6 Zusammenfassung / Summary

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Humane Zytomegalieviren (HCMV) etablieren nach einer Primärinfektion eine lebenslange latente oder persistierende Infektion. Es wird allgemein angenommen, daß hieran die Manipulation der humanen Immunantwort durch das Virus beteiligt ist. In der jüngeren Vergangenheit wurden zahlreiche viruskodierte Genprodukte beschrieben, die eine immunmodulierende Funktion besitzen. Hierzu zählen die Hemmung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen und die Beeinträchtigung der Leukozytenwanderung durch die Hemmung des Chemokinsystems.

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Für die Aktivierung von CD8+ T-Zellen wird die Präsentation viraler Peptide durch MHC-Klasse-I-Moleküle an der Oberfläche infizierter Zellen benötigt. Interessanterweise kodiert HCMV für vier Gene (US2, US3, US6 und US11), die eine Präsentation viraler Peptide auf der Oberfläche infizierter Zellen verhindern. Die Effizienz der US11-vermittelten Hemmung der T-Zell-Aktivierung wurde in einem rekombinanten Modell zur MHC-Klasse-I-vermittelten T-Zell-Aktivierung untersucht. Obwohl die Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle nach adenoviralem US11-Transfer in dendritische Zellen (DCs) um bis zu 60% vermindert war, konnte keine Hemmung der T-Zell-Proliferation beobachtet werden. Somit kann angenommen werden, daß neben der US11-Expression die Expression weiterer viraler Genprodukte für die Hemmung der T-Zell-Aktivierung in infizierten Zellen notwendig ist.

Mit US27, US28,UL33 und UL78 kodiert das HCMV für vier G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die Sequenzhomologien zu humanen Chemokin-Rezeptoren aufweisen. US28 ist der einzige funktionelle Rezeptor für die humanen inflammatorischen Chemokine MCP-1, MCP-3, RANTES, MIP-1α, MIP-1β sowie Fraktalkine. Nach Liganden-Stimulation vermittelt US28 die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen und Fokalen Adhäsionskinasen. Daneben induziert die US28-Expression eine konstitutive Aktivierung der Phospholipase C, sowie der Transkriptionsfaktoren NF-κB und CREB. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe von positionsspezifischen Rezeptormutanten der Argininrest an Position 129 des konservierten DRY-Motivs als strukturelle Voraussetzung sowohl für die konstitutive als auch eine Liganden-vermittelte Aktivierung von Signalwegen identifiziert werden.

Ferner bewirkt die Expression des US28-Rezeptors eine Entfernung inflammatorischer Chemokine aus der Umgebung infizierter Zellen. Dies wurde als ein Mechanismus gedeutet dem Immunsystem zu entgehen, indem die Rekrutierung von Leukozyten an den Ort der Infektion verhindert wird. Molekulare Grundlage der Liganden-Depletion stellt die Endozytose des US28-Liganden-Komplexes dar. Die Endozytose sowie die geringe Expression des US28-Rezeptors an der Zelloberfläche sind abhängig von seiner C-terminalen Phosphorylierung, was eine β-Arrestin-vermittelte Endozytose über den Clathrinweg andeutet. Es konnte gezeigt werden, daß der US28-Rezeptor zwar eine Umlagerung von β-Arrestin-Molekülen in vesikuläre Strukturen vermittelt, der Rezeptor jedoch unabhängig von Arrestin-Molekülen endozytiert wird. Zudem kommen beide Moleküle nicht gemeinsam in denselben Endozytosevesikeln vor. Die Endozytose des US28-Rezeptors war abhängig von der GTP-ase Dynamin. Sie bewirkt eine Abschnürung von Endozytosevesikeln sowohl auf dem Clathrin- als auch über den Lipid-Raft-abhängigen Weg. Die Beteiligung des Lipid-Raft-Weges an der US28-vermittelten Endozytose konnte durch eine verminderte Rezeptorendozytose nach Hemmung des Lipid-Raft-Weges und das Vorkommen des Rezeptors in der Detergenz-unlöslichen Zellfraktion gezeigt werden. Da die Hemmung des Clathrinweges durch Saccharose jedoch eine zweifach stärkere Verminderung der US28-Endozytose bewirkte, kann der Clathrin-abhängige Weg als der Hauptweg der US28-Endozytose angesehen werden. Gestützt wird diese Ansicht durch die Kolokalisation des US28-Rezeptors mit dem Clathrin-bindenden AP-2-Komplex in Endosomen. Mutagenesestudien des US28-Rezeptors deuten zudem an, daß ein C-terminales Dileuzin-Motiv nicht nur für die schnelle Rezeptorendozytose notwendig ist, sondern möglicherweise auch die direkte Kopplung an den AP-2-Komplex vermittelt.

Summary

Primary infections of the ubiquitous human cytomegalovirus (HCMV) are followed by a lifelong infection in the state of latency or persistence. It is believed that the virus employs a number of immunomodulatory mechanisms in order to establish latent infections. More recently, immunosubversive functions have been identified for several herpesvirus gene products. Among these are the inhibition of cytotoxic CD8+ T-cells and the impairment of leukocyte migration by the neutralization of chemokines.

Activation of CD8+ T-cells is triggered by the presentation of viral peptides by MHC class I molecules on the surface of infected cells. Interestingly, HCMV encodes four genes (US2, US3, US6 and US11) which are responsible for the abrogation of MHC class I restricted antigen presentation on the surface of infected cells. The potency of US11 to mediate the inhibition of T-cell activation was analysed in a recombinant model of MHC class I mediated T-cell activation. Surface expression of MHC class I molecules was reduced by 60 % after adenoviral transfer of US11 into murine dendritic cells. In contrast, there was no significant reduction in the capacity of the dendritic cells to induce T-cell proliferation, indicating that the expression of additional viral genes is required for the inhibitory effect on T-cell activation observed in HCMV infected cells.

HCMV encodes four putative G-protein coupled receptors with sequence homology to human chemokine receptors: US27, US28, UL33 and UL78. To date, only the US28 gene product has been characterized as a functional receptor for the inflammatory chemokines RANTES (CCL5), MCP-1 (CCL2), MCP-3 (CCL7), MIP-1 (CCL3), MIP-1 (CCL4) and fractalkine (CX3CL1). Upon ligand stimulation US28 mediates the activation of mitogen-activated protein kinases and focal adhesion kinases. Additionally, expression of US28 results in constitutive activation of phospholipase C and the transcription factors NF-B and CREB. By generating site directed receptor mutants it was shown that the arginine at position 129 which is located in the conserved “DRY-motif” represents a structural requirement for both the ligand-induced and the constitutive signaling by US28.

Moreover, it was suggested that the US28 dependent sequestration of chemokines from the environment of infected cells hinders leukocytes from the recruitment to sites of viral infection and therefore represents a mechanism of viral immune escape. A molecular mechanism for the ligand depletion may be provided by the endocytosis of US28-ligand complexes. Endocytosis and surface expression of US28 were regulated by C-terminal receptor phosphorylation, indicating β-arrestin mediated endocytosis on a clathrin dependent pathway. Confocal microscopy studies revealed that US28 expression induced a redistribution of β-arrestin molecules into vesicular cytoplasmic structures. In contrast, β-arrestin was dispensable for the endocytosis of the US28 receptor. Furthermore, both of the molecules resided in distinct endocytic vesicles. However, US28 endocytosis was dependent on the small GTPase dynamin, which is responsible for the fission of endocytic vesicles both in the clathrin dependent and in the lipid raft dependent pathway. A role for the lipid raft dependent pathway in US28 endocytosis was shown by impaired receptor endocytosis after inhibition of the lipid raft pathway as well as by the presence of US28 in the detergent insoluble cell fraction. Since inhibition of the clathrin dependent pathway by succrose resulted in a two-fold stronger reduction of US28 endocytosis, the clathrin-dependent pathway can be considered as the major route of US28 endocytosis. This notion is supported by the endosomal colocalization of US28 together with the clathrin binding AP-2 complex. In addition, mutagenesis studies of the US28 receptor indicate that a C-terminal di-leucine-motif is not only required for rapid receptor endocytosis, but may also regulate a direct interaction with the AP-2 complex.


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01.12.2006