Auf dem Peptid-Array, welches auf die Bindung zur SH3-Domäne von Myo5 (Abb. 14) getestet wurde, zeigten sich deutlich die 15 Markierungspeptide. Das Minimum betrug für diese Peptide 1481 Mean, und das Maximum lag bei 3738 Mean. Es ergab sich ein Mittelwert von 2420 Mean. Die Beladung der Membran betrug 16 nmol/ cm². Weiter zeigte sich auf der Membran eine Vielzahl von Spots mit verschiedenen intensiven Ausprägungen. Als Grenzwert (GW) (siehe 3.9) wurde eine Signalintensität von 404 Mean bestimmt, damit konnten für die Myo5-SH3-Domäne 354 Peptide als (positive) Binder bestimmt werden.

Die Auswertung der Interaktion zwischen dem Peptid-Array und der SH3–Domäne von Abp1 (Abb. 15) zeigte alle 15 Markierungspeptide. Ihr Minimum lag bei 1257 Mean, das Maximum lag bei 3312 Mean und der Mittelwert zeigte einen Wert von 2110 Mean. Die Membran hatte eine Beladung von 20 nmol/ cm². Der Grenzwert lag für die Abp1-SH3-Domäne 449 Mean, und es wurden 159 positive Binder ermittelt.

Abb. 14: Darstellung des Screeningarrays der Myo-SH3-Domäne:
Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Myo5–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. oranger Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Abb. 15: Darstellung des Screeningarrays der Abp1-SH3-Domäne:
Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Apb1–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. blauer Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Die Myo5-SH3-Domäne erkannte somit 12% aller 2953 Peptide, während es bei der Abp1-SH3-Domäne 5,4% waren (siehe 3.8.). Das Integral (siehe 3.8.) der Kurve in der Auswertung des Myo5-SH3-Arrays wurde mit dem Wert 0,068 und für den Abp1-SH3-Array mit 0,018 bestimmt. Um die beiden Domänen näher charakterisieren zu können, wurde nach Liganden gesucht, die als Binder sowohl für Myo5-SH3- als auch für Abp1-SH3-Domäne in Frage kommen. 24 Übereinstimmungen (Tab. 31) konnten ermittelt werden. Es wurde ein Liganden gesucht, der bei beiden Domänen einen hohen Mean-Wert aufwies. Der Ligand ERPKRRAPPPVPKKP erfüllte diese Bedingungen mit einem Mean-Wert von 676 (Myo5-SH3, Array-SI-Maximum 1150 Mean) und 1594 (Abp1-SH3, Array-SI-Maximum 3660 Mean) und wurde für weitere Untersuchungen mittels Affinitätsmessung, Substitutions- und Längenanalyse verwendet. Die Sequenz ERPKRRAPPPVPKKP ist ein Teil der Primärstruktur aus dem Hypothetischen 74.8 kDa Protein in der BET1-PAN1 intergenic Region.

Das Peptid-Array, welches auf die Bindung zur SH3-Domäne von Rvs167 (Abb. 16) untersucht wurde, zeigte die Markierungspeptide deutlich und vollzählig. Das Minimum ihrer Signalintensitäten lag bei 1118 Mean, und das Maximum wies einen Wert von 4339 Mean auf. Der Mittelwert zeigte einen Wert von 2437 Mean. Die Beladung der Membran betrug 27 nmol/ cm². Es waren nur wenige Spots zu erkennen. Der Grenzwert (siehe 3.9) lag für die Rvs167-SH3-Domäne bei 446 Mean. Es konnten 51 positive Binder ermittelt werden.

Nach der Auswertung des Peptidarray auf die Interaktionen mit der SH3–Domäne von Yhr016 (Abb. 17) waren ebenfalls alle 15 Markierungspeptide deutlich zu erkennen. Das Minimum dieser Peptide lag bei 686 Mean. Das Maximum wurde bei einer Intensität von 3277 Mean ermittelt und der Mittelwert lag bei 2176 Mean. Die Membran hatte eine Beladung von 18 nmol/ cm². Es konnten nur wenige unterschiedlich intensive Spots auf der Membran detektiert werden. Für die Yhr016-SH3-Domäne wurde ein Grenzwert mit einer Signalintensität von 438 Mean ermittelt. Mit dem Grenzwert (siehe 3.9) konnten positive 65 Liganden analysiert werden.

Abb. 16: Darstellung des Screeningarrays der Rvs167-SH3-Domäne:
Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Rvs167–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. pinker Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Abb. 17: Darstellung des Screeningarrays der Yhr016-SH3-Domäne:
Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Yhr016–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. grüner Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Von 2953 Liganden erkannte die Yhr016-Domäne 2,2% während die Rvs167–Domäne 1,7% erkannte (siehe 3.8.). Das Integral (siehe 3.8.) wurde für Yhr016–SH3 mit einem Wert von 0,01 und für Rvs167-SH3 mit einem Wert von 0,009 bestimmt. Anhand der ermittelten Grenzwerte konnten 12 gemeinsame Binder (Tab. 31) ermittelt werden. Dabei wurde der Ligand VQQDSLPKLPFRSWG für weitere Untersuchungen der beiden Domänen (Affinitätsmessung, Längen- und Substitutionsanalyse) ausgewählt. VQQDSLPKLPFRSWG ist ein Teil der Primärsequenz aus dem Protein General amino acid permease AGP2. Die Signalintensitäten betrugen für Yhr016–SH3 916 Mean (Array-SI-Maximum 2953) und für Rvs167-SH3 999 Mean (Array-SI-Maximum 2238) für die Interaktion mit diesem Liganden.

Es zeigte sich, dass der Mittelwert der Markierungspeptide zwischen 2110 und 2437 Mean nur geringfügig abweicht. Der Vergleich der vier Domänen (Tab. 18) in Hinblick auf ihre Neigungen aus den 2953 Peptiden einen individuellen Satz von Liganden zu erkennen, wurde als Selektivität definiert. Die Einteilung der untersuchten Domänen in selektiv oder promiskuitiv erfolgte anhand des Integrals und des Verhältnisses der Anzahl der individuell erkannten Peptide zu der Gesamtzahl der Peptide. Zusätzlich wurden die normalisierten Mean-Werte der SH3-Domänen (Abb. 18) graphisch dargestellt.

Myo-SH3

Abp1-Sh3

Yhr016-SH3

Rvs167-SH3

Minimum-Mark.peptid-Mean

1481

1259

686

1118

Maximum- Mark.peptid-Mean

3738

3312

3277

4339

Mittelwert in Mean

2420

2110

2176

2437

Grenzwert in Mean

404

449

438

446

Binderzahl

354

159

65

51

Übereinstimmungen

24

24

-

-

-

-

12

12

Selektivität in %

12

5,4

2,2

1,7

Integral

0,068

0,018

0,01

0,009

Tab. 18: Zusammenfassung

Aufgrund des Vergleiches zwischen Prozentsätzen der erkannten Peptide zu dem Anteil der Gesamtpeptide und der Flächen unterhalb der Graphen in (Abb. 18), wurde folgende Einteilung nach steigender Selektivität festgelegt:

Myo5-SH3 (0,068/ 12%) < Abp1-SH3 (0,018/ 5,4%) < Yhr-SH3 (0,01/ 2,2%) < Rvs167-SH3 (0,009/ 1,7%).

Es wurden 24 übereinstimmende Liganden für Myo5- und Abp1-SH3 ermittelt sowie 12 für Rvs- und Yhr-SH3. Der Vergleich der Sequenzen aller vier SH3–Domänen nach der Festlegung des Grenzwertes ergab, dass es keinen Ligand gab, der von allen Domänen erkannt wurde.

Abb. 18: Vergleich der SI (Mean) der gesamten SH3-Domänenarrays:
Vergleich der Selektivitäten anhand der Flächen unter den jeweiligen Graphen der SH3–Domänen von Myo5 (orange), Abp1 (blau), Yhr016 (grün) und Rvs167 (pink). Die Signal–intensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden von Maximum zu Minimum geordnet, normalisiert und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide aufgetragen

Auf dem oberen großen Abschnitt der Membran ist die Substitutionsanalyse abgebildet (Abb. 19). Der Wildtyp(wt)-Ligand wurde auf der Membran in der ersten Spalte vollständig und mit deutlichen schwarzen Spots abgebildet. Alle Spots der Wildtypaminosäuren konnten mit ähnlicher Schwärzung in den Spalten A bis Y (2 bis 20) erkannt werden. Die Substitution zeigte in den Positionen –8 bis –2 kein erkennbares Motiv, während ein Muster im Bereich der Position –1 bis 3 zu erkennen war. Hier waren nur wenige Substitutions–möglichkeiten für die L–Aminosäuren möglich, dort wo keine bzw. schwach abgebildete Spots zu erkennen waren, konnte die wt-Aminosäure nicht ersetzt werden. Die Positionen 3 bis 5 zeigten ebenfalls kein Motiv.

Ausgehend von der Definition nach Aasland wurde das erste Prolin im Kernmotiv mit 0 bezeichnet, die weitere Nummerierung der Schlüssel–aminosäuren erfolgte zum N-Terminus mit einem negativen Vorzeichen und zum C-Terminus mit einem positiven Vorzeichen.

Aus der Sequenz ERPKR _-4 R _-3 A _-2 P _-1 P ₀ P ₁ V ₂ P ₃KKP war nur die hervorgehobene Teilsequenz von Interesse. Die Positionen -1, P0 und P3 stellten Schlüssel–aminosäuren dar, die durch keine andere Aminosäure ersetzt werden konnten, außer durch sich selbst. Arginin an der Position -4 konnte durch die hydrophoben Aminosäuren F, H, I, K, L, M und W sowie durch die polaren Aminosäuren N und Q ersetzt werden. In der Position –3 waren als Substitutionsanaloge zu R die hydrophoben Aminosäuren A, I, V und W möglich. Alanin an der Position –2 konnte durch die hydrophoben Aminosäuren K, L, M, und P sowie durch die polaren Aminosäuren N ersetzt werden. Die Position 1 konnte durch eine große Zahl von Aminosäuren ersetzt werden. Die Ausnahme bildeten hier die aromatischen Aminosäuren F; W und Y sowie die polaren Aminosäuren mit endständigen OH-Gruppen T und der aliphatischen Aminosäure V durch die P nicht ausgetauscht werden kann. Die Position 2 zeigte eine hohe Präferenz für die aliphatische Aminosäuren I und L sowie für P. Zusammenfassend lautet das Konsensusmotiv:

(R _-4[HIKLMVW]) (R _-3[IVW]) (A _-2[KLMPN]) (P _-1 ) (P ₀ ) (x) (V[ILP]) (P ₃ ),

nach ASCII (48): %%%PPx%P

Das Peptid ERPKRRAPPPVPKKP konnte nicht sicher zu den Klasse 1 Liganden (R _-3 xxP ₀ xxP ₃) zugeordnet werden, da R_-3 durch weitere Aminosäuren ersetzt werden konnte. Eine Tendenz zum RxxPxxP-Motiv, wie sie unterstrichen in der Peptidsequenz dargestellt ist, lässt sich nicht verkennen.

Der KD-Wert bezeichnet die Konzentration bei Halbsättigung. Die graphische Auswertung ist in der (Abb. 19) zu entnehmen. Es wurde ein KD-Wert von 3,6 µMgemessen.

Abb. 19: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und Myo5-SH3:
Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit jene Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, orange Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Die Längenanalyse (Abb. 19) wurde unterhalb der Substitutionsanalyse parallel erstellt, damit die Mindestlänge des Liganden gesucht werden konnte, die für die Ligand-Proteininteraktion benötigt wurde. Das Ergebnis der Längenanalyse zeigte 13 schwach gefärbte Spots, wobei nur die ersten 11 (Position 1-6, 8-10 sowie 12 und 13) bewertet wurden, da der 13. Spot den letzten sich deutlich abbildenden Punkt darstellte. Die Flächen, wo keine schwarzen Spots abgebildet wurden, wiesen Sequenzkürzungen auf, die von der Domäne nicht erkannt wurden. Der Ligand ERPKRRAPPPVPKKP der SH3-Domänen von Myo5 wurde kontinuierlich bis auf eine Länge von 5 Aminosäuren vom N- und C–Terminus aus gekürzt, und das Längenmotiv in Bezug auf die abgebildeten Spots ausgewertet. Die Sequenzen der gesamten Analyse des Liganden für die SH3–Domänen Myo5 wurde in (Tab. 29) zusammengefasst.

Die Auswertung der Längenanalyse für den Liganden von Myo5-SH3 ergab ein Minimalepitop von 11 AS mit der Sequenz PKRRAPPPVPK.

Die Substitutionsanalyse ist im oberen Abschnitt der Membran abgebildet (Abb. 20). In der ersten Spalte zeigte sich der wt-Ligand vollständig und mit deutlichen Spots. Die Spots der Aminosäuren in der Substitutionsanalyse zeigten in den Spalten A bis Y (2 bis 20) ähnliche Schwärzungen und Größen wie die des Wildtyps.

In den Positionen –8 bis –4 konnte kein Muster erkannt werden. Der Bereich –3 bis 5 zeigte ein sich schwach abzeichnendes Motiv, während die Position 6 kein Motiv erkennen ließ. Weiße Flächen bzw. schwachgefärbte Spots in der Substitutionsanalyse stellten Bereiche dar, wo keine Aminosäure im Wildtyp ersetzt werden konnte. Es wurden nur die nummerierten Positionen ERPKR _-4 R _-3 A _-2 P _-1 P ₀ P ₁ V ₂ P ₃ K ₄ K ₅P näher untersucht.

Die Position -4 konnte durch die meisten Aminosäuren substituiert werden.Die Ausnahmen bildeten die polaren Aminosäuren G und N sowie die hydrophoben Aminosäuren P und Y. In der Position -3 konnte R durch die hydrophoben Aminosäuren A, F, G, H, I, K, T, W ersetzt werden. Die Position -2 konnte durch alle Aminosäuren außer P ersetzt werden. In der Position -1zeigte sich eine Bevorzugung zur Substitution der wt-Aminosäuren durch die polaren Aminosäuren G und S sowie von hydrophoben Aminosäuren A, F, H, I, K, L und R. Die Substitution in der Position 1 erfolgte durch die polaren Aminosäuren D und E sowie durch die hydrophoben Aminosäuren A, F, H, I, K, L, M und V. Die Position 2 konntedurch die aliphatischen Aminosäuren I, K, und L ersetzt werden. Eine Bevorzugung in der Position 4 zurSubstitution von K zeigten die polaren Aminosäuren D, Q, S und T und die hydrophoben Aminosäuren A, P, R und V.In den Positionen 0, 3, und 5zeigen sich kaum Austauschmöglichkeiten für P und K.Es konnten nur wenige Aminosäuren substituiert werden. In der Position 0 erfolgte eine Substitution nur durch die kurzkettige und hydrophobe Aminosäure Alanin. Die Position 3 wurde durch die positiv geladenen Aminosäuren R und K sowie durch die polaren Aminosäuren A und G ersetzt, während die Position 5nur durch die positiv geladene Aminosäure R ersetzt werden konnte. Die Auswertung der Substitutionsanalyse (Abb. 20) für den Liganden zeigte keine Bevorzugungen für die markierten Aminosäuren im Wildtypliganden (wt). Ein deutliches Bindungsmotiv wie unter 4.2.1 konnte nicht erkannt werden. Die Nummerierung der Aminosäuren erfolgte in Anlehnung der Nomenklatur nach Aasland (48)
R _-4 R _-3 A _-2 P _-1 P ₀ P ₁ V ₂ P ₃ K ₄ K ₅. Aus Substitutionsanalysen leitete sich das Konsensusmotiv für diesen Liganden ab:

(x_-4 ) (R _-3[AFGHIKTW]) (x_-2 ) (P _-1 [GSAFHIKLMV]) (P _0/ A) (x ₁ ) (V ₂[IKL]) (P ₃[AGKR]) (K ₄[DQSTAPRV]) (K ₅ /R). nach ASCII (48)^: %x%P/Ax#P/–AGKR%[+]. Der Liganden wurde der spezifischen Klasse K2 (16)(PxxPx[+]) zu geordnet. Der KD-Wert lag bei 3,7 µM. Die Beziehung RU_diff zur Konzentration wurde in (Abb. 20) dargestellt.

Abb. 20: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und Abp1-SH3:
Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit konnten Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, blaue Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Mit der Längenanalyse wurde nach der Mindestlänge des Liganden gesucht, die für die Ligand-Proteininteraktion nötig war. Im Ergebnis zeigten sich 9 deutlich gefärbte Spots an den Positionen 1 bis 3, 5 und 6, 9 und 10 sowie 14 und 15. Die Flächen, auf denen keine Spots abgebildet waren, wiesen Kürzungen auf, die von der Domäne nicht mehr erkannt wurden. Der Ligand ERPKRRAPPP–VPKKP der SH3-Domänen von Abp1 wurde kontinuierlich bis auf eine Länge von 5 Aminosäuren vom N- und C-Terminus aus gekürzt, und das Längenmotiv in Bezug auf die abgebildeten Spots ausgewertet. Die gesamten Sequenzen der Analyse sind in (Tab. 29) zusammengefasst. Nach der Auswertung zeigte sich eine Mindestlänge von 11 AS mit der Sequenz RRAPPPVPKKP (Abb. 20).

Zusammenfassend zeigt die Auswertung (Tab. 20, orange) der Substitutions–analyse von ERPKRRAPPPVPKKP für Myo5-SH3, dass ein Kernmotiv zu erkennen war. Der Ligand lässt sich der Klasse 1 zuordnen.

In der Auswertung der Längenanalyse zeigt sich, dass eine Mindestlänge von 11 Aminosäuren für die Ligandenerkennung nötig ist. Die Auswertung (Tab. 20, blau) der Substitutionsanalyse von Abp1-SH3 ergab kein definiertes Konsensusmotiv über den gesamten spezifischen Bereich. Der Ligand konnte dennoch in die Klasse K2 eingeordnet werden. Die minimale Länge, die für eine Interaktion benötigt wird, konnte mit Hilfe der Längenanalyse auf 11 AS festgelegt werden. Nach Auswertung der Dissoziationskonstanten zeigte sich, dass die KD-Werte des Liganden ERPKRRAPPPVPKKP für Myo5-SH3 und Abp1-SH3 3,7 und 3,6 µM betrugen. Die KD-Werte der Liganden liegen in einem für SH3-Domänen typischen Bereich von 1-100µM.

Myo5-SH3

Abp1-SH3

Min in Mean (Array)

271

267

Max in Mean (Array)

1150

3660

SI-Peptid in Mean (Array)

676

1597

Positionen

R- ₄(HIKLMVW)
R- ₃(IVW)
A- ₂(KLMPN)
P _-1 P ₀ P _{1 (x ohne F,T,V,W,Y)} V ₂(ILP)P ₃

R _{-4 (x ohne G,N,P,Y)} R _-3(AFGHIKTW)
A _{-2 (x ohne P)} P- ₁(GSAFHIKLMV)
P ₀ /A
P1 _{(x ohneG,N,Q,S,T,W,Y)} V ₂ (IKL)P ₃(AGKR)
K ₄(DQSTAPRV)
K ₅ /R

Myo5-SH3

Abp1-SH3

Konsensus

%%%PPx%P

%x%P/Ax#P/AGKR%[+]

Klasse

R1

K2

KD-Wert

3,6 µM

3,7 µ M

Minimallänge

11 AS: PKRRAPPPVPK

11 AS: RRAPPPVPKKP

Tab. 20: Zusammenfassung der Charakterisierung von ERPKRRAPPPVPKKP

In der oberen Fläche der (Abb. 21) ist die Substitutionsanalyse von VQQDSLPKLPFRSWG dargestellt. In der ersten Spalte wurde der Wildtyp deutlich und vollständig abgebildet. Die Spots der Wildtypaminosäuren konnten alle in den Spalten A bis Y (2 bis 20) widererkannt werden.

Die Positionen –6 bis –1 zeigten kein erkennbares Muster. In dem Bereich 0 bis 6 zeigte sich ein Motiv, während die Positionen 7 bis 9 kein Motiv erkennen ließen. Die Spots zeigten in der Substitutionsanalyse, dass hier die Wildtypaminosäure ausgetauscht werden konnte. Dort wo keine bzw. schwach abgebildete Spots in der Analyse zu sehen waren, konnte die jeweilige Aminosäure im Wildtyp nicht substituiert werden.

Die Nummerierung der Positionen der Aminosäuren des Liganden erfolgte nach der Nomenklatur von Aasland(48) VQQDSLP ₀ K ₁ L ₂ P ₃ F ₄ R ₅SWG.

Die Position 0, 2, 3 und 5 bestimmen die Schlüsselaminosäuren P, L, P und R. Diese Aminosäuren konnten durch keine der 19 Aminosäuren ersetzt werden, außer durch sich selbst. Die Positionen 1 zeigte Präferenzen für die hydrophoben Aminosäuren M, P, Q, R, und T, während an der Position 4 F durch die hydrophoben Aminosäuren A, K, P, und R substituiert werden konnte. Auffällig ist, dass K₁ und F₄ in Bezug auf die Schwärzung ihrer Spots nicht die besten Besetzungen waren. Einige Substituenten (M, P, Q, R und T) für die Positionen 1 und 4 zeigten eine stärkere Schwärzung. Sie waren scheinbar besser affine Binder als der wt-Ligand.

Das Konsensusmotiv konnte als (P ₀ ) (K ₁[MPQRT]) (L ₂ ) (P ₃ ) (F ₄[AKPR]) (R ₅ )und in Form nach ACSII (48) als P%LP%R definiert werden. Die Sequenz zeigte das typische Motiv der Klasse R2 (xP ₀ xxP ₃ xR ₅).

Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten zwischen Ligand und Domäne ergab einen KD-Wert von 490 µM.

Abb. 21: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und SH3-Domäne:
Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset, stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit konnten Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, pinke Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Das Ergebnis der Längenanalyse ist unter der Substitutionsanalyse abgebildet (Abb. 21). Der Ligand wurde kontinuierlich vom N- und C-Terminus her gekürzt bis auf eine Länge von fünf Aminosäuren. Es wurden 19 Spots mit unterschiedlicher Schwärzung abgebildet. Die Spots der Positionen 1 bis 6, 8 bis 10, 14 bis 15, 19 bis 21 und 26 wurden für die Auswertung verwandt (Tab. 30). Die Daten ergaben ein RVS167 bindendes Peptid mit der minimalen Länge von 9 AS und der Sequenz SLPKLPFRS. Die freien Bereiche zwischen den abgebildeten Spots stellten Verkürzungen dar, die nicht zu einer Interaktion führten.

Der obere Abschnitt in der (Abb. 22) zeigt die Substitutionsanalyse von VQQDSLPKLPFRSWG. In der ersten Spalte wurde der Wildtyp deutlich und vollständig abgebildet. Die Spots der Wildtypaminosäuren konnten alle in den Spalten A bis Y (2 bis 20) widererkannt werden.

Die Positionen –6 bis –1 zeigten kein erkennbares Muster. In den Bereichen 0, 2 und 3 sowie im Bereich 5 zeigte sich ein Motiv, während in den Positionen 1, 4 und 6 bis 7 kein Motiv zu erkennen war. Die dunklen Spots zeigten in der Substitutionsanalyse, dass hier die Wildtypaminosäure ausgetauscht werden konnte. Dort wo keine bzw. schwach abgebildete Spots in der Analyse zu sehen waren, konnte die jeweilige Aminosäure im Wildtyp nicht substituiert werden.

Die Auswertung der Substitutionsanalyse von VQQDSLP ₀ K ₁ L ₂ P ₃ F ₄ R ₅SWG zeigte, dass die Positionen 0, 2, 3 und 5 mit den Schlüsselaminosäuren P, L, P und R besetzt waren. Die Position 1 kann durch fast alle natürlichen L–Aminosäuren ersetzt werden. Die Ausnahme bildeten die aromatischen Aminosäuren F, W, und Y sowie die kurzkettige Aminosäure G. Die Position 4 tolerierte nahezu alle Aminosäuren außer W und Y.

Der Konsensus lautet (P ₀ ) (K ₁[x ohne G, F, W, Y]) (L ₂ ) (P ₃ ) (F ₄[x ohne W, Y]) (R ₅ ) nach ASCII (48)PxLPxR und definierte den Klasse-2–Liganden (xP ₀ xxP ₃ xR ₅). Der KD-Wert wurde zu 75 µM bestimmt.

Abb. 22: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und SH3-Domäne:
Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit konnten Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, grüne Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Die Längenanalyse ist unter der Substitutionsanalyse dargestellt (Abb. 22). Dabei wurde der Ligand kontinuierlich vom N- und C-Terminus her gekürzt bis auf eine Länge von fünf Aminosäuren. Es wurden 21 Spots abgebildet, wobei die Positionen 1 bis 6, 8 bis 10, 13 bis 15, 19 bis 21 und 26 bis 28 für die Ergebnisbildung relevant waren. Die Auswertung der Sequenzen (Tab. 30) ergab eine Minimallänge von 9 AS mit der Sequenz PKLPFRSWG.

Die Auswertung der Substitutionsanalyse ergaben für den Liganden von Yhr016-SH3 und Rvs167-SH3 das Konsensusmotiv PxLPxR bzw. P%LP%R und die Klassenzugehörigkeit Klasse R2.

Die Analyse der Längenbestimmung des Liganden für die beiden Domänen ergab eine Mindestlänge von 9 AS.

Die Auswertung der KD-Wertmessung zeigte einen Wert von 75µM für den Liganden von Yhr016-SH3 und für den Rvs167-SH3 Liganden 490µM.

Yhr016-SH3

Rvs167-SH3

Min in Mean (Array)

255

255

Max in Mean (Array)

2238

2953

SI-Peptid in Mean (Array)

916

999

Positionen

P ₀ K ₁(x ohne G, F, W, Y)L ₂ P ₃ F ₄(x ohne W, Y)R ₅

P ₀ K ₁(MPQRT)
L ₂ P ₃ F ₄(AKPR)
R ₅

Konsensus

PxLPxR

P%LP%R

Klasse

R2

R2

KD-Wert

75 µM

490 µM

Minimallänge

9 AS: PKLPFRSWG

9 AS: SLPKLPFRS

Tab. 21: Zusammenfassung der Charakterisierung von VQQDSLPKLPFRSWG