4 Ergebnisse

4.1  Rolle des HCMV-kodierten US11-Proteins auf die DC-vermittelte Aktivierung von T-Zellen

4.1.1  US11 vermindert die Expression von Maus-MHC-Klasse-I-Molekülen

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Virus-spezifische zytotoxische T-Zellen besitzen eine zentrale Bedeutung bei der Abwehr viraler Infektionen. Sie erkennen infizierte Zellen, da diese virale Peptide an der Zelloberfläche auf MHC-Klasse-I-Molekülen präsentieren. Das HCMV-kodierte Protein US11 ist im ER lokalisiert und bewirkt dort das Ausschleusen neu synthetisierter MHC-Klasse-Moleküle ins Zytoplasma, wo sie ubiquitiniert und durch das Proteasom abgebaut werden. Da bei den folgenden Untersuchungen das US11-Protein des humanen CMV verwendet wurde, sollte zunächst geprüft werden, ob US11 ebenfalls die Expression von Maus-MHC-Moleküle vermindert. Dazu wurden MCA-205-Zellen (H2-Kb, H2-Db) mit rekombinanten Adenoviren infiziert, die jeweils für das US11-Protein oder die LacZ als Kontrollprotein kodierten. Nach 48 h wurde die Expression der MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche der infizierten Zellen durchflußzytrometrisch bestimmt. Die Infektion mit dem Kontrolladenovirus führte zu einer leicht erhöhten Expression der H2-Kb-MHC-Allele. Aber bereits bei einer MOI von 30 konnte eine Verminderung sowohl der H2-Db als auch der H2-Kb MHC-Klasse-I-Moleküle nach Infektion mit dem für US11-kodierenden Adenovirus beobachtet werden (Abb. 4.1). Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß durch das humane Zytomegalivirus kodierte US11-Protein ebenfalls die Expression der Maus-MHC-Klasse-I-Moleküle vermindert wird.

4.1.2 Die Expression des US11-Proteins in dendritischen Zellen vermindert die Expression von H2-Db-Molekülen

Die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen wird durch Antigen-präsentierende Zellen, wie Monozyten und Makrophagen oder DCs, vermittelt. Unreife DCs nehmen virale Antigene auf, die aus apoptotischen Zellen freigesetzt werden, und wandern über die afferenten Lymphbahnen zu einem drainierenden Lymphknoten. Dort präsentieren sie die viralen Antigene auf

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Abb. 4.1. Die Expression des US11-Proteins bewirkt die Abnahme von Maus-MHC-Klasse-I-Moleküle H2-Kb und H2-Db auf der Zelloberfläche von MCA-205-Zellen.

MCA-205-Zellen wurden mit einer MOI von 30 mit Adenoviren infiziert, die für US11 oder β-Galaktosidase (LacZ) kodierten. Die Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle H2-Kb und H2-Db der MCA-205-Zellen durch US11wurde 48 h nach der Adenovirusinfektion mittels MHC-spezifischer Antikörper durchflußzytometrisch bestimmt.

MHC-Molekülen und stimulieren die Aktivierung naiver zytotoxischer T- Zellen durch die
Koexpression kostimulatorischer Moleküle wie CD80 und CD86. Um zu bestimmen, ob die verminderte Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle durch das US11-Protein eine Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen beeinflußt, wurde zunächst untersucht, ob US11 ebenfalls die Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle in dendritischen Zellen vermindert. Dazu wurden DCs mit den rekombinanten Adenoviren, die für US11 oder LacZ kodierten, infiziert. Die Expression ihrer MHC-Klasse-I-Moleküle wurde durchflußzytometrisch nach einer Immunfärbung bestimmt. Im Gegensatz zu der MCA-205-Zellinie konnte bei den primären dendritischen Zellen nur eine geringere Verminderung der Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle nachgewiesen werden (Abb. 4.2). Dabei zeigte sich, daß die einzelnen MHC-Klasse-I-Allele unterschiedlich stark beeinflußt wurden. So war die Expression von H2-Db deutlich stärker vermindert als die der H2-Kb-Moleküle.

Abb. 4.2. US11 bewirkt eine verminderte Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen nach Infektion dendritischer Zellen.

DCs wurden nach 12-tägiger Kultur mit GM-CSF aus Knochenmarksvorläuferzellen gewonnen und mit den angegebenen MOIs eines US11 oder LacZ kodierenden Adenovirus infiziert. Die Reinheit der DC-Kultur wurde durchflußzytometrisch durch die Doppelfärbung von CD11c (spezifische Anfärbung dendritischer Zellen in der Maus) und CD86 (kostimulatorisches Molekül, Zeigermolekül für die Ausreifung der DCs) nach der Infektion mit den Adenoviren bestimmt. Die Expression der MHC-Moleküle wurde durchflußzytometrisch analysiert.

4.1.3 Die Proliferation von zytotoxischen T-Zellen wird nicht durch US11-Expression in DCs beeinflußt

↓78

In dem folgenden Ansatz sollte überprüft werden, in wie weit die Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle durch das US11-Protein einen Einfluß auf die Aktivierung (Proliferation) von zytotoxischen T-Zellen hat. Da nach Infektion der DCs mit dem für US11 kodierenden Adenovirus H2-Db-Moleküle stärker beeinflußt waren, wurden dabei zytotoxische T-Zellen verwendet, die selektiv nur durch ein spezifisches Modellpeptid (gp33 des P14-Proteins des LCMV) auf H2-Db-Moleküle aktiviert werden. Für das Experiment wurden Maus-DCs mit einem für das US11-Protein-kodierenden Adenovirus oder einem Kontrolladenovirus (LacZ)

Abb. 4.3. Die Reduktion der MHC-Klasse-I-Moleküle durch die Expression von US11 in dendritischen Zellen hat keinen Einfluß auf die LCMV P-14 induzierte T-Zellproliferation.

Dendritische Zellen wurden aus Knochenmarksvorläuferzellen in 12-tägiger Kultur ausgereift und mit rekombinanten Adenoviren, die für LacZ und U11 kodieren, infiziert oder sie blieben uninfiziert. Die Hälfte der einzelnen DC-Ansätze wurden 4 h nach der Infektion mit dem gp33-Peptid des P14-Proteins des LCMV beladen. Am nächsten Tag wurden pro Ansatz die angegebene Anzahl dendritischer Zellen in 100 µl in eine 96-Lochplatte pipettiert und mit 1 x 105 CFSE markierten Milzzellen für 3 Tage kokultiviert. Die grau unterlegten Graphen zeigen die Proliferation CD8-positiver zytotoxischer T-Zellen, die mit der angegebenen Anzahl DCs in Anwesenheit des spezifischen Peptids kultiviert wurden, während die T-Zellen der offenen Graphen ohne das spezifische Peptid mit der angegebenen Zahl der DCs kultiviert wurden.

infiziert oder sie blieben uninfiziert. Die DCs wurden über Nacht mit dem Modellpeptid beladen und über 3 Tage mit Milzzellen der gp33-T-Zellrezeptor-transgenen C57/BL6-RAG -/- Mäuse kokultiviert. Die Milzzellen wurden vor der Kokultur mit dem Farbstoff CFSE markiert und ihre Proliferation wurde durchflußzytometrisch als Abnahme der Intensität dieses Farbstoffes gemessen. Der Farbstoff CFSE wird bei jeder Zellteilung gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt. Da nicht bekannt war, ob das Verhältnis zwischen DCs und T-Zellen die Proliferation der zytotoxischen T-Zellen beeinflußt, wurden jeweils 1x105 Milzzellen mit verschiedenen DC-Zellzahlen (1:10; 1:4; 1:2 DC:Milzzellen) inkubiert. Als Negativ-Kontrolle wurden DCs verwendet, die nicht mit Peptid beladen wurden (Abb. 4.3 offene Kurven).

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Überraschenderweise proliferierten die zytotoxischen T-Zellen (ausgefüllte Graphen) während der Kokultur mit uninfizierten DCs in Abhängigkeit von der DC-Zahl (Abb. 4.3). Dabei wurde ihre Proliferation durch eine höhere Anzahl von DCs negativ reguliert.

Nach der Kokultur der zytotoxischen T-Zellen mit Adenovirus-infizierten DCs konnte kein Unterschied in der Proliferation der T-Zellen zwischen US11- oder LacZ-exprimierenden DCs festgestellt werden. Aufgrund dieser Beobachtungen kann geschlossen werden, daß die Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle auf dendritschen Zellen durch die Expression von US11 nicht ausreichend war, eine durch Zugabe eines Modellpeptides vermittelte Proliferation peptidspezifischer T-Zellen zu hemmen.

4.2  Molekulare Untersuchungen des US28-Rezeptors

4.2.1  US28 weist eine vorwiegend intrazelluläre Verteilung auf

Der US28-Rezeptor vermittelt sowohl Liganden-abhängig als auch Liganden-unabhängig die Aktivierung zellulärer Signalwege. Dies erfordert die Expression des Rezeptors an der Zelloberfläche. Überraschenderweise konnte jedoch in mikroskopischen Untersuchungen nur eine intrazelluläre Lokalisation des US28-Rezeptors in HEK293A-Zellen beobachtet werden.

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Untersuchungen am humanen RANTES-Rezeptor CCR5 und an weiteren GPCRs zeigten, daß diese Rezeptoren im unstimulierten Zustand eine Verteilung vorwiegend an der Zelloberfläche aufweisen. Die Stimulation mit dem Liganden RANTES bewirkte jedoch eine Umlagerung des CCR5-Rezeptors in vesikuläre Strukturen in der Zelle (Abb. 4.4). Ebenso wie CCR5 nach der Stimulation mit seinem Liganden befindet sich der unstimulierte US28-Rezeptor vorwiegend in intrazellulären Vesikeln. Desweiteren wurde eine Lokalisation des US28-Rezeptors in anderen kernnahen Kompartimenten der Zelle gefunden (Abb. 4.4). Diese Kompartimente können möglicherweise das endoplasmatisches Retikulum (ER) oder den Golgiapparat darstellen. Eine Lokalisation des US28-Rezeptors an der Zellmembran konnte mikroskopisch jedoch nicht beobachtet werden.

Eine vergleichbare Beobachtung der vorwiegend intrazellulären Verteilung des US28-Rezeptors wurde mit Hilfe von US28-GFP- oder US28-CD4-Fusionsproteinen gemacht (Fraile-Ramos et al., 2001). Mit Hilfe dieser US28-CD4-Fusionsproteine konnte zusätzlich eine konstitutive Internalisierung (ohne Liganden) des US28-Rezeptors gezeigt werden, die als grundlegender Mechanismus des vorwiegend intrazellulären Vorkommens angenommen wird.

Abb. 4.4. Der US28-Rezeptor weist eine vorwiegend intrazelluläre, vesikuläre Verteilung auf.

4.2.2 US28 vermittelt eine konstitutive Umlagerung von β-Arrestin-2-GFP in vesikuläre Strukturen

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Da die konstitutive Internalisierung des US28-Rezeptors als Ursache für eine vorwiegend intrazelluläre Verteilung angenommen wird, sollten die molekularen Mechanismen der Internalisierung des US28-Rezeptors untersucht werden. Viele GPCRs internalisieren über Clathrin-umhüllte Vesikel (CCV). Dabei bewirkt die Aktivierung des Rezeptors durch seinen Liganden seine Phosphorylierung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRK), wodurch die Affinität des Rezeptors für Arrestin-Moleküle erhöht wird. Arrestin-Moleküle vermitteln dann den Transport des Rezeptors zu bereits vorhandenen Clathrin-Bereichen, die im Anschluß mit dem Rezeptor internalisiert werden. Für den Chemokinrezeptor CCR5 wurde bereits eine β-Arrestin-abhängige Internalisierung beschrieben (Aramori et al., 1997). Die Analyse fixierter und permeabilisierter HEK293A-Zellen nach Kotransfektion von CCR5 und β-Arrestin ergab eine zytoplasmatische Verteilung von β-Arrestin in unstimulierten Zellen. Die Stimulation mit 30 nM RANTES führte zu einer Umlagerung von β-Arrestin-2-GFP an die Plasmamembran und in intrazelluläre Vesikel (Abb. 4.5.). Im Gegensatz zu CCR5 kotransfizierten Zellen befand sich β-Arrestin-2-GFP in den mit US28-Rezeptor transfizierten Zellen konstitutiv, d.h. ohne externe Stimulation durch einen Liganden, in vesikulären Strukturen. In einigen Zellen

Abb. 4.5. US28 vermittelt eine konstitutive Umlagerung von β-Arrestin in vesikuläre Strukturen.

HEK293A-Zellen wurden mit β-Arrestin-2-GFP und CCR5, US28 wt oder US28 wt und Dynamin K44A kotransfiziert. 36 h nach der Transfektion wurden CCR5 transfizierte Zellen mit 30 nM RANTES für 30 min bei 37°C stimuliert oder blieben unstimuliert. Gezeigt ist die subzelluläre Lokalisation von β-Arrestin-2-GFP und Rezeptor kotransfizierten Zellen. Die Pfeile weisen auf vesikuläre Strukturen hin. Der Maßstab entspricht 10 µm.

konnte eine Akkumulation von β-Arrestin-GFP in größeren Kompartimenten in der Zelle beobachtet werden (Abb. 4.5.). Diese Kompartimente können möglicherweise Recyclingendosomen darstellen. Da aus den mikroskopischen Beobachtungen nicht geschlossen werden konnte, ob der US28-Rezeptor die Umlagerung der β-Arrestin-Moleküle ebenso wie CCR5 über die Internalisierung von der Plasmamembran vermittelt, wurde eine dominant negative Mutante für Dynamin, Dynamin K44A, kotransfiziert. Diese Mutante verhindert die vom wt vermittelte Abschnürung der Clathrin-Vesikel von der Plasmamembran. Die Kotransfektion der Dynamin Mutante K44A bewirkte eine Anreicherung von β-Arrestin-2-GFP an der Plasmamembran (Abb. 4.5.). Somit kann geschlossen werden, daß die Umlagerung der β-Arrestin-Moleküle in vesikuläre Strukturen ebenso wie bei CCR5 über die Plasmamembran vermittelt wird.

4.2.3 US28 und β-Arrestin-2-GFP befinden sich in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten

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β-Arrestin-Moleküle wirken als Adaptermoleküle, die den aktivierten Rezeptor mit Komponenten der Endozytosemaschinerie wie AP-2 und Clathrin verbinden. Weiterhin regulieren sie die Zeitspanne, in welcher der internalisierte Rezeptor dephosphoryliert wird und wieder zurück an die Plasmamembran recycelt (Shenoy und Lefkowitz, 2003;Shenoy et al., 2001). Basierend auf dem Bindungsvermögen an die unterschiedlichen Arrestin-Moleküle können GPCRs in zwei Gruppen eingeteilt werden. Klasse-A-Rezeptoren (µ-opioid-, β2- und α1b-adrenerger, Endothelin A- und Dopamin-D1A-Rezeptor) besitzen eine höhere Affinität zu β-Arrestin-2-Molekülen als zu β-Arrestin-1-Molekülen. Bei diesen Rezeptoren vermitteln Arrestin-Moleküle die Internalisierung des Rezeptors, dissoziieren aber vom Rezeptor während der Internalisierung oder bereits an der Plasmamembran. Im Gegensatz dazu binden Klasse-B-Rezeptoren (Substanz P-, Angiotensin AT1A-, Neurotensin 1- und Vasopressinrezeptor 2) an β-Arrestin-1- und β-Arrestin-2-Moleküle mit gleicher Affinität. Diese Rezeptoren internalisieren als Einheit mit den β-Arrestin-Molekülen in Endosomen (Oakley et al., 2001;Oakley et al., 2000). Um eine mögliche Wechselwirkung des US28-Rezeptors und β-Arrestin-2-GFP zu untersuchen, wurden HEK293A-Zellen mit der cDNA beider Moleküle kotransfiziert und ihre Verteilung in der Zelle mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet. Dabei wurde der humane Chemokinrezeptor CCR5 als Kontrolle verwendet, da bekannt war, daß er Arrestin-abhängig internalisiert (Aramori et al., 1997). 36 h nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert und die Rezeptoren durch Antikörper nachgewiesen. In CCR5-transfizierten Zellen konnte wie erwartet nach Stimulation mit dem Liganden RANTES eine Kolokalisation von Rezeptor und β-Arrestin-2-GFP nachgewiesen werden (Abb. 4.6). Die Kolokalisation des Rezeptors (rot) und β-Arrestin-2-GFP (grün) ist in der Überlagerung der Abbildung durch gelb gefärbte Strukturen erkennbar (Abb. 4.6 merge). Im Gegensatz dazu konnte eine Kolokalisation des US28-Rezeptors und β-Arrestin-2-GFP-Molekülen nicht beobachtet werden.

4.2.4 Herstellung der phosphorylierungsdefizienten Mutanten

Zahlreiche GPCRs internalisieren abhängig von Arrestin-Molekülen über CCV. Die Voraussetzung für die Bindung des Rezeptors an Arrestin-Moleküle ist eine Phosphorylierung C-terminaler Phosphoakzeptorstellen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) oder durch sogenannte second messenger Kinasen wie PKC oder PKA (siehe Übersichten in Luttrell und Lefkowitz, 2002; Ferguson, 2001). Für den Chemokinrezeptor CCR5 konnte kürzlich gezeigt werden, daß mindestens drei der vier C-terminalen Serinreste phosphoryliert sein müssen, um nach Stimulation mit dem Liganden die Umlagerung von β-Arrestin zur Plasmamembran und damit die Internalisierung des Rezeptors zu bewirken (Huttenrauch et al., 2002). Als mögliche Ursache für die konstitutive Umlagerung von β-Arrestin-Molekülen an

Abb. 4.6.: Fehlende Kolokalisation zwischen dem US28-Rezeptor und β-Arrestin-2-GFP.

Konfokale Mikroskopie von HEK293A-Zellen 36 h nach der Kotransfektion von β-Arrestin-2-GFP (grün), CCR5 oder US28 (rot). Die CCR5-transfizierten Zellen wurden vor der Färbung mit dem Maus anti-CCR5-Antikörper für 30 min bei 37 °C mit 30 nM RANTES stimuliert. Die Immunfärbung des US28-Rezeptors erfolgte durch den US28 spezifischen Antikörper Tub-06. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente für den US28-Rezeptor. Der Maßstab entspricht 10 µm.

↓83

Abb. 4.7. Schematische Darstellung der C-terminalen Aminosäuresequenz des US28-Rezeptors.

Die 12 Serinreste wurden aufeinanderfolgend von 1-12 nummeriert und in den verschiedenen Gruppen (grau unterlegt) durch Alaninreste ersetzt.

Abb. 4.8. Der Austausch der C-terminalen Serinreste beeinflußt das Migrationsverhalten des Rezeptors in der SDS-PAGE.

HEK293A-Zellen wurden mit CXCR5, US28 wt, US28 S1-2A, US28 S3-5A, US28 S6-8A, US28 S9-12A, US28 S3-8A, US28 S3-12A und US28 S1-12A transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen in TX-100-haltigem Puffer lysiert und auf ein 12,5 %-iges SDS-PAGE-Gel geladen. Die Proteine wurden auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert und anschließend wurde die US28-Expression mit dem mAk Tub-45 in einer Immunfärbung analysiert.

die Plasmamembran sowie ihre anschließende Umlagerung in vesikuläre Strukturen durch den US28-Rezeptor kann die konstitutive Phosphorylierung des US28-Rezeptors angesehen werden. Diese wurde in Kooperation mit Thilo Mokros untersucht (Mokros et al., 2002; Mokros, 2004).

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Um den Einfluß der C-terminalen Phosphorylierungsstellen des US28-Rezeptors auf die Umverteilung der β-Arrestin-Moleküle zu untersuchen, sollten Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr phosphoryliert werden. Aufgrund der Phosphoaminosäureanalyse konnte eine Phosphorylierung von Tyrosinresten ausgeschlossen werden (Mokros et al., 2002). Der C-Terminus des US28-Rezeptors enthält 12 Serin- und 2 Threoninreste, die in Gruppen ausgetauscht wurden. Dabei wurde die Mutante, bei der die ersten beiden Serinreste durch Alaninreste ersetzt waren, als S1-2A bezeichnet und alle weiteren entsprechend benannt (Abb. 4.7). Posttranslationale Modifikationen wie die Rezeptor-Phosphorylierung können das Laufverhalten von Proteinen in Acrylamidgelen beeinflussen. Um einen Hinweis auf die realisierten Phosphorylierungsstellen zu bekommen, wurden HEK293A-Zellen mit US28 wt und den verschiedenen Mutanten transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden sie in TX-100-haltigem

Abb. 4.9.: Die C-terminale Phosphorylierung des US28-Rezeptors und das konservierte DRY-Motiv regulieren die Umlagerung von β-Arrestin-2-GFP in vesikuläre Strukturen.

Konfokale Mikroskopie von HEK293A-Zellen 36 h nach der Transfektion mit β-Arrestin-2-GFP und US28 wt, US28 S1-12A oder US28 R129A. Dargestellt ist die subzelluläre Lokalisation von β-Arrestin-2-GFP Rezeptor-kotransfizierten Zellen. Der Maßstab entspricht 10 µm.

Puffer lysiert und auf eine SDS-PAGE geladen. Mittels eines Immunblots wurden die US28-spezifischen Banden sichtbar gemacht. Die Mutante US28 S9-12A migrierte schneller als die US28 wt Bande, wodurch eine starke Verminderung der Phosphorylierung dieser Mutante sowie der darauf basierenden Varianten (vgl. Abb. 4.7.) vermutet werden konnte (Abb. 4.8).

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Dieser erste Hinweis wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Mokros bestätigt, da bei der metabolischen Markierung mit [32P] der US28-Varianten nach Überexpression in HEK293A-Zellen diese Mutanten neben der US28 STA-Mutante den geringsten Einbau von [32P] aufwiesen (Mokros et al., 2002).

4.2.5 Die durch den US28-Rezeptor vermittelte Umlagerung von Arrestin-Molekülen wird durch die Phosphorylierung und das DRY-Motiv bestimmt

Um zu untersuchen, ob die Phosphorylierung der C-terminalen Serinreste des US28-Rezeptors die Umlagerung von β-Arrestin in vesikuläre Strukturen reguliert, wurden US28 wt oder die phosphorylierungsdefiziente Mutante US28 S1-12A mit β-Arrestin-2-GFP kotransfiziert. Die Zellen wurden 36 h nach der Transfektion fixiert und permeabilisiert und mit einem US28-spezifischen Antikörper gefärbt. Wie in der Abb. 4.9. zu sehen ist, konnte keine konstitutive Umlagerung von β-Arrestin-GFP in vesikuläre Strukturen durch die Kotransfektion der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 S1-12A beobachtet werden.

Neben der Rezeptorphosphorylierung wird die Arrestin-Bindung durch ein weiteres strukturelles Motiv von GPCRs, das DRY-Motiv, reguliert (Huttenrauch et al., 2002). Es befindet sich an der Grenze zwischen der dritten Transmembrandomäne und der zweiten intrazellulären Schleife. Um zu überprüfen, ob das DRY-Motiv des US28-Rezeptors die Arrestin-Umlagerung beeinflußt, wurde der Argininrest an Position 129 des US28-Rezeptors gegen einen Alaninrestausgetauscht (US28 R129A). Die Mutante wurde mit β-Arrestin-2-GFP kotransfiziert, nach 36 h wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und der US28-Rezeptor mit dem Antikörper Tub-45 nachgewiesen. Auch bei dieser Mutante konnte im Gegensatz zum wt-Rezeptor keine Umlagerung von Arrestin-Molekülen in US28 R129A exprimierenden Zellen nachgewiesen werden (Abb. 4.9).

4.2.6 Das DRY-Motiv reguliert die konstitutive und Liganden induzierte Signalleitung des US28-Rezeptors

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Von GPCRs, die ein DRY-Motiv besitzen, ist bekannt, daß es nicht nur ein notwendiges strukturelles Motiv für die Arrestin-Bindung ist, sondern darüber hinaus die Aktivierung von Signalkaskaden durch die Rezeptoren reguliert. Da der US28-Rezeptor sowohl konstitutiv, als auch nach Stimulation mit dem Chemokin RANTES die Aktivierung verschiedener Signalwege bewirkt, sollte der Einfluß des DRY-Motivs auf die konstitutive und Liganden-vermittelte Signalleitungsprozesse überprüft werden.

4.2.6.1  Das DRY-Motiv des US28-Rezeptors reguliert die konstitutive Aktivierung von NF-κB

Die transiente Expression des US28 wt-Rezeptors führt in COS-7-Zellen zu einer konstitutiven, d.h. Liganden-unabhängigen Aktivierung von NF-κB und Phospholipase C, die durch G-Proteine des Gαq-Typs reguliert wird (Casarosa et al., 2001). Um zu überprüfen, ob das DRY-Motiv des US28-Rezeptors für die konstitutive Aktivierung von NF-κB notwendig ist, wurde ein Luziferase-Reporter-Assay durchgeführt. Dazu wurde das Reporterplasmid 6NF-κBtkluc mit steigender Menge (10 ng, 50 ng, 100 ng) des US28 wt- oder US28 R129A- Plasmides kotransfiziert, wobei die Gesamtmenge der transfizierten cDNA in den einzelnen Ansätzen konstant blieb. Als Negativkontrolle wurde der humane Chemokinrezeptor CXCR5 verwendet. Verglichen mit CXCR5-transfizierten Zellen, die ohne Stimulation mit dem Liganden BCA

Abb. 4.10. Die konstitutive Aktivierung von NF-κB wird durch das DRY-Motiv des US28-Rezeptors reguliert.

Bestimmt wurde die konstitutive Aktivierung von NF-κB durch den US28-Rezeptor in einem dualen Luziferase Reporter Assay. HEK293A-Zellen wurden transient mit 6NF-κBtkuc, pRL-TK und entweder CXCR5, US28 wt oder US28 R129A transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen für 6 h in serumfreiem Medium kultiviert, anschließend lysiert und bis zur Messung eingefroren. Die Luziferaseaktivität wurde in einem Luminometer als Maß der NF-κB-abhängigen Luziferaseexpression bestimmt. Die angegebenen Werte entsprechen der relativen Luziferaseaktivität bezogen auf unstimulierte CXCR5 transfizierte Zellen. Angegeben sind die Mittelwerte ± S.D. von drei unabhängigen Experimenten.

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eine Aktivierung von NF-κB vermitteln, führte die Transfektion des US28 wt-Plasmids in den HEK293A-Zellen zu einer konzentrationsabhängigen Liganden-unabhängigen Aktivierung von NF-κB. Im Gegensatz dazu konnte bei der Transfektion der US28 R129A-Mutante keine Aktivierung von NF-κB festgestellt werden (Abb. 4.10). Diese Beobachtungen zeigen, daß die konstitutive Aktivierung von NF-κB durch US28 über das DRY-Motiv reguliert wird. Es kann vermutet werden, daß hierfür eine vom DRY-Motiv regulierte Kopplung von G-Proteinen an den US28-Rezeptor verantwortlich ist.

4.2.6.2  Das DRY-Motiv des US28-Rezeptors vermittelt die RANTES-induzierte Aktivierung von MAPK

Die Stimulation des US28-Rezeptors mit seinem Liganden RANTES führt über eine Kopplung an Gαi- und Gα16-Proteinen zur Aktivierung der extrazellulär regulierten Kinase (ERK) 2 (Billstrom et al., 1998). ERK 2 gehört zur Familie der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK). Ihre Aktivierung verläuft über eine Phosphorylierung der Kinasen, wodurch sie im Anschluß vom Zytoplasma in den Zellkern transportiert werden.

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Abb. 4.11. Das DRY-Motiv des US28-Rezeptors vermittelt die RANTES-induzierte Aktivierung der MAPK.

Mit CXCR5, US28 wt oder US28 R129A-transfizierte HEK293A-Zellen wurden 0, 1 und 10 min mit RANTES (10 nM) stimuliert. Die Zellen wurden in SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen, die Gesamtzellysate in einer SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Eine Aktivierung der ERK1 und ERK2 MAPK wurde durch phosphorylierungsspezifische Antikörper nachgewiesen. Diese wurden nach der Detektion entfernt und die Menge der aufgetragenen ERK1 und ERK2 Moleküle mit Hilfe von Gesamt-ERK1/ERK2-spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten.

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Für eine Untersuchuing der US28-vermittelten Aktivierung der MAPK wurden daher Antikörper verwendet, die spezifisch die phosphorylierte Form der MAPK erkennen. Um zu überprüfen, ob das DRY-Motiv des US28-Rezeptors neben der Liganden-unabhängigen ebenfalls die Liganden-vermittelte Signalleitung reguliert, wurden HEK293A-Zellen mit US28 wt und US28 R129A transfiziert. Als Negativkontrolle wurde auch hier der humane Chemokinrezeptor CXCR5 verwendet. Die Stimulation der US28 wt-transfizierten Zellen mit 10 nM RANTES bewirkte eine Phosphorylierung von ERK 1 und ERK 2 nach 10 min, während die Stimulation von US28 R129A und CXCR5-transfizierten Zellen mit dem Chemokin RANTES zu keiner Veränderung der Phosphorylierung von ERK 1/2 führte (Abb. 4.11). Um auszuschließen, daß die fehlende Arrestin-Umlagerung bzw. Signalleitung nicht durch eine Verminderung oder ein Fehlen des Rezeptors an der Oberfläche vermittelt wird, wurde die Expression der US28 R129A-Mutante auf der Zelloberfläche durchflußzytometrisch untersucht. Dabei konnte keine Veränderung der Oberflächenexpression dieser Mutante gegenüber US28 wt-transfizierten Zellen festgestellt werden (Daten werden nicht gezeigt).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß der Argininrest 129 im konservierten DRY-Motiv des US28-Rezeptors ein notwendiges strukturelles Merkmal sowohl für die konstitutive als auch die Liganden-vermittelte Signalleitung darstellt.

Abb. 4.12.: Der US28-Rezeptor internalisiert unabhängig von β-Arrestin und der konstitutiven Signalleitung.

HEK293A-Zellen wurden transient (A) mit US28 wt und pcDNA3.1., Arrestin 319-418 oder Arrestin V53D oder (B) mit US28 wt, US28 R129A oder pcDNA transfiziert und 2 h mit [125I]-RANTES auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und für 0, 10 und 60 min auf 37°C erwärmt. Die Hälfte der Ansätze wurden lysiert und die Menge des internalisierten und an der Zelloberfläche befindlichen [125I]-RANTES bestimmt (gesamtzelluläre Aktivität). Bei der anderen Hälfte der Zellen wurden das Zelloberflächen-gebundene [125I]-RANTES durch Inkubation mit saurem Bindungspuffer entfernt, die Zellen lysiert und ihre Aktivität bestimmt (Säure-resistente Aktivität). Die Internalisierung wurde aus dem prozentualen Anteil der Säure-resistenten Aktivität (= internalisiert) und der gesamtzellulären Aktivität berechnet. Jeder Meßpunkt ist ein Mittelwert ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten.

4.2.7 Die Internalisierung des US28-Rezeptors erfolgt unabhängig von β-Arrestin und der konstitutiven Signalleitung

↓89

Das Entfernen inflammatorischer Chemokine aus dem Überstand infizierter Zellen durch den US28-Rezeptor stellt einen möglichen Mechanismus des HCMV dar, den zellulären Elementen der menschlichen Immunantwort zu entgehen (Billstrom et al., 1999;Bodaghi et al., 1998). Als molekulare Grundlage kann die kürzlich beschriebene Liganden-abhängige Endozytose des US28-Rezeptors angenommen werden (Fraile-Ramos et al., 2001).

Aufgrund der Beobachtung, daß die konstitutive Phosphorylierung des US28-Rezeptors sowohl die Umlagerung von β-Arrestin-2 an die Plasmamembran als auch die Internalisierungsrate des Rezeptors reguliert (Mokros et.al., 2002), sollte überprüft werden, ob die Internalisierung des US28-Rezeptors von β-Arrestin-Molekülen abhängig ist. Um dies zu untersuchen, wurde US28 wt mit zwei verschiedenen dominant-negativen β-Arrestin-Mutanten, ArrestinV53D und Arrestin 319-418, kotransfiziert. Die Arrestin V53D-Mutante zeichnet sich durch eine erhöhte Bindung an Clathrin-Moleküle verglichen mit wt Arrestin-Molekülen aus. Weiterhin weist sie eine verminderte Bindung an den phosphorylierten Rezeptor auf. Die verkürzte Mutante, Arrestin 319-418, wiederum enthält lediglich den Bindungsabschnitt für Clathrin. Die Internalisierung des US28-Rezeptors wurde als Aufnahme von [125I]-RANTES in einem Rezeptor-Internalisierungs-Experiment untersucht. Dazu wurden HEK293A-Zellen mit US28 wt und pcDNA3.1., Arrestin V53D oder Arrestin 319-418 kotransfiziert und mit [125I]-RANTES inkubiert. Anschließend wurde die Endozytose des Rezeptors für 0, 10 und 60 min ermöglicht. Die Internalisierungsrate wurde anschließend aus dem prozentualen Anteil aus aufgenommenem [125I]-RANTES und dem gesamt gebundenen [125I]-RANTES errechnet. Dabei wurde kein Unterschied zwischen der Internalisierung des US28-Rezeptors nach Kotransfektion mit pcDNA oder den dominant negativen Mutanten für Arrestin festgestellt (Abb. 4.12. A). Somit kann geschlossen werden, daß die Internalisierung des US28-Rezeptors unabhängig von β-Arrestin-Molekülen ist. Diese Beobachtung wurde kürzlich durch eine Untersuchung in Arrestin-defizienten Fibroblasten bestätigt (Fraile-Ramos et al., 2003).

Allgemein bewirkt die Stimulation von GPCRs mit ihrem Liganden eine Aktivierung verschiedener Signalwege und die Internalisierung des Rezeptors. Demgegenüber hatten Untersuchungen von US28-CD4-Fusionsproteinen ergeben, daß diese auch ohne Bindung des Liganden internalisiert werden (Fraile-Ramos et al.,2003). Daher sollte im Folgenden bestimmt werden, ob die konstitutive Signalleitung des US28-Rezeptors seine Internalisierung reguliert. Dazu wurden HEK293A-Zellen entweder mit US28 wt oder US28 R129A transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurde auch hier die Aufnahme von [125I]-RANTES in einem Rezeptor-Internalisierungs-Experiment untersucht. Auch hier konnte kein statistisch signifikanter Unterschied (t-Test) in der Aufnahme von [125I]-RANTES festgestellt werden (Abb. 4.12.B). Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die Internalisierung des US28-Rezeptors unabhängig von β-Arrestin-Molekülen oder der Signalleitung reguliert wird.

4.2.8 Dynamin reguliert die Internalisierung des US28-Rezeptors

↓90

Da die Internalisierung des US28-Rezeptors nicht durch β-Arrestin-Moleküle beeinflußt wird, sollten im Folgenden weitere Moleküle untersucht werden, die an der Internalisierung von GPCRs beteiligt sind. Zu diesen zählt die GTP-ase Dynamin. Sie reguliert sowohl die Abschnürung von Clathrin-umhüllten Membranbereichen als auch von Lipid-Rafts/Caveolae. Um die Bedeutung von Dynamin bei der Internalisierung des US28-Rezeptors zu untersuchen, wurde die dominant negative Mutante Dynamin K44A verwendet. Diese Mutante ist in

Abb. 4.13. Dynamin reguliert die Internalisierung des US28-Rezeptors.

HEK293A-Zellen wurden transient mit US28 und (A) pcDNA oder Dynamin K44A oder (B) pcDNA oder PI3K-/- kotransfiziert. Die Endozytose des US28-Rezeptors wurde in einem Internalisierungsexperiment (siehe Abb. 4.12.) als Aufnahme von [125I]-RANTES bestimmt. Jeder Meßpunkt ist der Mittelwert ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten.

ihrer GTP-ase Aktivität beeinträchtigt, wodurch eine Abschnürung von Vesikeln verhindert wird. In einem Rezeptor-Internalisierungs-Experiment führte die Kotransfektion von US28 und Dynamin K44A zu einer verminderten Aufnahme von [125I]-RANTES. Dabei wurden nach 10 min nur etwa 34 % und nach 60 min nur 61 % des Wertes der pcDNA3.1. und US28 kotransfizierten Ansätze erreicht (Abb. 4.13.A). Dennoch konnte die Internalisierung des US28-Rezeptors nicht vollständig gehemmt werden. Dies kann möglicherweise darauf zurückgeführt werden, daß die Menge der dominant-negativen Mutante nicht ausreichend war, um endogenes Dynamin vollständig zu hemmen. Alternativ könnten durch den Rezeptor zusätzlich weitere Dynamin-unabhängige Wege der Rezeptorendozytose benutzt werden.

↓91

Verschiedene zelluläre Effekte wie die Proliferation sowie das Rearrangement des Zytoskeletts werden durch die Stimulation von Phosphatidyl-Inosit-3-Kinasen (PI3K)nach Aktivierung einer Vielzahl von GPCRs über βγ-Proteinuntereinheiten der heterotrimeren G-Proteine reguliert. Kürzlich konnte auch ein Einfluß der PI3K auf die Internalisierung des β2- adrenergen Rezeptors gezeigt werden (Naga Prasad et al., 2001). Um die Internalisierung des US28-Rezeptors in Abhängigkeit der PI3K-Aktivität zu untersuchen, wurde eine dominant negative Mutante der PI3K mit dem US28-Rezeptor kotransfiziert. Bei dieser Mutante wurde die ATP-Bindungsstelle entfernt und sie kann somit nicht mehr die Bildung von Phosphatidylinosit-3,4,5-Phosphat (PtdIns3,4,5P3) katalysieren. Frühere Untersuchungen zeigten, daß die Abwesenheit von PtdIns3,4,5P3 die Bindung von Arrestin-Molekülen an den AP-2-Komplex hemmt

Abb. 4.14. Die Kotransfektion von Dynamin K44A erhöht die Zelloberflächenexpression des US28-Rezeptors.

HEK293A-Zellen wurden mit pcDNA3.1., US28 S1-12A, US28 und pcDNA3.1., β-Arrestin-1, β-Arrestin-2, Dynamin,, Arrestin V53D, Dynamin K44A, PI3K, und PI3K -/- transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurde die Rezeptorexpression an der Oberfläche von intakten Zellen und die Gesamtexpression an fixierten und permeabilisierten Zellen bestimmt. Die Rezeptorexpression wurde durchflußzytomtrisch durch Anfärbung des US28-Rezeptors mit dem US28-spezifischen Antikörper Tub-45 ermittelt. Es ist angegeben, bei wievielen der Rezeptor-exprimierenden Zellen eine Lokalisation an der Zelloberfläche nachgewiesen wurde. Die angegebenen Daten sind Mittelwerte ± S.D. von fünf unabhängigen Experimenten. ** p ≤ 0,01 in Bezug zum US28 wt.

und somit die Internalisierung von GPCRs inhibieren kann (Gaidarov et al., 1996;Gaidarov et al., 1999) (Gaidarov et al., 1996;Gaidarov et al., 1999). HEK293A-Zellen wurden mit US28 und pcDNA3.1. oder PI3K -/- kotransfiziert und die Internalisierung des Rezeptors wurde durch die Aufnahme von [125I]-RANTES bestimmt. Dabei konnte kein Unterschied in der Internalisierung des US28-Rezeptors nach Kotransfektion mit der dominant negativen Mutante der PI3K festgestellt werden (Abb. 4.13.B).

4.2.8.1  Die Oberflächenexpression des US28-Rezeptors wird durch Dynamin reguliert

↓92

Die Kotransfektion des US28-Rezeptors mit der dominant negativen Mutante von Dynamin, Dynamin K44A, bewirkte eine verminderte Internalisierung des US28-Rezeptors. Daher sollte überprüft werden, ob sich der US28-Rezeptor infolge der Hemmung der konstitutiven Internalisierung an der Zelloberfläche anhäuft. Dazu wurde US28 wt mit Dynamin K44A kotransfiziert und die Expressionsrate des Rezeptors an der Zelloberfläche von allen US28-exprimierenden Zellen durchflußzytometrisch bestimmt. Dazu wurde die Hälfte der Zellen 48 h nach der Transfektion fixiert und permeabilisiert, während die Messung der Expression des US28-Rezeptors an der Zelloberfläche an lebenden Zellen durchgeführt wurde. Als Kontrolle für die spezifische Bindung der Antikörper wurden Zellen verwendet, die nur pcDNA3.1. transfiziert wurden. Als Positivkontrolle für eine erhöhte Expression des US28-Rezeptors an der Oberfläche wurde die phosphorylierungsdefiziente Mutante US28 S1-12A verwendet. Wie die Abb. 4.14. A und B zeigen, waren in US28 wt und pcDNA3.1. kotransfizierten Zellen durchschnittlich nur 8 % S.D. ± 3,2 des Rezeptors an der Oberfläche nachweisbar.

Die Kotransfektion des US28-Rezeptors mit der dominant negativen Mutante, Dynamin K44A, bewirkte eine Zunahme der Expression des US28-Rezeptors auf der Zelloberfläche auf durchschnittlich 25 % S.D. ± 9,2 (siehe Abb. 4.14.B). Alle anderen Adaptermoleküle oder dominant-negativen Mutanten waren an der Regulation der Oberflächenexpression des US28-Rezeptors nicht beteiligt und bestätigten somit die Daten der Internalisierung.

4.2.9  US28 befindet sich in der Detergenz-unlöslichen Zellfraktion

Die Untersuchungen der Zelloberflächenexpression und der Internalisierung des US28-Rezeptors ergaben, daß beide Prozesse durch Dynamin reguliert werden. Da Dynamin neben dem Clathrin-abhängigen auch an dem Lipid-Raft/Caveolae-abhängigen Weg der Rezeptorinternalisierung beteiligt ist, sollte im Folgenden untersucht werden, auf welchem der beiden Wege US28 endozytiert wird.

↓93

Dazu wurde zunächst die subzelluläre Verteilung des US28-Rezeptors bestimmt. Lipid-Rafts/Caveolae sind in nicht-ionischen Detergenzien wie TX-100 unlöslich und zeichnen sich durch einen hohen Anteil von Cholesterin und Sphingophospholipiden aus. Caveolae gehören zur Gruppe der Lipid-Rafts und sind zusätzlich durch das Vorkommen von Caveolin 1 charakterisiert (Anderson, 1998;Kurzchalia und Parton, 1999).

Abb. 4.15. Der US28-Rezeptor ist sowohl mit der Detergenz-löslichen als auch in der Detergenz-unlöslichen Zellfraktion nachweisbar.

HEK293A-Zellen wurden mit US28 transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit [35S]-Methionin und [35S]-Cystein markiert, in TX-100-haltigem Lysepuffer aufgenommen, unlösliche Bestandteile wurden abzentrifugiert, die löslichen Bestandteile wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die unlöslichen Bestandteile in SDS-haltigem Puffer gelöst. Der US28-Rezeptor und MHC-Klasse-I-Moleküle wurden aus den Zellsolubilisaten mit den Antikörpern Tub-06 (US28), HC10 und W6/32HL (MHC-Klasse-I-Moleküle) immunpräzipitiert und in einer SDS-PAGE analysiert. Die gezeigte Autoradiographie ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Um zu untersuchen, ob sich US28 in der Detergenz-unlöslichen Fraktion befindet, wurden zunächst HEK293A-Zellen mit US28 transfiziert und 48 h nach der Transfektion mit [35S]- Methionin/Cystein markiert. Die Zellen wurden in einem TX-100-haltigen Puffer lysiert und unlösliche Bestandteile abzentrifugiert. Das entstandene Pellet, die Detergenz-unlösliche Fraktion, wurde in 1%-igem SDS-Puffer und durch Erhitzen auf 95 °C gelöst. Anschließend wurde US28 aus dem TX-100-Lysat und aus der in SDS-Puffer gelösten Pelletfraktion immunpräzipitiert. Als Kontrolle wurden MHC-Klasse-I-Moleküle verwendet, die keine

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Abb. 4.16. Caveolin 1 und der US28-Rezeptor kolokalisieren nicht miteinander.

Konfoklale Mikroskopie der intrazellulären Verteilung von Caveolin 1 und dem US28-Rezeptor in US28-tranfizierten Zellen. Die Immunfärbung erfolgte 36 h nach der Transfektion mit mAk Tub-06 für US28 und einem polyklonalen Kaninchenserum für endogenes Caveolin 1. Die Daten repräsentieren drei unabhängige Experimente. Der Maßstab entspricht 10 µm.

Bestandteile von Caveolae/Lipid-Rafts sind und sich daher ausschließlich in der TX-100-löslichen Fraktion befinden. Wie die Abbildung 4.13.zeigt, konnte US28 im Gegensatz zu MHC-Klasse-I-Molekülen jedoch in beiden Fraktionen nachgewiesen werden. Diese Beobachtung deutete an, daß US28 sowohl über Clathrin-abhängige (TX-100 löslich), als auch über Lipid-Raft/Caveolae-vermittelte (TX-100 unlöslich) Endozytosewege in die Zelle aufgenommen werden kann.

4.2.10 US28 und Caveolin 1 befinden sich in unterschiedlichen Kompartimenten

Das Vorkommen von Proteinen in der Detergenz-unlöslichen Fraktion kann nicht als unmittelbarer Beweis für die Assoziation mit Caveolae angesehen werden, sondern kann auch durch eine Wechselwirkung des US28-Rezeptors mit dem Aktinskelett erklärt werden (Avalos et al., 1997;Sanderson et al., 1995). Deshalb sollte ein mögliches Vorkommen des US28-Rezeptors und Caveolin 1 in gemeinsamen Kompartimenten untersucht werden. Dazu wurden HEK293A-Zellen mit US28 transfiziert, 36 h nach der Transfektion fixiert, permeabilisiert und der US28-Rezeptor sowie endogenes Caveolin 1 mit Hilfe von spezifischen Antikörpern angefärbt. Wie die Abb. 4.16.zeigt, konnte keine Kolokalisation des US28-Rezeptors mit Caveolin 1 gefunden werden, was den Caveolaeweg als Hauptweg der US28-Internalisierung unwahrscheinlich erscheinen läßt.

↓95

Abb. 4.17. Die Internalisierung des US28-Rezeptors wird vorwiegend durch den Clathrin-Weg beeinflußt.

HEK293A-Zellen wurden transient mit US28 transfiziert und (A) mit Medium, 0,4 M Sucrose, 5 µg/ml Filipin III oder (B) Medium, 5 mM MCD inkubiert. Die Endozytose des US28-Rezeptors wurde in einem Internalisierungsexperiment (siehe Abb. 4.12.) als Aufnahme von [125I]-RANTES bestimmt. Jeder Meßpunkt ist der Mittelwert ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten.

4.2.11 Die Internalisierung des US28-Rezeptors wird durch Filipin III und hyperosmolare Saccharose gehemmt

Kürzlich wurde in einigen Untersuchungen die Relevanz von Lipid-Rafts/Caveolae für die Internalisierung von GPCRs wie CCR5 oder den B2-Bradikininrezeptor nachgewiesen (Lamb et al., 2002;Mueller et al., 2002).

Um eine Beteiligung von Lipid-Rafts bei der Endozytose des US28-Rezeptors zu untersuchen, wurden pharmakologische Inhibitoren verwendet, die mit dem Hauptbestandteil von Lipid-Rafts, dem Cholesterin, in Wechselwirkung treten. Methyl-β-Cyclodextrin (MCD) entfernt Cholesterin aus Membranen und beeinflußt somit neben der Lipid-Raft-abhängigen Endozytose ebenso konzentrationsabhängig eine Internalisierung über den Clathrin-Weg (Rodal et al., 1999). Im Gegensatz dazu bindet Filipin das Cholesterin in der Membran und beeinflußt somit selektiv die Lipid-Raft-abhängige Endozytose.

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In Internalisierungsexperimenten des US28-Rezeptors führte die Inkubation Rezeptor-transfizierter Zellen mit Filipin (5 µg/ml) zu einer partiellen Hemmung der Aufnahme von [125I]-RANTES (10 min unbehandelt 69,2 % und Filipin 39,3%; 60 min unbehandelt 84,1% und Filipin 61%), während eine Inkubation mit 5 mM MDC nur frühe Zeitpunkte der Internalisierung (10 min unbehandelt 55,6 % und MDC 28,1%) beeinflußte (Abb. 4.17). Da der Einsatz der pharmakologischen Inhibitoren der Lipid-Raft-abhängigen Endozytose nur eine par-tielle Verminderung der Internalisierung des US28-Rezeptors bewirkte, wurde daraufhin untersucht, ob der US28-Rezeptor ebenfalls über CCV internalisiert. Die Clathrin-abhängige US28-Internalisierung wurde durch die Inkubation US28-transfizierter Zellen mit hyperosmolarer Saccharose-Lösung untersucht. Im Gegensatz zur Hemmung des Caveolae-Weges konnte nach der Inkubation mit 0,4 M Saccharose-Lösung eine starke Verminderung der [125I]-RANTES-Aufnahme (10 min unbehandelt 69,2 % und Saccharose 10,4 %; 60 min unbehandelt 84,4 % und Saccharose 25%) festgestellt werden. Aufgrund der vorliegenden Daten kann davon ausgegangen werden, daß die Internalisierung des US28-Rezeptors vorwiegend durch den Clathrin-Weg stattfindet, eine Internalisierung durch Lipid-Raft-assoziierte Wege aber auch zu einem geringen Ausmaß beteiligt ist.

4.2.12 Die Internalisierung der phosphorylierungsdefizienten Mutante folgt den gleichen Wegen wie der wt-Rezeptor

Der Austausch der Phosphoakzeptorstellen des US28-Rezeptors durch Alaninreste bewirkte eine partielle Hemmung der Internalisierung des US28-Rezeptors. Diese Verminderung der Rezeptorendozytose kann jedoch nicht wie bei anderen phosphorylierungsdefizienten Mutanten verschiedener GPCRs durch eine fehlende Bindung von Arrestin-Molekülen an den Rezeptor erklärt werden, da der US28-Rezeptor unabhängig von Arrestin-Molekülen internalisiert. Es wurde daher untersucht, ob die unterschiedliche Kinetik der Internalisierung des wt-Rezeptors und der phosphorylierungsdefizienten Mutante durch unterschiedliche Internalisierungswege vermittelt wird. Zunächst wurde geprüft, ob die Internalisierung der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 S1-12A ebenfalls von der GTP-ase Dynamin abhängig ist. Dazu wurde US28 S1-12A mit der GTP-ase-defizienten Mutante Dynamin K44A kotransfiziert. Diese Kotransfektion bewirkte eine um 28 % (10 min) bzw. 55,7 % (60 min) verminderte Aufnahme von [125I]-RANTES gegenüber pcDNA3.1./US28 S1-12A kotransfizierten Zellen (Abb. 4.18A). Diese Daten zeigen, daß die Internalisierung des phosphorylierten und des nicht phosphorylierten Rezeptors in gleicher Weise von Dynamin abhängig waren. Die Inkubation US28 STA-transfizierter Zellen mit den Inhibitoren Filipin und Saccharrose ergab ebenfalls eine Verminderung der Internalisierung (10 min unbehandelt 23,1 % , Filipin 8,7 % und Sacccharose 2,5 % sowie 60 min unbehandelt 47,5 %, Filipin 26,4 % und Saccharose 8 % siehe Abb. 4.18.B ). Somit wird auch der nicht phosphorylierte Rezeptor ähnlich wie der wt-Rezeptor ebenfalls überwiegend auf dem Clathrin-Weg internalisiert.

Abb. 4.18. Die Internalisierung der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 STA wird vorwiegend durch den Clathrin-Weg beeinflußt.

HEK293A-Zellen wurden transient mit US28 STA transfiziert und (A) mit der GTP-ase defizienten Mutante Dynamin K44A oder pcDNA3.1. kotransfiziert oder (B) mit Medium, 0,4 M Saccharose, 5 µg/ml Filipin III inkubiert. Die Endozytose des US28-Rezeptors wurde in einem Internalisierungsexperiment (siehe Abb. 4.12.) als Aufnahme von [125I]- RANTES bestimmt. Jeder Meßpunkt ist der Mittelwert ± S.D. aus zwei unabhängigen Experimenten.

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Abb. 4.18. Die Internalisierung der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 STA wird vorwiegend durch den Clathrin-Weg beeinflußt.

4.2.13 Die Endozytose des US28-Rezeptors wird unabhängig von der Palmitylierung des C-Terminus reguliert

Neben der Phosphorylierung des Rezeptors sind für GPCRs weitere strukturelle Motive beschrieben, die eine Rezeptorendozytose regulieren. So kann die Palmitylierung C-terminaler Cysteinreste von GPCRs die Ausbildung einer vierten intrazellulären Schleife bewirken und damit die Anlagerung von G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinasen (GRKs) oder β-Arrestin-Molekülen verstärken und so die Internalisierung der Rezeptoren fördern (Bjorklof et al., 2002;Charest und Bouvier, 2003;Ferguson et al., 2002;Moffett et al., 1996). Weiterhin wurde vorgeschlagen, daß die Palmitylierung von Proteinen für eine effiziente Verankerung von Proteinen in Lipid-Raft-Bereichen der Zellmembran notwendig ist (Bijlmakers und Marsh, 2003;Li et al., 2003).

Die Palmitylierung des US28-Rezeptors wurde durch den Einbau von [3H]-Palmitinsäure in Zusammenarbeit mit Thilo Mokros bestimmt. Dazu wurden US28-transfizierte Zellen mit [3H]-Palmitinsäure inkubiert, die Zellen wurden im Anschluß lysiert und der US28-Rezeptor mit dem Antikörper Tub-45 immunpräzipiert. Im Vergleich zu CCR5 war der Einbau der Palmitinsäure bei US28 deutlich geringer (Abb. 4.19.A). Dies kann zum einen durch eine nicht vollständige Einwanderung des Rezeptors in das Acrylamidgel erklärt werden.

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Abb. 4.19.: Der US28-Rezeptor ist palmityliert.

(A) HEK293A-Zellen wurden mit CCR5 oder US28 wt transfiziert und metabolisch mit [3H]-Palmitat markiert. Der US28-Rezeptor wurde aus den Solubilisaten markierter Zellen mit dem US28 Tub-45 und CCR5 mit mAk R22/7 immunpräzipitiert und in einer SDS-PAGE analysiert. Die Autoradiographie zeigt eines von zwei Experimenten mit gleichem Ergebnis. Die eingesetzten Rezeptormengen wurden in einer zweiten SDS-PAGE in einem Immunblot (IB) kontrolliert. (B, C) HEK293A-Zellen wurden mit US28 wt, US28 C304A, US28 C347A oder US28 C304,347A transfiziert und 48 h nach der Transfektion wurde die Endozytose (siehe Abb. 4.12.) des US28-Rezeptors als Aufnahme von [125I]-RANTES bestimmt. Jeder Meßpunkt ist der Mittelwert ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten.

Weiterhin besitzt der US28-Rezeptor nur zwei potentielle Palmitylierungsstellen im C-Terminus, während bei CCR5 alle drei möglichen Palmitylierungsstellen verwirklicht sind (Blanpain et al., 2001;Kraft et al., 2001;Percherancier et al., 2001).

Bei dem humanen Chemokinrezeptor CCR5 war die Palmitylierung Voraussetzung für eine effiziente Internalisierung (Blanpain et al., 2001;Kraft et al., 2001;Percherancier et al., 2001). Um zu untersuchen, ob die Palmitylierung des US28-Rezeptors seine Internalisierung beeinflußt, wurden Rezeptorvarianten hergestellt, bei denen die potentiellen Palmitylierungsstellen am C-Terminus gegen Alaninreste ausgetauscht wurden (Cysteinreste an den Positionen 304 und 347 siehe Abb.1.6.). Die Internalisierung dieser Mutanten wurde durch die Aufnahme von [125I]-RANTES nach 0, 10 und 60 min gemessen. Die Internalisierungsraten dieser

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Abb. 4.20.: US28 wt und die phosphorylierungsdefiziente Mutante US28 S1-12A kolokalisieren mit dem AP-2-Komplex.

HEK293A-Zellen wurden kotransfiziert mit (A-G) US28 wt, β-Arrestin-2-GFP und β2-Adaptin-FLAG oder (H-J) US28 S1-12A und β2-Adaptin-FLAG. 36 h nach der Transfektion wurden β2-Adaptin-FLAG und der US28-Rezeptor mit dem FLAG-spezifischen Antikörper M2 und US28 mit dem Biotin-markierten Antikörper Tub-06 angefärbt und in der konfokalen Mikroskopie analysiert. Der Maßstab entspricht 10 µm.

Mutanten sowie einer Doppelmutante, bei der beide Cysteinreste durch Alaninreste ersetzt wurden, unterschieden sich jedoch nicht signifikant von der Internalisierungrate des wt-Rezeptors (Abb. 4.19 B,C). Aufgrund dieser Beobachtungen kann vermutet werden, daß die Palmitylierung C-terminaler Cysteinreste nicht relevant für die Internalisierung des US28-Rezeptors ist.

4.2.14 US28 kolokalisiert mit dem AP-2-Komplex

Die Internalisierung des US28-Rezeptors und der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 STA wurde durch die Inkubation mit Saccharose partiell gehemmt. Dies läßt eine Internalisierung auf dem Clathrin-Weg vermuten. Da die Internalisierung des US28-Rezeptors unabhängig von β-Arrestin-Molekülen erfolgte, sollte untersucht werden, ob ein weiteres Schlüsselmolekül des Clathrin-Weges, der AP-2-Komplex, an der Internalisierung des US28-Rezeptors beteiligt ist. Der heterotetramere AP-2-Komplex besteht aus zwei großen Untereinheiten von 100 kDa (α-, β2-Adaptin), einer mittleren Untereinheit von 50 kDa (µ2-Adaptin) und einer kleinen Untereinheit von 17 kDa (σ2-Adaptin) (Brodsky et al., 2001). Funktionell verbindet AP-2 den Rezeptor-Arrestin-Komplex oder aber den Rezeptor direkt mit Clathrin-Molekülen (Laporte et al., 2000). Um zu untersuchen, ob der AP-2-Komplex an der Internalisierung von US28 beteiligt ist, wurde zunächst das gemeinsame Vorkommen des US28-Rezeptors sowie der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 S1-12A und des AP-2-Komplexes in der Zelle untersucht. Dazu wurden HEK293A-Zellen mit US28 wt, β-Arrestin-2-GFP und β2-Adaptin-FLAG, oder US28 S1-12A und β2-Adaptin-FLAG kotransfiziert. 36 h nach der Transfektion wurden US28 und β2-Adaptin-FLAG durch spezifische Antikörper in fixierten und permeabilisierten Zellen nachgewiesen. In der konfokalen Mikroskopie konnte eine Kolokalisation (pink, Pfeilspitzen E,F) von β2-Adaptin-FLAG (rot C) mit dem US28 wt –Rezeptor (blau A) beobachtet werden. Ebenso konnte eine Kolokalisation (gelb J) der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 S1-12A (grün H) mit dem β2-Adaptin-FLAG-Molekülen (rot I) nachgewiesen werden.

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Die gezeigte Kolokalisation (gelb, Pfeile F) von Arrestin-2-GFP (grün B) und β2-Adaptin-FLAG (rot C)bestätigt zusätzlich, daß Arrestin in Vesikeln des Clathrin-abhängigen Endozytoseweges vorlag, obwohl es offenkundig nicht mit dem US28-Rezeptor kolokalisierte (D Pfeilspitzen).

4.2.15 Das Dileuzinmotiv reguliert eine schnelle Internalisierung des US28-Rezeptors

Den einzelnen Untereinheiten des AP-2-Komplexes werden verschiedene Aufgaben bei der Internalisierung von GPCRs zugeschrieben. Dabei erfolgt die Bindung des AP-2-Komplexes an Clathrin über die β2-Adaptin-Untereinheit (Shih et al., 1995), während die Bindung der Frachtmoleküle über die µ2-Untereinheit erfolgt. Die Voraussetzung dafür bilden auf der Seite der Frachtmoleküle/Rezeptoren sogenannte Tyrosin-enthaltende Motive (z.B. YxxΦ bei dem x für eine beliebige Aminosäure steht, während Φ vorwiegend für hydrophobe Aminosäuren steht) (Ohno et al., 1995;Owen und Evans, 1998). Andere Motive, wie Dileuzin-Motive, können ebenfalls mit dem AP-2-Komplex in Wechselwirkung treten (Dale et al., 2001;Haucke und Krauss, 2002;Heilker et al., 1996). Dabei ist eine genaue Lokalisation der Bindungsstelle des AP-2-Komplexes nicht bekannt. Mit Hilfe einer Mutagenesestudie sollte geprüft werden, welche der in der Sequenz des US28-Rezeptors gefundenen Motive an einer Internalisierung beteiligt

Abb. 4.21. Das Dileuzin-Motiv des US28-Rezeptors ist für seine schnelle Endozytose notwendig.

(A) HEK293A-Zellen wurden mit US28 wt, US28 Y208A, US28 Y321A und US28 LL305/306AA transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurde die Rezeptorexpression an der Oberfläche von intakten Zellen und die Gesamtexpression an fixierten und permeabilisierten Zellen durchflußzytometrisch bestimmt. Es ist angegeben, bei wievielen der Rezeptor-exprimierenden Zellen eine Lokalisation an der Zelloberfläche nachgewiesen wurde. Die angegebenen Daten sind Mittelwerte ± S.D. von fünf unabhängigen Experimenten. (B-D) HEK293A-Zellen wurden mit US28 wt, US28 Delta 130-138, US28 Y208A, US28 Y321A und US28 LL305/306AA wie angegeben transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurde die Endozytose des US28-Rezeptors in einem Internalisierungsexperiment (siehe Abb. 4.12) als Aufnahme von [125I]-RANTES bestimmt. Jeder Meßpunkt ist der Mittelwert ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten.

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sind. Dazu wurden die sich im Sequenzmotiv befindlichen Tyrosinreste an den Positionen Y208 (dritte intrazelluläre Schleife), Y321 (C-Terminus), sowie die beiden Leuzinreste an Position LL305/306 (C-Terminus) gegen Alaninreste ausgetauscht. Die Mutagenese der 2. intrazellulären Schleife an den Positionen Y130, 131 und 138 ergab eine Mutante (US28 Delta 130-138), bei der der Tyrosinrest der Position 130 durch einen Prolinrest ersetzt war, das Tyrosin an Position 131 fehlte, während der Tyrosinrest an Position 138 durch einen Alaninrest ersetzt war. Die durchflußzytometrische Untersuchung ergab, daß sich alle Mutanten nicht signifikant in Bezug auf ihre Oberflächenexpression vom US28 wt-Rezeptor unterschie-den (Abb. 4.21.A). Um zu untersuchen, ob die Tyrosin-Motive bzw. das Dileuzin-Motiv an der Internalisierung des US28-Rezeptors beteiligt sind, wurden HEK293A-Zellen mit dem US28 wt-Rezeptor oder den Mutanten transfiziert und die Endozytoserate wurde durch die Aufnahme von [125I]-RANTES bestimmt. Dabei unterschied sich die Internalisierungsrate der Tyrosin-Mutanten nicht von US28-wt-transfizierten Zellen (Abb. 4.21. B,D). Der Austausch der Leuzinreste an den Positionen 305/306 führte jedoch zu einer Hemmung der Internalisierung um 37 % nach 10 min im Vergleich zum US28 wt-Rezeptor (Abb.4.21.C). Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die Tyrosin-basierenden Sequenzmotive der 3. intrazellulären Schleife und des C-Terminus die Internalisierung des US28-Rezeptors nicht beeinflußten, während die Leuzinreste hingegen die schnelle Internalisierung des Rezeptors regulierten.


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01.12.2006