5 Diskussion

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Im Verlauf dieser Arbeit wurde gezeigt, daß (1) die durch US11-vermittelte Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche von DCs nicht ausreichend war, um eine Proliferation peptidspezifischer T-Zellen zu hemmen. (2) Der US28-Rezeptor wurde sowohl auf Clathrin- als auch auf Lipid-Raft-abhängigen Wegen endozytiert. (3) Als strukturelle Voraussetzungen für die Internalisierung des US28-Rezeptors konnten die C-terminalen Phosphorylierungstellen und ein C-terminales Dileuzinmotiv identifiziert werden. (4) Weiterhin konnte beobachtet werden, daß das DRY-Motiv am Übergang der dritten Transmembran-Domäne die Aktivierung sowohl von konstitutiven als auch Liganden-vermittelten Signalwegen reguliert.

5.1  Bedeutung des US11-Proteins bei Aktivierung von CTLs

Ein zentraler Teil des Immunsystems bei der Abwehr von HCMV-Infektionen wird von zytotoxischen CD8+ T-Zellen repräsentiert. Zu dieser Ansicht trugen Untersuchungen an Patienten mit einer eingeschränkten CD8-spezifischen T-Zellantwort bei, da diese Patienten ein erhöhtes Risiko für eine Reaktivierung des HCMVaufwiesen (Quinnan et al., 1982;Reusser et al., 1991). Dennoch scheint die schützende Rolle der CD8+ T-Zellen während einer HCMV-Infektion überraschend, da das Virus-Genom für vier Gene kodiert (US2, US3, US6, US11), die eine Präsentation viraler Antigene in infizierten Zellen in vitro stark vermindern und somit dem Erkennen virusinfizierter Zellen entgegenstehen (Jones et al., 1995). US3 wird schnell, aber transient nach der Infektion exprimiert und hält MHC-Klasse-I-Moleküle im ER zurück (Jones et al., 1996). Die Proteine US2 und US11 werden während der frühen Phase der Infektion exprimiert. Sie bewirken den retrograden Transport neu synthetisierter MHC-Klasse-I-Moleküle in das Zytoplasma, wo diese proteasomal abgebaut werden (Jones und Sun, 1997;Wiertz et al., 1996). US6 wird während der späten Phase der Infektion exprimiert und blockiert den TAP-Transporter, der für den Transport der MHC-Klasse-I-stabilisierenden Peptide vom Zytoplasma in das ER-Lumen verantwortlich ist (Ahn et al., 1997;Lehner et al., 1997).

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Da in dieser Arbeit das US11-Protein des humanen Zytomegalievirus untersucht werden sollte, wurde zunächst getestet, ob das Protein ebenfalls die Expression von Maus-MHC-Klasse-I-Molekülen beeinflußt. Ein solches heterologes Expressionssystem für HCMV-kodierte Antigene wäre von Nutzen, um ein Tiermodell etablieren zu können, in dem die aus in vitro-Untersuchungen bekannten immunmodulatorischen Eigenschaften in vivo überprüfbar wären. Dazu wurde die Maus-Zellinie MCA-205 verwendet, die MHC-Klasse-I-Moleküle der Allele H2-Db und H2-Kb exprimiert. Die adenovirale Expression des US11-Proteins bewirkte in MCA-205 Zellen einen nahezu vollständigen Verlust der getesteten MHC-Klasse-I-Moleküle H2-Db und H2-Kb. Daher sollte überprüft werden, inwieweit US11 ebenfalls die Expression der MHC-Moleküle in primären DCs beeinflußt. Dendritische Zellen sind deshalb von besonderem Interesse, da sowohl reife als auch unreife DCs durch HCMV-infiziert werden können (Jahn et al., 1999;Raftery et al., 2001;Riegler et al., 2000;Senechal et al., 2004). Funktionell stehen DCs im Zentrum einer adaptiven Immunantwort, da sie eine der effizientesten antigenpräsentierenden Zellpopulationen darstellen. Der adenovirale Transfer des US11-Gens in DCs bewirkte im Gegensatz zu den MCA-205-Zellen eine unterschiedlich starke Beeinflussung der getesteten MHC-Allele. Dabei wurde die Expression der H2-Db-Moleküle an der Zelloberfläche stärker vermindert als die der H2-Kb-Moleküle. Dieses Phänomen konnte auch in anderen Maus-Zellsystemen beobachtet werden (Basta et al., 2002;Machold et al., 1997).

Obwohl die Expression von US11 zu einer bis zu 60%-igen Verminderung der H2-Db-Expression führte, wurde hierdurch die antigenspezifische T-Zellproliferation nicht beeinträchtigt. Eine mögliche Erklärung hierfür bieten frühere Untersuchungen, in denen die Aktivierungsschwelle von T-Zellen analysiert wurde. Dabei waren bereits weniger als 210 MHC-Moleküle ausreichend, um eine Aktivierung von T-Zellen zu bewirken (Harding und Unanue, 1990). In einer Studie von Sykulev et al. wurde berichtet, daß bereits ein MHC-Klasse-I-Molekül auf einer Zielzelle ausreichend war, eine T-Zell-vermittelte Lyse auszulösen (Sykulev et al., 1996).

Weiterhin konnten in in vitro Studien an HCMV-infizierten humanen DCs ebenfalls nur eine partielle Hemmung der MHC-Klasse-I-Expression gezeigt werden. Dabei führte die Infektion reifer DCs mit HCMV zu einer verstärkten Expression der Apoptose-vermittelnden Liganden CD95L und TRAIL, wodurch ein neuartiger Mechanismus einer HCMV-vermittelten T-Zellhemmung durch infizierte DCs angedeutet wird (Raftery et al., 2001). In einer kürzlich veröffentlichten Studie an HCMV-infizierten DCs konnte eine weitere Strategie des HCMV gezeigt werden, dem Immunsystem zu entgehen. Dabei führte die Infektion reifer DCs zu einer Abgabe von löslichem CD83, wodurch die Aktivität uninfizierter benachbarter DCs und damit eine T-Zell-Proliferation durch einen nicht genauer bekannten Weg blockiert wurde (Senechal et al., 2004).

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Aufgrund der hier vorgestellten Beobachtungen und der Ergebnisse von Raftery et al. und Senechal et al. kann angenommen werden, daß allein die partielle Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche dendritischer Zellen nicht ausreichend ist, um eine Aktivierung von T-Zellen zu verhindern. Demgegenüber zeigt eine Studie von Berger et al. an humanen Fibroblasten, daß die Expression von US11 ausreichte, um eine Lyse dieser Zellen durch zytotoxische T-Lymphozyten zumindest teilweise zu hemmen. Eine komplette Inhibition der CTL-vermittelten Lyse wurde aber erst nach Koexpression eines weiteren viralen Genproduktes, dem ICP47 des Herpes Simplex-Virus 1, erreicht (Berger et al., 2000). Die Tatsache, daß die verschiedenen Studien zwei unterschiedliche Mechanismen (T-Zellaktivierung vs. Zellyse) betrachten, mag die unterschiedlichen Ergebnisse erklären. Zudem wurde die Untersuchung in unterschiedlichen Zellsystemen durchgeführt, was darauf hindeutet, daß möglicherweise zelltypspezifische Unterschiede die Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle durch US11 beeinflussen können.

Kürzlich wurde in zwei Studien die in vivo Funktion des US11-Proteins untersucht. Die Studie von Shen et al. zeigte, daß durch die Expression des US11-Proteins zwar nicht die Oberflächenexpression der MHC-Moleküle beeinflußt wird, US11 dennoch die Expression neu synthetisierter Antigene signifikant verringert. Dadurch wurde effektiv eine Induktion einer antiviralen Immunantwort oder aber das Erkennen infizierter Zellen vermindert (Shen et al., 2002). Die zweite Studie von Basta et al. zeigt, daß die Expression von US2 oder US11 zu einer signifikant verringerten Anzahl von Antigen-spezifischen T-Zellen führt (Basta et al., 2002). Eine komplette Hemmung der T-Zellantwort wurde aber in beiden Studien nicht erreicht. Im Gegensatz zu den erwähnten Studien wurde in dieser Arbeit das Antigen als Peptid von außen den Zellen zugegeben. Interessanterweise kann die Präsentation der exogenen Antigene auf MHC-Klasse-I-Molekülen auch durch eine direkte Bindung der Peptide an MHC-Klasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche erfolgen (Su et al., 1998;Su et al., 1999). Somit kann nicht ausgeschlossen werden, daß die Aktivierung der in der Arbeit verwendeten gp-33-spezifischen T-Zellen auch über eine Stimulation exogen gebundener Peptide erfolgte.

Zusammenfassend beschreiben die hier vorgelegten Daten, daß die alleinige Expression von US11 in dendritischen Zellen nicht ausreichend war, die Aktivierung (Proliferation) von zytotoxischen T-Zellen zu hemmen. Als Ursache dafür kann eine nur partielle Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche angenommen werden. Dennoch wird zumindest in HCMV-infizierten dendritischen Zellen eine Aktivierung von T-Zellen verhindert (Raftery et al., 2001; Senechal et al., 2004). Somit scheint die partielle Verminderung der MHC-Klasse-I-Moleküle in infizierten DCsdurch weitere immunmodulatorische Mechanismen des HCMV (FasL und TRAIL oder CD83) komplementiert zu werden.

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Zum Nachteil des Virus würde ein kompletter Verlust aller MHC-Klasse-I-Moleküle einen zweiten Weg der antiviralen Immunantwort aktivieren, der eine Lyse dieser Zelle durch NK-Zellen vermittelt. Die Aktivität der NK-Zellen wird durch die Bindung an MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche möglicher Zielzellen verhindert (Karre, 1997;Lanier et al., 1997).

Die Expression des HIV-kodierten Proteins Nef führt zu einer verminderten Expression von HLA-A und HLA-B Molekülen auf der Oberfläche und interagiert so mit einer Erkennung durch CTLs. Eine Expression von HLA-C und HLA-E Molekülen, die durch verschiedene NK-Zellrezeptoren erkannt werden, wird aber nicht beeinflußt (Cohen et al., 1999;Collins et al., 1998). Auch die HCMV-kodierten Proteine US2 und US11 interagieren im humanen System speziell mit HLA-A und HLA-B Molekülen, jedoch nicht mit Produkten des HLA-C- (HLA-Cw4) und HLA-G-Locus (Schust et al., 1998). Somit kann vermutet werden, daß die US11-vermittelte Modulation der MHC-Klasse-I-Expression nicht zu einer Aktivierung von NK-Zellen führt. Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen konnte eine US11-vermittelte Degradation von HLA-C Molekülen in HeLa-Zellen beobachtet werden, die zu einer spezifischen Lyse US11-transfizierter Zellen durch NK-Zellen führte (Huard und Fruh, 2000).

Zusammenfassend kann das US11-Molekül als Teil eines umfassenden Systems zur Hemmung spezifischer zytotoxischer T-Zell-Antworten angesehen werden, dessen Funktionsweise im Wechselspiel mit der menschlichen Immunantwort noch weitgehend unverstanden ist.

5.2 Die Internalisierung des US28-Rezeptors

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Im Allgemeinen weisen GPCRs eine hohe Expression an der Zelloberfläche auf. Im Gegensatz dazu konnte nur eine geringe Expression des US28-Rezeptors an der Zelloberfläche transfizierter HEK293A-Zellen nachgewiesen werden. Mit Hilfe mikroskopischer Untersuchungen konnte eine Anreicherung des US28-Rezeptors in intrazellulären Kompartimenten gezeigt werden, während der humane RANTES-Rezeptor CCR5 im inaktiven Zustand eine Verteilung an der Plasmamembran aufwies. Als Ursache für das vorwiegend endosomale Vorkommen des US28-Rezeptors kann die konstitutive Endozytose des Rezeptors angesehen werden (Fraile-Ramos et al., 2001), die durch eine konstitutive Phosphorylierung reguliert wird (Mokros et al., 2002). Nach einem allgemeinen Modell werden aktivierte GPCRs zunächst durch Mitglieder der GRKs an intrazellulären Domänen phosphoryliert, wodurch die Bindung von Arrestin-Molekülen an den Rezeptor erleichtert wird (vgl. Abb.1.5.). Diese Bindung von Arrestin-Molekülen an den Rezeptor führt zu einer Hemmung des Rezeptors, die eine erneute Interaktion mit seinen spezifischen G-Proteinen und somit eine erneute Stimulation verhindert (Desensitivierung). Über die Bindung von Rezeptor und Arrestin-Molekül wird im Folgenden die Internalisierung des Rezeptors in Clathrin-umhüllten Vesikeln vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte eine von β-Arrestin-Molekülen unabhängige Internalisierung des US28-Rezeptors gezeigt werden, da die eingesetzten dominant negativen Arrestin-Mutanten V53D und Arrestin 319-418 die Internalisierung des US28-Rezeptors nicht beeinflußten. Weiterhin konnte bei der Internalisierung der US28 R129A-Mutante, die keine konstitutive Umlagerung von Arrestin-Molekülen in vesikulare Strukturen vermittelt, kein signifikanter Unterschied verglichen mit dem wt-Rezeptor beobachtet werden. Eine von β-Arrestin-Molekülen unabhängige Internalisierung ist in HEK293A-Zellen ebenfalls für den humanen Chemokinrezeptor CXCR2 beschrieben worden (Mueller et al., 1997). Überraschenderweise wurden in einem anderen Expressionssystem, in 3AsubE-Zellen, jedoch Hinweise auf eine β-Arrestin-abhängige Internalisierung von CXCR2 gefunden (Fan et al., 2001). Die β-Arrestin-Unabhängigkeit der US28-Internalisierung wird ebenfalls durch Experimente in Arrestin-defizienten Fibroblasten unterstützt, die aus β-Arrestin-1 und -2 deletierten Mausembryonen stammten (Fraile-Ramos et al., 2003). Somit scheint die Arrestin-unabhängige Internalisierung des US28-Rezeptors aufgrund der gleichen Beobachtungen in verschiedenen Spezies- und Zellsystemen ein generelles intrinsisches Merkmal des Rezeptors zu sein. Allgemein wurde die ursprüngliche Annahme einer generellen Arrestin-Abhängigkeit der GPCR-Endozytose durch zahlreiche Beobachtungen mittlerweile in Frage gestellt (Abb. 5.1.). So wurde eine von Arrestin-Molekülen unabhängige Internalisierung ebenso für den N-Formylpeptid-Rezeptor, den 5HT2A-Rezeptor und die muskarinergen m1-, -m3- und -m4-Rezeptoren beschrieben (Bhatnagar et al., 2001;Lee et al., 1998;Pals-Rylaarsdam et al., 1997;Vines et al., 2003).

Neben Arrestin-Molekülen sind verschiedene andere Moleküle an der Clathrin-abhängigen Internalisierung von GPCRs beteiligt. Zu diesen gehören der Adapterkomplex 2 (AP-2) und die GTP-ase Dynamin. AP-2 vermittelt über eine Bindung an β-Arrestin- und Clathrin-Moleküle die Einbindung des aktivierten GPCRs in CCVs. Bei einigen Rezeptoren, wie dem humanen Chemokinrezeptor CXCR2, kann diese Einbindung auch unabhängig von β-Arrestin über eine direkte Interaktion des Rezeptors mit dem AP-2-Komplex stattfinden (Fan et al., 2001).

Somit deutet die hier nachgewiesene Kolokalisation von US28 mit dem AP-2-Komlex an, daß US28 trotz der Unabhängigkeit von β-Arrestin über den Clathrin-Weg internalisiert wird. Diese Annahme wird durch elektronenmikroskopische Untersuchungen an US28-GFP Fusionsproteinen unterstützt, die eine Lokalisation des US28-Rezeptors in CCV zeigten (Fraile-Ramos et al., 2001). Eine weitere Komponente dieses Internalisierungsweges ist die GTP-ase Dynamin, die Clathrin-umhüllte Membranbereiche von der Plasmamembran abschnürt und damit eine Internalisierung des Rezeptors in CCVs erlaubt.

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Die Koexpression der Mutante mit GTP-ase-defizienter Aktivität, Dynamin K44A, bewirkte eine verminderte Internalisierung und die Anreicherung des US28-Rezeptors an der Zelloberfläche. Die nur partielle Hemmung der US28-Internalisierung nach Kotransfektion der dominant-negativen Dynamin-Mutante kann möglicherweise auf folgende Ursachen zurückgeführt werden: (1) Es gibt noch andere Dynamin-unabhängige Wege der Internalisierung des US28-Rezeptors. (2) Durch die Kotransfektion wurden nicht alle US28-transfizierten Zellen auch mit Dynamin K44A transfiziert, wodurch in einigen Zellen die Internalisierung des US28-Rezeptors nicht gehemmt werden konnte. (3) Die transfizierte Menge des Dynamin K44A war nicht ausreichend, um endogen exprimiertes Dynamin vollständig zu hemmen.

Dynamin ist neben der Abschnürung von CCV auch an der Abschnürung von Caveolae beteiligt (Ferguson, 2001;Henley et al., 1998). Zu den biologischen Aufgaben der Caveolae gehört zum einen die Organisation funktioneller Membranbereiche, in denen bestimmte Signalmoleküle zusammengeführt werden. Zu diesen zählen heterotrimere G-Proteine, Src Tyrosinkinasen und H-ras (Chun et al., 1994;Parton, 2003;Rehm und Ploegh, 1997). Eine zweite Funktion ist die Internalisierung und damit auch die Desensitivierung von GPCRs wie sie für CCR5, den B2-Bradykinin-Rezeptor, den ETA-Endothelinrezeptor und den Cholezystokininrezeptor beschrieben wurden (Chun et al., 1994;Lamb et al., 2002;Mueller et al., 2002;Roettger et al., 1995).

Caveolae und Lipid-Rafts sind durch eine Anreicherung von Cholesterin, Glykolipiden und Sphingophospholipiden charakterisiert (Abb.5.1.). Caveolae stellen spezielle Bereiche der Lipid-Rafts dar, die sich durch die Gegenwart des Proteins Caveolin auszeichnen. Caveolin selbst scheint für die strukturelle Integrität der Caveolae verantwortlich zu sein (Harder und Simons, 1997). Um eine Beteiligung von Caveolae an der US28-Internalisierung zu untersuchen, wurden pharmakologische Inhibitoren benutzt, die mit dem Cholesterin in der Membran in Wechselwirkung treten. MCD (10 mM) entfernt Cholesterin aus der Plasmamembran und beeinflußt dadurch nicht nur den Caveolae-, sondern auch den Clathrin-Weg (Rodal et al., 1999). Im Gegensatz dazu bindet Filipin III an das Cholesterin in der Plasmamembran und beeinflußt dadurch spezifisch die Internalisierung über den Caveolae-/Lipid-Raft-Weg. Die hier gezeigte Verminderung der US28-Rezeptor-Internalisierung in Gegenwart von Filipin lieferte einen ersten Hinweis darauf, daß US28 zusätzlich zum CCV-Weg auch über Caveolae

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Abb. 5.1. Internalisierungswege von GPCRs.

Der am besten untersuchte Weg der Internalisierung von GPCRs erfolgt abhängig von Arrestin-Molekülen über CCV. Neben diesem Hauptweg wurde bei einigen GPCRs auch eine Arrestin-unabhängige Internalisierung über CCV beschrieben. Weiterhin ist eine Endozytose von GPCRs über Lipid-Raft-abhängige Wege bekannt. Sie können entweder über Caveolae oder unabhängig von Caveolin erfolgen. Die Abschnürung der CCV und Lipid-Rafts wird durch die GTP-ase Dynamin vermittelt.

oder Lipid-Rafts internalisiert wird. Im Gegensatz dazu wird die Internalisierung des US28-Rezeptors nach Inkubation der Zellen mit 5 mM MCD nur zu frühen Zeitpunkten beeinflußt. Lipid-Rafts/Caveolae sind aufgrund des hohen Anteils an Cholesterin und Sphingophospholipiden unlöslich in TX-100-haltigem Lysepuffer. In Übereinstimmungdamit wurde ein Teil der US28-Rezeptor-Moleküle, nicht aber die als Kontrolle verwendeten MHC-Klasse-I-Moleküle, in der TX-100-unlöslichen Fraktion gefunden. Weiterhin führte die subzelluläre Fraktionierung US28-transfizierter Zellen über einen Saccharosegradienten zu einer Kofraktionierung des US28-Rezeptors und Caveolin 1, wenn der US28-Rezeptor in hohen Expressionsraten vorlag (persönliche Mitteilung A. Rehm). In diesem Zusammenhang ist die während der Doktorarbeit gezeigte US28-Palmitylierung von Interesse. Allgemein stellt die Palmitylierung von Cysteinresten eine strukturelle Voraussetzung für eine Assoziation verschiedener Proteine, wie Mitglieder der Src-Familie sowie einigen Gα-Untereinheiten, mit Lipid-Rafts/Caveolae dar (Resh, 1999). Die Verhinderung der Palmitylierung bewirkt ein vermindertes Vorkommen dieser Proteine in Lipid-Rafts oder Caveolae (Li et al., 1996;Waheed und Jones, 2002).

Das Fehlen einer Kolokalisation des US28-Rezeptors mit Caveolin 1 in der konfokalen Mikroskopie schließt eine Lipid-Raft-abhängige Internalisierung nicht aus, wenngleich damit eine Caveolae-abhängige Internalisierung des US28-Rezeptors unwahrscheinlich ist. In Übereinstimmung mit den hier dargelegten Beobachtungen für US28 wurde kürzlich eine Lipid-Raft-abhängige, aber Caveolin-unabhängige Internalisierung von CD36 beschrieben (Zeng et al., 2003). Ebenso zeigten Studien in Caveolin-defizienten Mäusen, daß durch das Fehlen der Caveolin-Moleküle die Endozytose Lipid-Raft/Caveolae-internalisierender Moleküle nichtbeeinflußt wird(Galbiati et al., 2001).

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Demgegenüber bewirkte der Einsatz von 0,4 M Saccharose, wodurch eine spezifische Hemmung des Clathrin-Wegs erreicht wird, eine starke Verminderung der US28-Internalisierung.

Zusammenfassend kann gefolgert werden, daß der Hauptweg der Internalisierung des US28-Rezeptors Arrestin-unabhängig über Clathrin-umhüllte Vesikel erfolgt. Zusätzlich ist ein Caveolin-unabhängiger, Lipid-Raft-abhängiger Weg an der Internalisierung beteiligt.

5.2.1  Die Internalisierung des US28-Rezeptors wird nicht durch die Aktivierung vonSignalwegen reguliert

Viele Moleküle, die an der Signalleitung beteiligt sind, wie G-Proteine, Rho, Rab, ARF6 sowie auch die verschiedenen Phosphoinosit-Moleküle, könnten ebenfalls an der Regulation der GPCR-Internalisierung beteiligt sein, da sie an der Restrukturierung des Aktinskeletts oder an der Bildung Clathrin-umhüllter-Vesikel mitwirken (Cavalli et al., 2001). Die Frage, ob eine Aktivierung intrazellulärer Signalwege die Internalisierung von GPCRs vermittelt oder die Internalisierung und die Signalleitung unabhängig voneinander reguliert werden, läßt sich gegenwärtig nicht eindeutig beantworten. Hinweise auf eine Unabhängigkeit von der Signalaktivierung und Endozytose liefern verschiedene Rezeptormutanten, die ihre G-Proteine nicht mehr aktivieren können, aber nach Stimulation durch ihren Liganden internalisiert werden. Andererseits sind signalleitungsdefiziente Mutanten beschrieben worden, die nicht mehr endozytiert werden (Übersichten in Chalmers und Behan, 2002). Ein neuartiger Mechanismus der Internalisierung von GPCRs ist kürzlich für Gαq-koppelnde Rezeptoren beschrieben worden. Die Internalisierung von CXCR4 und dem Thromboxan-A2 β-Rezeptor, zwei an Gαq-koppelnde Rezeptoren, ereignete sich teilweise unabhängig von PLC, PKC, GRK und Arrestin-Molekülen, war aber von einer Aktivierung der Gαq-Untereinheit abhängig(Rochdi und Parent, 2003).

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Für den US28-Rezeptor konnte eine konstitutive Aktivierung der PLC sowie des Transkriptionsfaktors NF-κB nachgewiesen werden (Casarosa et al., 2001;Waldhoer et al., 2002). Diese Aktivierung wird durch die Interaktion des Rezeptors mit der Gαq–Untereinheit vermittelt (Casarosa et al., 2001).Um zu untersuchen, ob die konstitutive Internalisierung abhängig von einer konstitutiven Aktivierung von Signalwegen ist, wurde die Mutante US28 R129A entwickelt. Diese Rezeptorvariante ist nicht in der Lage, über die heterotrimeren G-Proteine Signalwege zu aktivieren. Im Internalisierungsexperiment konnte jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen US28-Rezeptor und der R129A-Mutante festgestellt werden. Demnach kann für US28 ausgeschlossen werden, daß die Internalisierung über die Aktivierung intrazellulärer Signalwege vermittelt wird.

5.3 Strukturelle Voraussetzungen der US28-Rezeptorendozytose

5.3.1  Die phosphorylierungsdefizienten Mutanten US28 S1-12A und US28 STA internalisieren über die gleichen Wege wie der wt-Rezeptor

Die Phosphorylierung von C-terminalen Phosphoakzeptorstellen spielt eine entscheidene Rolle bei der Internalisierung von GPCRs. So führte der Austausch C-terminaler Serinreste durch Alaninreste bei CCR5 zu einer Verringerung der Rezeptorinternalisierung, die sich aufgrund einer fehlenden Interaktion mit Arrestin-Molekülen erklären läßt (Huttenrauch et al., 2002). Ebenso wie bei CCR5 führte der Austausch der C-terminalen Serine in der Variante US28 STA zu einer verminderten Internalisierung dieser Mutante gegenüber dem wt-Rezeptor (Mokros et al, 2002). Diese Verringerung kann aber nicht auf ein Fehlen der Interaktion mit Arrestin-Molekülen zurückgeführt werden, da der US28-Rezeptor unabhängig von Arrestin-Molekülen internalisiert (siehe vorheriger Abschnitt und (Fraile-Ramos et al., 2003). Deshalb wurden verschiedene Internalisierungswege für die phosphorylierungsdefizienten Mutanten US28 S1-12A oder US28 STA im Vergleich zum wt-Rezeptor untersucht. Da Internalisierungswege von phosphorylierungsdefizienten US28-Mutanten bisher nicht untersucht waren, sollte zunächst geprüft werden, welche Adaptermoleküle die Internalisierung beeinflussen. Die Kotransfektion der dominant-negativen Mutante für Dynamin führte bei der US28 S1-12A-Variante zu einer vergleichbaren relativen Hemmung der Internalisierung wie beim wt-Rezeptor. Daraus läßt sich folgern, daß die US28-Phosphorylierung keinen regulatorischen Einfluß auf die Funktion der Dynamin-Moleküle imVerlauf der Rezeptorendozytose besitzt. Der Einsatz der pharmakologischen Inhibitoren Filipin und Saccharose führte ebenso zu einer verminderten Internalisierung der US28 STA-Mutante, was analog zum wt-Rezeptor auf eine Beteiligung von Lipid-Rafts neben der Dominanz des CCV-Weges schließen läßt. Diese Annahme wird durch die Kolokalisation der phosphorylierungsdefizienten Mutante US28 S1-12A mit dem AP-2-Komplex gestützt. Zusammenfassend kann geschlossen werden, daß die Internalisierung der phosphorylierungsdefizienten Mutanten US28 S1-12A oder US28 STA in gleichem Maße von den untersuchten Adaptermolekülen abhängig war wie die Internalisierung des wt-Rezeptors. Dies läßt vermuten, daß die US28-Mutanten S1-12A und US28 STA über die gleichen Wege internalisiert werden wie der wt-Rezeptor und die Funktion der Adaptermoleküle nicht durch die US28-Phosphorylierung reguliert wird.

5.3.2 Bedeutung der Palmitylierung des US28-Rezeptors für die Rezeptorinternalisierung

Die Palmitylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation zytoplasmatischer und membranständiger Proteine. Sie ermöglicht u.a. die Verankerung zytosolischer Proteine an Membranen und beeinflußt weiterhin die Endozytose, das Recycling, die Proteinstabilität sowie Transportwege vom ER zur Plasmamembran verschiedener Proteine(sieheÜbersichten in (Bijlmakers und Marsh, 2003;Qanbar und Bouvier, 2003). Eine Palmitylierung wurde für verschiedene GPCRs beschrieben, darunter der β2-adrenerge-Rezeptor, der V2-Vasopressinrezeptor und CCR5 (Kraft et al., 2001;Percherancier et al., 2001;Schulein et al., 1996). In dieser Arbeit konnte ebenfalls eine Palmitylierung des viralen Chemokinrezeptors US28 gezeigt werden.

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Die Palmitylierung von GPCRs erfolgt an intrazytoplasmatisch gelegenen Cysteinresten vorwiegend am C-Terminus des Rezeptors, kann aber auch wie im Falle des µ-Opioidrezeptors sowie der V1- und V2-Vasopressinrezeptoren außerhalb dieses Bereiches stattfinden (Chen et al., 1998;Hawtin et al., 2001;Qanbar und Bouvier, 2003). Untersuchungen des Rhodopsin-Rezeptors konnten die Palmitylierung eines C-terminalen Cysteinrestes nachweisen, der 14 AS von der Transmembrandomäne entfernt war. Aufgrund des Abstandes von der vorhergesagten Transmembrandomäne wurde durch die Autoren vorgeschlagen, daß die Palmitylierung des Cysteinrestes die Ausbildung einer vierten intrazellulären Schleife bewirkt (Ovchinnikov Yu et al., 1988). Diese Vermutung konnte durch die Röntgenstrukturanalyse des Rinder-Rhodopsins erhärtet werden (Palczewski et al., 2000). Potentielle Palmitylierungsstellen des US28-Rezeptors befinden sich im C-Terminus an Position 304, 10 AS von der vorhergesagten Transmembrandomäne entfernt, sowie an Position 347 und an Position 66 in der ersten intrazellulären Schleife.

Die Relevanz C-terminaler Palmitylierungen für die Rezeptorphosphorylierung oder Internalisierung wurde beispielhaft an verschiedenen GPCRs untersucht. Der Austausch des Cysteinrestes an Position 341 durch einen Glutaminrest des β2-adrenergen-Rezeptors führte zu einer Hyperphosphorylierung, die auch nach der Stimulation des Rezeptors mit seinem Liganden nicht weiter erhöht werden konnte (Moffett et al., 1993). Im Gegensatz dazu zeigten Studien am Vasopressinrezeptor und an CCR5, daß der Austausch der C-terminalen Cysteinreste zu einer verringerten basalen und Liganden-vermittelten Phosphorylierung führte (Kraft et al., 2001;Schulein et al., 1996). Ferner zeigten palmitylierungsdefiziente Mutanten des V2-Vasopressinrezeptors (Schulein et al., 1996), des humanen Somatostatinrezeptors (Hukovic et al., 1998), des Thyreotropin-Releasing-Hormon-Rezeptors (Groarke et al., 2001)und von CCR5 (Kraft et al., 2001) ebenfalls eine veringerte Internalisierung. Im Falle des Thyreotropin-Releasing-Hormon-Rezeptors wurde diese verringerte Internalisierung auf eine verminderte Assoziation mit β-Arrestin-Molekülen zurückgeführt (Groarke et al., 2001). Im Gegensatz dazu führte der Austausch der potentiellen Palmitylierungsstellen Cystein 304 des US28-Rezeptors (C304A) zu keiner veränderten Internalisierung des Rezeptors. Ebenso wurde die Internalisierungsrate nach Austausch des Cysteinrestes an Position 347 durch einen Alaninrest nicht beeinflußt.

Die Palmitylierung einiger GPCRs stellt eine strukturelle Voraussetzung für ein fehlerfreies Erreichen der Plasmamembran dar. So zeigen die palmitylierungsdefizienten Mutanten des Vasopressinrezeptors und von CCR5 eine verminderte Lokalisation der Rezeptoren an der Zellmembran (Kraft et al., 2001;Schulein et al., 1996). Die Oberflächenexpression des US28-Rezeptors wurde nach Austausch der potentiellen Palmitylierungsstellen nicht beeinflußt (Daten werden nicht gezeigt). Unter Berücksichtigung der vorgelegten Daten kann geschlossen werden, daß die Palmitylierung C-terminaler Cysteinreste keine notwendige strukturelle Voraussetzung der US28-Endozytose darstellt.

5.3.3 Ein C-terminales Dileuzin-Motiv reguliert die Kinetik der US28-Internalisierung

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In dieser Arbeit konnte die Kolokalisation des AP-2-Komplexes und des US28-Rezeptors beschrieben werden. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung wurde kürzlich vorgeschlagen, daß die Internalisierung des US28-Rezeptors von AP-2 abhängig ist (Fraile-Ramos et al., 2003). Für eine direkte Interaktion mit dem AP-2-Komplex sind sogenannte Tyrosin- und Dileuzinmotive auf Seite der Rezeptoren beschrieben. Tyrosin-basierende Motive bestehen entweder aus NPxY- oder Yxxφ-Sequenzmotiven (wobei x für beliebige Aminosäure- und φ für hydrophobe Aminosäurenreste steht). Das Yxxφ-Motiv vermittelt die Bindung an die µ2-Untereinheit des AP-2-Komplexes (Owen und Evans, 1998).

Der US28-Rezeptor weist kein NPxY-Sequenzmotiv auf. Im Gegensatz dazu konnten auf zytoplasmatischer Seite vier Yxxφ-Konsensusmotive (Abb.1.6.) gefunden werden. Der Austausch der Tyrosine in den Konsensusmotiven führte zu keiner verminderten Internalisierung des US28-Rezeptors, so daß diese Motive nicht für eine direkte Interaktion mit dem AP-2-Komplex verantwortlich sein können. Neben Tyrosin-basierenden Motiven kann eine Bindung des Rezeptors auch über Dileuzin-Sequenzmotive an den AP-2-Komplex erfolgen. Eine exakte Lokalisation dieser Bindungsstelle innerhalb des AP-2-Komplexes ist bisher jedoch nicht bekannt. Allerdings scheint der Abstand der C-terminalen Dileuzinmotive von der Transmembranregion bedeutend für ihre Funktion zu sein. Dieser beträgt im Fall des US28-Rezeptors 10 AS von der vorausgesagten Transmembrandomäne und erfüllt somit einen Mindestabstand von 6-7 AS, um als Endozytosemotiv zu wirken (Geisler et al., 1998).

Die funktionelle Relevanz des Dileuzinmotivs für die Rezeptorinternalisierung wurde in Untersuchungen der humanen Chemokinrezeptoren CXCR2, CXCR4 und CCR5 bestätigt (Fan et al., 2001;Kraft et al., 2001;Orsini et al., 1999). Der Austausch der Dileuzinreste an Position 305/306 durch Alaninreste führte bei US28 zu einer um 30 % verminderten Internalisierung des Rezeptors nach 10 min. Nach 60 min war die Internalisierung jedoch identisch mit der des US28-wt-Rezeptors, was die Relevanz des C-terminalen Dileuzin-Motives für die Kinetik der US28-Internalisierung andeutet. Allerdings blieb die Kapazität der US28-Internalisierung von dem Austausch der Dileuzinreste unbeeinflußt.

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Andere Endozytose-vermittelnde Motive wie ein C-terminales Dithreonin-Motiv im Gonadotropinrezeptor des Huhns (Pawson et al., 2003) oder ein MxxxL-Motiv des Prostata-spezifischen-Membranantigens (Rajasekaran et al., 2003) konnten in der Sequenz des US28-Rezeptors nicht identifiziert werden.

5.4 Die intrazelluläre Sortierung des US28-Rezeptors

Yxxφ-Motive befinden sich nicht nur in endozytierenden Rezeptoren wie dem Transferrinrezeptor, sondern auch in der Aminosäuresequenz lysosomaler Membranproteine wie Lamp 1, Lamp 2 oder CD63 (siehe Übersichten in (Bonifacino und Dell'Angelica, 1999;Bonifacino und Traub, 2003). Da die Internalisierung des US28-Rezeptors unabhängig von den Yxxφ-Motiven war, könnten diese an der lysosomalen Sortierung des Rezeptors beteiligt sein. In diese Richtung weisen Untersuchungen an GFP-Fusionsproteinen des US28-Rezeptors, die eine Kolokalisation des US28-Rezeptors mit Lamp 1 und CD63 zeigten (Fraile-Ramos et al., 2001;Waldhoer et al., 2003).

Wie die Yxxφ-Motive sind auch Dileuzinmotive neben der Internalisierung auch an der endosomalen-lysosomalen Sortierung von Rezeptoren beteiligt. Kürzlich konnte ein Dileuzinmotiv des HIV-1 Gag-Vorläuferproteins pr55 identifiziert werden, das ähnlich dem Dileuzinmotiv des US28-Rezeptors eine schnelle Endozytose vermittelt. Darüber hinaus war das Dileuzinmotiv des HIV-Gag Proteins auch an dem Zusammenbau und der Freisetzung viraler Partikel beteiligt. Dabei wurde das Vorkommen dieses Proteins in multivesikulären Körperchen (MVB), die Bestandteil von späten Endosomen sind, als notwendiger Schritt für die Herstellung und Freisetzung viraler Partikel identifiziert. (Lindwasser und Resh, 2004). Als zellulärer Ursprung für die Lipidhülle des HCMV wurden ebenfalls die MVB vermutet (Fraile-Ramos et al., 2002). Eine Analyse der HCMV-kodierten Chemokinrezeptoren UL33 und US27, sowie der Hüllproteine gB und gH zeigten ein Vorkommen dieser Proteine in diesen zellulären Strukturen sowie in freien Viruspartikeln (Fraile-Ramos et al., 2002). Analog dazu wurde das Vorkommen von US28 in Viruspartikeln vermutet. Grundlage der Annahme waren elektronenmikroskopische Untersuchungen, die das Vorkommen des US28-Rezeptors in MVBs bestätigten (Fraile-Ramos et al., 2001). Somit könnte das Dileuzinmotiv des US28-Rezeptors für seine Lokalisation in MVBs ähnlich der des HIV-Gag Proteins verantwortlich sein.

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Ein weiterer Mechanismus der Proteinsortierung beruht auf der Ubiquitinierung zytoplasmatischer Lysinreste. Wie die Phosphorylierung oder Palmitylierung ist die Ubiquitinierung eine reversible posttranslationale Modifikation. Zusätzlich wirkt die einfache Ubiquitinierung als ein regulatorischer Mechanismus und beeinflußt u.a. die Rezeptorinternalisierung sowie die Sortierung verschiedener Proteine in MVBs. Der Austausch der Lysinreste im C-Terminus des CXCR4-Rezeptors verhinderte zwar nicht die Internalisierung des Rezeptors, aber dessen lysosomalen Abbau (Marchese und Benovic, 2001). Auch in der Aminosäuresequenz des
US28-Rezeptors befinden sich intrazytoplasmatische Lysinreste, die entweder eine Internalisierung, die Sortierung des Rezeptors in MVB oder den lysosomalen Abbau beeinflussen könnten.

5.5 US28-vermittelt eine konstitutive Umlagerung von Arrestin-Molekülen in US28-freie Vesikel

Arrestin-Moleküle sind sowohl an der Regulation der Desensitivierung von Rezeptoren, als auch an deren Internalisierung oder der Aktivierung intrazellulärer Signalwege (MAPK) beteiligt. Die Kotransfektion des US28-Rezeptors mit β-Arrestin-2-GFP führte zu einer Liganden-unabhängigen Umlagerung der Arrestin-Moleküle in intrazelluläre Vesikel. Dabei war auch der US28-Rezeptor Liganden-unabhängig in intrazellulären Vesikeln lokalisiert, ohne daß eine Kolokalisation beider Moleküle nachweisbar war. Weiterhin war die Internalisierung des US28-Rezeptors unabhängig von Arrestin-Molekülen. Ein ähnliches Phänomen konnte ebenfalls für den 5HT2A-Rezeptors beobachtet werden. Eine Stimulation des 5HT2A-Rezeptors mit seinem Liganden führte wie beim US28-Rezeptor zu einer Rekrutierung von Arrestin-Molekülen in vesikuläre Strukturen. Dabei konnte ebenfalls keine Kolokalisation zwischen Rezeptor und Arrestin-Molekülen beobachtet werden. Ferner war die Internalisierung des 5HT2A-Rezeptors wie bei US28 unabhängig von Arrestin-Molekülen (Bhatnagar et al., 2001).

Wie kann eine derartige Beobachtung erklärt werden? Zum einen könnte eine kurze Interaktion zwischen Rezeptor und Arrestin-Molekül an der Plasmamembran erfolgen. Danach würden Rezeptor und Arrestin-Moleküle in unterschiedliche Vesikel transportiert. In Übereinstimmung damit führte die Kotransfektion der phoshorylierungsdefizienten Mutante US28 S1-12A zu einem zytoplasmatischem Verteilungsmuster der β-Arrestin-Moleküle. Dies läßt eine direkte Interaktion des Rezeptors mit β-Arrestin vermuten, da die Phosphorylierung des C-Terminus die Affinität des Rezeptors für β-Arrestin-Moleküle erhöht. Die Transfektion der signalleitungsdefizienten Mutante US28 R129A führte ebenfalls zu keiner Umlagerung von β-Arrestin-Molekülen in vesikuläre Strukturen. Untersuchungen an CCR5-spezifischen Peptiden zeigten, daß Peptide des DRY-Motives eine stärkere Bindungsaffinität an β-Arrestin-Moleküle besitzen, als die von Peptiden des phosphorylierten C-Terminus. Deshalb wurde angenommen, daß das DRY-Motiv als weitere Bindungsstelle für Arrestin wirken kann (Huttenrauch et al., 2002). Somit könnte der Austausch des Argininrestes 129 ebenso wie der Austausch der C-terminalen Phosphorylierungsstellen zu einer Zerstörung möglicher Bindungsstellen des US28-Rezeptors für β-Arrestin-Moleküle geführt haben.

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Im Gegensatz zu dieser Vermutung legten Untersuchungen am 5 HT2A-Rezeptor nahe, daß die Umlagerung der Arrestin-Moleküle nicht durch eine direkte Bindung von Arrestinen mit dem DRY-Motiv des Rezeptors vermittelt wird, sondern durch eine vom DRY-Motiv-vermittelte Aktivierung von Signalkaskaden. Grundlage für diese Ansicht bildeten Experimente mit einem Antagonisten für den 5 HT2A-Rezeptor. Dieser verhinderte die Rezeptoraktivierung und Signalleitung sowie die Umlagerung von β-Arrestin-Molekülen, nicht aber die Internalisierung des Rezeptors (Bhatnagar et al., 2001). Eine Aktivierung verschiedener Signalwege könnte analog dem 5HT2A-Rezeptor ebenso bei dem US28-Rezeptor für die konstitutive Umlagerung von β-Arrestin-Molekülen verantwortlich sein. Diese Annahme wird insbesondere von den hier gezeigten Ergebnissen gestützt, daß die R129A-Mutante signalleitungsdefizient ist und im Gegensatz zum wt-Rezeptor keine Umlagerung von Arrestin vermittelt. Weiterhin scheint der Austausch der Phosphorylierungsstellen am C-Terminus zu einer veränderten Kopplung an G-Protein-Untereinheiten zu führen (Mokros, 2004). Dadurch könnte eine veränderte Aktivierung von Signalwegen bewirkt werden, die die diffuse zytoplasmatische Verteilung der Arrestin-Moleküle durch die der US28 S1-12A Mutante erklärt. Ein Einsatz spezifischer Inhibitoren für verschiedene Signalwege könnte eine mögliche Beteiligung verschiedener Signalwege bei der Arrestin-Umlagerung aufklären helfen.

Eine weitere Erklärung für die unterschiedliche Lokalisation des Rezeptors und der β-Arrestin-Moleküle in den verschiedenen vesikulären Kompartimenten könnte durch eine direkte oder signalvermittelte Aktivierung eines zweiten unbekannten Rezeptors geliefert werden. So wird die Aktivität einiger GPCRs durch die Bildung von Homo- oder Heterodimeren reguliert. Beispielsweise ist die direkte molekulare Interaktion des Typ 2 GABAB-Rezeptors und des Typ 1 GABAB-Rezeptors notwendig, um ihren Transport an die Zelloberfläche zu gewährleisten (Jones et al., 1998). Die molekulare Wechselwirkung des D2-Dopaminrezeptors und des Somatostatinrezeptors führte zu einer verstärkten Aktivität des Heterodimers (Rocheville et al., 2000). Analog könnte direkt oder durch die konstitutive Aktivität des US28-Rezeptors die Aktivierung eines weiteren Rezeptors vermittelt werden. In der Folge würden beide Rezeptoren phosphoryliert, wodurch β-Arrestin-Moleküle an die Plasmamembran rekrutiert würden und der zweite unbekannte Rezeptor zusammen mit den β-Arrestin-Molekülen in Vesikeln internalisiert wird, die nicht den US28-Rezeptor enthalten. Einen solchen Rezeptor könnte CXCR4 darstellen, da CXCR4 endogen in den hier verwendeten HEK293A-Zellen exprimiert wird. Es wurde beobachtet, daß nach Kotransfektion des US28-Rezeptors eine Abnahme von CXCR4 von der Zelloberfläche erfolgte, die aber nach Kotransfektion mit den US28-homologen humanen Chemokinrezeptoren CCR5 und CCR1 nicht festgestellt wurde (Pleskoff et al., 1998). Diese Beobachtung wird auch als heterologe Desensitivierung bezeichnet. Ein weiteres Beispiel einer heterologen Desensitivierung wurde kürzlich für den konstitutiv-aktiven GPCR ORF 74 des Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus beschrieben. Nach seiner Koexpression mit dem Thyrotropin-Releasing-Hormon- und m1-muscarinergen-Acetylcholinrezeptor wurde deren Fähigkeit, Kalziumsignale zu aktivieren, stark gehemmt (Lupu-Meiri et al., 2001). Kürzlich konnte ebenso eine heterologe Desensitivierung für die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 beobachtet werden. Die vorherige oder simultane Stimulation mit den rezeptorspezifischen Liganden bewirkte eine Inhibition der Signalleitung, Adhäsion und Chemotaxis des jeweils anderen Rezeptors (Hecht et al., 2003).

Was sind die möglichen Auswirkungen der konstitutiven Umlagerung von Arrestin-Molekülen in vesikuläre Strukturen? Zum einen könnte durch die konstitutive, durch US28-induzierte Arrestinumlagerung ein Mangel an freien Arrestin-Molekülen entstehen und somit die Desensitivierung weiterer GPCRs vermindern. Daraus würde eine Verstärkung oder Verlängerung verschiedener Signalwege resultieren. Grundlage für diese Vermutung bilden Untersuchungen an den Neurokininrezeptoren 1 und 3. Die Aktivierung des Neurokininrezeptors 1 führte zu einem verminderten Vorkommen freier Arrestin-Moleküle in der Zelle. Dadurch konnte die Desensitivierung des Neurokininrezeptors nicht länger gewährleistet werden und es folgte eine verlängerte Signalaktivierung des Rezeptors (Schmidlin et al., 2002). Interessanterweise wird auch die Aktivierung von NF-κB durch den humanen RANTES-Rezeptor CCR1 nach Koexpression des US28-Rezeptors signifikant verstärkt. Ob diese Hyperaktivierung aufgrund einer fehlenden Desensitivierung von CCR1 durch die Besetzung der Arrestin-Moleküle vermittelt wird, wurde nicht untersucht (Bakker et al., 2004).

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Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß der US28-Rezeptor, obwohl er unabhängig von Arrestin-Molekülen internalisiert, eine Umlagerung von Arrestin in Endozytosevesikel bewirkt. Weiterhin wurde erstmalig gezeigt, daß US28 und Arrestin-Moleküle dabei nicht in denselben Vesikeln lokalisierten. Die molekularen Mechanismen dieser Umlagerung konnten noch nicht im Detail geklärt werden. Mögliche funktionelle Konsequenzen der Umlagerung von Arrestin-Molekülen können in einer Hyperaktivierung anderer Rezeptoren vermutet werden.

5.6 Strukturelle Vorausetzung des US28-Rezeptors für die Aktivierung intrazellulärer Signalwege

Der US28-Rezeptor vermittelt Liganden-unabhängig eine Aktivierung der Phospholipase C sowie der Transkriptionsfaktoren NF-κB und CREB (Casarosa et al., 2001;Waldhoer et al., 2002). Die Eigenschaft der konstitutiven Signalleitung teilt der US28-Rezeptor mit konstitutiv aktiven Mutanten humaner GPCRs. Gleichzeitig scheint die konstitutive Aktivität unter viralen Chemokinrezeptoren ein weit verbreitetes Merkmal zu sein. Besonders ausführlich wurden der ORF74 des Kaposi Sarkom-assoziierten Herpesvirus, UL33 des HCMV und seine homologen Rezeptoren im Maus- und Ratten-Zytomegalievirus, M33 und R33 untersucht.

Bei einigen der konstitutiv aktiven Mutanten humaner GPCRs oder viral kodierter Chemokinrezeptoren konnte das DRY-Motiv am Übergang der dritten Transmembrandomäne als eine strukturelle Voraussetzung für ihre konstitutive Aktivität identifiziert werden. Ein Schlüsselschritt für den Übergang des Rezeptors in einen aktiven Konformationszustand beinhaltet die Protonierung der Asparaginsäure innerhalb dieses Motivs (Gether, 2000). Dementsprechend führte der Austausch der Asparaginsäure bei dem β2-adrenergen Rezeptor und CCR2 zu konstitutiv aktiven Rezeptormutanten, woraus geschlossen wurde, daß das DRY-Motiv für die Stabilisierung inaktiver Rezeptorkonformationen verantwortlich ist (Rasmussen et al., 1999). Weiterhin besitzt der Kaposi-Sarkom-assoziierte Chemokinrezeptor ORF74 ein VRY-Motiv, wodurch seine konstitutive Aktivität vermittelt wird (Burger et al., 1999).

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Andererseits führte der Austausch des Argininrestes im konservierten DRY-Motiv zu einer Inaktivierung verschiedener Signalwege bei CCR5 und somit zu einer Hemmung der CCR5-vermittelten Chemotaxis (Gosling et al., 1997). Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, führte der Austausch des Argininrestes an Position 129 des konservierten DRY-Motives bei dem US28-Rezeptor zum Verlust der konstitutiven NF-κB-Aktivierung sowie der RANTES-abhängigen Aktivierung von MAPK. Zudem ist auch die konstitutive Aktivierung von PLC von der Expression des Arginin 129 abhängig (Waldhoer et al., 2003). Somit konnte mit dem DRY-Motiv des US28-Rezeptors eine entscheidene strukturelle Voraussetzung für die Aktivierung Liganden- und konstitutiv-vermittelter Signalwege identifiziert werden.

5.7 Die Rolle des US28-Rezeptors während der HCMV-Infektion

Ein Mechanismus des HCMV dem Immunsystem zu entgehen beinhaltet eine Wechselwirkung viraler Genprodukte mit dem Chemokinsystem. Bereits der Kontakt einer Zelle mit dem HCMV ist ausreichend, um eine Ausschüttung des inflammatorischen Chemokins RANTES zu bewirken. Dennoch nimmt die Menge an RANTES aus der Umgebung infizierter Zellen im Verlauf der Infektion ab (Michelson et al., 1997). Dieser Effekt ist abhängig von der Expression des US28-Rezeptors (Billstrom et al., 1999;Bodaghi et al., 1998). Als molekularer Mechanismus dieser effizienten Chemokinentfernung kann die Endozytose des US28-Rezeptors angesehen werden (Fraile-Ramos et al., 2001).

Während dieser Arbeit konnten molekulare Details der US28-Endozytose aufgezeigt werden. Die Endozytose des US28-Rezeptors erfolgte vorwiegend über CCVs. Auf diesem Weg der Internalisierung wird bei einigen Rezeptoren nach der schnellen Endozytose ein schnelles Recycling des Rezeptors zurück an die Zelloberfläche ermöglicht. Anschließend steht der Rezeptor für eine erneute Chemokininternalisierung wieder zur Verfügung. Tatsächlich wurde das Recycling des US28-Rezeptors im Anschluß an seine Endozytose nachgewiesen (Fraile-Ramos et al., 2001). Ferner stellte die konstitutive Phosphorylierung des US28-Rezeptors eine wichtige strukturelle Voraussetzung für ein effizientes Entfernen der inflammatorischen Chemokine dar. Neben der Internalisierung des US28-Rezeptors durch CCVs konnten Lipid-Rafts als weiterer Weg der Internalisierung identifiziert werden. Eine kürzlich veröffentlichte Studie schlug Lipid-Rafts als Bereiche für den HIV-Eintritt vor (Hug et al., 2000). Damit könnte eine Lokalisation des US28-Rezeptors in diesem Kompartiment für seine HIV-Korezeptor-Funktion benötigt werden (Pleskoff et al., 1997).

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Weiterhin wurde vermutet, daß die durch den US28-Rezeptor-vermittelten proliferativen Signale (NF-κB und MAPK) Apoptose verhindern sowie an der Ausbildung der Latenz und Persistenz des HCMVs beteiligt sind (Beisser et al., 2002;Beisser et al., 2001;Billstrom Schroeder et al., 2002). Während dieser Arbeit konnte das Arginin 129 im konservierten DRY-Motiv des US28-Rezeptors als notwendige strukturelle Grundlage für die durch den Rezeptor-vermittelte Aktivierung proliferativer Signalwege identifiziert werden.

In HCMV-infizierten Zellen werden die MAPK ERK1, ERK2 und p38 6-8h nach der Infektion aktiviert. Zusätzlich zu dieser frühen Phase der Aktivierung ist für die p38 MAPK ebenso eine Aktivierung 24-48h nach der HCMV-Infektion beschrieben werden. Diese Aktivierung der p38 korreliert mit einer zeitlichen Expression des US28-Rezeptors. Ebenfalls ist für den US28-Rezeptor in unterschiedlichen Zellsystemen sowohl eine konstitutive als auch eine RANTES-vermittelte Aktivierung der p38 MAPK beschrieben worden (Miller et al., 2003;Waldhoer et al., 2002). Somit kann vermutet werden, daß der US28-Rezeptor für die späte Aktivierung der p38 MAPK in HCMV-infizierten Zellen verantwortlich sein könnte. In diesem Zusammenhang könnte eine in HCMV-infizierten Zellen beobachtete p38-abhängige Aktivierung des HSP27 von Interesse sein, da HSP27 einen Schutz vor Apoptose durch zellulären Streß vermittelt(Johnson et al., 2000)). Somit wurde vermutet, daß die Aktivierung der p38 MAPK dazu beiträgt, dem Virus eine vollständige Virusreplikation zu ermöglichen, bevor die Wirtszelle aufgrund des lytischen Zyklus abstirbt (Fortunato et al., 2000).

5.8 Ausblick

Zusammenfassend beschreiben die hier vorgelegten Daten die molekularen Mechanismen US28-vermittelter Funktionen. Insbesondere stellt die Internalisierung des US28-Rezeptors über CCV die molekulare Grundlage zur Entfernung inflammatorischer Chemokine aus der Umgebung infizierter Zellen dar. Bei der im Zusammenhang mit der Endozytose beobachteten konstitutiven Umlagerung von Arrestin-Molekülen in vesikuläre Strukturen konnte ein molekularer Mechanismus bisher nicht gefunden werden. Weitere Untersuchungen in diesem Zusammenhang könnten eine Beeinflussung anderer GPCRs oder GPCR-vermittelter Signalleitung durch den US28-Rezeptor aufzeigen.

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Tyrosin oder Dileuzin-basierende Sequenzmotive können neben der Internalisierung auch an einer intrazellulären Sortierung in MVBs oder späte Endosomen beteiligt sein. Mit Hilfe der in dieser Arbeit hergestellten Rezeptor-Varianten kann die Sortierung des US28-Rezeptors und damit ein möglicher später Einbau in die Virushülle untersucht werden.

Alle bisher diskutierten Funktionen des US28-Rezeptors, die mit der Ausbreitung des Virus, der Ausbildung der Latenz oder der Umgehung des Immunsystems im Zusammenhang stehen, basieren auf Daten, die in vitro aus verschiedenen Versuchen abgeleitet wurden. Für mögliche in vivo Versuche stehen derzeit keine Tiermodelle zur Verfügung, da die Zytomegalieviren der Maus oder Ratte keinen US28-homologen Chemokinrezeptor besitzen. Daher wäre eine Etablierung von Tiermodellen hilfreich, um das defizile Wechselspiel zwischen Virus und Wirt zu verstehen.


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01.12.2006