2 Material

2.1  Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

↓17-20

Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg): Enhanced Chemilumineszens (ECL) Reagenzien, Protein A-Sepharose®, Rainbow-Proteinmarker, PD-10 Säulen,

Eastman Kodak Company (Stuttgart): Röntgenfilme (X-OMAT AR), Filmentwickler und –fixierer

Genomed (Bad Oeynhausen): JetStar Plasmidisolationssäulen und –puffer (Plasmid Purification Maxi Kit)

E. Merck AG (Darmstadt): Ammoniumpersulfat (APS), Ampizillin, Kanamyzin

Qiagen (Hilden): Qiaquick Gel Extraction Kit

PAA (Cölbe): RPMI, DMEM, Penizillin, Streptomyzin, Trypsin EDTA

R&D Systems GmbH (Wiesbaden): rekombinantes murines GM-CSF, humanes RANTES

Roche Diagnostics (Mannheim): Fugene 6

C. Roth GmbH (Karlsruhe): Agar-Agar, Albumin Fraktion V (BSA), Ammoniumhydrogencarbonat, Cäsiumchlorid, Dimethylsulfoxid (DMSO), Essigsäure, Ethanol, Ethidiumbromid, Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA), Glaswolle, Glycerin, Glycin, Hefe-Extrakt, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-ethansulfonsäure (HEPES), Isoamylalkohol, Isopropanol, Kaliumazetat, β-Mercaptoethanol, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), Methanol, 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), Natriumazid, Natriumchlorid, Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumhydroxid, Natriumzitrat, Rothiphorese® Gel 30 (30% Acrylamidstammlösung), Pepton aus Casein, Phenol, Salzsäure, Tween®-20, TEMED, Zitronensäure Monohydrat

Sigma-Aldrich (Taufenkirchen): Aprotinin, 4´,6-Diamidino-2-Phenyllindiol Dihydrochloridhydrat (DAPI), Digitonin, FilipinIII, Methyl-β-Cyclodextrin, Natriumfluorid (NaF), Natriumorthovanadat (Na3VO4), Paraformaldehyd, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Propidiumjodid (PI)

Stratagene (Amsterdam Niederlande): QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit

Radiochemikalien

↓21

[125I]RANTES human, rekombinant 2200 Ci/mmol (NEN Life Science Products, Köln)

[35S] Methionin/Cystein; EXPRE35S35S Protein Labeling Mix 1000 Ci/mmol (NEN, Köln)

[3H] Palmitat (NEN, Köln)

2.2 Bakterien

↓22

E.coli DH5 α

Für die Klonierung von DNA-Fragmenten sowie die Amplifikation von Plasmid-DNA. Genotyp: F-, endA1, hsdR17, (rK-, mK+), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, Δ(argF-laczya) U169, Φ80dlacZΔM15, λ-

2.3 Plasmide

2.4 Oligonukleotide

Die Oligodesoxynukleotid-Primer für die Polymerase-Kettenreaktion wurden von der Firma BioTeZ GmbH, Berlin Buch bezogen.

↓23-29

XbaCCR5-s: 5´-GCT CTAGAGCATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCA-3´ (Xba)

CCR5Hind-as: 5´CCCAAGCTTGGGTCACAAGCCCACAGATATTCC-3´ (Hin d III )

Arrestin s: 5´- CAA TAAGCTTACCATGGT TTCCTACAAGTGAAAGTG-3´ (Hin d III )

Arrestin as: 5`- AGATGGATCCCTATCTGTCGTTGAGCCG-3´ (Bam H I )

US28sXba: 5´-GCTCTAGAGCCATGACACCGACGACGACG-3´ (Xba)

US28asHind: 5´-CCCAAGCTTGGGGTATGAAAAGGCCGAGGTAGCGGC-3´ (Hin d III )

US28d1-2s: 5´-GTGGTACCAGGCTACATCGCGGGCAAAGAGTCGC-3´ (Kpn I )

US28d3-5s: 5´-GGTGGTACCACGCCATGGCCTTTGCGCGTCGG-3´ (Kpn I )

US28d3-8s: 5´-GGTGGTACCACGCCATGGCCTTTGCGCGTCGGGCCGCGCCGGCTCGAAGAGAG-3´ (Kpn I )

US28d6-8s: 5´-GGTGGTACCACAGCATGAGCTTTTCGCGTCGGGCCGCGCCGGCTCGAAGAGAG-3´ (Kpn I )

US28d9-12as: 5´-CCCAAGCTTTTATTACGGTATAATTTGTGCGACGCGACACACCTCGTCGGCCAGCGTGTCGGCAGCTGTCTCTCT-3´ (Hin d III )

US28 DRYs: 5´-CACGGAGATTGCACTCGATGCCTACTACGCTATTGTTTAC-3´

US28 DRYas: 5´-GTAAACAATAGCGTAGTAGGCATCGAGTGCAATCTCCGTG-3´

US28 Dillfw: 5´-GAACTACACTGTGCG GCG GCCGAGTTTCGC-3´

US28 Dillrev: 5´-GCGAAACTCGGCCGCCGCACAGTGTAGTTC-3´

US28 seclpfw: 5´-CTCGATCGCGCCGCCCCCGCTATTGTTTACATGAGAGCTCGGCCT-3´

US28seclprev: 5´-TACAGGCCGAGCTCTCATGTAAACAATAGCGGCGGCGCGATCGAG-3´

US28 thirdloopfw: 5´-CAGCTACTGCGCCTACCGCATTTCC-3´

US28 thirdlooprev: 5´-GGAAATGCGGTAGGCGCAGTAGCTG-3´

US28ctermfw: 5´-GATGTATCCTGGGCCCACAGCATGAGC-3´

US28ctermrev: 5´-GCTCATGCTGTGGGCCCAGGATACATC-3´

2.5 Enzyme

↓30

Invitek GmbH (Berlin):CombiPol DNA Polymerase Mix

NEB GmbH (Frankfurt a. M.): Alkalische Phosphatase (CIP), Restriktionsendonukleasen

Roche Diagnostics (Mannheim):T4 DNA-Ligase

2.6 Antikörper und Streptavidinkonjugate

↓31-35

Labor Dr. A. Rehm (MDC, RRK):anti-human MHC-Klasse-I-Antikörper HC10 und anti- human MHC-Klasse-I-Antikörper W6/32HL (Barnstable et al., 1978;Stam et al., 1990).

Thilo Mokros (AG Lipp unter der Leitung von Dr. Uta E. Höpken MDC, Berlin)stellte im Rahmen seiner Dissertation die monoklonalen Maus-anti-US28-Antikörper Tub-6 und Tub-45 her (Mokros et al., 2002).

AG Lipp (MDC): Ratte-anti-CXCR5-Antikörper (Hybridom 8B2)

Dr. Martin Oppermann (Institut für Immunologie, Universität Göttingen)stellte den Maus-anti-CCR5-Antikörper R22/7 zur Verfügung (Pollok-Kopp et al., 2003).

Cell Signaling (NEB GmbH, Frankfurt/ a.M.): Kaninchen-anti-Phospho- p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) -Antikörper, Kaninchen-anti- p44/42 MAPK-Antikörper, Peroxidase-gekoppelter anti-Kaninchen-Antikörper

Jackson Immunoresearch Laboratories (Dianova Hamburg):Ratte-anti-Maus-IgG Cy3 gekoppelt, Ziege-anti-Maus-IgG Biotin gekoppelt, Esel-anti-Kaninchen-IgG Cy3 gekoppelt,

Ziege-anti-Maus-IgG und -IgM FITC gekoppelt

Molecular Probes (Leiden, Niederlande): Alexa Fluor® 488 und Alexa Fluor®568, jeweils Streptavidin-gekoppelt

Pharmingen (BD Heidelberg): Biotin-markierter anti-Maus-CD8-Antikörper, anti-Maus- CD11c Biotin markiert, anti-Maus-H-2Ld/Db Biotin markiert,anti-Maus-H-2Kb Biotin markiert, anti-Maus-H-2Db Biotin markiert, anti-Maus-CD86 FITC gekoppelt, anti–Maus-I-Ab FITC markiert, anti–Maus-CD8 APC gekoppelt

R&D Systems GmbH (Wiesbaden): Maus-anti-CCR5-Antikörper Klon 45523.111

Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg ): polyklonales Kaninchen-anti-Caveolin-1-Antiserum, affinitätsaufgereinigt

Sigma-Aldrich (Taufenkirchen): Anti-FLAG® monoklonaler Antikörper M2

Southern Biotechnology (Eching): Peroxidase-gekoppelter Ziege-anti-Maus-Antikörper

2.7 Geräte und sonstige Materialien

↓36-39

Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg): Geltrockner (Hoefer SE 1160 DryGel Sr.)

Beckman Instruments GmbH (Heidelberg): Beckman L7t55 Ultrazentrifuge

Becton-Dickinson GmbH (Heidelberg): Durchflußzytometer (FACScan™)

Berthold GmbH (Bad Wildbach): Gammazähler (Wallac 1470 WIZARD®), Luminometer (Luminat LB 9507)

Eppendorf (Hamburg): Reaktionsgefäße 0,5, 1,5 und 2,0 ml, Thermomixer comfort

Greiner GmbH (Nürtingen): Mikrobiologische Zellkulturschalen ∅ 10 cm, sterile 15 ml Röhrchen

Heraeus (Hanau): Brutschränke, Tischzentrifugen Biofuge pico und fresco

Leica (Bensheim): Fluoreszenzmikroskop Leica DM IRBE

Nerbe plus GmbH (Winsen/Luhe): sterile, RNase-/DNase-freie Filter-Pipettenspitzen

Nunc GmbH (Wiesbaden): Einfrierröhrchen Cryotube 2 ml

PALL (VWR International GmbH, Darmstadt): Acrodisc® sterile Spritzenfilter, 25 mm, 0,45 µm Porengröße

TPP: Zellkulturschalen und -flaschen, sterile 15 ml und 50 ml Zentrifugenröhrchen

Carl Zeiss Mikroskopie (Göttingen): AxioCam™ color Digitalkamera für die Mikroskopie, Zeiss LSM für die Konfokale Mikroskopie

2.8 Zellen

↓40

HEK293A Subklon von HEK293-Zellen, der fest an der Plastikzellkulturschale haftet (HEK293: Ad5 transformierte, humane, embryonale Nierenzellinie; epithelial) (Quantum Biotech. Inc. ATCC CRL-1573)

MCA205 Methylcholantren induzierte Fibrosarkom Zellinie, wurde freundlicherweise von der Gruppe von Prof. Dr. Thomas Blankenstein (MDC) zur Verfügung gestellt

2.9 Adenoviren

Adenoviren, die für US11 und LacZ kodieren waren in der Arbeitsgruppe von Dr. A. Rehm vorhanden.

2.10 Medien

2.10.1  Medien für die Bakterienkultur

LB-Medium

5 g Hefe-Extrakt, 10 g Bacto-Trypton, 5 g NaCl ad 1 l ddH2O, autoklaviert

LB-Medium zur Vektorselektion

100 mg Ampizillin / l LB-Medium

30 mg Kanamyzin / l LB-Medium

Feste Nährböden wurden durch Zugabe von 15 g Agar-Agar auf 1 l Medium hergestellt. Der Agar löste sich durch das Autoklavieren (20 min bei 120°C, 2 bar).

2.10.2 Medien für die Säugetier-Zellkultur

↓43

Bindungsmedium (BM), für Internalisierungsexperimente

RPMI 1640 ohne Bicarbonat; 0,2% BSA; 10 mM HEPES pH 7,4; Sterilfiltration

Saures Medium, Waschmedium bei Internalisierungsexperimenten

RPMI 1640 ohne Bicarbonat; 0,2% BSA; 10 mM MES; pH 2,5 (HCl); Sterilfiltration

2.11 Puffer

2.11.1  Proteinelektrophorese und Westernblot

↓44-48

Isolation Detergenz-resistenter Membranen

25 mM Pipes, pH 6,5; 150 mM NaCl, 1% TX-100, 1 mM PMSF

Laufpuffer

50 mM Tris, 0,38 mM Glycin, 0,1% SDS

Lysepuffer für die Zellextraktion mit Detergenz

PBS pH 7,3; 1% TX-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF (frisch vor Gebrauch zusetzen)

NET-Puffer

50 mM Tris, pH 7.4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40

PBS/T- Puffer für das Waschen von Immunoblots

PBS; 0,1% Tween-20

Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Sammelgelpuffer 0,5 M Tris pH 6,8; 0,4% SDS

Trenngelpuffer 1,5 M Tris pH 8,8; 0,4% SDS

Gellösungen SDS-PAGE

Trenngel

12,5 %

Sammelgel

ddH2O

16,75 ml

7,5 ml

Puffer

12,5 ml

3,13 ml

Acrylamidlösung (Rotiphorese® Gel 30,

30 % Acrylamid; 0,8 % Bisacrylamid)

20,75 ml

1,8 ml

10 % APS (ddH2O)

250 µl

90 µl

TEMED

25 µl

9 µl

2x Protein-Probenpuffer für die SDS-PAGE

↓49-54

125 mM Tris/HCl pH 6,8; 4% SDS; 0,2% Bromphenolblau; 20% Glycerin; 5% ß-Mercaptoethanol

TBS/T-Puffer für das Waschen von Immunblots

20 mM Tris pH 7,6; 140 mM NaCl; 01% Tween-20

Transferpuffer, Westernblot

25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol

2.11.2 DNA-Gelelektrophorese und Plasmidpräparation

P1, P2, P3 für den alkalischen Schnellaufschluß von Bakterien:

P1 (Zellsuspension): 50 mM Tris/HCl pH 8, 10 mM EDTA, 100 mg/l RNase A

P2 (Zellyse): 200 mM NaOH, 1% SDS

P3 (Neutralisation): 3,1 M Kaliumazetat, ad Essigsäure pH 5,5

10x DNA-Probenpuffer

30% Ficoll 400, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylene-Cyanol FF, 30% Glycerol

TAE-Puffer (50x), für die Agarosegelelektrophorese

242 g Tris, 57,1 ml Eisessig, 37,2 g Na2EDTA·2H2O ad 1l ddH2O

Transformationspuffer (TfP) zur Herstellung chemokompetenter Bakterien

TfPI: 75 ml ddH2O; 0,75 g KCl; 1 g MnCl2·4H2O; 0,3 g Kaliumazetat; 0,15 g CaCl2; 15 ml Glycerin auf pH 5,5 mit 0,2 M Eisessig einstellen, ddH2O auf 100 ml, steril filtrieren

TfPII: 75 ml ddH2O; 0,21 g MOPS; 0,08 g KCl; 1,1 g CaCl2; 15 ml Glycerin; pH 6,8 mit 0,5 M NaOH einstellen; ddH2O auf 100 ml, sterilfiltrieren

2.11.3 Zellkultur und zytologische Färbungen

↓55-57

2x HBS Puffer, für die Kalziumphosphat-Transfektion

50 mM HEPES pH 7,1; 280 mM NaCl; 1,5 mM Na2HPO4

10x Lysepuffer, für Erythrozyten

89,9 g NH4Cl, 10 g KHCO3, 0,37 g EDTA pH 7,3

Mowiollösung, für die Mikroskopie

24 ml einer 0,2 M Tris/HCl pH 8,5- Lösung, 12 g Glycerin, 4,8 g Mowiol 4-88,

30-40 min bei 50°C rühren, abzentrifugieren, Lagerung bei 4°C

PBS

0,14 M NaCl; 2,7 mM KCl; 8,1 mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4 pH 7,3

2.12 Mäuse

C57BL/6 wt Tiere

LCMV P-14 transgene C57BL/6 Rag-/- Mäuse, die transgen für einen T-Zellrezeptor sind, der das LCMV-P14-Peptid gp33-41 auf MHC-Klasse-I-H2-Db-Molekülen erkennt, wurden freundlicherweise von der Gruppe Prof. Dr. Thomas Blankenstein (MDC, Berlin) zur Verfügung gestellt (Gladow et al., 2004).

2.13 Peptid

↓58

Peptid zur Beladung der dendritischen Zellen gp33 des LCMV P14-Proteins

(gp33-41)-KAVYNFATC (Biosynthan, Berlin)


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01.12.2006