1 Einleitung

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Der menschliche Körper stellt ein komplexes Netzwerk an überlebenswichtigen Prozessen dar. Effektoren dieses Zusammenspiels sind die Zellen. Spezialisiert auf unterschiedliche Funktionen müssen sie sich an die lokal herrschenden Bedingungen anpassen und diese aktiv modifizieren. Die für das Überleben und die Funktion der Zellen elementaren Umweltfaktoren sind Glukose und Sauerstoff. Ihre Verfügbarkeit sorgt für eine reibungslose Funktion in allen Zelltypen. Die Konkurrenz um diese und andere Umweltressourcen mit anderen Organismen hat evolutionär zur Ausbildung eines aktiven Schutzmechanismus gegen Nahrungskonkurrenten geführt, dem Immunsystem. Das Eindringen eines Pathogens in den Körper löst eine Reaktion aus, die darauf abzielt, dieses zu beseitigen, Ressourcen zu schützen und die Weitergabe genetischer Informationen an die nächste Generation zu gewährleisten. Entzündungsprozesse als Reaktion auf ein Pathogen zeichnen sich durch die vier Merkmale Überwärmung, Schwellung, Rötung und Schmerz aus. Es bildet sich lokal eine Hyperämie mit verlangsamtem Blutfluss und ein durch Histamin verursachtes Ödem, das bei Gefäßeinengung den Abtransport von Metaboliten und Kohlendioxid erschwert. Nimmt dieser Prozess einen chronischen Verlauf, wie bei dem Krankheitsbild der Rheumatoiden Arthritis, so bildet sich lokal ein relativer Sauerstoff- und Glukosemangel.

Im Rahmen dieses Krankheitsbildes beeinflussen Lymphozyten als pathogenetische Einflussfaktoren das Ausmaß dieser Erkrankung. Die Forschung zur Rheumatoiden Arthritis konzentriert sich auf die Funktion dieser Zellen und ihrer Produkte, welche als Signaltransduktoren in Form von Zytokinen vorliegen oder als Rezeptormoleküle zur Interaktion mit anderen Zellen des Immunsystems imponieren. Als eine wichtige Population unter den Lymphozyten wird in diesem Zusammenhang die Gruppe der Lymphozyten angesehen, die das Oberflächenmolekül CD4 tragen. Aus diesem Grunde steht die Untersuchung dieser Zellen in der vorliegenden Arbeit im Vordergrund.

Sie befasst sich mit der Wirkung von Glukose- und Sauerstoffmangel auf CD4+-Zellen, einer speziellen Population der Immunzellen des Körpers. Es sollte die Frage geklärt werden, wie sich diese Zellen verhalten, wenn man sie in einer hypoxischen Umgebung über längere Zeit inkubiert, was einer Nachahmung der oben genannten in vivo Verhältnisse entsprach. Glukose diente hierbei als Energielieferant zur Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) über die Glykolyse oder, in Kombination mit Sauerstoff, über die oxidative Phosphorylierung. Charakteristisch für eine hypoxische Umgebung ist der Nachweis von HIF-1, einem bei Sauerstoffmangel stabilisierten Protein in den Zellen. Messungen der ATP-Bilanz, der Zytokinproduktion und der Wirkung auf die Transkription zweier Schlüsselenzyme für die Glykolyse und den Radikalstoffwechsel sollten Aussagen über das Energiemanagement der Zellen und die Beeinflussung der Zellfunktionen durch Glukose- und Sauerstoffmangel liefern. Die folgenden Abschnitte dieses Einleitungskapitels erläutern die genannten Faktoren und Messvariablen näher.

1.1 Das Immunsystem und Unterscheidungsmerkmale für verschiedene T-Lymphozyten

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Das Immunsystem lässt sich in die zelluläre und die humorale Komponente einteilen. Das Komplementsystem und die zu Plasmazellen ausdifferenzierten, Antikörper produzierenden B-Lymphozyten stellen die Stützpfeiler der humoralen Immunität dar. T-Lymphozyten hingegen stehen als Haupteffektorzellen der zellulären Immunität im Vordergrund. Allen T-Lymphozyten gemeinsam ist die Expression des T-Zellrezeptors (TCR) auf ihrer Oberfläche. Ein für die Signalweiterleitung verantwortlicher Abschnitt dieses Rezeptors ist auch unter der Oberflächenmarkerbezeichnung CD3 bekannt. Zusätzlich zum T-Zellrezeptor gibt es noch weitere, die einzelnen Subpopulationen der T-Lymphozyten differenzierende Oberflächenmarker, wie die zwei verschiedenen MHC-Klassen bindenden Adhäsionsmoleküle CD4 und CD8. Entwicklungsbedingt gibt es die Möglichkeit, dass T-Lymphozyten entweder CD4 oder CD8 auf ihrer Oberfläche exprimieren (CD4+CD8- oder CD4-CD8+) oder beide Marker gleichzeitig aufweisen (CD4+CD8+ -Lymphozyten). CD4+CD8--Lymphozyten lassen sich auf der Basis ihres Zytokinprofils weiter in TH1-Zellen und TH2-Zellen aufgliedern. TH1-Zellen sind durch die Expression von Interleukin-2, Interferon- und Tumornekrosefaktor- gekennzeichnet, während TH 2-Zellen IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13 produzieren. Beide Gruppen können aus einer Population naiver T-Zelle hervorgehen und stellen zwei unterschiedliche Polarisationen dar. TH-1 Zellen entstehen durch den Einfluss von IL-12 auf naive T-Zellen. Lymphozyten des TH2-Typs entwickeln sich aus den naiven T-Zellen durch die Bindung von IL-4. Die typischen Zytokine der TH1-Population werden besonders bei autoimmunbedingten Erkrankungen wie Rheumatoider Arthritis und Multipler Sklerose gefunden, während Erkrankungen mit einer allergischen Genese einen Überschuss an Zytokinen aus der TH2 Gruppe aufweisen. Es existiert das Phänomen, dass mit zunehmendem Alter des Individuums die Polarisierung naiver T-Zellen in Richtung TH1 Populationen erfolgt. Dies könnte eine Ursache für das Verschwinden von atopischen Krankheitsbildern mit zunehmendem Lebensalter sein (1). TH1- und TH2-Zellen ist gemeinsam, dass sie für ihre Aktivierung und Proliferation den Kontakt mit antigenpräsentierenden Zellen (APC) benötigen. Diese APC präsentieren den T-Lymphozyten das Antigen gebunden an einen MHC-II Komplex in Kombination mit einem kostimulatorischen Molekül (CD80/86). Die über den MHC-II Komplex präsentierten Antigene sind im wesentlichen extrazellulären Ursprungs. TH1 Zellen sind in der Lage, über das Zytokin Interferon- (IFN-) Makrophagen zu aktivieren, welche körperfremde oder zur Vernichtung markierte Zellen phagozytieren und die prozessierten Antigene wiederum auf ihrer Oberfläche über MHC-II als antigenpräsentierende Zelle (APC) zeigen. CD4-CD8+-Lymphozyten hingegen werden über das Erkennen von MHC-I gebundenem Antigen auf allen Körperzellen unter Zytokineinfluss der TH1 Zellen zur Proliferation angeregt. Die über MHC-I präsentierten Antigene sind Fragmente von intrazellulär produzierten Proteinen, die als fremd erkannt werden, wenn sie viralen oder entarteten Ursprungs sind. Eine Aktivierung dieses Zelltyps hat die Einleitung des programmierten Zelltodes der präsentierenden Zelle zur Folge. Auf diese Weise werden virale oder durch Entartung von Körperzellen hervorgerufene Gewebsschäden begrenzt. TH2 Zellen sind hingegen hauptsächlich für die Aktivierung von B-Lymphozyten verantwortlich und regen diese zur Ausdifferenzierung zu Plasmazellen mit einer spezifischen Antikörperproduktion an(2).

1.2 Die Energieversorgung der Zelle, Entstehung von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die funktionelle Bedeutung von Adenosintriphosphat (ATP)

Die Energieversorgung in allen eukaryoten Zellen ist durch zwei miteinander gekoppelte, jedoch auch eigenständig funktionierende Stoffwechselwege zur ATP Produktion charakterisiert. Dies ist zum einen die Glykolyse, welche als phylogenetisch ältestes, da in Pro- und Eukaryoten vorkommendes, System angesehen wird. Sie funktioniert unter sauerstoffreichen und sauerstoffarmen Bedingungen. Zum anderen dient die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), welche nur in den Mitochondrien eukaryotischer Zellen vorkommt, zur Synthese von ATP. Sie erfordert das unbedingte Vorhandensein von Sauerstoff. Beide Systeme sind über den Zitratzyklus miteinander verbunden, der als zentraler Kreislauf für die Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten für die oxidative Phosphorylierung aus der Glykolyse und aus der Verwertung von glukoplastischen Aminosäuren verantwortlich ist. Die Effizienz beider ATP liefernder Prozesse ergibt sich aus der Menge ATP pro Mol eingesetzter Glukose, und ist bei der oxidativen Phosphorylierung mit maximal 34 mol ATP pro mol Glukose bei weitem größer als bei der anaeroben Glykolyse mit 2 mol ATP pro mol Glukose. Der Nachteil dieser hohen Effizienz ist die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette. Zu den ROS gehören Moleküle wie Wasserstoffperoxyd (H2O2), Ionen wie das Hypochlorid-Ion (OCl-), Radikale wie das Hydroxylradikal (•OH) und Mischformen wie das Superoxid-Anion (•O2 -). Diese Radikale sind für Schädigungen von Zellmembranen verantwortlich, da sie die Fettsäureseitenketten der Membranlipide über verschiedene Zwischenstufen kovalent verknüpfen und somit deformieren. Dies führt im Falle der Mitochondrienmembran zu Funktionsverlusten der Atmungskette, im Falle der Zellmembran zu Beeinträchtigungen in der rezeptorassoziierten Signaltransduktion. Werden die Membranen des endoplasmatischen Retikulums oder des Golgiapparates geschädigt, sind die Proteinsynthese und die Glykolysierung beeinträchtigt. Als Schutz gegen die Wirkung der ROS gibt es enzymatische Protektionsmechanismen wie die Superoxiddismutase (SOD) und die Katalase. Mit ihrer Hilfe werden die entstandenen Radikale in folgender Reaktionskette unschädlich gemacht:

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Ihre aggressive Wirkung auf Zellmembranen wird von Immunzellen wie Makrophagen und neutrophilen Granulozyten jedoch auch dazu verwendet, phagozytiertes Material wie beispielsweise Bakterien zu zerstören. Hierzu synthetisieren Makrophagen mit Hilfe des Enzyms NADPH-Oxidase in speziellen Zellkompartimenten, Phago-Lysosomen genannt, Superoxid-Anionen. Neutrophile Granulozyten haben darüber hinaus die Fähigkeit, mit Hilfe des Enzyms Myeloperoxidase aus Wasserstoffperoxyd Hypochlorid-Ionen (OCl -) zu erzeugen, welche als stark antiseptisch wirkende Substanzen Bakterienmembranen oxidieren. Da es sich bei den CD4 +- Lymphozyten nicht um phagozytierende Zellen handelt, steht bei der Betrachtung der SOD ihre protektive Funktion für die eigenen Zellmembranen im Vordergrund.

ATP dient in der Zelle als Energiespeicher, auf den ein rascher Zugriff möglich ist. Die im Triphosphat enthaltene Energie wird in einem exergonen Prozess mittels hydrolytischer Abspaltung des dritten Phosphatrestes durch Phosphatasen freigesetzt. Sie wird verwendet, um Ionenpumpen anzutreiben, Proteine zu synthetisieren, um für Phophorylierungsreaktionen Ausgangsmaterial und Energie bereitzustellen, sowie für alle energieabhängigen Prozesse in der Zelle. ATP dient aber auch extrazellulär als Mediator von Immunfunktionen. So ist zum Beispiel die lytische Aktivität von NK-Zellen durch ATP, welches extrazellulär wirkt, negativ beeinflussbar (3). Auf aktivierten Lymphozyten sind ATP bindende Enzyme wie Ecto-nucleosid-triphosphat-diphosphohydrolase (Ecto-NTPDasen) exprimiert. Man kann auch purinerge Rezeptoren für ATP finden, von denen es Ionenkanal-assoziierte (P2X) und G-Protein gekoppelte (P2Y) gibt. Durch Depletion von extrazellulärem ATP und Blockade von Ecto-NTPDasen lassen sich beispielsweise die Transkription von IL-2 mRNA und die Interferon-γ Sekretion hemmen. Des weiteren werden auch intrazelluläre T-Zell-Rezeptor vermittelte Kalziumströme durch extrazelluläres ATP beeinflusst (4). Im Zusammenhang mit der Energiegewinnung ist ein Effekt zu nennen, der bei malignen Zellen beobachtet wurde. Dies ist der Warburg-Effekt, nach welchem maligne Zellen trotz guter Oxygenierung bei ausreichendem Angebot von Glukose den aerob-glykolytischen Weg der Energiegewinnung bevorzugen. Dieser ist im Vergleich zur oxidativen Phosphorylierung weit weniger effizient. Ursache hierfür ist möglicherweise eine autonome Glukoseaufnahme durch die malignen Zellen, welche zu einer kontinuierlichen Beanspruchung der glykolytischen Kaskade führt (5). Des weiteren gibt es noch zwei andere bei Mikroorganismen verbreitete Effekte, welche die Zusammenhänge der Glykolyse und der oxidativen Phosphorylierung betreffen. Zum einen ist hier der Pasteur-Effekt zu nennen. Darunter versteht man, dass Zellen durch die Versorgung mit Sauerstoff in ihrem Umsatz von Glukose reguliert werden. Bei hohem Sauerstoffangebot wird die glykolytische Aktivität zu Gunsten der oxidativen Phosphorylierung gebremst. Zum anderen wird ein weiterer Regulationsmechanismus durch den Crabtree-Effekt beschrieben. Er besagt, dass eine hohe Glykolyserate die oxidative Phosphorylierung hemmt.

1.3 Die zentrale Rolle von HIF-1α, seine Struktur und seine Funktion als Transkriptionsfaktor

HIF (Hypoxia Inducible Factor) ist ein zentrales Protein in allen Zelltypen, welches für die Regulation von Zellfunktionen zuständig ist, die der Zelle den adäquaten Umgang mit einer hypoxischen Umgebung ermöglichen. Hierzu zählen Einflüsse auf folgende Enzyme der Glukoseverwertung:

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Hexokinase-1 und 2, Phosphofructokinase-L, Aldolase-C, Triosephosphatisomerase, Pyruvatkinase-M, Laktatdehydrogenase-A, Enolase-1 und der Glukosetransporter-1 (6).

HIF dient aber auch zur Regulation der Transkription von VEGF als Aktivator der Angiogenese. VEGF wird von T-Lymphozyten im Entzündungsgebiet produziert und trägt neben seinem Einfluss auf die durch Endothelzellen initiierbare Angiogenese auch zur proinflammatorischen T-Lymphozyten-Differenzierung durch Erhöhung der IFN-γ-Expression in T-Zellen bei. Gleichzeitig wird durch VEGF die IL-10 Produktion herunterreguliert und somit ein wichtiger anti-inflammatorischer Faktor ausgeschaltet (7). Im Eisenstoffwechsel spielt HIF ebenfalls eine entscheidende Rolle durch die Regulation von Coeruloplasmin, von Transferrin und seinem Rezeptor wie auch im Matrixstoffwechsel durch einen Einfluss auf die Expression von Prolyl-4-hydroxylase-α und Kollagen Typ V (8-12). Entdeckt wurde der Faktor jedoch durch seine Wirkung auf die Erythropoietinproduktion von Leber und Nierenzellen. Erythropoietin ist für die Produktion von neuen Erythrozyten im Knochenmark als Sauerstofftransporter für den Kreislauf verantwortlich (13). Das HIF-1 Protein wurde erstmals 1995 von Wang et al. kloniert und sequenziert. Hier zeigten sich zwei Untereinheiten, HIF-1α mit 120 kDa (bis dato unbekannt) und HIF 1β mit 91-94 kDa (vormals auch als ARNT (Aryl-Hydrocarbon receptor nuclear translocator) bekannt). In der Proteinstruktur findet sich eine sauerstoffabhängige Degradationsdomäne (ODD), die für den Abbau des Faktors unter normoxischen Bedingungen im Proteasomenkomplex der Zellen verantwortlich ist. Erst ab einer Sauerstoffsättigung von weniger als 6% beginnt die Stabilisierung von HIF-1α. Bei einem derart niedrigen Sauerstoffangebot gelingt es den eisenabhängigen Prolyl-4-hydroxylasen nicht mehr, die Proline an Position 402 und 564 innerhalb der ODD zu oxidieren, um Hydroxylgruppen für eine Bindung an pVHL (product of von Hippel-Lindau gene) herzustellen. Dadurch wird eine unmittelbare Ubiquitinierung und der folgende Abbau des Faktors im 26S-Proteasomenkomplex verhindert (14).Somit gelten die Prolyl-4-hydroxylasen als intrazellulärer Sauerstoffsensor in vielen Zelltypen.

Dauert die Hypoxie an, findet sich HIF-1α schon nach ungefähr einer Stunde im Zellkern, wo es mit HIF-1β dimerisiert und an die Bindungsstelle für HIF (HBS) der verschiedenen von ihm beeinflussten Gene bindet. HIF benötigt jedoch Kostimulatoren um die Transkription der Zielgene zu initiieren. Bei den Genen, die für Transferrin, Phosphoglyceratkinase I, Insuline-like-growth-factor-binding-protein oder Glukosetransporter-1 kodieren, reicht auch ein Multimer von verschiedenen HIF Bindungsdomänen zur Transkription aus. Dies bedeutet, wenn HIF-1 in ausreichender Menge im Kern vorhanden ist, werden diese Gene auch ohne Kostimulatoren transkribiert.

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Neben der Hypoxie sind auch verschiedene Zytokine in der Lage sogar unter Normoxie die HIF-1α Stabilisierung und die Translokation in den Zellkern zu bewirken. Unter ihnen sind IL-1β, TNF-α, TGF-β, PDGF, FGF-2 und der Insuline-like-growth-factor. Sie binden an mit Tyrosinkinasen verbundenen Rezeptoren (RTK) und bewirken die Stimulation des PI-3K/Akt-kinase/FRAP-Weges, welcher die Translation von HIF-1α verstärkt (15).

Die rezeptorgebundenen Tyrosinkinasen aktivieren jedoch auch die RAF/MEK/MAP-Kinase-Kaskade, so dass über diesen notwendigen Weg HIF-1α phosphoryliert wird und in den Kern gelangen kann. Im Gegensatz zum ersten Weg zeichnet sich der zweite durch ein Fehlen des Einflusses auf die Translation von HIF-1α selbst aus.

1.3.1  Die Relevanz von Hypoxia Inducible Factor-1 (HIF-1) für Autoimmunerkrankungen am Beispiel der Rheumatoiden Arthritis

Die Rheumatoide Arthritis (RA) stellt sich als eine chronisch inflammatorische Erkrankung der Gelenke mit hyperplastischer, invasiv wachsender, die Knochen- und Knorpelsubstanz zerstörender Synovialschleimhaut dar. Diese ist von den verschiedenen Immunzelltypen infiltriert. Lokal zeigt sich eine Ansammlung von Makrophagen, B-Lymphozyten und T-Lymphozyten und eine ebenfalls lokale Erhöhung der TNF-α- und IL-1β-Konzentration. Bei dieser Erkrankung zeigen im Mittel 50% der Synoviozyten eine starke HIF-1α-Produktion, während bei Synovialgewebe von Normalspendern nur bis zu 20 % der Synoviozyten HIF-1α positiv sind (16).

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Aufgrund der erhöhten IL-1β- und TNF-α-Konzentration ist eine durch diese beiden Zytokine verstärkte HIF-1α-Synthese über die im Kapitel 1.3 beschriebenen Tyrosinkinase-assoziierten Rezeptoren und den mit ihnen verbundenen Signalkaskaden möglich. So konnte ein Zusammenhang zwischen TNF-α Rezeptorbindung und einer verstärkten Expression von funktionell aktivem, jedoch im Gegensatz zu Hypoxie ubiquitiniertem HIF1-α über einen NFκB-abhängigen Mechanismus hergestellt werden. Dies ist jedoch bisher nur an Nierenzellen der Linie HEK293 und an Proximaltubuluszellen (LLC-PK1) gezeigt worden (17). Diese erhöhte HIF-1α-Expression führt unter anderem zu einer verstärkten lokalen Präsenz von VEGF, das hauptsächlich von Makrophagen exprimiert wird und somit zu einer erhöhten Angiogenese. Dies erklärt auch die beobachtete Zunahme der Dichte von mikrovaskulären Strukturen im hyperplastischen Synovialgewebe (Pannus) von RA-Patienten (18). Studien mit Anti-TNF-α-Antikörpern haben ergeben, dass die Expression von VEGF, IL-1, IL-6 und IL-8 durch TNF-α gesteuert wird. RA-Patienten unter Anti-TNF-α-Therapie zeigten demzufolge eine erniedrigte VEGF-Konzentration im Serum im Vergleich zu unbehandelten Patienten. Frisch gewonnenes Synovialgewebe von RA Patienten reagierte in Kultur auf die Gabe von Anti-TNF-α nur in Kombination mit Anti-IL-1 mit einer Halbierung der VEGF-Produktion (19).

Alle genannten Befunde lassen auf eine Verbindung zwischen TNF-α über die Rezeptortyrosinkinasen mit der Regulation von HIF 1-α und dessen regulierenden Einfluss auf die VEGF-Synthese schließen, welche zu einer verstärkten Vaskularisation des hyperplastischen Synovialgewebes führt und somit den destruktiven Prozess der Invasion des Knorpel- und Knochengewebes durch den Pannus unterhält.

1.4 Zytokine als lokale Immunregulatoren

1.4.1  Zell-Zell-Kontakt, Zytokinproduktion und Autoimmunerkrankung

T-Lymphozyten wandern, angelockt durch im Entzündungsgebiet befindliche polymorphkernige Neutrophile und Makrophagen, in das geschädigte Gebiet ein. Dort treffen sie aufeinander und gehen direkte Zell-Zell-Interaktionen ein. Diese Kontakte zwischen aktivierten T-Lymphozyten und Makrophagen führen zur vermehrten Ausschüttung von IL-1β durch letztere Zellen. Diese IL-1β Ausschüttung durch Makrophagen ist auch durch alleinige Gabe von LPS induzierbar. Hierbei ist kein Zellkontakt zu T-Lymphozyten nötig. Bei Entzündungsprozessen ohne exogene Ursache, wie der Rheumatoiden Arthritis oder der Multiplen Sklerose, stellt der Zell-Zell-Kontakt zwischen Makrophagen und aktivierten T-Lymphozyten (experimentell PHA/PMA oder Anti-CD3/Anti-CD28 bzw. spezifisches Antigen) und die daraus resultierende Expression von IL-1β jedoch die Hauptursache für die Ausbreitung der Entzündung dar.

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Es ist noch unbekannt, welche Oberflächenmoleküle diese Zell-Zell-Interaktion im Einzelnen ermöglichen. Es konnte jedoch ein Einfluss von Therapeutika wie Leflunomid (Dihydroorotatdehydrogenasehemmer = Pyrimidinsyntheseinhibitor = Proliferationshemmer) und IFN-β (u.a. Verstärkung der antiviralen Immunantwort durch NK-Zellen) auf diese wichtige Zell-Interaktion gezeigt werden(20). In den nun folgenden Abschnitten sollen die Zytokine als Mediatoren der Entzündungsreaktion näher beschrieben werden. Es wird hierbei besonders auf ihre speziellen Funktionen eingegangen. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 soll in diesem Zusammenhang näher beleuchtet werden. Manche Zytokine werden durch ihn reguliert, andere regulieren selbst die Stärke seiner funktionellen Aktivität. Dieses Wechselspiel zu verstehen bedeutet, einen tieferen Einblick in die Auswirkung von Hypoxie zu erlangen. In dieser Einleitung zu den Zytokinen werden die Funktionen des einzelnen Zytokins, seine chromosomale Lokalisation, die Auswirkungen von Mutationen und die Regulation durch andere Faktoren beschrieben.

1.4.2 IL-1β

Interleukin-1β wird durch enzymatische Prozessierung durch Caspase-I aus einem IL-1 Vorläuferprotein gewonnen. Durch die enzymatische Prozessierung des gleichen Vorläuferproteins durch Calpain wird IL-1α gebildet. Somit entstehen IL-1β und IL-1α aus einem Vorläuferprotein. Beide Produkte binden an den gleichen Rezeptor. IL-1 wird von Monozyten, Makrophagen, B-Zellen, dendritischen Zellen, Endothelzellen und anderen Zelltypen produziert. In TH-Lymphozyten wirkt es bei deren Aktivierung mit und unterstützt die Produktion von IL-2 (21-23). In B-Zellen sorgt es für die Zellreifung und die klonale Expansion. In NK-Zellen steigert es die zytotoxische Aktivität. Auf Endothelzellen werden durch IL-1 mehr interzelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAMs) exprimiert. Auf andere Makrophagen und Neutrophile wirkt es als Chemoattraktant. In Leberzellen induziert IL-1 die Synthese von Akut-Phase Proteinen und im Hypothalamus ist es für die Induktion von Fieber verantwortlich. Insgesamt handelt es sich demnach bei IL-1 um ein pro-inflammatorisches Zytokin. IL-1β wird eine regulierende Rolle in der Stabilisierung und Kerntranslokation des Transkriptionsfaktors HIF-1α in einer von reaktiven Sauerstoffspezies abhängigen Form zugesprochen, allerdings ist dies bisher nur für fetale Alveolarepithelzellen des Typs II gezeigt worden (24).

1.4.3 IL-2

Interleukin-2 ist ein von aktivierten TH1-Zellen produziertes Protein, welches in TH-Zellen und in zytotoxischen T-Zellen (Tc -Zellen), nach Kontakt mit einem Antigen, eine Proliferation bewirkt. Bei antigenspezifischen T-Zell-Klonen wird durch IL-2 das Wachstum über längere Zeiträume hinweg unterstützt. Es wirkt auf NK-Zellen aktivitätssteigernd und hat einen proliferativen Effekt auf B-Lymphozyten (25). Im selben Jahr der Klonierung des IL-2 Gens 1983 durch Taniguchi et al. stellte die Gruppe um Fujita fest, dass die Promotorregion dieses Gens Ähnlichkeiten zu der des Interferon-gamma Gens aufweist. Der Genlokus wurde 1984 von der Gruppe um Seigel auf dem q-Arm des Chromosoms 4 (4q27) identifiziert (26) Ein Defekt der IL-2 Transkription wurde in einem Fallbericht von Weinberg und Parkman beschrieben. Der Mangel an funktionellem IL-2 führte bei einem neugeborenen Jungen aus Salvador zum Krankheitsbild der schweren kombinierten Immundefizienz (SCID), welcher er nach zweimaliger Knochenmarkstransplantation in Folge einer hämorrhagischen Pankreatitis im Alter von 15 Monaten erlag. Das Krankheitsbild bei diesem Patienten wurde durch eine Hepatomegalie, niedrige Serum IgG-, IgM- und IgA-Konzentrationen, einen schmerzhaft, juckenden erythematösen Hautausschlag sowie perirektale Moniliasis (Soor) bestimmt. Seine T-Lymphozyten waren nicht in der Lage, auf Stimulation hin mit einer IL-2 Ausschüttung und Proliferation zu reagieren. Erst unter Zugabe von rekombinanten IL-2 war dieser Defekt der Proliferationshemmung in vitro behebbar (27). 1998 entdeckte die Gruppe um Hollander einen sehr interessanten Aspekt in der Regulation der IL-2 Gentranskription. Die Forscher fanden eine an nur eines der zwei IL-2 Genallele gebundene Genexpression. Sie vermuteten in diesem Mechanismus eine strikte Regulation der Genexpression basierend auf der Tatsache, dass die Überexpression von IL-2 durch T-Zellen zur Aufhebung von Anergie autoreaktiver T-Zellen führen kann (28, 29)

1.4.4 IL-6

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Interleukin-6 wird von Monozyten, Makrophagen, TH2-Zellen und Stromazellen des Knochenmarks gebildet. Bei proliferierenden B-Zellen leitet es die terminale Differenzierung zu Plasmazellen ein. Bei Plasmazellen erhöht es die Antikörperproduktion. In Stammzellen des Knochenmarks fördert IL-6 die Differenzierung, und in Leberzellen sorgt es für die Synthese von Akut-Phase Proteinen. Bei T-Zellen ist es in Synergie mit IL-1 für eine vermehrte IL-2 Produktion verantwortlich(30).Der Genlokus für IL-6, auch bekannt unter dem Namen Interferon-β-2, befindet sich auf dem p-Arm von Chromosom 7 (7p15.3) (31).Bei Patienten mit Juveniler Rheumatoider Arthritis wird IL-6 in Verbindung mit den bei dieser Erkrankung typischen, in der akuten Phase regelmäßig auftretenden, nächtlichen Fieberschüben gebracht. Als mögliche Ursache zeigte sich hier ein Polymorphismus, der sich an Position 174 bp vor dem Genstart befindet, und durch einen Basenaustausch von Cytosin (C) durch Guanin (G) charakterisiert ist. Während bei Patienten mit Juveniler Rheumatoider Arthritis der G-Polymorphismus gehäuft auftritt, ist bei der Vergleichsgruppe der protektive C-Polymorphismus vorhanden (32).

Chronisch erhöhte IL-6-Niveaus werden mit der Osteoporose in Verbindung gebracht. Auch bei Patienten mit Morbus Paget, einer Stoffwechselerkrankung mit besonders stark erhöhtem Knochenumbau, finden sich signifikant erhöhte IL-6-Werte in Serum und Knochenmark betroffener Knochen. Diese Erkrankung zeichnet sich durch sehr große, multinukleäre Osteoklasten aus. IL-6 wird hierbei für die abnorme Aktivitätssteigerung der Osteoklasten verantwortlich gemacht. Bei dieser Erkrankung erfolgt ein schneller Knochenabbau durch Osteoklasten, der parallel zu einem schnellen Knochenaufbau durch Osteoblasten stattfindet. Dieser Aufbau ist aber qualitativ nicht ausreichend und es ergibt sich hieraus eine Verminderung der Belastbarkeit des Knochens und somit eine erhöhte Frakturhäufigkeit. Als möglicher Auslöser dieser Erkrankung wird eine Infektion mit Paramyxoviren angenommen (33).

1.4.5 IL-8

IL-8 ist der Prototyp eines CXC-Chemokins und wird vorrangig von Monozyten/ Makrophagen und Endothelzellen synthetisiert. In CD4+-T-Lymphozyten bewirkte eine Kombination aus PMA- und Ionomycin-Stimulation eine Vermehrung der mRNA für IL-8, jedoch wurde die Ausschüttung von IL-8-Polypeptid in den Experimenten von Smyth et al. nicht beobachtet. Dies wurde als Blockierung der IL-8 Produktion auf posttranskriptioneller Ebene interpretiert (34). In neueren Experimenten konnte jedoch eine Sekretion von IL-8 unter PHA Stimulation gezeigt werden (35). IL-8 wirkt auf Neutrophile als Chemoattraktant und fördert die Adhäsion an vaskuläres Endothel durch Induktion von Adhäsionsmolekülen an der Zelloberfläche sowie die Extravasion (das Verlassen des Blutstromes durch die Gefäßwand) in das betroffene Gewebe. Außerdem verstärkt es die Freisetzung lysosomaler Enzyme durch Neutrophile und initiiert den respiratorischen Burst. In vitro wurde eine Chemotaxis für CD4+- und CD8+-Lymphozyten festgestellt. IL-8 wird von einigen sehr aggressiven Melanomarten unter dem Einfluss von Hypoxie gebildet, um eine Neovaskularisation zu induzieren. Dieser Prozess scheint von der Präsenz der Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFκB abhängig zu sein (36). Es konnte gezeigt werden, dass die IL-8-Expression ohne den Transkriptionsfaktor NFκB in allen untersuchten Zelltypen nicht möglich ist, und dass NFκB wiederum durch das Auftreten von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) induziert wird (37).

1.4.6 IL-10

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Interleukin-10 wird von TH1-, TH2-Zellen, Monozyten und B-Lymphozyten exprimiert und vermindert die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen in T-Zellen und Monozyten (IL-1α und IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, GM-CSF, G-CSF) (38).

Wichtige kostimulatorische Moleküle wie ICAM (CD54), CD80 und CD86 zur Aktivierung von T-Lymphozyten werden ebenfalls in ihrer Expression durch IL-10 negativ beeinflusst (39).Auf antigenpräsentierenden Zellen wird unter Einfluss von IL-10 die Expression von MHC-II Molekülen gesenkt und somit eine Antigenpräsentation erschwert. Bei reinen CD4+-T-Lymphozytenkulturen hat IL-10 einen suppressiven Effekt auf die IL-2- und TNF-α-Produktion(40). Bei aktivierten B-Lymphozyten hingegen bewirkt der Kontakt mit IL-10 eine Proliferation und Ausdifferenzierung zu Antikörper produzierenden Plasmazellen. Auf CD8+-T-Zellen hat IL-10 einen stimulatorischen Effekt(41). Auf T-Zelltypen, welche unter IL-2 Mangel innerhalb von wenigen Tagen Apoptose begehen, hat IL-10 einen anti-apoptotischen Einfluss(42). Der Genlokus von Interleukin 10 wurde 1997 von Eskdale et al. auf den q-Arm des Chromosoms 1 eingegrenzt. (1q31-32) (43). In Autoimmunerkrankungen wie RA und Systemischen Lupus Erythematosus (SLE) zeigen sich chronisch erhöhte IL-10 Serumkonzentrationen. 2001 konnten Gibson et al. zeigen, dass bestimmte Polymorphismen von Einzelbasen (SNP) in der Promotorregion des IL-10-Gens in Verbindung mit einer höheren Anfälligkeit für SLE gebracht werden können (44). Ein bestimmtes Allel des IL-10-Gens (IL10.G13) wird mit einer erhöhten Anfälligkeit für Psoriasis in Verbindung gebracht. Bei diesen Patienten zeigte sich eine positive Familienanamnese, ein frühes Einsetzen der Erkrankung vor dem 40. Lebensjahr und eine erhöhte Symptomausprägung bei verminderter IL-10 Produktion (45).In einer kleinen Studie an 50 RA-Patienten unter Monotherapie mit Etanercept (TNFα-Antagonist) konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einem R3-Allel in der Promotorregion des IL-10 Gens besser auf die Therapie im Vergleich zu G13 Allelträgern ansprachen (46). IL-10 kann durch sein Wirkungsprofil in die Gruppe der anti-inflammatorischen Zytokine eingeordnet werden.

1.4.7 TNF-α

Tumornekrosefaktor-α wird hauptsächlich von Makrophagen und T-Lymphozyten gebildet. Auf Tumorzellen hat dieses Protein einen zytotoxischen Effekt. Bei Entzündungszellen wirkt es induktiv auf die Zytokinproduktion und ist für die Tumorkachexie verantwortlich. In Endothelzellen verursacht TNF-α die vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen wie beispielsweise E-Selektin. T-Lymphozyten werden durch vermehrte Wasserstoffperoxydkonzentration zur Produktion von TNF-α angeregt(47). In Fibroblasten und Synoviozyten von RA-Patienten regt TNF-α die Produktion von Prostaglandin-E2 (PGE 2) und Kollagenasen a(48).Über die Aktivierung von Osteoklasten ist TNF-α mitverantwortlich für die Knochendestruktion bei der RA. Die Ausschüttung von TNF-α erfolgt von allen untersuchten Zytokinen am schnellsten. Erhöhte TNF-α Serumspiegel fanden sich im von Black et al. verwendeten Mausmodell bereits 30 Minuten nach Einwirken eines Stressfaktors. Dies bedeutet, dass TNF-α die Initiation der Entzündungskaskade bewirkt und somit den Ablauf und das Ausmaß der Entzündungsprozesse beeinflusst. Diese schnelle Nachweisbarkeit von TNF-α im Serum entsteht im Ergebnis der Wirkung des TNF-α-Konversionsenzym (TACE), welches membrangebundenes präformiertes TNF-α auf neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten durch enzymatische Abtrennung freisetzt. Auf diese Weise kann unmittelbar lokal auf einen Stimulus reagiert und der Zeitraum zur de novo Synthese des Faktors überbrückt werden(49). Durch Spies et al. wurde 1986 die Lage des TNFα-Gens auf dem p-Arm des Chromosoms 6 nachgewiesen (6p21.3-21.1) und eine Verbindung zu den MHC-Genloci hergestellt (50). Interessanterweise befindet sich das Gen für TNF-β nur 1-2kb entfernt vom TNF-α Gen. Beide liegen zwischen dem C2-Lokus von HLA-III und dem HLA-B-Lokus der Klasse I (51).

1.4.8 MCAF

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Monocyte-Chemotactic-and-Activation-Factor, auch MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) genannt, ist der Prototyp eines CC-Chemokins und wurde bei LPS stimulierten Monozyten erstmals entdeckt. Wie auch IL-8 wirkt dieses Chemokin auf einen G-Protein gekoppelten Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen. Während IL-8 als CXC-Chemokin jedoch vorrangig chemoattraktiv auf neutrophile Granulozyten wirkt, ist MCAF in erster Linie chemoattraktiv und aktivierend für Monozyten / Makrophagen und Lymphozyten. In Monozyten werden durch die Anwesenheit von MCAF mehr IL-1 und IL-6 gebildet. Des weiteren fördert MCAF in Monozyten einen respiratorischen Burst sowie die Freisetzung lysosomaler Enzyme. Außerdem werden durch MCAF nicht nur Monozyten / Makrophagen ins Entzündungsgebiet gelockt, sondern auch CD4+ - und CD8+ -T-Lymphozyten. MCAF hat also auf Monozyten den gleichen Effekt wie IL-8 auf neutrophile Granulozyten (37).In fibroblastenähnlichen Synoviozyten (FLS) von Patienten mit Rheumatoider Arthritis oder Osteoarthritis (OA) bewirkt die Gabe von IL-2 und IL-1β eine vermehrte Produktion von MCAF. Dies wird als einer der Mechanismen zur Rekrutierung von Makrophagen und T-Lymphozyten in die Synovialmembran angesehen. Die Wirkung von IL-2 auf die FLS wurde als Folge der Bindung von IL-2 an die β-Kette des IL-2-Rezeptors (CD122) erkannt. Die FLS von Patienten mit RA reagierten dabei signifikant stärker auf den IL-2-Stimulus, mit einer Erhöhung der MCAF-Produktion, als FLS von Patienten mit Osteoarthritis. Es wird also eine Kausalkette von IL-2 produzierenden TH1-Lymphozyten über die FLS zur Makrophagenrekrutierung in die Synovialmembran angenommen (52).


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11.08.2006