Bewertung der WISE-Arrays

Die erstellten Peptid-Arrays repräsentieren mit einer Anzahl von je 2953 Peptiden alle möglichen Bindungspartner aus dem Hefeproteom, welche mit dem vollständigen Satz der Hefe-SH3–Domänen interagieren könnten. Diese Anzahl ist mit einem Algorhythmus der Forschergruppe Ceasareni aus der Hefeprotein–datenbank ermittelt.Die Bewertung der Ergebnisse aus den Bindungsstudien zeigen, dass eine statistische Auswertung, der in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse nur bedingt möglich ist. Eine für die Statistik notwendige Vergleichbarkeit der Membranen ist unter den gegebenen Voraussetzungen nicht möglich, da:

Die Regenerierung der CAPE-Membran nicht gelungen ist, so dass die Wiederholungen der Experimente in einem angemessenen Zeitraum unmöglich sind. Der Arbeitsaufwand pro Membran beträgt nämlich einen Monat.
Die Mean-Werte der Markierungspeptide auf den Membranen können auch nicht als einheitlicher Bezugswert extrapoliert werden, um eine Vergleichbarkeit zu erreichen. Die Signalintensitäten der Markierungspeptide sind hierfür zu hoch. Die Mean-Werte liegen im Sättigungsbereich des Chemilumineszenzdetektors und damit außerhalb des linearen Messbereiches. Der lineare Messbereich auf dem sigmoiden Graphenverlauf definiert einen Bereich, in dem die geringste Fehlerabweichung der Signalintensitäten auftritt. Dieser Bereich entspricht einer Spotfärbung von grau nach schwarz.
DieAbweichungen in den Ergebnissen sindmethodenbedingt. Die Beladungsdichte der Membranen variiert in einem Bereich von 16 bis 27 nmol/cm2. Grund hierfür ist die nicht vollständige chemische Umsetzung der Edukte während der Reaktion.

Die SPOT-Synthese ist als semiquantitative Methode für das Durchmustern von Peptidbibliotheken gut geeignet, um eine Aussage über die Peptid–Domäneninteraktionen treffen zu können, wie sie in dieser Arbeit untersucht wurden. Mit der semiquantitativen Auswertung aller Screeningarrays konnte eine Einteilung der SH3-Domänen von Myo5, Abp1, Yhr016 und Rvs167 nach ihrer Selektivität in bezug auf alle 2953 Liganden (Tab. 23-Tab. 26) über das Integral der jeweiligen Graphen und den Grenzwert (Tab. 22) erfolgen. Zum ersten Mal wurde eine große Anzahl von potentiellen Liganden der SH3–Domänen mit Hilfe der SPOT-Synthese auf einer Zellulosemembran erstellt. Als Grundlage diente die dafür eingeführte CAPE-Membran. Die Membran eignet sich besonders für die Untersuchung von Peptid-Domäneninteraktionen wegen der geringeren Beladungsdichte und den weniger stark auftretenden Hintergrundsignalen.

Die Resultate der Auswertungen mit Hilfe der arbiträren Grenzwerte konnte über das Integral aus den graphischen Darstellungen bis auf den geringen Unterschied zwischen Yhr016-SH3 und Rvs167-SH3 verifiziert werden (Abb. 18, Tab. 22).

Der Vergleich der Ergebnisse nach der Grenzwertbestimmung und dem Integral in Bezug auf die Selektivität der Domänen zeigt einen Anstieg Myo5-SH3 zu Rvs167-SH3; nach der Grenzwertbestimmung: Myo5-SH3 (12%) < Abp1-SH3 (5,4%) < Yhr016-SH3 (2,2%) < Rvs167-SH3 (1,7%) und dem Integral: Myo5–SH3 (0,068) < Abp1-SH3 (0,018) < Yhr016-SH3 (0,01) < Rvs167-SH3 (0,009). Es zeigt sich in den beiden Auswertverfahren, dass die SH3-Domäne von Myo5 von allen untersuchten Domänen die niedrigste Selektivität aufwies, gefolgt von der Domäne von Abp1. Beide Domänen zeigen eine geringe Selektivität im Vergleich zu den SH3-Domänen von Yhr und Rvs. Eine ähnliche Aussage kann nach der Auswertung der korrespondierenden Liganden von Abp1-/ Myo5-SH3 (24 Liganden) und Rvs167–/ Yhr016-SH3 (12 Liganden) bestätigen (Tab. 31). Eine Unterscheidung in der Selektivität zwischen Yhr-SH3 und Rvs167-SH3 an Hand des Integrals kann nicht erfolgen, da sich die Ergebnisse nur um 1/1000 unterscheiden. Da das Integral ein objektiver Wert im Vergleich zu dem arbiträren Grenzwert (Bestimmung siehe 3.9) darstellt und zusätzlich einen viel größeren Datenbereich einbezieht, werden die Domänen nach steigender Selektivität in Anlehnung an das Integral wie folgt geordnet: Myo5-SH3 < Abp1-SH3 < Yhr016-SH3 und Rvs167-SH3.

Die Voruntersuchung stellt einen wesentlichen Beitrag für die anzuschließenden Untersuchungen mit allen 27 Hefe-SH3-Domänen dar. Um eine semiquantitative Aussage zur Selektivität der SH3-Domänen über den Grenzwert (GW) erhalten zu können, müssen natürlich weitere Experimente erfolgen. Die Festlegung des Grenzwertes muss dann über eine Korrelation der Mean-Werte mit einer quantifizierbaren Größe erfolgen. Für die Definition eines Grenzwertes würde sich beispielsweise die Dissoziationskonstante (27) oder die Berechnung des GW der Mean-Werte auf CAPE-Membranen eignen. Über ein solches Verfahren ist über Antiköperbindungsstudien auf ß–Alanin-Membranen berichtet worden (A. Weiser persönliche Mitteilung, Arbeit eingereicht).

Die vorliegenden Ergebnisse aus dem Screeningexperimenten lassen nur eine Bewertung der Interaktion unter in vitro Bedingungen zu. Es werden Einschränkungen unter physiologischen Gegebenheiten nicht berücksichtigt wie z.B. die Lokalisation von Sequenzen im Protein, Veränderungen der Konzentrationen von Proteinen durch zeitlich und räumlich unterschiedliche Expressionen des sequenzenthaltenden Proteins, unterschiedliche Kompartimentisierung der Proteine in der Hefe sowie der Tatsache, dass die Liganden mehrfach in einem Protein auftreten können.

Bewertung der Peptid-Protein-Bindungen

Mit den Auswertungen der primären Screens kann kein gemeinsam bindender Ligand für die vier SH3-Domänen ermittelt werden (Vergleich der positiven Binder (Tab. 31) nach der Grenzwertbestimmung). Es wird daher je ein Ligand ausgewählt, der eine potentiell spezifische Bindung zwischen den SH3–Domänen Myo5 und Abp1 sowie Yhr016 und Rvs167 aufweisen kann. Die Auswahl der Liganden erfolgt zufällig an Hand möglichst hoher Signal–intensitäten. Der Hintergrund dieser beiden Charakterisierungen ist es, ein Motiv im Liganden zu analysieren, das Rückschlüsse auf Aminosäuren erlaubt, die für eine Interaktion von Bedeutung sind.

Die Charakterisierungen der gefundenen Liganden ERPKRRAPPPVPKKP und VQQDSLPKLPFRSWG erfolgt über Substitutionsanalyse, Längenanalyse, Einteilung in die jeweilige Klasse und die Bestimmung der Dissoziations–konstanten (Tab. 22).

Unterschiede zwischen dem Ligand ERPKRRAPPPVPKKP von Myo5-SH3 und Abp1-SH3 zeigen sich in der Lage des Konsensusmotivs im Liganden, der Länge des Motivs, den flankierenden Aminosäuren des PxxP-Motivs und der Klassenzugehörigkeit (Tab. 22).

Die Auswertung der Interaktion zwischen dem Liganden und der SH3-Domäne von Myo5 zeigt, dass das sensitive Motiv mittig zwischen N- und C-Terminus liegt und eine Länge von 8 Aminosäuren aufweist. Die SH3-Domäne von Myo5 bevorzugt für die Interaktion mit ERPKR _–4 R _-3 A _-2 P _–1 P ₀ P ₁ V ₂ P ₃KKP hydrophobe Aminosäuren in den Positionen -4, -3, -2 und 2 (Tab. 22) wie das Konsensus–motiv %%%PP x %P zeigt. R-4 kann nur durch hydrophobe Aminosäuren substituiert werden. Die hydrophoben Eigenschaften der langen aliphatischen Seitenkette von Arginin stehen an dieser Position im Vordergrund. R-3 zeigt in dieser Position nicht die Funktion als spezifische Aminosäure (positiver Ladungsträger) für die Determinierung der Bindungsklasse (4). Es dominiert die hydrophobe Eigenschaft von Arginin, jedoch können hier wesentlich weniger hydrophobe Aminosäuren als Substituenten (wie unter Position-4 aufgetreten) eingesetzt werden (Tab. 22). Die Substitutionsanalyse des Liganden zeigt, dass R in der Position -3 nicht die ideale Besetzung ist (Abb. 19). Die Substituenten I, V, W zeigen eine stärkere Schwärzung ihrer Spots als die der wt-Aminosäure R. Die Position -2 kann ebenfalls nur durch hydrophobe Aminosäure ersetzt werden, allerdings auch nur durch eine geringere Anzahl wie unter Position -4. Die Position 2 ist spezifisch, da Valin nur durch die hydrophoben Aminosäuren I, L und P substituiert werden kann. Die Position 1 ist als unspezifisch zu bewerten, da P bis auf wenige Ausnahmen durch alle Aminosäuren ersetzt werden kann. Auffällig ist, dass keine aromatische Aminosäure für diese Position als Substitutionsanaloga dienen kann. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Bindungstasche der Domäne nicht für die Aufnahme von großen und hydrophoben Resten geeignet ist. Weiter zeigen die Positionen -1, 0 und 3, dass es sich hier um den Kern des Konsensusmotivs handelt. Der Kern wird durch die spezifischen P in diesen Positionen gebildet. Aus dem resultierenden Konsensusmotiv % _-4 % _-3 % _-2 P _-1 P ₀ x ₁ % ₂ P ₃ kann keine eindeutige Zuordnung in eine Klasse nach Cesareni et al. (19)erfolgen. Der Ligand wird auf Grund der Auffälligkeit in der Position -3 (enthält die aromatische Aminosäure W) in bezug auf das bekannte Px@Px@_- ₃xxP₀xxP₃ tendenziell der Klasse 1@ zu geordnet (19), wobei die Präferenz für eine aromatische Aminosäure an der Position –3 nicht eindeutig bestätigt werden kann.

Das ermittelte %x%P/Ax#P( AGKR )%[+]-Motiv aus der Interaktion von ERPKRR _-3 A _-2 P _–1 P ₀ P ₁ V ₂ P ₃ K ₄ K ₅P und der SH3–Domäne von Abp1 ist zum C–Terminus verschoben (Tab. 22, Abb. 20). Das Konsensusmotiv ist mit 9 Aminosäuren länger als der Konsensus von der Ligand-Myo5-SH3-Interaktion. Das Konsensusmotiv lässt kein eindeutiges Kernmotiv (PxxP) aus der Substitutionsanalyse erkennen. Für die Nummerierung der einzelnen Positionen muss daher das ermittelte Motiv %x%P/Ax#P( AGKR )%[+] mit dembekannten [+]xxxPxxPx[+]PxxL-Motiv (11)(16)(19)(25)verglichen werden. Die Positionen 0, 3 und 5 müssten nach dem allgemeinen P₀xxP₃xK₅-Motiv den Kern des Konsensusmotivs bilden. Die Substitutionsanalyse (Abb. 20) zeigt, dass P0 durch A ersetzt werden kann. Beide Aminosäuren zählen zu den kurzkettigen Varianten. Die Position 0 kann daher neben P durch eine weitere spezifische Aminosäuren A besetzt werden, da sie ähnliche Eigenschaften wie P aufweist. P3 kann sogar durch A, G, K und R ersetzt werden. Die Austauschaminosäuren A und G sind kurzkettig und polar, während K und R basisch positiv geladene Aminosäuren sind. Dieses Ergebnis ist in sofern erstaunlich, da die wt–Aminosäure P kurzkettig und hydrophob ist, daher eher den Eigenschaften von A und G entspricht. Die Aminosäuren K und R besitzen hingegen eine positive Ladung und eine lange hydrophobe Seitenkette. Es besteht somit die Möglichkeit, dass an dieser Position hydrophobe Kräften zwischen der Bindungstasche der Domäne und dem Liganden wirken können, und zusätzlich die weiter entfernte positive Ladung zur Bindung beitragen kann. K5 definiert die spezifische Position im Liganden (4). Diese Position kann nur durch die chemisch verwandte Aminosäure R ersetzt werden. Die Positionen –3, -1 und 4 können nur durch hydrophobe Aminosäuren substituiert werden. R _-3 definiert nicht die spezifische Position im Motiv. Es dominiert an dieser Position die lange hydrophobe Seitenkette von R anstatt der positiv geladenen Guanidiumgruppe. Die Position –2 ist unspezifisch, da hier die überwiegende Anzahl der Aminosäuren als Substituenten dienen können. Die Position 2 kann nur durch aliphatische Aminosäuren substituiert werden. Der Ligand mit dem %x%P/Ax#P( AGKR )%[+]-Motiv wird von K5 in die Klasse K2 eingeteilt.

Trotz der Besonderheiten, die in der Interaktion zwischen dem Ligand ERPKRRAPPPVPKKP und den SH3-Domänen von Myo5 und Abp1 aufgetreten sind, ist die Peptid-Domänenbindung spezifisch. Die Affinität der Bindungen von 3,6 µM (Myo5) und 3,7 µM (Abp1) (Tab. 22) sind für SH3–Domänen sehr stark. Sie liegen im oberen Bereich von 1-100µM (15)^{. Eine mögliche Erklärung für die hohe Affinität der beiden Interaktionen ist, dass aus dem großen Erkennungspool (} Tab. 22 ^{) der beiden SH3-Domänen die Stärke der Bindungsaffinität einen wesentlichen Beitrag für die Spezifität der Peptid-Ligandinteraktion beiträgt. Die hoch affinen Liganden konkurrieren nicht mit den niedriger affinen Bindern.}

^{Es zeigen sich geringfügige Unterschiede in Charakterisierung von}VQQDSLP–KLPFRSWG und der SH3-Domänen von Yhr016 und Rvs167 in Bezug auf die Lage des Konsensusmotivs im Liganden, der Länge des Motivs, den flankierenden Aminosäuren des PxxP-Motivs und der Klassenzugehörigkeit (Tab. 22)^.

In der Auswertung der Substitutionsanalysen des Liganden VQQDSL–P ₀ K ₁ L ₂ P ₃ F ₄ R ₅SWG zeigte sich das Konsensusmotiv P ₀x₁ L ₂ P ₃x₄ R ₅ für die Interaktionen mit der SH3-Domäne von Yhr016 (Tab. 22, Abb. 22). Das Motiv liegt im Liganden zum C-Terminus verschoben und hat eine Länge von 6 Aminosäuren. Die Positionen x1 und 4 sind unspezifische Orte im Konsensus, da sie durch die Mehrzahl der L-Aminosäuren substituiert werden können. Die Aminosäuren P, L, P und R der Positionen 0, 2, 3 und 5 definieren wichtige Bindungspartner für die Interaktion mit der Domäne. Diese Positionen sind in der Substitutionsanalyse nur durch sich selbst zu ersetzen. P0 und P4 sind die beiden Proline, die den Kern des Motivs bilden, und R₅ determiniert die Klasse des Liganden R2. Das analysierte PxLPxR–Motiv stimmt mit dem bekannten PxLPxR Motiv überein (19)(25). Damit kann bestätigt werden, dass Yhr016–SH3 den Liganden VQQDSLP ₀ K ₁ L ₂ P ₃ F ₄ R ₅SWG der Klasse R2 mit dem allgemeinen PxxP-Motiv (4)bindet.

Die Interaktion zwischen der SH3-Domäne von Rvs167 und dem Liganden VQQDSLP ₀ K ₁ L ₂ P ₃ F ₄ R ₅SWG ergibt in der Auswertung der Substitutions–analyse das Konsensusmotiv P ₀ % ₁ L ₂ P ₃ % ₄ R ₅ (Tab. 22, Abb. 21). Das Motiv ist wie der Konsensus von Yhr016 zum C–Terminus verlagert. Es hat ebenfalls eine Länge von 6 Aminosäuren. Mit der näheren Betrachtung der Positionen 1 und 4 fällt auf, dass diese nicht ideal durch die wt–Aminosäuren im Liganden besetzt sind. Für K1 zeigt sich in der Substitutionsanalyse eine stärkere Färbung der Spots für die hydrophoben Substituenten M, P, Q, R, und T. Die Position 4 ist durch F ebenfalls nicht ideal besetzt. Hier tritt eine intensivere Schwärzung durch den Austausch mit den hydrophoben Aminosäuren A, K, P, Q und K auf. Die Positionen 0, 2, 3 und 5 sind spezifische Positionen. Sie bilden die Kernpositionen des Konsensus mit den Aminosäuren P0, L2, P3 und R5.

Der Vergleich der Positionen in den Kosusmotiven P₀P₁#₂P₃P₄R₅ (bekannt ^[ ⁽²⁵⁾ ^]) und P ₀ % ₁ L ₂ P ₃ % ₄ R ₅(ermittelt) zeigt Unterschiede in den Präferenz für Position 1 und 4 für P bzw. hydrophobe Aminosäuren sowie in der Position 2 für aliphatische Aminosäuren bzw. die spezifische Aminosäure L. Da P zu den hydrophoben und L zu den aliphatischen und hydrophoben Aminosäuren zählt, unterscheiden sich die beiden Konsensusmotive unwesentlich. VQQDSL–P ₀ K ₁ L ₂ P ₃ F ₄ R ₅SWG ist in Bezug auf Rvs-SH3-Interaktion ein Klasse-2-Ligand, wobei, wie es aus der Literatur bekannt ist (16)(25), die SH3–Domäne von Rvs167 auch einen Klasse-1-Liganden mit dem Konsensus Rx#PxPP auf Grund der Pseudosymmetrie der PPII (Abb. 3) binden kann.

Die Affinitäten für die Ligandeninteraktion zwischen Yhr016- bzw. Rvs167–SH3 und VQQDSLPKLPFRSWG sind gering bzw. sehr schwach (Tab. 22). Der Wert liegt für Yhr016 bei 75µM (gering) und für Rvs167 bei 490µM (sehr schwach). Der Normbereich für die Bindungsstärker von SH3-Domänen liegt bei 1-100 µM (15). Die sehr schwache Affinität von 490µM (schwache Bindung) der Ligand-Rvs-SH3-Interaktion könnte implizieren, dass die Bindung nicht spezifisch ist. Diese Annahme bestätigt sich nicht. Die erkennbare positive Ligandenzahl von allen Domänen ist die geringste (Tab. 22), so muss die Spezifität auch nicht so hoch sein. Die Liganden können auch mit einer geringeren Affinität gebunden werden, weil es wenig Konkurrenz in diesem Pool gibt. Ähnliches gilt für die Affinität der SH3-Domäne von Yhr016 und ihrem Liganden. Die Affinität ist stärker mit 75µM, wobei geringfügig mehr Liganden als positive Binder (Tab. 22) ermittelt werden.

Bei den SH3-Domänen von Myo5 und Abp1 kann auf Grund des langen Konsensus und der erweiterten minimalen Bindungslänge davon ausgegangen werden, dass die flankierenden Aminosäuren am PxxP-Motiv einen größeren Einfluss nehmen als bei denen von Yhr- und Rvs-SH3. Ein direkter Beweis, dass flankierende Aminosäuren Einfluss auf die Bindungsspezifität ausüben, konnte jedoch nicht erfolgen. Dazu müssen Messungen für weitere KD-Werte mit kürzeren Liganden erfolgen sowie kombinatorische Bibliotheken synthetisiert und untersucht werden. Bei diesem Verfahren wird das Kernmotiv nicht verändert. Die flankierenden Aminosäuren werden wie in der Substitutions–analyse ausgetauscht. Die genaueste Aussage in Bezug auf die Struktur und Funktion (hier Interaktion zum Liganden) kann z.B. die Nuklear-Magnet–Resonanz-Spektrometrie erbringen. Damit können Aussagen über mögliche Aminosäurepräferenzen getroffen werden, die eine Folge der Struktur in der Bindungstasche der Domäne sind.

Weiter kann die Auswertung zu der Charakterisierung der Liganden zeigen, dass das bestehende Klassifizierungsmodell nach Cesareni et. al. (19) noch verbessert werden muss, damit die Liganden allgemeingültig in eine Bindungskategorie zugeordnet werden können. So kann der Ligand der SH3-Domäne von Myo5 nicht eindeutig einer Klasse zugeordnet werden, während der Ligand der SH3–Domäne von Abp1 kein eindeutiges PxxP–Kernmotiv aufweist. Erstaunlicher–weise trifft diese Beobachtung nicht für die Interaktion der SH3–Domäne von Yhr016 und Rvs167 zu. Es wurden eindeutige Konsusmotive und Klassen–zugehörigkeiten festgestellt. Die Konsensusmotive sind sehr ähnlich in ihrer Primärsequenz, Länge und Lange. Somit kann geschlussfolgert werden, dass die selektiven SH3-Domänen (Yhr016 und Rvs167) einen eindeutigen und kurzen Konsensus im Liganden binden, während die promiskuitiven Domänen (Myo5 und Abp1) ein stärker variables und längeres Motiv im Liganden binden. Ähnliches zeigen die Größen der Minialepitope in den Längenanalysen von Myo5-SH3- und Abp1-SH3-Domäne mit 11 Aminosäuren bzw. von Yhr016–und Rvs167-SH3 mit 9 Aminosäuren.

Diese aufgetretenen Fragen werden Untersuchungsansätze für die nachfolgenden Experimente mit dem gesamten Satz der Hefe-SH3-Domänen sein.

Myo-SH3

Abp1-Sh3

Yhr016-SH3

Rvs167-SH3

Array:

Grenzwert in Mean

404

449

438

446

Binderzahl

354

159

65

51

Übereinstimmungen

24

24

-

-

-

-

12

12

Selektivität in %

12

5,4

2,2

1,7

Integral

0,068

0,018

0,01

0,009

Charakterisierung:

ERPKRR...

ERPKRR...

VQQDSL...

VQQDSL...

Min in Mean (Array)

271

267

255

255

Max in Mean (Array)

1150

3660

2238

2953

SI-Peptid in Mean (Array)

916

999

916

999

Positionen

R- ₄(HIKLMVW)
R- ₃(IVW)
A- ₂(KLMPN)
P _-1 P ₀ P ₁ _{(x ohne F,T,V,W,Y)} V ₂(ILP)P ₃

R _-4 _{(x ohne G,N,P,Y)} R _-3(AFGHIKTW)
A _-2 _{(x ohne P)} P- ₁(GSAFHIKLMV)
P ₀ /A
P1 _{(x ohne G,N,Q,S,T,W,Y)} V ₂(IKL)P ₃(AGKR)
K ₄(DQSTAPRV)
K ₅ /R

P ₀ K ₁(x ohne
G,F,W,Y)L ₂ P ₃ F ₄(x ohneW,Y)R ₅

P ₀ K ₁(MP
QRT)
L ₂ P ₃ F ₄(AKPR)
R ₅

Konsensus

%%%PPx%P

%x%P/Ax#P/GKR%[+]

PxLPxR

P%LP%R

Klasse

tendenziell @1

K2

R2

R2

KD-Wert

3,6 µM

3,7 µ M

75 µM

490 µM

Myo-SH3

Abp1-Sh3

Yhr016-SH3

Rvs167-SH3

Minimallänge

11 AS: PKRRAPPPVPK

11 AS:
RRAPPPVPKKP

9 AS: PKLPFRSWG

9 AS: SLPKLPFRS

Tab. 22: Gesamtzusammenfassung