Herstellung einer CAPE-Membran :

Das Ausgangsmaterial ist ein 19x29cm großes Filterpapier (Whatmann 50, Maidstone, United Kingdom). Im ersten Arbeitsschritt wird die Zellulose–Membran mit 400 mg para-Toluolsulfonsäure (PTS, Firma Fluka), gelöst in 50 ml Methanol (MeOH, Firma Merck) angesäuert. Dazu wird die Membran in die Lösung gegeben, und 5 min geschüttelt (Rocky®, Firma Fröbel Labortechnik). Nach dem Abgießen der Lösung wird die Membran bei 30°C getrocknet.

Die Ansätze A und B (Tab. 2) werden auf 80°C erhitzt, und in eine vorgeheizte Instrumentenschale gegeben. Danach wird die Membran eingelegt und 3h bei 80°C geschüttelt.

Lösungen einzeln in Bechergläsern bei 80^oC gelöst

Chemikalie

Hersteller

Menge

A) 1,4-Dioxan

Merck

45ml

N-(2,3-epoxypropyl)-phthalimid

Merck

8g

B) 1,4-Dioxan

Merck

5ml

para-Toluolsulfonsäure (PTS)

Fluka

400mg

Tab. 2: Ansatz zur Derivatisation der Zellulose

Anschließend wird die Membran 3x5 min mit Dioxan und 2x5 min mit Ethanol (EtOH) bei RT gewaschen. Danach wird die primäre Aminofunktion durch das Abspalten der Phthalimidgruppe mittels Hydrazinhydrat erzeugt (Tab. 3).

Lösung auf die Membran geben, 6-8 Std. inkubieren bei Raumtemperatur.

Chemikalie

Hersteller

Volumen

Ethanol

Herbeta Arzneimittel

60ml

Hydrazinhydrat (80%ig)

Merck

6ml

Tab. 3: Ansatz zur Bildung der primären Amidgruppe

Nach den sich anschließenden Waschschritten (2x EtOH waschen, 3x DMA [Firma Merck] waschen, 2x EtOH waschen, 2xEther [Firma Merck] waschen und trocknen), ist die Zelluloseaminopropylether-Membran (CAPE-Membran) für die eigentliche SPOT-Synthese fertiggestellt.

Fmoc-Quantifizierung:

Die Beladung der Membran mit primären Aminofunktionen wird über die Fmoc–Quantifizierung bestimmt. Dazu werden am Rand der Membran fünf Spots mit je 1 µl 0,3 M Fmoc-ß-Alanin-OPfp in Dimethylsulfoxid (DMSO, Firma Merck) gelöst aufgetragen. Die Reaktionszeit beträgt 15 min. Die Kopplung wird zwei Mal wiederholt. Anschließend kann das Membranstück abgeschnitten, mehrfach gewaschen und getrocknet werden. Die Spots können jetzt ausgestanzt, in je ein 1,5 ml Eppendorfgefäß gegeben und mit je 1ml 20% Piperridin versetzt werden. Nach dem Verschließen der Reaktionsgefäße wird 20 min geschüttelt. Anschließend wird für jeden Spot die Absorption bei 302 nm in einem UV-Spektrometer (Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech, England) bestimmt. Als Blindwert dient eine 20% Piperridinlösung. Die Bestimmung der Konzentration erfolgt nach dem Lambert-Beer-Gesetz.

Die für diese Arbeit verwendeten Membranen hatten nach den Messungen eine Beladung zwischen 16 und 20 nmol/cm².

Definieren der Spots für die Synthese:

Eine 0,3 M ß-Alanin-OPfp-Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO, Firma Merck) wird hergestellt und mit Hilfe des Auto-Spot Robot ASP 222 XL punktförmig auf die CAPE–Grundmembran aufgetragen. Anschließend werden alle nicht benetzten Aminogruppen nach folgendem Prozedere acetyliert: Die Membran wird 2-3 min in eine Lösung aus 2% Acetanhydrid in DMA gelegt. Danach wird der Träger 30 min in einem Gemisch aus in DMA gelösten 2 % Acetanhydrid (Firma Merck), 1% N-Ethyl-Diisopropylamin (DIPA, Firma Merck) in DMA geschüttelt. Nach der Acetylierung werden folgende Schritte ausgeführt: 5x Waschen mit DMA, 20 min Fmoc-Gruppenabspaltung mit 20% Piperidin (Firma Merck) in DMA, 5x Waschen mit DMA á 3 min und anschließend 2x Waschen mit EtOH á 3 min. Die freien Aminogruppen werden reversibel mit Bromphenolblau (Firma Fluka) angefärbt. Danach folgen 2 Waschschritte mit EtOH á 2x3 min und Ether (Firma Merck) á 2x3 min.

Herstellung der Aminosäurelösungen:

Fmoc-ß-Alanin-OPfp wird für die erste Kopplung und die Fmoc–Quantifizierung in Dimethylsulfoxid (DMSO, Firma Merck) gelöst.

Die anderen Aminosäuren (Tab. 14) werden in 1-Methyl-2-Pyrrolidon (NMP, Firma Merck) gelöst. Alle Aminosäuren werden von Bachem oder Nova Biochem erworben. Die Konzentration beträgt durchgehend 0,3 Molar.

Synthese der zellulosegebundenen Peptide:

Die Aminosäuren werden nacheinander nach dem gleichen Arbeitsablauf (Abb. 7) auf die Membran aufgetragen: 3x3 min waschen mit DMA, 20 min Fmoc–Gruppenabspaltung mit 20% Piperidin in DMA, 5x3 min waschen mit DMA , 2x3 min waschen mit EtOH, Anfärben der freien Aminogruppen mit Bromphenol–blau (Firma Fluka), 2x3 min waschen mit EtOH und zuletzt 2x3 min waschen mit Ether. Durch die Abspaltung der Fmoc-Gruppe wird der N–Terminus der Aminosäure für den sich anschließenden Reaktionszyklus freigesetzt. Die Reaktionszeit für die Bildung der Amidbindung beträgt pro Kopplungszyklus 15 min.Um die kontrollierte Verlängerung der Peptidketten zu ermöglichen, sind die funktionellen Seitenketten der Aminosäuren geschützt (siehe Tab.4). Am Ende der Peptidsynthese müssen diese Gruppen in zwei Arbeitsschritten abgespaltet werden.

Schutzgruppe

Aminosäure

Trityl

für Cystein, Asparagin, Glutamin

t-Butyloxycarbonyl

für Histidin, Lysin und Tryptophan

Pentamethylchroman-6-sulfonyl

für Arginin

t-Butyl

für Glutamat, Aspartat, Serin und Threonin

Tab. 4: Schutzgruppen der Aminosäuren

Im ersten Abspaltungsschritt werden die zellulosegebundenen Peptide dieser CAPE-Membran mit einer 90% Trifluorethansäurelösung (TFA) (siehe Tab. 5) für 30 min ohne Schüttelbewegungen inkubiert.

Chemikalien

Hersteller

Menge

destilliertes Wasser

1ml

Dichlormethan (DCM)

Merck

2,5ml

Phenol

Merck

0,5g

TFA

Merck

45ml

Triisobutylsilan (TIPS)

Merck

1,5ml

Tab. 5: Abspaltung 1

Danach erfolgen mehrere Waschschritte:

4x3 min mit DCM, 3x3 min mit DMA, 3x3 min mit EtOH und 2x3 min mit Ether. Im zweiten Abspaltungsschritt wird die Membran mit einer 50% TFA–Lösung (Tab. 6) für 150 min unter Schüttelbewegungen behandelt.

Chemikalien

Hersteller

Menge

destilliertes Wasser

1ml

Dichlormethan (DCM)

Merck

22,5ml

Phenol

Merck

0,5g

TFA

Merck

25ml

Triisobutylsilan (TIPS)

Merck

1,5ml

Tab. 6: Abspaltung 2

Nach den Waschschritten 4x3 min mit DCM, 3x3 min mit DMA, 3x3 min mit EtOH und 2x3 min mit Ether, wird die Membran getrocknet und dann in den Screening-Experimenten eingesetzt.

Abb. 7: Zusammenfassung des praktischen Ablaufes der Spotsynthese

Die Arrays bestehen aus 15 Markierungspeptiden á 10 Aminosäuren mit der Primärsequenz LASDLIVPRR und 2953 Peptiden á 15 Aminosäuren aus dem Proteom der Bäckerhefe. Das Peptid LASDLIVPRR dient als Positionierungs–hilfe zum Anlegen der Messschablone von dem Programm Genespotter. Die Markierungspeptide erscheinen immer positiv im Screening. Die 2953 Peptide wurden mittels bioinformatischer Werkzeuge erzeugt (Abb. 8)(16).

Die Auswahl der Peptide ist das Ergebnis von Voruntersuchungen der Forschergruppe von Prof. Cesareni (Universität von Rom) (16). Die 2953 polyprolinhaltigen Sequenzen wurden durch einen limitierenden Suchalgorhythmus aus dem Hefeproteom (5885 Proteine) gewonnen. Diese Anzahl der Peptide ist für die SPOT-Synthese handhabbar.

Die Untersuchung soll zum ersten Mal Aufschluss über die Selektivität der SH3–Domäne mit einer möglichst repräsentativen Anzahl von polyprolin–haltigen Liganden der Hefe geben. Vier CAPE-Membranen werden nach dem Standardprotokoll (29)(30)(31)mit 2968 Peptiden hergestellt, mit den SH3–Domänen und Antikörpern nach dem Standardprotokoll inkubiert und im Lumi–Imager ausgewertet (3.2.1).

Abb. 8: Schematische Darstellung WISE-Technik:

Landgraf et al 2004, Plos Biology Vol..2

Für die Inkubation der Membran wird eine Proteinkonzentration von 10 µg/ml Domäne in BB (Blocking Buffer, Firma Sigma) genutzt. Die Ausgangs–konzentrationen der Domänen sind in (Tab. 16) gezeigt. Alle für diese Arbeit verwendeten SH3-Domänen liegen als GST- (Glutathion-S-Transferase) Fusionsprotein vor.

Der Inkubationsschritt der Bindungsstudie für die SH3-Domänen gliederte sich wie folgt:

Die Membran wird 1x 10 min in Methanol gewaschen und hinterher 3x10 min mit TBS (Tris Buffered Saline) (siehe 3.7) gewaschen.

Anschließend wird sie 3h bei Raumtemperatur in der Blockierungspufferlösung (Tab. 7) geschüttelt.

Chemikalie

Hersteller

Menge

Bl. Buffer (10 fach)

Sigma

5ml

TBS (10 fach)

5ml

Saccharose

Merck

2.5g

Tab. 7: Zusammensetzung des Blocking Buffer (BB)

mit Aqua dest. auf 50ml auffüllen

Danach wird die Membran 1x 10 min mit TBS waschen. Die SH3-Domänen–konzentration soll in 40 ml Blocking Buffer 10 µg/ml betragen. Diese Lösung wird auf die Membran geben und über Nacht (12h) im Kühlschrank (4 ^o C) schüttelnd inkubiert.Nach der Inkubation wird die Membran 3x10 min mit TBS gewaschen. Anschließend wird die Membran 3h mit dem monoklonalen anti–GST-Antikörper aus der Maus (Tab. 8) inkubiert.

Chemikalie

Hersteller

Konzentration

Anti-GST-Antikörper monoklonales Immunglobulin G (IgG-G-1160) aus der Maus

Sigma

1µg/ ml in BB

Tab. 8: 1. Antikörperendkonzentration in BB

Nach den Waschschritten (3x10 min mit TBS) wird 1,5h mit dem Anti-Mouse–IgG-Peroxidasekonjugat inkubiert werden (Tab. 9).

Chemikalie

Hersteller

Konzentration

Anti-Mouse-IgG Peroxidasekonjugat (A-5906)

Sigma

1µg/ ml in BB

Tab. 9: 2. Antikörperendkonzentration in BB

Es schließt sich ein erneuter Waschschritt für 3x10 min mit T-TBS an.

Die Detektion der Bindung erfolgt über die Chemilumineszenz. Hierzu wird ein Baukastensystem (Luminol/ enchancer solution) (Tab. 10) verwendet. Bei der Reaktion wird Luminol durch die Peroxidase zu 3-Aminophthalat oxidiert, wobei Licht mit einer Wellenlänge von 425 nm emittiert wird. Die Chemilumineszenz ist auf die auf Enzym-Substratreaktion limitiert.

Lösung A und B wurden im Verhältnis von 1ml:1Tropfen zusammengegeben.

Chemikalie

Hersteller

Bezeichnung

1.Uptilight HRP Blot Reagent A

Interchim, France

UP99619A-A

2.Uptilight HRP Blot Reagent B

Interchim, France

UP99619A-B

Tab. 10: Bestandteile der Luminol/ enchancer solution

Die Membran wird für ca. 1 min. in die Lösung (Tab. 10) gestellt. Die Chemilumineszenz wird anschließend im Lumi-Imager™ (Boehringer, Mannheim) gemessen. Die Signalintensität wird in der Einheit „Mean“ mit dem Programm Genespotter (Microdiscovery, Berlin) gemessen.

Substitutions- und Längenanalyse von ausgewählten Peptidliganden

Die Erkennungsmotive (Konsensusmotive) der vier ausgewählten SH3-Domänen können durch die Substitutions- und Längenanalyse charakterisiert werden.

In der Substitutionsanalyse wird jede Aminosäureposition innerhalb des Liganden systematisch durch alle natürlichen L-Aminosäuren mit Ausnahme von Cystein ausgetauscht. Es resultiert eine Peptidbibliothek, die alle möglichen Einzelsubstitutionsvarianten des Wiltyp-Liganden enthält. Mit dieser Bibliothek lassen sich die Reste im Liganden identifizieren, die Schlüsselreste für die spezifische Erkennung der SH3-Domomänen sind.

Die Längenanalyse erzeugt Variationen des Wildtypliganden, die aus schritt–weise N- und C-terminal gekürzten Peptiden besteht. Aus dieser Peptid–bibliothek kann der Ligand mit der geringsten Länge ermittelt werden.

Die zwei genannten Peptidbibliotheken werden über das Sequenz–regenerierungsprogramms LISA erstellt. Die Arbeitsabläufe werden wie unter 3.1–3.2.1 beschrieben durchgeführt.

Zur Untersuchung der Regenerierbarkeit der CAPE-Membran wird ein Na–Zitrat/ Zitratpuffer (Tab. 11) verwendet.

Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt.

Chemikalie

Hersteller

Menge

Natriumzitrat

Merck

1,73g

Zitronensäure

Merck

0,413g

NaOH

Merck

1M

Tab. 11: Zusammensetzung des Zitratpuffers

Die CAPE-Membran, die mit der SH3-Domäne Abp1 inkubiert wurde, wird für diesen Versuch ausgewählt. Zuerst muss die Membran mit den Antikörpern versetzt und danach ausgewertet werden. Dieses Procedere wird als Kontrolle zu der schon ausgewerteten CAPE-Membran von Abp1-SH3 durchgeführt, da die Membran zur Lagerung eingefroren war und sich eventuell dabei verändert haben könnte.

Die Membran wird 3x20 min in den siedenden Puffer gelegt und zwischendurch für 3 min in siedendem destillierten Wasser gewaschen. Nach 3 Durchläufen wird die Membran im destillierten Wasser über Nacht gewaschen. Anschließend erfolgt eine erneute Inkubation mit den entsprechenden Antikörpern und anschließender Auswertung (3.2.1).

Das Messsystem besteht aus dem Sensorchip bestehend aus dem Glasträger, einer bis zu 56 nm dünnen Goldschicht und der dünnen Matrixschicht, dem Detektor, einer Lichtquelle, die polarisiertes Licht aussendet und einem Fluss–system. Die Flusszelle wird in eine Referenz- und in eine Sensorzelle unterteilt (Abb. 11).

Abb. 11: Aufbau des CM5-Chips und Aufbau des Meßsystems:
Linke Graphik: Aufbau des Sensorchips, Dextranmatrix (blau-orange), Goldschicht (gold), Glas (hellblau) Rechte Graphik: Aufbau des Meßsystems Flusskanal (schwarzumrandet), Sensorchip (hellblau-gelb), SPR–Detektor (orange) bestehend aus Lichtquelle und dem Sensor. Der Detektor befindet sich auf der Glasseite.

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Das Prinzip des Gerätes beruht auf der Totalreflektion an 2 Flächen mit unterschiedlichen Brechungsindices. Durch den einfallenden Strahl wird im Metall eine Oberflächenplasmonresonanz bei einem bestimmten Einfallswinkel (Resonanzwinkel) generiert, wenn der Wellenvektor von Licht und Plasmon übereinstimmt. Dieses Phänomen ist von der Beladung der organischen Matrix abhängig. Als Resultat tritt auf der Seite des reflektierten Strahles ein scharfer Schatten auf. Dieses Signal wird durch einen CCD-Chip (engl. Abkürzung Charge Coupled Device: Ladungsgekoppeltes, analoges Bauelement) aufgenommen und als SPR-Image auf einem Computer dargestellt. Der Resonanzwinkel hängt dabei direkt vom Brechungsindex bzw. der Dielektrizitätskonstanten der Sensoroberfläche ab. So wirken sich Adsorption und Desorption von Molekülen durch eine lokale Änderung des Brechungs–indexes an der Oberfläche des Sensors aus. Die Änderung im Brechungsindex bringt eine Änderung des Resonanzwinkels mit sich.

Die Resonanzeinheit (RU) definiert eine Änderung von 0,0001° im Resonanz–winkel, bei der ein Intensitätsminimum auftritt. Äquivalent steht dieser Winkel für eine Massenänderung von weniger als 1pg pro mm², wenn eine Probe an der beschichteten Chipoberfläche bindet. Der Winkel kann variiert werden, bis sich die Intensitätsminima von Mess- und Referenzzelle gleichen und wird als Resonanzunitdifferenz im Sensorgramm bezeichnet. Letztendlich wird mit dem BIAcore-X-Gerät der Einfallswinkel gemessen, bei dem ein Minimum der Lichtintensität, hervorgerufen durch die Oberflächenplasmonresonanz, auftritt (45)(46)(47).

Es gibt unterschiedliche Sensorchips: CM-Dextran (Abb. 12) für die kovalente Kopplung von Proteinen (über Amin- , Thiol-, Aldehyd-, Carboxylreste).

Streptavidin für die Immobilisierung biotinylierter DNA, RNA, Peptide, Kohlehydrate, Nickel-NTA für die reversible Adsorption von His-Tag-Proteinen und Lipid-Capture für die reversible Adsorption von Lipid-Doppelschichten.

Abb. 12: Schematische Darstellung der Modifizierungsmöglichkeiten der carboxy–mehylierten Dextranmatrix:

Die Messungen erfolgen mit einem BIAcore®-X-System, bei einer Temperatur von 25°C und einer Flussrate von 5 µl/min.

Um die Affinitäten der Proteininteraktion messen zu können, muss zunächst der Sensorchip aktiviert und beladen werden. Der CM5-Chips wird mit dem Amin–kopplungsreagenz (Firma BIAcore) 0.4 M 1-ethyl-3-(3-dimethylamino–propyl)–carbodiimid (EDC) und 0.1 M N-Hydroxysuccinimid (NHS) (Verhältnis 1:1 100 µl, Fluss 5 µl/min für 7 min) aktiviert. Danach erfolgt die kovalente Bindung des Anti-GST-Antikörper (von der Ziege, Firma BIAcore) mit einer Konzentration von 0,8 mg/ml und mehrfachen Injektionen von 5-75 µl. Die Deaktivierung der übrig gebliebenen Aminofunktionen auf der Goldoberfläche erfolgt mit 1 M Ethanolamin-HCL pH 8,5. Die Beladung des CM5–Chips mit dem Anti-GST-Antikörper der Ziege erfolgt nach Herstellerangaben. Das Signal beträgt 6000 RU (Resonanz Units), das einer Konzentration von 6µg/mm² auf dem Chip äquivalent ist.

Die Flusszelle wird unterteilt in Referenz- und Messzelle. Die Referenzzelle (F _c1) wird mit GST (1 µl in 69 µl HBS-Puffer) als Negativkontrolle beladen. In der F_c1-Zelle beträgt das Signal 1005 RU. Die Messzelle (Fc ₂) wird mit dem GST-SH3-Fusionsproteinen (Konzentration 10 µg/ml) beladen. Nach jeder Messung wird die Messzelle regeneriert (Glycin pH 2,2 10 mM) und neu mit GST-Fusionsprotein beladen. Die Signale betragen nach der Beladung bei SH3–Abp1-GST 600 RU, bei SH3-Myo5-GST 630 RU, bei SH3-RVS167-GST 600 RU und bei SH3-Yhr016-GST 820 RU. Die Liganden für die Bestimmung der Dissoziationskonstanten (KD) zwischen den 4 SH3-Domänen, werden aus der Auswertung der BLU-Werte der Screeningarrays gewählt. Die zwei Liganden VQQDSLPKLPFRSWG (Interaktionspartner von SH3-RVS167 und SH3–Yhr016) und ERPKRRAPPPVPKKP (Interaktionspartner von SH3-Abp1 und SH3-Myo5) werden in HBS-Puffer (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% (w/v) Surfactant P20, Firma BIAcore) gelöst. Die Stammlösung hat eine Konzentration von 2 mmol. Sie wird für eine Verdünnungsreihe im Verhältnis von 1:10 verdünnt und davon ausgehend acht mal 1:2 weiter verdünnt.

Die Signaldifferenzen zwischen F_c1-Zelle und F_c2-Zelle für die Affinitäts–messungen zwischen Antikörper und GST (F _c1 -Zelle) sowie Liganden und GST–Fusionsproteinen (F _c2 -Zelle) liegen zwischen 30 und 60 RU. Mit Hilfe der Auswertsoftware BIAevaluation wird für jede Peptid-Domäneninteraktion ein Sensorgramm (Abb. 13) erstellt und der K_D-Wert bestimmt.

Abb. 13: Schematische Darstellung eines Sensorgrams:
a) Basislinie im Pufferfluss, b) Probeninjektion, Bindung und Signalanstieg, c) Dissoziation, Signalabfall im anschließenden Pufferfluss, d) Regenerierung und entsprechende Basislinie, die Kästchen zeigen die Beladung des Sensorchips

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Fmoc-Aminosäuren

Code

Aminosäure

M _r (g/ mol)

Code

Aminosäure

M _r (g/ mol)

A

Fmoc-A-OPfp

477.4

N

Fmoc-N(Trt)-OPfp

537.5

D

Fmoc-D(OtBu)-OPfp

577.5

P

Fmoc-P-OPfp

503.4

E

Fmoc-E(OtBu)-OPfp

577.8

Q

Fmoc-Q(Trt)-OPfp

776.8

F

Fmoc-F-OPfp

553.5

R

Fmoc-R(Pbf)-OPfp

814,9

G

Fmoc-G-OPfp

463.2

S

Fmoc-S (tBu)-OPfp

549.5

H

Fmoc-H(Boc)-OPfp

643.6

T

Fmoc-T (tBu)-OPfp

563.5

I

Fmoc-I-OPfp

519.5

V

Fmoc-V-OPfp

505.4

K

Fmoc-K(Boc)-OPfp

634.6

W

Fmoc-W(Boc)-OPfp

692.4

L

Fmoc-L-OPfp

519.5

Y

Fmoc-Y(tBu)-OPfp

625.6

M

Fmoc-M-OPfp

537.5

Tab. 14: Auflistung aller verwendeten Aminosäuren

Alle AS wurden von der Firma Bachem oder NOVA Biochem erworben.

TBS-Puffer für die Inkubation der CAPE-Membran

TBS 10 fach pH 8,0 (Tris Buffered Saline)

80g NaCl (Firma Merck)

2g KCl (Firma Merck)

61g TRIS (Trishydroxymethylaminomethan, Firma Merck)

in 0,8l Aqua dest. lösen, mit konzentrierter Salzsäure (HCl, Firma Merck) pH 8,0 einstellen anschließend auf 1l auffüllen.

Blocking-Buffer (BB) für die Inkubation der CAPE-Membran

5ml Bl. Buffer (10 fach) (Firma Sigma )

5ml TBS (10 fach)

2,5g Saccharose (Firma Merck)

mit destilliertem Wasser auf 50ml auffüllen.

Regenerierungspuffer für die CAPE-Membran

Zitratpuffer für 1l Volumen

1,73g Natriumzitrat (Firma Merck) gelöst in destilliertem Wasser

0,413g Citrat (Firma Merck) gelöst in destilliertem Wasser

Natriumhydroxid (Firma Merck) 1M, bis sich der pH-Wert 6 einstellt

Mit destilliertem Wasser auf 1l auffüllen.

Aminkopplungskit: NHS/ EDC der Firma BIAcore

Beladungskit

Reagenz

Konzentration

rekombinant GST (S. japonicum)

0,2mg/ml

Ziege-Anti-GST-Antikörper

0,8mg/ml

Regenerierungslösung für GST-Fusionsproteine

Glycin pH 2,2 10mM

Tab. 15: GST-Capturekit der Firma BIACORE

4 SH3-Domänen

Die folgende Tabelle zeigt Konzentration und die Position der Domäne in den Proteinen (Tab. 16).

Fusionsprotein

Lage im Protein

Konzentration

SH3-RVS167-GST

424-ETVT....YVQL-479

0,4 mg/ml

SH3-YHR016016-GST

326-PTAV....VRVS-382

1,4 mg/ml

SH3-Abp1-GST

535-PWAT....VSLG-591

1,0 mg/ml

SH3-Myo5-GST

1088-RMFE....AYMK-1144

1,8 mg/ml

Tab. 16: Konzentrationen der SH3-Fusionsproteine

(bereitgestellt von der Forschungsgruppe Cesareni Universität Rom)

Puffer für die BIAcore

Chemikalie

Konzentration

HEPES pH 7,4

0,01 M

NaCl

0,15 M

EDTA

3mM

(w/v) Surfactant P20

0,005%

Tab. 17: HBS-Puffer BIA Certified der Firma BIACORE