yoshimura et al., 1987). Chemokine sind chemotaktisch wirkende Zytokine, die über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) Signalwege aktivieren und dadurch eine Zielsteuerung von Zellen entlang eines Konzentrationsgradienten bewirken. Chemokine und ihre Rezeptoren sind zudem am Aufbau sekundärer lymphatischer Organe, an der Organ- und Embryonalentwicklung (Doitsidou et al., 2002;Tachibana et al., 1998), an der Wundheilung (Gillitzer und Goebeler, 2001), an der Angiogenese (Bernardini et al., 2003) sowie vermutlich an der Metastasierung von Tumoren (Balkwill, 2003) beteiligt.

Ein strukturelles Merkmal der meisten Chemokine ist die Existenz von vier Cysteinresten, von denen jeweils der erste und der dritte sowie der zweite und vierte über intramolekulare Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Es können vier Gruppen von Chemokinen hinsichtlich der Anordnung der ersten beiden Cysteinreste am N-Terminus unterschieden werden. Bei den Mitgliedern der CXC-Familie sind die beiden konservierten Cysteinreste durch eine Aminosäure getrennt, während diese trennende Aminosäure bei den Mitgliedern der CC-Familie fehlt. Das CX3C-Chemokin Fraktalkine ist der einzige Vertreter der dritten Gruppe und zeichnet sich durch drei Aminosäuren zwischen den N-terminal gelegenen Cysteinresten aus. Demgegenüber besitzten Lymphotactin-α und -β (C-Chemokin) als alleiniger Vertreter der vierten Gruppe nur zwei der vier konservierten Cysteinreste.

Funktionell wird zwischen inflammatorischen und homöostatischen Chemokinen unterschieden (Abb.1.2). Die inflammatorischen Chemokine werden nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen oder nach Pathogenkontakt von Zellen (z.B. Makrophagen) am Ort einer Entzündung freigesetzt. Diese Gruppe von Chemokinen bewirkt die Rekrutierung von Effektorzellen, wie z.B. neutrophilen Granulozyten, aktivierten T-Zellen oder NK-Zellen, an den

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Abb. 1.2. Bedeutung der inflammatorischen und homöostatischen Chemokine in der Immunantwort.

T:T-Zelle,NK:NK-Zelle,HEV: Hohe endotheliale Venolen. (Modifiziert nach Luster, 2002 (Luster, 2002)).

Ort der Entzündung. Ferner werden unreife dendritische Zellen (DC) angelockt, die Rezeptoren (CCR1 und CCR5) der inflammatorischen Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES exprimieren. Am Ort der Infektion nehmen die unreifen DCs Antigene auf und werden aktiviert. Die Aktivierung führt zu einer Reifung und Differenzierung der DCs, was sie zu hoch effektiven antigenpräsentierenden Zellen macht. In diesem Stadium exprimieren sie den homöostatischen Chemokinrezeptor CCR7. Homöostatische Chemokine regulieren insbesondere die Organsteuerung von Immunzellen in sekundäre lymphatische Organe. So werden aktivierte DCs mittels des CCR7-Liganden SLC über afferente Lymphgefäße in drainierende Lymphknoten dirigiert. Die Rekrutierung von naiven T-Zellen ist ebenfalls von CCR7 abhängig. In den Lymphknoten werden T-Zellen durch den Kontakt mit antigenpräsentierenden DCs aktiviert, sie differenzieren zu Effektorzellen und gelangen über die Blutbahn mit Hilfe der inflammatorischen Chemokine an Orte der Entzündung (Abb.1.2).

Ein besonderes Interesse erlangten die humanen Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 durch ihre Funktion als Korezeptoren für den Eintritt von HIV in ihre Zielzellen. Die Rezeptoren bilden zusammen mit dem CD4-Molekül und dem Hüllprotein des HIV, gp120, einen tri-molekularen Komplex, der die Fusion des HI-Virus mit der Plasmamembran durch gp41 vermittelt (Berger et al., 1999;Wyatt und Sodroski, 1998). Die besondere Bedeutung des Chemokinrezeptors CCR5 bei HIV-Infektionen wird durch die Beobachtung unterstützt, daß eine natürlich vorkommende Deletion von 32 Basenpaaren im CCR5-Gen homozygote Träger dieser Mutation vor HIV-1-Infektion schützt (Dean et al., 1996;Samson et al., 1996).

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Bis heute sind über 30 viral-kodierte Chemokine und Chemokinrezeptoren bekannt (Murphy, 2001). Sie wurden vorwiegend in Herpesviren gefunden und können sowohl agonistisch als auch antagonistisch wirken. So vermittelt das vCXC1-Molekül (ORF UL146) des HCMV nach Bindung an CXCR2 in neutrophilen Granulozyten eine Ausschüttung von intrazellulären Kalzium-Ionen sowie die Migration und Degranulation CXCR2 tragender Zellen (Penfold et al., 1999). Im Gegensatz dazu blockiert das vMIPII, das von HHV8 kodiert wird, die Signalleitung über CCR1, CCR2, CCR3, CCR5 und CXCR4 sowie eine CCR5-vermittelte Infektion mit HIV (Kledal et al., 1997).

Schließlich wurden unter den Herpesviren zahlreiche Chemokinrezeptor-Homologe identifiziert, die an die Chemokine des Wirtes binden und die Migration der infizierten Zellen sowie die Aktivierung intrazellulärer Signalwege vermitteln. Über ihre Funktion während der Virusinfektion in vivo kann derzeit nur spekuliert werden (Alcami, 2003). Besonders gut untersucht ist der vGPCR (ORF 74) des Kaposi-Sarkom assoziierten Herpesvirus (HHV8). Dieser Rezeptor ist konstitutiv aktiv und vermittelt Läsionen in immunkompetenten transgenen Mäusen, die dem histologischen Bild von virusinduzierten Kaposi-Sarkomen des Menschen entsprechen (Arvanitakis et al., 1997;Yang et al., 2000). Vom MCMV kodierten Chemokinrezeptor M33 ist bekannt, daß er für die Infektiösität und Replikation des Virus in vivo notwendig ist, da er die Ausbreitung des Virus in die Speicheldrüsen gewährleistet (Davis-Poynter et al., 1997).

1.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)

1.3.1  Die Struktur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren

Strukturell gehören die Chemokinrezeptoren zu der größten Familie membranständiger Rezeptoren, den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Mit über 1000 Vertretern kodieren die GPCRs für ca. 3 % der menschlichen Strukturgene (Marinissen und Gutkind, 2001). Allen Rezeptoren gemeinsam ist, daß sie die Aktivierung heterotrimerer G-Proteine regulieren. Strukturell besitzen alle GPCRs sieben Transmembrandomänen, die durch alternierende intrazelluläre und extrazelluläre Schleifen miteinander verbunden sind. Die meisten Rezeptoren können in drei Hauptfamilien eingeteilt werden (siehe Übersicht(Gether, 2000). Die Gruppe der Rhodopsin-verwandten Rezeptoren (Familie A) bildet dabei die größte Untergruppe. Zu ihnen gehören neben Rhodopsin, den β-adrenergen Rezeptoren, Angiotensin- und Vasopressinrezeptoren auch die Gruppe der Chemokinrezeptoren, darunter der US28-Rezeptor. Ihre Mitglieder zeichnen sich durch ein hoch konserviertes E/DRY-Motiv auf der zytoplasmatischen Seite der dritten Transmembrandomäne und eine Palmitylierungsstelle am C-Terminus aus, die möglicherweise die Ausbildung einer vierten intrazellulären Schleife ermöglicht.

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Charakteristisch für die Familie der Glucagonrezeptor-ähnlichen Rezeptoren (B-Familie) ist ein über 100 Aminosäuren langer N-Terminus, der viele Cysteinreste enthält, die vermutlich über Disulfidbrücken verbunden sind. Die Rezeptoren der C-Familie (z.B. GABA-Rezeptor), zeichnen sich durch einen sehr langen N-Terminus (500-600 Aminosäuren) aus.

1.3.2 Molekulare Mechanismen der Aktivierung von GPCRs

Die Aktivierung von GPCRs zieht eine Änderung der Rezeptorkonformation nach sich, die neben der Aktivierung von G-Proteinen ebenfalls eine Interaktion mit anderen Adaptermolekülen, die an der Signalleitung und Endozytose des Rezeptors beteiligt sind, ermöglicht. Dabei vermittelt die Bindung eines Agonisten einen aktivierten Konformationszustand, während die Bindung eines Antagonisten eine inaktive Konformation stabilisiert. Diese Annahme wird durch spektroskopische Untersuchungen am β2-adrenergen Rezeptor und am Rhodopsin gestützt, die nach der Aktivierung des Rezeptors eine relative Bewegung der Transmembrandomänen III und VI voneinander vorhersagen (Abb. 1.3) (Chalmers und Behan, 2002;Farrens et al., 1996;Gether et al., 1997). Dadurch wird die Konformation der angrenzenden G-Protein-bindenden intrazellulären Schleifen zwei und drei verändert. Zusammen mit der Protonierung der Asparaginsäure im DRY-Motiv am Übergang der dritten Transmembrandomäne wird diese Konformationsänderung als Ursache für die Dissoziation des G-Proteins von seinem Rezeptor angesehen (Gether, 2000). Folglich ist es möglich, daß Veränderungen der Aminosäurekomposition in konformationell wichtigen Bereichen eine konstitutive Aktivierung der GPCRs bewirken können. Interessanterweise wurde dabei das DRY-Motiv in vielen GPCRs als ein bedeutendes Strukturmotiv identifiziert, um die aktive Konformation zu erhalten. Eine besondere Bedeutung scheint dabei die Asparaginsäure zu besitzen, da die Mutation dieser

Abb. 1.3. Die inaktive und aktive Konformation eines GPCRs.

Das Bild basiert auf der Kristallstruktur von Rhodopsin und zeigt eine Aufsicht auf den GPCR von der zytoplasmatischen Seite. (a) Die inaktive Konformation eines GPCRs. (b) Der aktive Zustand des GPCRs. Der Wechsel vom inaktiven zum aktiven Zustand verändert den Abstand zwischen der III. und VI. Transmembrandomäne. Dabei wird die VI. Transmembrandomäne herausgedreht, was mit einer Konformationsänderung der zweiten und dritten intrazellulären Schleife einhergeht.(Chalmers und Behan, 2002)

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Aminosäure im Rhodopsin (Cohen et al., 1993), im β2-adrenergen Rezeptor (Rasmussen et al., 1999) und im M1-muskarinergen Rezeptor (Lu et al., 1997) eine konstitutive Aktivität induzierte. Ebenfallsbewirkte ein Austausch der Asparaginsäure im konservierten DRY-Motiv zu Valin eine konstitutive Aktivierung des CXCR2-Rezeptors, ähnlich dem konstitutiv aktiven Kaposi-Sarkom-assoziierten Rezeptor ORF74, der ein solches VRY-Motiv besitzt (Burger et al., 1999).

Zusätzlich zu dem DRY-Motiv konnten ebenfalls weitere strukturelle Bereiche ermittelt werden, die eine konstitutive Aktivierung des Rezeptors bewirken. Untersuchungen am C5a-Rezeptor identifizierten Mutationen von Aminosäuren in bestimmten Abschnitten der III. und

VI. Transmembrandomäne als sensible Bereiche für eine konstitutive Aktivität des Rezeptors (Geva et al., 2000). Kürzlich wurde durch eine Analyse chimärer C-terminaler Rezeptorkonstrukte der C-Terminus des US28-Rezeptors als strukturelles Merkmal seiner konstitutiven Aktivität identifiziert (Waldhoer et al., 2003).

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Tabelle 1.1.: Die G-Proteinfamilien und eine Auswahl ihrer Effektoren.

Untereinheit

Toxinsensivität

Funktion

s

Choleratoxin

Aktivierung der Adenylatzyklase

i

Pertussistoxin

Hemmung der Adenylatzyklase;

Aktivierung von PI3Kγ

q

Aktivierung der PLC, PKC

12

Aktivierung von Aktinpolymerisation und der fokalen Adhäsion, Induktion der NO-Synthetase

Gβγ

Aktivierung der GRK, PLC-β, src-Familie von Tyrosinkinasen, PI3K

Choleratoxin von Vibrio cholera verlängert die Aktivität der Gαs-Untereinheit. Pertussistoxin von Bordetella pertussis hemmt spezifisch die Signalleitung über Gαi-Proteine. GRK: G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase, PI3K Phosphatidyl-Inosit-3-Kinase, PLC Phospholipase C, NO Stickstoffmonoxid

1.3.3 Die Aktivierung intrazellulärer Signalwege durch Chemokinrezeptoren

GPCRs vermitteln die Aktivierung verschiedener Signalwege durch ihre Kopplung an intrazellulär gebundene G-Proteine. Diese setzen sich aus einer α-Untereinheit und einem βγ-Dimer zusammen. Anhand ihrer α-Untereinheit werden G-Proteine in vier Klassen (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12) unterteilt. Die Bindung eines Agonisten an den GPCR katalysiert über eine Konformationsänderung des Rezeptors die Aktivierung seines G-Proteins. Dabei wirkt der GPCR als Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) und vermittelt eine Konformationsänderung der α-Untereinheit des G-Proteins, die zum Austausch von GDP durch GTP führt. Im Anschluß daran dissoziiert die GTP-gebundene α-Untereinheit vom Rezeptor sowie von der βγ-Untereinheit. Die aktivierten α- und βγ-Untereinheiten regulieren im Anschluß unabhängig voneinander die Aktivität verschiedener Signalmoleküle, wie der Phospholipase A2, PI3K, RhoGEFs, G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinasen (GRKs) und Src-Kinasen sowie verschiedene Formen der Adenylatzyklase und der Phospholipase C (PLC) (Übersichten in (Knall und Johnson, 1998;Marinissen und Gutkind, 2001;Morris und Malbon, 1999) (Abb.1.4).

Abb. 1.4. Aktivierung intrazellulärer Signalwege durch Chemokinrezeptoren.

Die Abbildung zeigt eine Auswahl der durch Chemokinrezeptoren aktivierten Signalwege. Schlüsselmoleküle sind orange unterlegt, die verbindenden Pfeile stehen sowohl für direkte als auch indirekte Interaktionen zwischen den beteiligten Partnern (Mokros, 2004).

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Allgemein werden durch die Stimulation von Chemokinrezeptoren Signalwege aktiviert, die die Migration, die Proliferation oder die Aktivierung von Zellen regulieren. Für eine gerichtete Migration Chemokinrezeptor-tragender Zellen wird bei einer großen Anzahl von Rezeptoren eine Kopplung an Gαi-Proteine benötigt. Bei diesen Rezeptoren kann die Chemotaxis durch die spezifische Hemmung der Gαi-Untereinheit mittels Pertussistoxin verhindert werden. Für die humanen Chemokinrezeptoren CXCR1, CCR2, CCR5 und CXCR4 ist eine solche Kopplung an G-Proteine des Gαi-Typs beschrieben (Damaj et al., 1996;Mellado et al., 1998;Rodriguez-Frade et al., 1999;Vila-Coro et al., 1999).

Die Rho-Familie kleiner GTP-asen (Rho, Rac, Cdc42) stellt einen Signalweg dar, der die Zellmigration vermitteln kann (Schmitz et al., 2000). Alternativ aktivieren die Chemokine RANTES und SDF-1 die Tyrosinkinasen FAK und Pyk-2 in T-Zellen sowie in hämatopoetischen Vorläuferzellen (Bacon et al., 1996;Wang et al., 2000). Beide Moleküle sind Bestandteile der fokalen Adhäsions-Komplexe, die neben der Regulation der Zellmigration auch an der Kontrolle des Zellwachstums beteiligt sind (Schlaepfer et al., 1999).

Die PI3Kγ konnte als weiteres Molekül von zentraler Bedeutung für die Induktion der Chemotaxis identifiziert werden, da Untersuchungen an PI3Kγ-defizienten Mäusen ergaben, daß die Leukozyten dieser Mäuse eine erheblich verminderte Fähigkeit zur Chemotaxis zeigten (Hirsch et al., 2000;Sasaki et al., 2002). Die Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) ERK 1/2 und p38 sind ebenfalls durch die Stimulation der Phospholipase A2 (PLA2) an der Regulation der Chemotaxis beteiligt (Gutkind, 2000). Dabei führt die Aktivierung der Phospholipase A2 zur Freisetzung von Arachidonsäure und Phospholipiden, die im weiteren Verlauf die Aktin-Polymerisierung regulieren (Hill und Treisman, 1995).

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Neben einer Auslösung der Migration sind einige der bereits genannten Moleküle ebenfalls an einer Induktion proliferativer Signalwege oder der Verhinderung von Apoptose beteiligt. Durch die PI3Kγ wird die Aktivität der Proteinkinase B (PKB/Akt) reguliert. PKB/Akt verhindert zum einen Apoptose, indem es die Komponente Bad des Bad/Bcl-XL-Komplexes phosphoryliert und ist weiterhin an einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB beteiligt. Auch die PKC ist in der Lage die Aktivierung von NF-κB zu vermitteln, der an der Regulation der Zellproliferation, dem Schutz vor Apoptose sowie der Transkription immunmodulatorischer Moleküle beteiligt ist (Downward, 1998;May und Ghosh, 1998). Proliferative Signale werden ebenfalls durch die MAPK-Mitglieder ERK 1/2, p38 und c-Jun vermittelt, die eine Transkription verschiedener Gene regulieren.

Neben einer G-Protein-abhängigen Aktivierung von Signalwegen (Abb.1.4) sind zwei G-Protein-unabhängige Mechanismen der Signalleitung durch GPCRs bekannt. Zum einen können die Chemokinrezeporen CXCR4, CCR2 und CCR5 direkt Januskinasen (JAK) binden und damit die Transkriptionsregulation über STAT-Moleküle vermitteln. Weiterhin ist eine Aktivierung der MAPK über endosomale Rezeptor-Arrestin-Komplexe bekannt (Mellado et al., 2001;Pierce et al., 2001).

1.3.4 Die Regulation der GPCR-Aktivität

Die Aktivität von GPCRs wird hauptsächlich durch drei Schritte, die Desensitivierung, die Internalisierung sowie die Resensitivierung oder den lysosomalen Abbau reguliert (Abb.1.5). Als Desensitivierung wird der Verlust der Aktivierbarkeit eines Rezeptors nach wiederholter
Abb. 1.5. Molekulare Mechanismen der GPCR-Internalisierung und des GPCR-Recyclings.

Die Bindung des Liganden führt zur Dissoziation der G-Protein α-Untereinheit von der βγ-Untereinheit und führt so zur Aktivierung von Signalwegen (1.) GRKs interagieren mit βγ-Untereinheiten und induzieren so die Phosphorylierung des GPCRs. Die Phosphorylierung erleichtert die Bindung von Adaptermolekülen, die eine erneute Aktivierung von G-Proteinen durch den Rezeptor sterisch verhindern (2.) und eine Dynamin-abhängige Endozytose vermitteln (3). Im endosomalen Kompartiment erfolgt anschließend ein Transport zurück an die Plasmamembran (4), oder ein lysosomaler Abbau. (Modifiziert nach Mokros, 2004 (Mokros, 2004))

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Stimulation mit einem Liganden bezeichnet.Die Desensitivierung wird durch die Phosphorylierung des Rezeptors durch die Mitglieder der G- Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen oder Second-messenger-abhängige Kinasen (PKA, PKC) eingeleitet. Dadurch wird eine Kopplung des Rezeptors an sein G-Protein vermindert. Zusätzlich erhöht die Phosphorylierung des Rezeptors durch GRKs seine Affinität für Adaptermoleküle, wie β-Arrestin. Durch die Bindung von β-Arrestin-Molekülen an den phosphorylierten Rezeptor wird sterisch eine erneute Bindung mit einem G-Protein verhindert.

Nach Aktivierung durch ihre Liganden werden fast alle GPCRs internalisiert. Ursprünglich wurde vorgeschlagen, daß dieser Mechanismus vorwiegend dazu benötigt wird, den „gebrauchten“, desensitivierten Rezeptor von der Zelloberfläche zu entfernen. Aus heutiger Sicht sind jedoch weitere Funktionen hiermit verknüpft worden. Dabei wird durch die Internalisierung das Entstehenintrazellulärer Signalkomplexe an Rezeptor-tragenden Endosomen, der Abbau des Rezeptors und damit eine lang anhaltende Desensitivierung sowie die Bereitstellung des Rezeptors für das Recycling zurück zur Zelloberfläche für eine kontinuierliche Signalleitung reguliert (Luttrell und Lefkowitz, 2002). Der am besten verstandene Mechanismus der GPCR-Internalisierung ist die Endozytose eines Rezeptors über Clathrin-umhüllte Vesikel (clathrin coated vesicle, CCV). Bei vielen GPCRs ist dieser Vorgang abhängig von ArrestinMolekülen. Diese besitzen neben Bereichen, die mit dem Rezeptor interagieren, auch Bereiche, die an Clathrin und den Clathrin-assoziierten Adapterkomplex AP-2 binden (Goodman et al., 1996;Laporte et al., 1999). Untersuchungen am β-adrenergen Rezeptors ergaben, daß der aktivierte Rezeptor zunächst β-Arrestin-Moleküle bindet und daraufhin zusammen mit Arrestin zu bereits existierenden Clathrin-angereicherten Membranbereichen oder CCV transportiert wird (Santini et al., 2002). Die GTP-ase Dynamin vermittelt im Folgenden eine Abschnürung der Vesikel von der Plasmamembran. Nach der Internalisierung der CCV dissoziieren die β-Arrestin-Rezeptorkomplexe, die Rezeptoren werden dephosphoryliert und an die Zelloberfläche transportiert, wo sie einer erneuten Stimulation zur Verfügung stehen. Alternativ kann der lysosomale Abbau der Rezeptoren erfolgen.

Abhängig von der Interaktion der GPCRs mit β-Arrestin-Molekülen können GPCRs in zwei Gruppen unterteilt werden (Oakley et al., 2001;Oakley et al., 2000;Tohgo et al., 2003). Zur ersten Gruppe gehören der β2-adrenerge Rezeptor, der µ-Opioidrezeptor und der Endothelin-A-Rezeptor. Sie binden β-Arrestin-2 mit höherer Affinität als β-Arrestin-1 und zeichnen sich durch eine nur vorübergehende Interaktion mit β-Arrestin-Molekülen aus, da der Rezeptor-β-Arrestin-Komplex bereits während oder kurz nach der Internalisierung zerfällt. Diese Rezeptoren erreichen die Endosomen ohne β-Arrestin und werden schnell wieder an die Oberfläche transportiert. Im Gegensatz dazu binden der Angiotensin-1a-Rezeptor, der Neurokininrezeptor oder der Vasopressinrezeptor-2 β-Arrestin-1 und -2 mit gleicher Affinität und bilden stabile Komplexe, die zusammen die Endosomen erreichen. Dort können sie bis zu 4 h verbleiben. Diese Rezeptoren recyceln nur langsam an die Oberfläche. Untersuchungen am β-adrenergen Rezeptor und am Vasopressinrezeptor zeigten, daß die unterschiedlichen Affinitäten der Rezeptoren zu den β-Arrestin-Molekülen sowie die Unterschiede im Recycling durch den C-Terminus der verschiedenen GPCRs bestimmt werden (Oakley et al., 2000).

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Neben der Rezeptorphosphorylierung sind weitere Sequenzmotive bekannt, die eine Clathrin-abhängige Endozytose vermitteln. Durch Dileuzin- und Tyrosin-basierende Sequenzmotive, wie FxNPxY oder Yxxφ (x steht für jede beliebige Aminosäure und φ für hydrophobe Aminosäuren), kann die direkte Bindung des Rezeptors an die µ2-Untereinheit des heterotetrameren AP-2-Komplexes vermittelt werden. Der AP-2-Komplex vermittelt dann über seine α- und β2-Untereinheit gleichzeitig eine Bindung an Clathrin-Moleküle (Ferguson, 2001;Kirchhausen et al., 1997). Neben einer Clathrin-abhängigen Internalisierung ist für GPCRs auch die Internalisierung durch Caveolae beschrieben. Caveolae sind flaschenförmige Membraneinbuchtungen, die reich an Cholesterin und Phospholipiden sind und darüber hinaus Caveolin als Struktur-vermittelndes Markerprotein enthalten. Dynamin reguliert wie auch im Clathrin-vermittelten Weg die Abschnürung der Caveolae. Über eine mögliche Bedeutung der Caveolae für die Regulation der GPCR-Aktivität ist bisher wenig bekannt.

1.4 Der viral-kodierte Chemokinrezeptor US28

Das HCMV kodiert für vier Gene, US27, US28, UL33 und UL78, die eine Sequenzhomologie mit humanen Chemokinrezeptoren aufweisen (Abb. 1.6). Dennoch konnte US28 bislang als einziger funktioneller Rezeptor für die Chemokine RANTES, MIP-1α und -β, MCP-1 und -3 sowie Fraktalkine identifiziert werden (Billstrom et al., 1998;Bodaghi et al., 1998;Kledal et al., 1998;Neote et al., 1993). Nach Bindung des Chemokins RANTES bewirkt der US28-Rezeptor eine durch Gαi- und Gα16-Untereinheiten vermittelte Aktivierung von ERK 2 (Billstrom et al., 1998;Gao und Murphy, 1994). Neben dieser Liganden-vermittelten Aktivierung von Signalwegen weist der US28-Rezeptor auch eine Liganden-unabhängige, konstitutive Aktivität auf. Dabei konnte eine konstitutive, durch Gαq-Untereinheiten-vermittelte Aktivierung von PLC, CREB (cyclic AMP response element binding protein) und NF-κB beobachtet werden (Casarosa et al., 2001;Waldhoer et al., 2002). Darüber hinaus wurde die Liganden-unabhängige Endozytose und das konstitutive Recycling des US28-Rezeptors beschrieben (Fraile-Ramos et al., 2001). In vitro-Untersuchungen an einem US28-deletierten HCMV-Stamm zeigten, daß US28 nicht essentiell für die Replikation des Virus war (Vieira et al., 1998). Daher werden gegenwärtig drei mögliche in vivo Funktionen des US28-Rezeptors diskutiert: Zum einen scheint die Aktivierung proliferativer Signalwege, wie NF-κB, CREB und der MAPK, möglicherweise für eine Etablierung der Viruslatenz oder für den Schutz vor Apoptose notwendig zu sein (Billstrom Schroeder et al., 2002;Casarosa et al., 2001;Waldhoer et al., 2002). Des weiteren könnte der US28-Rezeptor an einer Ausbreitung des HCMV im Organismus beteiligt sein, da durch die hochaffine Bindung des US28-Rezeptors an das membranständige
Abb. 1.6. Der HCMV kodierte Chemokinrezeptor US28.

Konservierte homologe Aminosäuren für die CXC-Chemokinrezeptoren wurden dunkelgrau und für die CC-Chemokinrezeptoren hellgrau unterlegt. Mögliche C-terminale Phosphorylierungsstellen sind durch weiße Schrift auf dunklem Grund gekennzeichnet und von eins bis zwölf numeriert. Potentielle Palmitylierungsstellen des C-Terminus befindet sich an der Position 304 und 347. Die Vorhersagen zur Membrantopologie und Proteinstruktur erfolgte mit dem „HUSAR-Paket 6.0“. E1-E3: extrazelluläre Domäne 1-3; I1-I3: intrazelluläre Schleifen 1-3; A: potentielle PKA-Phosphorylierungsstellen C: PKC-Phosphorylierungsstellen; II: potentielle Caseinkinase II-Phosphorylierungsstellen (Modifiziert nach Mokros, 2004 (Mokros, 2004)).

Chemokin Fraktalkine die Zellfusion begünstigt wird. Dadurch könnte eine Infektion Fraktalkine-exprimierender Zellen erleichtert werden (Haskell et al., 2000;Kledal et al., 1998). Weiterhin vermittelt der US28-Rezeptor nach Stimulation mit den Chemokinen RANTES oder MIP-1α die Migration infizierter arterieller glatter Muskelzellen (SMCs), wodurch die Ausbreitung des HCMV im Organismus begünstigt würde. Es wurde vorgeschlagen, daß die Migration der SMCs eine mögliche Ursache für HCMV-bedingte Arteriosklerosen und Restenosen von Herzkranzgefäßen darstellt (Streblow et al., 1999). Schließlich wird durch US28 möglicherweise die Rekrutierung von Leukozyten an den Ort der Infektion verhindert, da US28 das Entfernen der inflammatorischen Chemokine RANTES und MIP-1α aus der Umgebung HCMV infizierter Zellen bewirkt (Bodaghi et al., 1998;Randolph-Habecker et al., 2002). Somit könnte diese Eigenschaft des US28-Rezeptors als Teil des HCMV-Repertoirs angesehen werden, der menschlichen Immunantwort zu entgehen.

1.5 Fragestellung

↓15

US11 und US28 lassen sich der Gruppe der HCMV-kodierten Gene zuordnen, die an der Beeinflussung des menschlichen Immunsystems beteiligt sind.

Die Expression von US11 bewirkt eine verminderte Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen an der Oberfläche HCMV-infizierter Zellen. In einem heterologen Expressionssystem sollte untersucht werden:

↓16

Es wird angenommen, daß die Umgehung der menschlichen Immunantwort durch den US28-Rezeptor sowohl durch die Aktivierung verschiedener Signalwege, als auch durch die Depletion inflammatorischer Chemokine am Infektionsort erfolgt. Basierend auf Mutagenesestudien sollte in Kombination mit verschiedenen zellbiologischen und biochemischen Methoden untersucht werden:


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01.12.2006