3 Methoden

3.1  Nukleinsäure-Techniken

3.1.1  DNA-Amplifikation mit Hilfe der PCR

↓58

Die in vitro-Amplifikation von DNA erfolgte durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Sie wurde (nach Mullis und Faloona, 1987) mit Hilfe thermostabiler DNA-Polymerasen in 25-35 Zyklen durchgeführt. Ein Zyklus bestand aus der Hitzedenaturierung der Matrizen-DNA (95 °C, 45 s), der Primeranlagerung (55-65°C, 45 s) und der Kettenverlängerung (72°C, 90 s). Die hergestellten DNA-Stränge wurden nach ihrer Fertigstellung in einen Expressionsvektor kloniert. Da sie anschließend in eukaryotischen Zellen zur Proteinexpression verwendet wurden, wurde ein Polymerasemix mit „proofreading“ Aktivität verwendet. Alle hergestellten PCR-Produkte wurden nach ihrer Klonierung durch die Firma Invitek (Berlin) sequenziert.

↓59

Der Standard-PCR-Ansatz bestand aus folgenden Komponenten:

Reagenz

Konzentration im 50µl Ansatz

DNA-Matrize

1µl

Optiperform Puffer III (10x)

5µl

OptiZyme (Enhancer)

10µl

MgCl2 [50 mM]

2µl

dNTPs

je 0,2 mM

3´- und 5´-Primer

je 25 pM

CombiPol-Polymerase

1 U

3.1.2 Agarosegelelektrophorese

Vektor-DNA oder PCR-Produkte wurden in 0,8-1 %-igen Agarosegelen (= 0,8-1g Agarose in 100 ml 1 x TAE-Puffer; 0,5 µg/ml Ethidiumbromid) aufgetrennt und analysiert. Hierzu wurden die PCR-Produkte oder die Vektor-DNA mit 1/10 Volumen eines 10 x DNA-Probenpuffer gemischt und in die Taschen des Gels geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele auf dem UV-Tisch ausgewertet und gegebenenfalls wurden Banden zur weiteren Verwendung ausgeschnitten.

3.1.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

↓60

Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mittels Zentrifugation. Dazu wurden am Boden eines 0,5 ml Reaktionsgefäßes mit einer Kanüle ein Loch gestochen und dieses mit einem Glaswollpfropf verschlossen. Die ausgeschnittenen DNA-Banden wurden in das Reaktionsgefäß überführt. Dieses wurde in ein 2 ml Reaktionsgefäß gestellt und 10 min bei 13.000 Upm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Die im Durchlauf befindliche DNA wurde dann anschließend mit Hilfe von Ethanol gefällt.

Bei nur geringen Ausgangsmengen wurde der „Qiaquick Gel Extraction Kit“ von Qiagen nach Herstellerangaben verwendet.

3.1.4 Reinigungsmethoden für Nukleinsäuren

3.1.4.1  Phenol/Chloroform-Extraktion

Nukleinsäuren wurden von Proteinen durch eine Extraktion mit Tris-gepuffertem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1, v/v/v) getrennt. Zu der Probe, die aus einem Mindestvolumen von 0,1 ml bestand, wurde das gleiche Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol gegeben. Das Gemisch wurde 30 s mit dem Vortexer gemischt und danach 5 min in der Tischzentrifuge bei 13.000 Upm zentrifugiert. Die wäßrige obere Phase wurde abgenommen und die in ihr enthaltenden Nukleinsäuren durch Alkoholpräzipitation konzentriert.

3.1.4.2  Präzipitation von Nukleinsäuren mit Alkohol

↓61

Für die DNA-Fällung wurde die Nukleinsäure enthaltende Probe zunächst auf eine Endkonzentration von 0,25 M Natriumazetat eingestellt. Nach Zugabe des 2,5-fachen Volumens einer 96 %-igen Ethanol-Lösung wurde die Probe bei –20°C für mindestens 30 min gefällt. Die Nukleinsäuren wurden anschließend durch Zentrifugation (4°C, 30 min, maximale Geschwindigkeit, Tischzentrifuge) pelletiert. Das Pellet wurde zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen und anschließend getrocknet und in ddH2O aufgenommen.

3.1.5 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen

Für die Spaltung von DNA mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen wurden die vom Hersteller empfohlenen Puffer verwendet. Für 1µg DNA wurden 1 bis 2 U der entsprechenden Endonukleasen verwendet und diese mit der DNA für 1 bis 4 h bei 37 °C inkubiert. Das Volumen des zugesetzten Enzyms/der Enzyme betrug jedoch nicht mehr als 1/10 des Gesamtvolumens. Ein Aliquot des Restriktionsansatzes wurde auf ein Agarosegel geladen, um zu prüfen, ob eine vollständige DNA-Spaltung erfolgt war. Bei DNA, die darauffolgend zur Klonierung verwendet werden sollte, wurden die Enzyme nach Herstellerangaben durch Hitze inaktiviert. Bei Enzymen, die sich nicht durch Hitze inaktivieren ließen, wurde eine Phenolextraktion mit anschließender Fällung der DNA durch Ethanolpräzipitation durchgeführt.

3.1.6 Abspaltung von 5´-Phosphatresten durch alkalische Phosphatase

Zur Verhinderung intramolekularer Religation wurden vor der Ligation die 5´-Phosphatgruppen des Vektors enzymatisch entfernt. Dazu wurden die DNA-Fragmente nach der Restriktionsspaltung und der Inaktivierung der Restriktionsendonukleasen durch die Zugabe von einer Einheit alkalischer Phosphatase 30 min bei 37 °C dephosphoryliert. Der Reaktionsansatz wurde zur Inaktivierung der alkalischen Phosphatase für 10 min bei 70° C erhitzt. Die enthaltenden DNA-Fragmente wurden anschließend über ein Agarosegel aufgereinigt.

3.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten

↓62

Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde unter Verwendung von einer Einheit T4-Ligase pro Mikrogramm eingesetzter DNA in einem 10 µl Reaktionsansatz durchgeführt. Ein Standardligationsansatz enthielt 300 ng des zu klonierenden Fragmentes, 100 ng des linearisierten Vektors, 1 µl 10 x Ligationspuffer, T4-Ligase und ddH2O. Die Ligation erfolgte über Nacht (16 h) bei 16°C in einem Wasserbad.

3.1.8 Herstellung transformationskompetenter Bakterien

Für die Klonierung von DNA-Fragmenten wurden Bakterien des DH5α-Stammes verwendet. 5 ml LB-Medium wurden mit den Bakterien in einer Übernachtkultur angeimpft. Nach 16 h wurden 3 ml der Bakteriensuspension in 500 ml LB-Medium überführt und bis zum Erreichen der OD600 von 0,6 weiterkultiviert. Die Kultur wurde 30 min auf Eis gekühlt und anschließend 10 min bei 3000 xg bei 4°C zentrifugiert. Das entstandene Zellpellet wurde in 100 ml eiskaltem Transformationspuffer I resuspendiert und im Anschluß 15 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen erneut abzentrifugiert und in 20 ml Transformationspuffer II aufgenommen. Je 200 µl der Bakteriensuspension wurden in Reaktionsgefäße überführt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

3.1.9 Transformation

Das halbe Volumen des Ligationsansatzes wurde mit 70 µl kompetenten Bakterien vermischt und 20 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei 42 °C für 45 s erfolgte eine erneute Inkubation für 2 min auf Eis. Danach wurde der Bakteriensuspension 1 ml LB-Medium zugegeben und 60 min in einem Schüttler bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert, in 100 µl LB-Medium aufgenommen und anschließend auf LB-Agarplatten, die zur Selektion Ampizillin enthielten, ausgestrichen und 16 h bei 37°C inkubiert.

3.1.10  Isolierung von Plasmiden aus Bakterien

↓63

Geringe Mengen Plasmid-DNA wurden mit Hilfe des alkalischen Bakterienaufschlußes präpariert. Dazu wurde ein Bakterienklon in 3 ml LB-Medium über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach 16 h wurden 1,5 ml der Zellsuspension 1 min bei 13.000 Upm pelletiert und in 250 µl Puffer 1 resuspendiert. Anschließend wurden 250 µl des Puffers 2 zugegeben, vorsichtig gemischt, und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zugabe von 250 µl Puffer 3 und vorsichtigem Mischen folgte eine Inkubation von 10 min auf Eis. Bakterielle Proteine, Zellreste und genomische DNA wurden anschließend durch eine10 minütige Zentrifugation bei 13.000 Upm in der Tischzentrifuge entfernt und der klare Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die DNA wurde durch Ethanolpräzipitation gefällt und das entstandene DNA-Pellet in 50 µl Wasser aufgenommen.

3.1.11 Präparative Plasmidisolierung

Für die Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA wurden 400 ml LB-Medium mit einer Bakterienkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Am nächsten Tag wurden die Bakterien bei 3.500 xg pelletiert. Die Plasmidisolierung erfolgte nach dem Prinzip des alkalischen Bakterienaufschlußes mit anschließender Anionenaustauscher-Säulenchromatographie. Für die Präparation wurden Anionenaustauscher-Säulen und Puffer der Firma Genomed nach Herstellerangaben verwendet.

3.2 Einführung von Mutationen in cDNA mittels PCR

In die Nukleotidsequenz des US28-Rezeptors wurden Punktmutationen mittels PCR eingeführt. Die hierbei verwendeten PCR-Primer enthielten von der US28 Sequenz abweichende Basenfolgen, die für die gewünschte Änderung der Aminosäuresequenz kodierten. Dabei wurden verschiedene Strategien verwendet.

3.2.1  Mutagenese der C-terminalen Serinreste

↓64

Für den Austausch der potentiellen Phosphorylierungsstellen am C-Terminus des US28 Rezeptors konnte eine natürlich vorkommende Kpn I-Schnittstelle benutzt werden. Der Austausch der 12 Serinreste erfolgte in verschiedenen Gruppen gegen Alaninresten. Um die ersten beiden Serinreste an Position 315 und 319 auszutauschen, wurden die Primer US28d1-2 und US28sXba verwendet (siehe Abbildung 3.1.). Als Matrize wurde dabei das US28 wt Plasmid verwendet. Das daraus resultierende PCR-Produkt wurde durch die Restriktionsendonukleasen Xba I und Kpn I geschnitten und in ein ebenfalls mit Xba I und Kpn I geschnittenes Plasmid eingeführt, das die US28 wt Sequenz enthielt. Der Austausch der Serinreste 3-5 (323, 325, 327), 6-8 (330, 331, 333) und 3-8 (323-333) gegen Alaninresten erfolgte durch die PCR mit Hilfe der entsprechenden Primer US28d3-5s, US28d6-8s und US28d3-8s und dem 3´ N-terminalen Primer US28asHind, der eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Hind III kodiert. Die PCR-Produkte wurden durch Kpn I und Hind III geschnitten und in ein Kpn I und Hind III geschnittenes Plasmid eingeführt, das die US28 wt-Sequenz enthielt. Die Mutagenese der Serinreste 9-12 (338, 339, 343 und 350) erfolgte durch PCR mit Hilfe der Primer US28sXba und US28d9-12as. Das entstandene PCR-Produkt wurde Xba I, Hind III geschnitten und in pcDNA3.1.(-) eingefügt. Zum Austausch der Serinreste 3-12 (323-350) wurden die Primer US28d9-12as und US28sXba verwendet. Als Matrize wurde hierbei das US28 S3-8A Plasmid verwendet, bei dem die Serinreste der Positionen 323-333 bereits durch Alaninreste ersetzt waren. Der komplette Austausch der Serinreste 1-12 entstand durch Kpn I und Hind III-Spaltung der Plasmide US28 S1-2A und US28 S3-12A und anschließender Ligation des US28 S3-12A-Fragmentes in den US28 S1-2A-Vektor.

Abb. 3.1 Mutagenese potentieller Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des US28-Rezeptors (Erläuterungen siehe Text 3.2.1)

3.2.2 Mutagenese der auf Tyrosinresten und Doppel-Leuzinresten basierenden AP-2 Adapterstellen sowie des Cysteinrestes C347 des US28 Rezeptors

Für den Austausch der Tyronsinreste (Y130-138, Y208, Y321), Leuzinreste (LL305/306) oder des Cysteinrestes (C347) konnten keine natürlich vorkommenden Restriktionsschnittstellen verwendet werden. Deshalb wurden jeweils zwei DNA-Fragmente der DNA-Matrize getrennt amplifiziert, die die Bereiche N- und C-terminal der zu mutierenden Nukleotide abdeckten und sich in diesem Bereich überlappten. Durch die Einführung der Mutation in den 3´-Primer (für die Amplifikation des N-terminalen Abschnittes) und in den 5´-Primer (für die Amplifikation des C-terminalen Abschnittes), die einander komplementär sind, wurde diese Mutation in der amplifizierten DNA verwirklicht. Die beiden PCR-Produkte wurden mit jeweils 20 Zyklen amplifiziert, über ein Agarosegel aufgereinigt und gemeinsam, unter Verwendung des 5´aminoterminalen Primers (US28sXba) und des 3´carboxyterminalen Primers (US28asHind) erneut 20 Zyklen amplifiziert. Das entstandene PCR-Produkt wurde durch die Restriktionsendonukleasen Xba I und Hind III geschnitten und in pcDNA3.1(-) kloniert.

3.2.3 Herstellung der US28 R129A-Mutante

↓65

Der Austausch des Argininrestes 129 zu einem Alaninrest wurde mit Hilfe der Qick change „site-directed mutagenese“ Reagenzien von Stratagene durchgeführt. Dazu wurden einander komplementäre Primer, die für die Mutationen kodierten, entworfen. Die parentale Plasmid-DNA wurde zunächst durch Erhitzen auf 95°C denaturiert. Es folgte die Anlagerung der Mutageneseprimer an die DNA-Stränge durch Abkühlung auf 55°C und die Elongation der Primer durch die Turbo-Pfu-Polymerase bei 68°C. Durch häufige Wiederholung der Reaktionsschritte wurde ein Plasmid amplifiziert, das die gewünschte Mutation enthielt. Nach Abkühlung des Ansatzes auf 37°C schloß sich eine Behandlung mit der Endonuklease Dpn I an, die spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA schneidet. Da Plasmid DNA, die in E.coli DH5α amplifiziert wurde, methyliert ist, erfolgte auf diese Weise der Verdau parentaler DNA, während die in vitro amplifizierte, mutierte DNA erhalten blieb.

3.3 Zellkultur

3.3.1  Kultivierung von Säugetierzellinien

HEK293A-Zellen wurden in einem Brutschrank bei 37°C und einer Wasserdampf gesättigten Atmosphäre mit 5 %-igem CO2-Gehalt kultiviert. Als Standard-Zellkulturmedium wurde DMEM verwendet, dem 10 % FKS (vor Zugabe durch Hitzebehandlung bei 56 °C inaktiviert), 100 U/ml Penizillin, 100µg/ml Streptomyzin und 2 mM L-Glutamin zugesetzt wurden. Vor Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst, in Zellkulturmedium resuspendiert und im Verhältnis 1:5 bis 1:10 auf neue Zellkulturgefäße verteilt.

3.3.2 Transfektion von HEK293A-Zellen mit der Kalziumphosphat-Methode

Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion so ausgesät, daß sie zum Zeitpunkt der Transfektion 50-70 % konfluent gewachsen waren. Die Puffer und Lösungen wurden auf Raumtemperatur erwärmt. Für die Transfektion der Zellen einer Kulturschale von 10 cm Durchmesser wurden 10 µg Plasmid-DNA mit 50 µl der 2,5 M CaCl2-Lösung gemischt und auf ein Gesamtvolumen von 500 µl mit ddH2O aufgefüllt. Diese Mischung wurde tropfenweise zu 500 µl 2 x HBS-Lösung unter Schütteln auf dem Vortexer zugegeben. Das Präzipitat wurde nach 20 min Minuten tropfenweise unter Schwenken der Kulturschale auf den Zellen verteilt. Nach einer Inkubation von 16-24 h wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in frischem Zellkulturmedium weiterkultiviert.

3.3.3 Transfektion von HEK293A-Zellen mit Fugene 6

↓66

HEK293A-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion auf Schalen ausgesät, so daß sie zum Zeitpunkt der Transfektion 70 % konfluent waren. Für eine Zellkulturschale von 10 cm Durchmesser wurden 3 µg DNA verwendet. Da die Transfektionseffizienz verschiedener Zellinien durch das Verhältnis von Fugene 6 zur DNA-Menge bestimmt wird, wurde zunächst in Testtransfektionen mit GFP das Fugene/DNA Verhältnis ermittelt. HEK293A-Zellen wurden durch ein Verhältnis von 3:1 (Fugen [µl]/DNA-Menge[µg]) optimal transfiziert.

Für die Transfektion wurde 3 µg DNA in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. In einem zweiten Reaktionsgefäß wurden 9 µl Fugene in 300 µl Optimem Medium verdünnt. Danach wurde die Optimem-Fugene-Mischung zur DNA gegeben, gemischt und 15 min bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe der Transfektionsansätze auf die Zellen.

3.3.4 Amplifikation und Aufreinigung von Adenoviren

HEK293A-Zellen wurden in 15 cm Platten ausgesät. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70-80 % erreicht hatten, wurden sie mit den zu amplifizierenden Adenoviren infiziert. Nach 24-48 h zeigten alle Zellen einen zytopathischen Effekt. Sie wurden vorsichtig geerntet und pelletiert. Das Zellpellet wurde in 7 ml Medium aufgenommen und dreimal eingefroren und wieder aufgetaut, um die Zellmembranen zu zerstören und die Viruspartikel freizusetzen. Nach dem letzten Auftauen wurde das Zellysat 20 min bei 300 x g zentrifugiert und der trübe Überstand auf einen Cäsiumchloridgradienten geladen. Der Cäsiumchloridgradient wurde durch Überschichten von 10 ml 1,4 M CsCl-Lösung mit 8 ml einer 1,2 M CsCl-Lösung hergestellt. Die Gradienten wurden 3 h in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 xg zentrifugiert. Nach der Zentrifugation waren die Viruspartikel als ein weißer Ring sichtbar. Sie wurden mit einer 5 ml Spritze abgesaugt und ein zweites Mal in kleinerem Volumen über einen CsCl-Gradienten aufgereinigt. Dazu wurden 4 ml der 1,4 M CsCl mit 3 ml 1,2 M CsCl und 3 ml der Virussuspension überschichtet. Der Gradient wurde 16 h bei 100.000 xg in der Ultrazentrifuge zentrifugiert und die Viruspartikel am nächsten Tag in einem kleinen Volumen abgesaugt. Um das CsCl aus der Viruspräparation zu entfernen, erfolgte ein Pufferaustausch über eine Gelfiltrationssäule PD10 (Pharmacia). Dazu wurde die Säule mit 50 ml PBS äquilibriert. Das Virus wurde auf die Säule geladen und Eluate in einem Volumen von 5-7 Tropfen aufgefangen. Fraktionen, die Virus enthielten, konnten durch eine leicht milchige Trübung identifiziert werden. Diese trüben Fraktionen wurden vereinigt und nach Zugabe von 10 % (v/v) Glycerol bei –80°C gelagert.

3.3.5 Bestimmung des Adenovirustiters

↓67

Der Virustiter wurde als Doppelbestimmung durch die TCID50-Methode (Tissue Culture Infectious Dose 50 ) ermittelt. Zur Bestimmung des Virustiters wurde Standard-Kulturmedium (siehe 3.3.1) mit 2 % FKS verwendet. Es wurden zwei 96-Loch-Platten mit 1 x 104 HEK293A Zellen/Loch in 100 µl Medium ausgesät. 10 Löcher pro Platte wurden mit jeweils 100µl einer Verdünnungsstufe (10-6 bis 10-13) des aufgereinigten Virus infiziert. 16 weitere Löcher pro Platte dienten als Kontrolle und wurden mit je 100 µl Medium/Loch inkubiert. Nach 10 Tagen wurde das Verhältnis der Löcher der Zellen, die einen vollständigen zytopathischen Effekt zeigten, zur Gesamtzahl der infizierten Löcher pro Verdünnungsstufe bestimmt. Zeigten zum Beispiel die HEK293A-Zellen bei der Verdünnung der Virussuspension von 10-8 in 8 von 10 Löchern einen vollständigen zytopathischen Effekt. Darum würde dieser Verdünnungsstufe ein Wert von 0,8 zugeordnet werden. Das Verhältnis aller Verdünnungsstufen (10-1 bis 10-13) wurde addiert und als s-Wert in folgende Formel einbezogen:

T = 10 1+1 (s-0,5 )

Da die TCID50 um ca. 0,7 Logstufen größer ist, als die Anzahl der Viren pro ml bei einem Plaque Assay, wurde 0,7 von T subtrahiert, um einen mit dem Plaqueassay vergleichbaren Wert zu erhalten.

3.3.6 Infektion von Säugetierzellen mit Adenovirus

↓68

Für die Infektion von Säugetierzellen wurden verschiedene Mengen infektiöser Viruspartikel pro Zelle, MOIs, eingesetzt. Dabei wurden für eine MOI von 100 entsprechend 100 infektiöse Viruspartikel pro Zelle verwendet. Für die Infektion von 1 x 106 Zellen wurden 100 µl eines aufgreinigten Virus mit einem Titer von 108/100 µl benutzt. Die Infektion der Zellen erfolgte in serumfreien Medium für 4 h.

3.4 Durchflußzytometrie

3.4.1  Nachweis von Oberflächenmolekülen

Eine quantitative Untersuchung von Molekülen auf der Zelloberfläche, aber auch intrazellulärer Antigene, erfolgte mit Hilfe der Durchflußzytometrie. Adhärent wachsende Zellen wurden mit PBS gewaschen und unter vorsichtigem Pipettieren geerntet. Stark adhärent wachsende Zellen wurden mit Hilfe von PBS/2 mM EDTA von der Platte gelöst. Die Zellen wurden zentrifugiert und in kaltem PBS gewaschen. Für die Untersuchung von Oberflächenmolekülen wurden die Zellen in 50 µl FACS-Puffer (PBS, 0,5 % BSA, 0,01 % NaN3) aufgenommen und mit den entsprechenden Antikörpern oder einem gleichen Volumen eines

Hybridomüberstandes für 30 bis 60 min bei 4°C inkubiert. Dem zweimaligem Waschen mit kaltem FACS-Puffer folgte eine Inkubation mit einem Fluorochrom-gekoppelten anti-Immunglobulin-Antikörper, sofern der im ersten Inkubationsschritt verwendete Antikörper nicht selbst mit einem Farbstoff markiert war. Für Biotin-markierte Antikörper wurde im zweiten Schritt ein Farbstoff-markiertes Streptavidinkonjugat eingesetzt. Der zweite Inkubationsschritt erfolgte für 30 min bei 4°C, die Zellen wurden danach zweimal gewaschen und durchflußzytometrisch untersucht. Auf Zellen, die große Mengen Fc-Rezeptoren exprimierten (z.B. DCs), erfolgte vor der Immunfärbung ein zusätzlicher Blockierungsschritt mit Serum der Spezies des zweiten Antikörpers. Für die sichere Unterscheidung, ob ein Protein an der Oberfläche exprimiert ist, wurde direkt vor der Messung zusätzlich mit 4 µM Propidiumjodid (PI) gefärbt. Dieser Farbstoff dringt durch geschädigte Zellmembranen in das Innere der Zelle ein und färbt die DNA im Zellkern an. PI positive Zellen wurden von der Auswertung der Zelloberflächenexpression ausgeschlossen.

3.4.2 Nachweis intrazellulärer Epitope

↓69

Die Untersuchung intrazellulärer Antigene erfolgte an fixierten und permeabilisierten Zellen. Dazu wurden 1-5 x 106 Zellen in 5 %-iger Paraformaldehylösung (5 % PFA in PBS) 15 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 2 x mit PBS gewaschen und in Digitoninlösung (0,0025 % Digitonin in PBS) 7-8 min bei RT permeabilisiert. Die Zellen wurden gewaschen, in FACS-Puffer resuspendiert und die Färbung mit den Antikörpern erfolgte wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.

3.5  T-Zellproliferationsassay

3.5.1  Ausreifung und Aufreinigung dendritischer Zellen aus Knochmarkszellen

Die Präparation dendritischer Zellen (DCs) erfolgte nach dem Protkoll von T. Schüler (Schuler und Blankenstein, 2002). Dazu wurden Knochenmarkszellen aus Femur und Tibia von C57BL/6 Mäusen entnommen. Die Zellen wurden auf 6-Loch-Platten ausgesät und nach einer Stunde wurden nicht adhärente Zellen in einer Konzentration von 4 x 106/ml in 6-Loch-Platten überführt. Die Kultivierung der Knochenmarkszellen erfolgte in RPMI mit 10 % FKS und 20 ng/ml murinem GM-CSF. Um die Aktivierung der dendritischen Zellen zu verhindern, wurden die Zellen über 12 Tage in den gleichen Platten ausgereift. Am ersten und dritten Tag nach der Präparation wurden nicht adhärente Zellen entfernt. Ab Tag 5 wurde an jedem zweiten Tag 50 % des Mediums entfernt und durch frisches GM-CSF-haltiges Medium ersetzt. Am Tag 12 nach der Präparation wurden die dendritischen Zellen geerntet und der Reifungsgrad und die Reinheit der Kultur durch die Expression von CD11c und CD86 durchflußzytometrisch überprüft. Um eine möglichst reine DC Population zu verwenden, wurden noch verbliebene B- und T-Zellen aus der Kultur durch paramagnetische Kügelchen, die mit anti-CD19- oder anti-CD3-Antikörpern gekoppelt waren, nach Herstellerangaben entfernt.

3.5.2 Präparation von Mausmilzzellen

Die für den T-Zellproliferationsassay benötigten T-Zellen wurden aus Milzzellen von LCMV P14-transgenen C57BL/6 Rag -/- Mäusen gewonnen. Die Milzen wurden mit dem Kolben einer 5 ml Spritze zerrieben, um die Zellen zu vereinzeln und anschließend in 10 ml RPMI aufgenommen und in ein 14 ml-Röhrchen überführt. Größere Organtrümmer setzten sich nach kurzer Zeit am Boden eines 14 ml Röhrchens ab und konnten durch Überführen der Zellsuspension in ein neues Gefäß entfernt werden. Erythrozyten wurden durch eine 5-minütige Inkubation in Erythrozyten-Lysepuffer entfernt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in frischem Medium aufgenommen. Im Anschluß erfolgte eine Plattenadhärenz der Milzzellen für eine Stunde. Die nicht adhärierten Zellen, die die T-Zellen enthielten, wurden geerntet und mit 5 µM CFSE bei 37°C 10 min inkubiert. Die CFSE gefärbten Zellen wurden dreimal gewaschen und ihre erfolgreiche Farbstoffaufnahme wurde durchflußzytometrisch überprüft.

3.5.3 Durchflußzytometrische Untersuchung der CD8 T-Zellproliferation

↓70

Da der Einfluß von US11 auf die Präsentation von Peptiden an MHC-Klasse-I-Molekülen an CD8 T-Zellen untersucht werden sollte, wurden die DCs mit US11 oder LacZ kodierenden Adenoviren infiziert oder blieben uninfiziert. Die Hälfte der DCs wurde mit 5 µg/ml des LCMV-Peptids über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden je 1 x 105 Milzzellen mit jeweils 1 x 104, 2,5 x 104 oder 5 x 104 DCs/Loch in einer 96-Loch-Platte inkubiert. Nach drei Tagen wurde die Proliferation der CD8 T-Zellen durch die Verminderung der grünen Fluoreszenz durchflußzytometrisch bestimmt. Dazu wurde die Kokultur mit PBS gewaschen und unspezifische Bindungsstellen durch eine 20-minütige Inkubation in Blockierungspuffer (PBS 10 % FKS, 1 % Mausserum und 2 mM EDTA) abgesättigt. Die Zellen wurden gewaschen und die T-Zellen wurden eine Stunde mit einem APC-konjugierten CD8α-Antikörper gefärbt. Nach dreimaligem Waschen wurden die Zellen mit dem Durchflußzytometer FACScan (Becton-Dickinson) analysiert. Die Auswertung der Meßdaten erfolgte mit dem Programm „WinList 3.0“. In die Auswertung der Proliferation wurden nur CD8α positive T-Zellen einbezogen.

3.6 Immunzytochemie und Immunfluoreszenzmikroskopie

HEK293A-Zellen wurden auf Kollagen beschichtete Deckgläschen ausgesät und am folgenden Tag transfiziert. 36-48 h nach der Transfektion wurden die immunzytochemischen Färbungen durchgeführt. Dazu wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und danach 20 min mit PBS/5 % Paraformaldehydlösung bei RT fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit 0,1 % TX-100/PBS für 15 min bei RT permeabilisiert. Alternativ erfolgte die Permeabilisierung mit Saponin. Dazu enthielten alle während der Antikörperfärbung verwendeten Puffer 0,5 % Saponin. Unspezifische Bindungen wurden mit PBS/0,5 % BSA, 3 % Ziegenserum für 30 min blockiert. Die anschließenden Färbeschritte wurden in PBS/0,5 % BSA durchgeführt. Zunächst erfolgte die Inkubation mit dem antigenspezifischen Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur. Nach drei bis fünfmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen entweder mit einem Biotin-markierten oder Fluorochrom-markierten anti-Immunglobulin-Antikörper inkubiert. Bei der Kolokalisation von US28 und AP-2 wurden die Zellen zunächst mit dem aus der Maus stammenden anti-Flag-Antikörper M2 inkubiert, gefolgt von einem Esel-anti-Maus-Cy3 konjugierten Antikörper, dann erst wurde der US28-Rezeptor mit dem Biotin-markierten Tub-6 gefärbt. Biotin-markierte Antikörper wurden in einem weiteren Schritt mit Streptavidin/Fluorochrom–Konjugate gefärbt. Nach viermaligem Waschen wurden die Deckgläschen mit Mowiollösung auf den noch feuchten Präparaten fixiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Auswertung erfolgte unter Anleitung von Prof. Dr. Ricardo Hermosilla an einem Zeiss LSM Fluoreszenzmikroskop.

3.7 Metabolische Zellmarkierung mit Radioisotopen

3.7.1  Metabolische Zellmarkierung mit [35S] Methionin/Cystein

5 x 106 Zellen wurden in Methionin- und Cystein-freiem DMEM-Kulturmedium + 2,5 % FKS gewaschen und 30 min bei Kulturbedingungen inkubiert. Danach wurden die Zellen zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen in 2,5 ml des Methionin- und Cystein-freien DMEM-Kulturmedium, das mit 200 µCi [35S] L-Methionin/Cystein versetzt war, für 6 h inkubiert. Vor der weiteren Verwendung wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen.

3.7.2 Metabolische Zellmarkierung mit [3H] Palmitat

↓71

Vor der Verwendung mußte die Ethanol-haltige [3H] Palmitat-Lösung unter N2 getrocknet werden. Das getrocknete [3H] Palmitat wurde in einer Konzentration von 1 mCi/25 µl in DMSO gelöst. HEK293A-Zellen wurden mit CCR5 und US28 transfiziert. 24 h danach wurden die Zellen in serumfreiem Medium für 16 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 4 h in serumfreiem DMEM, welchem 400 µCi/ml [3H] Palmitat und 0,1 % Fettsäure-freies BSA zugesetzt waren, metabolisch markiert.

3.8 Zellextraktion mit Detergenz

Alle Schritte wurden mit eisgekühlten Reagenzien auf Eis durchgeführt.

Adhärente Zellen wurden mit PBS gewaschen und durch vorsichtiges Pipettieren von der Platte gelöst. Die Zellen wurden 3 min bei 2.800 Upm bei 4°C in der Tischzentrifuge pelletiert und in angemessener Menge (ca. 1-107 Zelle/ml) TX-100 haltigem Lysepuffer aufgenommen. Die Zellyse erfolgte für 30 min auf Eis. Zellkerne und unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation in der Tischzentrifuge bei 13.000 Upm 10 min und 4 °C entfernt. Der Zentrifugationsüberstand (Zellsolubilisat) wurde sofort für Immunpräzipitationen eingesetzt oder in 2 x SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen und auf ein SDS- Polyacrylamid-Gel geladen.

3.9 Immunpräzipitation

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Für die Immunpräzipitation von Proteinen aus Zellsolubilisaten wurden Protein A-Sepharose-Kügelchen mit den Protein-spezifischen Antikörpern beladen. Zellsolubilisate von radioaktiv markierten Zellen wurden zweimal mit Hitze inaktivierten Staph. aureus und 5 µl normalem Mausserum für 30 min bei 4 °C unter Rotation inkubiert, um unspezifisch bindende Moleküle zu entfernen. Bei Immunpräzipitationen, denen ein Immunblot folgte, entfiel dieser Schritt. Es folgte eine Inkubation der vorgereinigten Zellsolubilisate mit den antikörperbeladenen Protein A-Kügelchen für 2 h bei 4 °C unter Rotation. Anschließend wurden die Kügelchen vier- bis fünfmal in kaltem Lysepuffer gewaschen und in 100 µl 2 x SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen. Die Proben wurden auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel geladen und aufgetrennt.

3.10 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE wurde im Wesentlichen nach der von Laemmli 1970 beschriebenen Methode in einem diskontinuierlichen Puffersystem mit Trenngelen von 12,5 % Acrylamidgehalt durchgeführt. Bei dieser Methode werden Proteine durch die Kombination von oberem Sammelgel und unterem Trenngel an der Grenzschicht fokussiert, wodurch die Proteinbanden schärfer ausfallen als bei reinen Trenngelen. Die Fokussierung der Proben erfolgte in einem 3,5 %-igen Sammelgel. Die Proben wurden vor dem Auftrag auf das Gel in 2 x SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen. Chemokinrezeptor enthaltende Proben wurden, wenn nicht anders angegeben, nicht auf 95 °C erhitzt. Alle anderen nachzuweisenden Proteine wurden 5 min bei 95 °C erhitzt und anschließend auf Eis gekühlt, bevor sie auf das Gel geladen wurden. Die Elektrophorese eines 13 x 16 cm Geles erfolgte bei konstanter Spannung 65 V für 14 h-16 h bei RT.

3.10.1  Autoradiographie

SDS-Polyacrylamid-Gele wurden nach der Gelelektrophorese zur Entwässerung zweimal 30 min in DMSO inkubiert und anschließend 1h in einer gesättigten PPO/DMSO-Lösung geschwenkt. Danach wurden die Gele 20 min gewässert, bevor sie auf Filterpapier gelegt und 90 min bei 75 °C unter Vakuum getrocknet wurden. Radioaktiv markierte Proteinbanden wurden durch Exposition von Röntgenfilmen auf den getrockneten Gelen bei –80°C und anschließender photographischer Entwicklung sichtbar gemacht.

3.11 Immunblots

3.11.1  Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembranen (Westernblot)

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Der Transfer von Proteinen aus dem Polyacrylamidgel auf Nitrozellulosemembranen wurde im Naßverfahren in einer Tank-Blot-Apparatur (Biorad) durchgeführt. Dazu wurde das Polyacrylamidgel direkt nach beendeter Gelelektrophorese einige Minuten in Transferpuffer inkubiert. Drei Filterpapiere und ein Membranstück entsprechend der Gelgröße wurden ausgeschnitten. Das Membranstück wurde ebenfalls einige Minuten in Transferpuffer inkubiert. Es wurde ein Stapel bestehend aus einem feuchten Schwamm, zwei feuchten Filterpapieren, dem Polyacrylamidgel, der Membran, einem weiteren feuchten Filterpapier und abschließend einem feuchten Schwamm gemäß Herstellerangaben in die Blotapparatur eingespannt. Es wurde darauf geachtet, daß die einzelnen Bestandteile des Stapels luftblasenfrei aufeinander lagen. Die Blotkammer wurde mit Transferpuffer gefüllt und der Transfer wurde bei 400 mA für 2 h durchgeführt.

3.11.2 Immunfärbung von Proteinen

Alle Inkubationsschritte wurden unter Schütteln für 1h bei RT durchgeführt. Davon abweichend erfolgte die Inkubation des primären Antikörpers bei 4°C über Nacht. Nach dem Proteintransfer wurde die Nitrozellulosemembran in PBS/T, 5 % Milchpulver inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen. Die Inkubation mit dem Primärantikörper (Hybridomüberstände 1:3-1:10 v/v) erfolgte in 5 % Milchpulver. Anschließend wurden die Membranen dreimal 5 min in PBS/T gewaschen und mit Peroxidase gekoppeltem Sekundärantikörper (1:5000 in 5 % Milchpulver) inkubiert. Vor Durchführung des Chemilumineszenz-Nachweises wurden die Membranen viermal mindestens 10 min in PBS/T gewaschen.

3.11.3 Immundetektion von Mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK) im Immunblot

Im Gegensatz zu der zuvor beschriebenen Immunfärbung wurde die Immundetektion der MAPK mit Hilfe Phospho-(MAPK)-spezifischer Antikörper in TBST/T durchgeführt. Die Nitrozellulosemembran wurde nach dem Proteintransfer 1h in TBS/T 5 % Milchpulver (w/v) bei RT langsam geschüttelt. Die Membran wurde dreimal gewaschen und über Nacht mit dem phosphospezifischen Antikörper (1:1000 in TBS/T; 5 % BSA) bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran dreimal für 10 min mit TBS/T gewaschen und anschließend mit dem Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (1:1000 in TBS/T; 5 % Milchpulver) für 1h bei RT unter Schütteln inkubiert. Vor Durchführung des Chemilumineszenz-Nachweises wurden die Membranen mindestens viermal für 10 min in TBS/T unter leichtem Schütteln gewaschen.

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Zum Nachweis, daß gleiche Proteinmengen geladen wurden, wurden die gebundenen Nachweisantikörper nach der Durchführung des Chemilumineszenz-Nachweises zunächst von der Membran entfernt. Dazu wurden die Membranen nochmals mit TBS/T gewaschen und anschließend mit 0,1 M Glycin pH 2,7 für 30 min unter Schütteln bei RT inkubiert. Die Membran wurde mit ddH2O gespült und mit TBS/T; 5 % Milchpulver wurden unspezifische Bindungen abgesättigt. Es folgte eine Immunfärbung mit Antikörpern, die sowohl die phosphorylierten als auch nicht phosphorylierten Formen der MAPK erkennen.

3.11.4 Chemilumineszenz-Nachweis

Die Chemilumineszenz-Methode diente zum Nachweis von Proteinbanden in Immunoblots, die mit Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörpern angefärbt wurden. Der Nachweis wurde mit Hilfe der „ECL“-Reagenzien (Amersham) nach Herstellerangaben durchgeführt. Dazu wurden 0,1 ml des 1:1 Gemisches (v/v) der Reagenzien 1 und 2 pro cm2 Membran eingesetzt. Die Membran wurde 1 min mit dem Lösungsgemisch inkubiert, das Gemisch wurde abgetropft und die Membran zwischen zwei Klarsichtfolien eingeschlagen. Anschließend wurde ein Röntgenfilm in einer Filmkassette 30 s bis 30 min auf der eingeschlagenen Membran exponiert und danach entwickelt.

3.12 Bestimmung der NF-κB-Aktivierung mit Hilfe des Luziferase-Assays

Die Messung der NF-κB-abhängigen Transkription wurde mit Hilfe des Luziferase-Reporter- Plasmides „6NF-κBtkluc.neo“ (Bergmann 1998) durchgeführt. Das Plasmid enthält oberhalb des Luziferasegens sechs Wiederholungen der NF-κB-Bindungssequenz (GGGACTTTCC) und eine minimale Thymidinkinasepromotorsequenz. Nach Aktivierung vermittelt NF-κB die Transkription des Luziferasegens. Als interne Kontrolle für Variationen in den Versuchsbedingungen, wie z.B. Zellzahl, Transfektionseffizienz, wurde eine weitere Luziferase unter Kontrolle eines Thymidinkinasepromotors transfiziert (pRL-TK). Die Aktivität der beiden Luziferasen kann unabhängig voneinander bestimmt werden.

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HEK293A-Zellen wurden in 6-Loch-Platten so ausgesät, daß sie am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 50 % erreichten. Es wurden verschiedene Plasmide mit der Kalziumphosphatmethode kotransfiziert :

Nach 24 h wurden die Zellen mit PBS gewaschen und für 6 h in serumfreiem Medium unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in PBS gewaschen und in 250 µl „Passive Lysis Buffer“ (Promega) 30 min auf einem Schwenktisch lysiert und bis zur Messung der Luziferaseaktivität bei –20 °C gelagert. Jeweils 20 µl des Lysates und je 50µl der Reagenzien I und II des Dualen Reporter Assay Kits wurden pro Messung im Luminometer verwendet. Reagenz I ermöglicht die Messung der Aktivität der Luziferase, die unter Kontrolle von NF-κB steht. Die Zugabe des Reagenz II unterdrückt diese Aktivität, erlaubt aber die Messung der Aktivität der zweiten, der Renilla-Luziferase. Die spezifische, NF-κB-abhängige Aktivität ergibt sich aus dem Quotienten aus der Aktivität der NF-κB-abhängigen Luziferase und der Renilla-Luziferase.

3.13  Internalisierung von [125I]-markiertem RANTES

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HEK293A-Zellen wurden 24 h nach der Transfektion gewaschen und in einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Loch in einer 24-Loch-Zellkulturplatte ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen in kaltem Bindungsmedium gewaschen und nach der Zugabe von 250 µl kaltem BM, das 125 pM [125I]-RANTES enthielt, für 2 h auf Eis inkubiert. Danach wurde das Medium entfernt und nicht gebundener Ligand durch zweimaliges Waschen mit kaltem BM entfernt. Anschließend wurde warmes BM zu allen Zellen, mit Ausnahme der Zellen für den Zeitpunkt t=0 min gegeben. Danach erfolgte die Internalisierung von Zelloberflächen-gebundenem [125I]-RANTES bei 37 °C und normaler Atmosphärenumgebung. Nach 10 und 60 min wurden die Platten zur Beendigung des Internalisierungsvorgangs auf Eis gestellt und mit eiskaltem BM gewaschen, um nicht gebundenes [125I]-RANTES zu entfernen. Pro Zeitpunkt wurden vier Löcher verwendet. Zwei Löcher wurden erneut zweimal mit kaltem BM gewaschen und in 400 µl 0,2 M NaOH lysiert. Von diesen Lysaten wurde die „Gesamte zellassoziierte Aktivität“ bestimmt. Die verbliebenen 2 Löcher wurden zweimal für 4 min mit gekühltem, saurem Medium gewaschen, um Zelloberflächen-gebundenes [125I]-RANTES zu entfernen. Die Zellen wurden ein weiteres mal mit BM gewaschen und in 400 µl 0,2 M NaOH lysiert („Säure-resistente Aktivität“). Alle Zellysate wurden in 0,5 ml Reaktionsgefäße überführt und in einem Gammazähler analysiert. Die Internalisierung wurde als der prozentuale Anteil der „Säure-resistenten Aktivität“ (internalisiert) an der „Gesamten zellassoziierten Aktivität“ nach Abzug der Hintergrund-Aktivität zum Zeitpunkt t=0 min berechnet.


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01.12.2006