1 Einleitung

• 1.1 Überblick

• 1.2 SH3-Domäne als Beispiel einer Protein-Interaktions-Domäne

• 1.3 Selektivität und Promiskuität; Regulationsmechanismen in der Zelle

• 1.4 Untersuchte SH3-Domänen

• 1.5 Medizinische Zusammenhänge

  • 1.5.1 Malaria und Tuberkulose

  • 1.5.2 Amphiphysin I

  • 1.5.3 AmphiphysinII/ BIN1

2 Thema

3 Materialien/ Methoden

• 3.1  Die SPOT-Technologie: chemischer Teil

  • 3.1.1 Praktische Durchführung der SPOT-Synthese

  • 3.1.2 Eingesetzte WISE-Arrays

• 3.2 Die SPOT-Technologie: Screening-Teil

  • 3.2.1  Praktische Durchführung des Screening-Teils der SH3-Peptid-Bindungsstudie

  • 3.2.2 Regenerierung der CAPE-Membran

• 3.3 Standart-Festphasenpeptidsynthese

• 3.4 BIAcore/ Surface Plasmon Resonance

  • 3.4.1 Theoretische Betrachtung

  • 3.4.2 BIAcore: praktische Durchführung

• 3.5 Verwendete Geräte

• 3.6 Verwendete Software:

• 3.7 Chemikalien

  • 3.7.1 Reagenzien für die Spotsynthese

  • 3.7.2 Reagenzien für die BIAcore®X

• 3.8 Datenauswertung

• 3.9 Grenzwertbestimmung

4 Ergebnisse

• 4.1 Analyse der Ligand-SH3-Domäneninteraktion

  • 4.1.1 SH3-Domänen von Myo5 und Abp1

  • 4.1.2 SH3-Domänen von Rvs167 und Yhr016

  • 4.1.3 Gesamtauswertung der vier Screeningarrays

• 4.2 Charakterisierung der ausgewählten Liganden der vier SH3-Domänen

  • 4.2.1  ERPKRRAPPPVPKKP als Myo5-SH3-Domänenligand

  • 4.2.2 ERPKRRAPPPVPKKP als Abp1-SH3-Domänenligand

  • 4.2.3 Zusammenfassung der Charakterisierung von ERPKRRAPPPVPKKP

  • 4.2.4 VQQDSLPKLPFRSWG als Rvs167-SH3-Domänenligand

  • 4.2.5 VQQDSLPKLPFRSWG als Yhr016-SH3-Domänenligand

  • 4.2.6 Zusammenfassung der Charakterisierung von VQQDSLPKLPFRSWG

• 4.3 Regenerierung der CAPE-Membran

5 Diskussion

• 5.1 Bewertung der WISE-Arrays

• 5.2 Bewertung der Peptid-Protein-Bindungen

• 5.3 Regenerierung

6 Ausblick

Abkürzungsverzeichnis

Anhang

Literaturverzeichnis

Lebenslauf

Danksagung

Erklärung

Tab. 1: Charakterisierung der ausgewählten SH3-Domänen

Tab. 2: Ansatz zur Derivatisation der Zellulose

Tab. 3: Ansatz zur Bildung der primären Amidgruppe

Tab. 4: Schutzgruppen der Aminosäuren

Tab. 5: Abspaltung 1

Tab. 6: Abspaltung 2

Tab. 7: Zusammensetzung des Blocking Buffer (BB)

Tab. 8: 1. Antikörperendkonzentration in BB

Tab. 9: 2. Antikörperendkonzentration in BB

Tab. 10: Bestandteile der Luminol/ enchancer solution

Tab. 11: Zusammensetzung des Zitratpuffers

Tab. 12: Geräte

Tab. 13: Software

Tab. 14: Auflistung aller verwendeten Aminosäuren

Tab. 15: GST-Capturekit der Firma BIACORE

Tab. 16: Konzentrationen der SH3-Fusionsproteine

Tab. 17: HBS-Puffer BIA Certified der Firma BIACORE

Tab. 18: Zusammenfassung

Tab. 19: Beschreibung des Konsensusmotivs mit ASCII

Tab. 20: Zusammenfassung der Charakterisierung von ERPKRRAPPPVPKKP

Tab. 21: Zusammenfassung der Charakterisierung von VQQDSLPKLPFRSWG

Tab. 22: Gesamtzusammenfassung

Tab. 23: Datensatz Abp1-SH3

Tab. 24: Datensatz Myo5-SH3

Tab. 25: Datensatz Rvs167-SH3

Tab. 26: Datensatz Yhr016-SH3

Tab. 27: Datensatz Regenerierung Abp1-SH3

Tab. 28: Datensammlung Markierungspeptide von SH3-Domänen Abp1, Myo5, Rvs167, Yhr016

Tab. 29: Längenanalyse: Ligand: ERPKRRAPPPVPKKP Myo5-SH3/ Abp1-SH3

Tab. 30: Längenanalyse: Ligand: VQQDSLPKLPFRSWG Rvs167-SH3/ Yhr016-SH3

Tab. 31: Korrespondierende Liganden von Abp1-/ Myo5-SH3 und Rvs167-/ Yhr016-SH3

Tab. 32: Puffer für die Regenerierung

Abb. 1: Schematische Darstellung der SH3-Domäne Abp1: rot/ blau: ß-Faltblätter, grün: Helix, zyan: N-Src-Loop, pink: RT-Loop, grau: distaler Loop und gelb: Aminosäuren, welche die Bindungstasche ausbilden

Abb. 2: A) Struktur und Bindungsmechanismus einer SH3-Domäne: Dargestellt ist die SH3–Domäne von Sem5, die einen Polyprolinliganden bindet. B) Darstellung der Bindungsoberfläche von Sem-SH3, in der ein Ligand bindet:  Die Bindungsoberfläche der Domäne besteht aus drei Taschen (grün und gelb gekennzeichnet). Hier wird der prolinhaltige Ligand (in schwarz dargestellt) erkannt. Weiter ist die schematisch–räumlich und trianguläre Struktur des Liganden (PPII-Helix) zu erkennen.Grün stellt sich die spezifische Bindungstasche dar, die mit den basischen Aminosäureresten interagiert. Gelb stellen sich die zwei konservierten aromatischen Taschen dar, die mit der xP-Sequenz des Liganden interagieren.

Abb. 3: Schematische Darstellung der Ligandenbindungsmöglichkeit einer SH3-Domäne: Gezeigt wird eine SH3-Domäne, die einen Klasse-1-Liganden bzw. einen Klasse-2-Liganden binden kann. In beiden Abbildungen ist ausgehend vom Liganden links der RT-Loop und rechts der n-Src-Loop. Die Orientierung des Klasse-1-Liganden vom N- zum C-Terminus in der Bindungstasche ist auf der linken Seite zu sehen, und die des Klasse-2-Liganden in der gleichen Tasche von C- zum N-Terminus auf der rechten Seite zu sehen ist. Die Liganden unterscheiden sich nur in einer Rotation von 180° in der Vertikalen. Beim Klasse-1-Liganden zeigen die Prolinreste des PxxP-Motivs zum RT-Loop und beim Klasse-2-Liganden zum n-Src-Loop. Die Positionen der zwei unspezifischen Taschen und der spezifischen Tasche bleiben konstant.

Abb. 4: Ausschnitt eines SH3-Proteinnetzwerkes in Saccharomyces cerevisiae: Die Farben der Linien entsprechen den einzelnen Interaktionen zwischen den Proteinen, die durch SH3–Domänen vermittelt wurden. Der Durchmesser der Linien ist proportional zu den gemessenen Signalintensitäten der jeweiligen Bindung. Fett unterstrichen sind die vier näher zu charakterisierenden SH3-Domänen von Myo5 (rot), Abp1 (blau), Rvs167 (hellblau) und Yhr016 (pink).

Abb. 5: Modell: Rolle der negativen Selektion für ein spezifisches Interaktionsnetzwerk: a) Das PxxP-Motiv von Pbs2 (gekennzeichnet mit einem X) wird neben Sho1-SH3 von SH3–Domänen anderer Spezien erkannt. Die Interaktion zwischen den SH3-Domänen und dem Pbs2–Motiv ist promiskuitiv, da die Erkennungsprofile (rote und graue Kreise) für diesen Liganden überlappen. b) Das Pbs2-Motiv (gekennzeichnet mit einem X) ist in der Hefe einzigartig. Das Motiv liegt nur im Erkennungsprofil (rote und graue Kreise) von Sho1-SH3. Es ist hoch selektiv für Sh01-SH3.

Abb. 6: Grundprinzip SPOT-Verfahren zur Peptidsynthese auf Cellulosemembranen:

Abb. 7: Zusammenfassung des praktischen Ablaufes der Spotsynthese

Abb. 8: Schematische Darstellung WISE-Technik:

Abb. 9: Chromatogramme der Liganden ERPKRRAPPPVPKKP (SH3-Abp1 und -Myo5) und VQQDSLPKLPFRSWG (SH3-Rvs167 und -Yhr016) in der analytischen HPLC:

Abb. 10: Massenspektren (MALDI-TOF) der Liganden ERPKRRAPPPVPKKP (SH3–Abp1 und –Myo5) und VQQDSLPKLPFRSWG (SH3-Rvs167 und -Yhr016): Das Molekulargewicht der einzelnen Liganden ist in der Abbildung als unterstrichener Wert dargestellt. ERPKRRAPPPVPKKP bei 1753,57 g/mol (soll 1753,08 g/mol) und VQQDSLPKLPFRSWG bei 1757,42 g/mol (soll 1757,97 g/mol)

Abb. 11: Aufbau des CM5-Chips und Aufbau des Meßsystems: Linke Graphik: Aufbau des Sensorchips, Dextranmatrix (blau-orange), Goldschicht (gold), Glas (hellblau) Rechte Graphik: Aufbau des Meßsystems Flusskanal (schwarzumrandet), Sensorchip (hellblau-gelb), SPR–Detektor (orange) bestehend aus Lichtquelle und dem Sensor. Der Detektor befindet sich auf der Glasseite.

Abb. 12: Schematische Darstellung der Modifizierungsmöglichkeiten der carboxy–mehylierten Dextranmatrix:

Abb. 13: Schematische Darstellung eines Sensorgrams: a) Basislinie im Pufferfluss, b) Probeninjektion, Bindung und Signalanstieg, c) Dissoziation, Signalabfall im anschließenden Pufferfluss, d) Regenerierung und entsprechende Basislinie, die Kästchen zeigen die Beladung des Sensorchips

Abb. 14: Darstellung des Screeningarrays der Myo-SH3-Domäne: Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Myo5–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. oranger Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Abb. 15: Darstellung des Screeningarrays der Abp1-SH3-Domäne: Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Apb1–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. blauer Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Abb. 16: Darstellung des Screeningarrays der Rvs167-SH3-Domäne: Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Rvs167–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. pinker Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Abb. 17: Darstellung des Screeningarrays der Yhr016-SH3-Domäne: Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Peptidbibliothek mit 2953 15–meren-Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) hergestellt und auf Bindung mit zur Yhr016–SH3–Domäne analysiert. Die sichtbaren Spots zeigen eine Interaktion zur jeweiligen SH3–Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. grüner Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum.

Abb. 18: Vergleich der SI (Mean) der gesamten SH3-Domänenarrays: Vergleich der Selektivitäten anhand der Flächen unter den jeweiligen Graphen der SH3–Domänen von Myo5 (orange), Abp1 (blau), Yhr016 (grün) und Rvs167 (pink). Die Signal–intensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden von Maximum zu Minimum geordnet, normalisiert und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide aufgetragen

Abb. 19: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und Myo5-SH3: Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit jene Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, orange Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Abb. 20: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und Abp1-SH3: Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit konnten Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, blaue Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Abb. 21: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und SH3-Domäne: Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset, stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit konnten Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, pinke Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Abb. 22: Darstellung der Substitutions-/ Längenanalyse nach der Auswertung im Lumi–Imager und graphische Darstellung der Affinität zwischen Ligand und SH3-Domäne: Mit Hilfe der SPOT–Synthese wurden die Membranen erstellt. Nach der Inkubation mit der jeweiligen Domäne und dem Antikörperset stellten sich nach der Auswertung die abgebildeten Muster dar. Linke Abbildung: Substitutionsanalyse (obere Fläche): In der ersten Spalte wurde der Wildtyp (wt) synthetisiert. Jede Aminosäure des Liganden wurde durch 19 L-Aminosäuren ersetzt (außer C) damit konnten Schlüsselaminosäuren erkannt werden. Längenanalyse (untere Fläche): Der Ligand wurde nacheinander N- und C-terminal bis auf eine Länge von 5 Aminosäureresten gekürzt. Rechte Abbildung: Graphische Darstellung der Beziehung zwischen Resonanzunit zur gegebenen molaren Konzentration: blaue Vierecke: sind die Signale zu der jeweiligen Konzentration, grüne Linie: gemittelter Graph zwischen den einzelnen Signalen. Der KD-Wert wird unter zu Hilfenahme des Programms BIAevaluation aus den abgebildeten Werten errechnet (siehe ab 3.4).

Abb. 23: Darstellung des Screeningarrays von Abp1-SH3 (CAPE-Membran) nach der Auswertung im Lumi-Imager und die graphische Darstellung aller Mean des Screeningarrays: Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Proteinbibliothek mit 2953 Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) mit einer Länge von 15 Aminosäure hergestellt. Die sichtbaren Spots (punktförmige Abbildungen) zeigen eine Interaktion mit der jeweiligen SH3-Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. blauer Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum

Abb. 24: Darstellung des Screeningarrays von Abp1-SH3 (CAPE-Membran) nach der Auswertung im Lumi-Imager und die graphische Darstellung aller Mean des Screeningarrays: Linke Abbildung: Mit Hilfe der SPOT-Synthese wurde eine Proteinbibliothek mit 2953 Peptiden und 15 Markierungspeptiden (starkgefärbte Eckpunkte) mit einer Länge von 15 Aminosäure hergestellt. Die sichtbaren Spots (punktförmige Abbildungen) zeigen eine Interaktion mit der jeweiligen SH3-Domäne. Rechte Abbildung: Die Signalintensitäten (in Mean-Einheit Genspotter) wurden vom Maximum zum Minimum geordnet und gegen die Anzahl der nach Mean geordneten Peptide (Peptidindex) aufgetragen. roter Graph: Verlauf der Signalintensität vom Maximum zum Minimum

Abb. 25: Signalintensitäten (Mean) der SH3-Abp1-Domänenarrays vor und nach der Regeneration: Vergleich der Signalintensitäten vor der Regenerierung (blauer Graph) und nach der Regenerierung (roter Graph). Die Mean-Werte wurden gegen den Peptidindex (siehe Abb.24) aufgetragen.