2 Materialien und Methoden

▼ 10 (fortgesetzt)

Tabelle1 Puffer- und Medienliste

Puffer / Medium

Zusammensetzung

  

RPMI Kulturmedium mit / ohne Glukose

RPMI 1640; 10 % (v/v) FCS, 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin, 0,1 % (v/v) 50mM β-Mercaptoethanol ± 11,1 mM Glukose

Phosphate buffered saline (PBS) pH 7,6

80 mM Na2HPO4 ; 19mM NaH2PO4∙2H2O; 100 mM NaCl

Tris-buffered saline (TBS) pH 7,5

150 mM NaCl (Roth) ; 10mM Tris-HCl (Roth)

Blot-Stripping-Puffer pH 6,7

100 mM β-Mercaptoethanol (Sigma M-625); 2%(w/v) SDS (Roth); 62,5 mM Tris-HCl (Roth)

TBS-Tween

Siehe TBS + 0,05% Tween 20 (Sigma P-1397)

Blottingpuffer pH 8,3

26mM Tris (Roth), 190mM Glycin (Roth), 20% (v/v) Methanol

PBS / BSA (Bovine serum albumin)

Siehe PBS + 1%(w/v) BSA

Ponceau-S Red

0,2% Ponceau-S red, 1% Essigsäure

5 x Laemmli Puffer pH 6,8

Bromphenolblau 100 mg; 3,5 mL Glycerin; 2,5 mL β-Mercaptoethanol; 1,5 g SDS, 1 M Tris-HCl

Blocking-Lösung

5% (w/v) Magermilchpulver in TBS-T

ATP Zelllysispuffer pH 7,75

0,1 M Tris-HCl (Roth); 4 mM EDTA-acetat (Roth)

2.1 Präparation humaner CD4+ Zellen

Humane periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation von Leukozytenfilterspülungen gewonnen. Die hierfür benötigten Leukozytenfilter kamen aus der Blutspendezentrale der Charité. Sie waren nie älter als zwei Stunden nach Vollblutspende durch gesunde Blutspender.

▼ 11 

Zuerst wurden die Leukozytenfilter entgegen der Filterrichtung mit insgesamt 135 mL PBS/ BSA und 25 mL Luft gespült. Die gewonnenen 160 mL Zellsuspension wurden auf vier 50 ml Falconröhrchen mit jeweils 15 mL Ficoll aufgeschichtet und anschließend bei Raumtemperatur und 2000 rpm (836 x g) in einer Heraeus Labofuge Zentrifuge für 20 Minuten ohne Bremse zentrifugiert, wobei der Rotor bis zum Stillstand weitere 17 Minuten benötigte. Danach wurden die PBMC von je zwei 50 mL Tubes mittels einer 1 mL Eppendorfpipette oder einer 10 mL Glaspipette mit Akkupipettierhilfe (Pipetus-akku, Hirschmann) von der Grenzschicht zwischen Ficoll und Zellsuspension in ein frisches 50 mL Falconröhrchen überführt. Die zwei resultierenden 50 mL Röhrchen mit den PBMC Suspensionen wurden dann mit PBS/ BSA aufgefüllt und in einer Heraeus Labofuge 400R Zentrifuge bei 1200 rpm (280 g) mit Bremse 10 Minuten pelletiert. Im Anschluss wurde der Überstand abgesaugt und die zwei Pellets in je 720 µL PBS/ BSA resuspendiert. Um unspezifische Bindungen für die nachfolgend verwendeten Antikörper zu blocken, wurden je 80 µL Flebogamma (Grifols Deutschland GmbH, 50 mg/mL) hinzugegeben und die Suspension für 5 Minuten auf Eis ruhend belassen. Im folgenden wurden je 200 µL Anti-human-CD4-Microbeads der Firma Miltenyi hinzugegeben und die Suspension bei 12 °C für 15 Minuten belassen, um den mit magnetischen Partikeln konjugierten Antikörpern gegen die CD4-Regionen der Zellenoberflächen die Möglichkeit zur Bindung zu geben. Um eine verstärkte Bindung der Antikörper an Monozyten zu verhindern, wurden die Zellsuspensionen nach 15 Minuten mit PBS/ BSA aufgefüllt und in der Heraeus Labofuge 400R Zentrifuge für 10 Minuten bei 1200 rpm (280 x g) gewaschen. Nach Resuspendierung in 2,5 mL PBS/ BSA wurden die so markierten Zellen unter Zugabe eines weiteren Milliliters PBS/ BSA mittels automatischer magnetischer Zellsortierung mit einem MACS-Automaten von Miltenyi durch positive Selektion (Programm Possel) von den unmarkierten Zellen getrennt. Die Trennung von den unmarkierten Zellen erfolgte über eine im Gerät befindliche Säule bei angelegtem Magnetfeld durch Spülen mit einem FACS Flow Puffer. Bei abgeschaltetem Magnetfeld wurden dann die markierten Zellen durch Spülen der Säule gewonnen. Zur Bestimmung der Reinheit der Zellpopulation sowie zur Viabilitätsmessung wurden 25 µL Zellkonzentrat (von insgesamt 4 mL) zur Analyse am FACS verwendet. Diese 25 µL Probe wurde zu einer vorbereiteten Lösung von 1 µL FITC-markiertem Anti-human-CD4-IgG (1:1000 Verdünnung in 100 µL Endvolumen) in 74 µL PBS/ BSA gegeben und für 10 Minuten auf Eis belassen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 1 mL PBS/ BSA und das Waschen in einer Eppendorfzentrifuge (Heraeus Biofuge fresco) bei 4°C und 2300 rpm (502 x g) für 8 Minuten. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Pellet in 400 bis 500 µL PBS/ BSA resuspendiert und unmittelbar vor der Messung am FACS mit Propidiumjodid (0,1 mg/mL) im Verhältnis 1:100 versetzt. Anhand der FITC markierten anti CD4+-Antikörper und der Propidiumjodidmarkierung ließen sich nun Reinheit und Viabilität der Zellpopulation bestimmen. Ab einer Reinheit von über 97% CD4+-Zellen und einer Viabilität von über 96% wurden die Zellen weiter verwendet, andernfalls verworfen. Parallel zur Färbung der 25 µL Probe für die FACS Messung wurde die gewonnene Zellsuspension mit dem jeweils für den aktuellen Versuch verwendeten Medium auf 15 mL aufgefüllt und in einer Heraeus Labofuge 400R Zentrifuge bei 1200 rpm (280 x g) und 4 °C für 10 Minuten gewaschen. Danach wurde das entstandene CD4+-Zellpellet in 4,5 mL Medium resuspendiert und durch Messung einer 10 µL Probe dieser Suspension in 10 mL PBA mit einem Zytometer (CASY TT) die Zellkonzentration bestimmt. Nach der ersten Konzentrationsmessung wurde durch Zugabe von Medium zur Ausgangssuspension eine Zellkonzentration um 4 x 106 Zellen pro mL eingestellt, was durch erneute Messung einer 10 µL Probe überprüft wurde. Enthielten die 4,5 mL Ausgangssuspension weniger als 1,7 x 107 Zellen [3,78*106 Zellen pro mL] wurde der Versuch abgebrochen.

2.2 Messung des Sauerstoffverbrauchs mittels Clark-Elektrode

Das Messprinzip der amperometrischen Sauerstoffmessung beruht auf der Reduktion von molekularem Sauerstoff an einer Goldelektrode (Kathode) zu Wasser.

Als Gegenelektrode (Anode) dient eine Silberelektrode als Elektronenquelle.

▼ 12 

Die entsprechenden Reaktionsgleichungen lauten:

Die entstehenden Silberionen werden mit KCl-Lösung, in welcher sich die Elektroden befinden, gefällt. Eine mit KCl gefüllte Messkammer beinhaltet die Elektrode. Sie ist von der die Zellsuspension enthaltenden Versuchskammer durch eine für molekularen Sauerstoff permeable Polypropylenmembran getrennt. Der messbare Stromfluss zwischen den Elektroden ist dem Sauerstoffgehalt im Messmedium proportional.

▼ 13 

Abbildung 1a Aufbau der Versuchskammer

Abbildung 1b Experimenteller Aufbau

Zu Beginn des Experiments wurde zunächst die durch einen Wasserkreislauf auf 37°C erwärmten Versuchskammer mit 1,4 mL des im jeweiligen Versuch verwendeten Mediums - RPMI 1640 mit 10 % FCS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 0,1 % β-Mercaptoethanol mit 11,1 mM Glucose bzw. ohne Glucose – gefüllt. Nach 3 Minuten der Erwärmung und Equilibrierung mit dem Umgebungssauerstoff wurde die Elektrode in das Medium unter Luftabschluss eingetaucht und der Schreiber vom Typ Pharmacia LKB Rec01 (Pharmacia) (Schreibgeschwindigkeit 0,1 mm/sec) geeicht, wobei die Sauerstoffkonzentration im jeweiligen Medium als 100% der Ausgangskonzentration für die Folgemessungen festgesetzt wurde. Diese wurden später anhand des Integrals unter der aufgezeichneten Sauerstoffsättigungs- / Zeitkurve mit 191 nmol O2 / mL im Medium mit Glucose und 196 nmol O2 / mL im Medium ohne Glucose bestimmt. Die in der vorangegangenen Präparation gewonnene Zellsuspension wurde nun in drei Aliquots zu je 1,4 mL aufgeteilt, wobei ein Aliquot in die Versuchskammer der Sauerstoffelektrodeneinrichtung vom Typ 781 (Strathkelvin Instruments, Bearsden Glasgow), sowie ein zweites Aliquot in eine eben solche Versuchskammer gegeben wurde (Abbildung 1b). Das dritte Aliquot wurde in ein 15 mL Falconröhrchen pipettiert. Nach einer Equilibrierungszeit von 3 Minuten wurden zu allen drei Aliquots nun jeweils 1,4 µL Phorbol-12–myristat-13-acetat, ein Aktivator der Proteinkinase Cn/c (1:100 vorverdünnt mit jeweiligem Medium) gegeben. Im Anschluss wurden 1,4 µL Ionomycin, eines Kalziumionophors, in die Suspension gegeben. Diese Substanzen bewirkten eine sehr starke Stimulation der CD4+-Zellen. Beide Proben in den Versuchskammern wurden von Beginn an mit einem Magnetrührer (Typ Ikamag Reo) bei 300 rpm gleichmäßig und kontinuierlich bis zum Ende des Experiments gerührt. Im Falle des ersten Aliquots verhinderte dies ein Konzentrationsgefälle für molekularen Sauerstoff zwischen der Versuchskammer und der mit KCl-Lösung gefüllten und mit einer für Sauerstoff permeablen Polypropylenmembran von der Versuchskammer abgetrennten Messkammer. Beim zweiten Aliqot gewährleistete dies die kontinuierliche Sauerstoffversorgung und sorgte für eine dem ersten Aliquot vergleichbare mechanische Belastung. Das dritte Aliquot im 15 mL Röhrchen diente als Kontrolle der Ausgangswerte (0h Normoxie) für die ATP-Messungen, die Proteingewinnung zur Westernblotanalyse sowie zur RNA-Isolation für folgende PCR-Analysen. Der Versuch wurde ab dem Aufsetzen der Messelektrode für 360 Minuten durchgeführt, wobei jeweils nach 180 Minuten und 360 Minuten mittels einer 50 µL Hamiltonpipette eine Probe von 50 µL aus Aliquot 1 (Hypoxie) und Aliquot 2 (Normoxie) zur Bestimmung des ATP-Gehaltes entnommen wurde. Nach 360 Minuten wurden erneut je 100 µL Proben zur Propidiumjodidmessung am FACS in je 400 µL PBS/BSA aufgenommen, sowie je 500 µL zur Proteingewinnung und je 500 µL zur RNA-Gewinnung verarbeitet. Die Auswertung des Schreiberpapiers erfolgte per Hand, wobei der Startpunkt der Messung einheitlich bei 90% der initialen Sauerstoffsättigung im Medium festgesetzt wurde.

2.3 Bestimmung der ATP-Menge

▼ 14 

Das Messprinzip zur Bestimmung der ATP-Menge in einer Probe beruht auf folgender chemischer Reaktionskette:

Luciferase + Luciferin + ATP ⇔ Luciferase-luciferyl-AMP + PPi

Luciferase-luciferyl-AMP + O2 ⇔ Luciferase + Oxyluciferin + AMP + CO2 + Emission hν560nm

▼ 15 

Die Intensität des emittierten Lichts ist proportional zur ATP Konzentration in der Probe und ermöglicht eine quantitative Bestimmung der Probenkonzentration. Das hier verwendete Luciferase-Luciferinsystem der Firma Roche wurde zusammen mit einem für weiße 96-well Mikrotiterplatten geeigneten Luminometer (Monolight 3096, BD Pharmingen) eingesetzt. Laut Herstellerangaben der Firma Roche wurde vor Gewinnung der ATP-Proben aus der Versuchskammer der Sauerstoffelektrode folgender Puffer angesetzt.

ATP Zelllysispuffer:

▼ 16 

450 µL dieses auf 100°C erhitzten Puffers wurden mit 50 µL Probe aus der Versuchskammer mit der Zellsuspension vermischt und zwei Minuten im Wasserbad gekocht. Danach wurde die verdünnte und gekochte Zellsuspension bei 3200 rpm (1000 x g) in der Fresco Zentrifuge bei 4°C pelletiert und 300 µL Überstand zur ATP Messung bei –20°C eingefroren. Diese Prozedur wurde für die 0h Kontrolle im 15 ml Röhrchen sowie für die Proben der Versuchskammern nach 180 Minuten und 360 Minuten durchgeführt. Die derart gewonnenen Proben wurden gesammelt und bis zur Messung bei –20°C aufbewahrt. Nach Abschluss von mehreren Versuchen wurden die Proben aufgetaut und mit zusätzlichen Proben einer Standardverdünnungsreihe von ATP in 50 µL Portionen auf eine weiße 96-well Mikrotiterplatte der Firma NUNC pipettiert. Im Luminometer wurde dann in jede Vertiefung 50 µL Luciferin / Luciferasemischung durch automatische Zugabe gegeben und für 10 Sekunden gemessen. Aus den relativen Lichteinheiten (RLUs) der zwei bis drei unabhängigen Standardverdünnungsreihen (10-5-10-10 M ATP = 5 Verdünnungsschritte) liessen sich per Mittelwert eine Eichkurve durch doppelt logarithmischer Auftragung und deren Näherungsgleichung ermittelt. Anhand der gemessenen RLUs der Proben war es nun möglich, die ATP-Konzentrationen rechnerisch zu bestimmen. Alle Proben wurden als Doppel- oder Dreifachwerte gemessen.

2.4 HIF-1α Nachweis mittels Westernblot

Für die Proteinauftrennung mittels Elektrophorese erfolgte zunächst die
Aufteilung einer Trenngelmischung bestehend aus 4 mL Aqua dest.; 3,3 mL 30% Acrylamidmix (Roth); 2,5 mL 1,5 M Trispuffer (pH 8,8) und 0,1 mL 10% SDS (Roth); 0,1 mL frischem APS (10%; Roth) und 5 µL TEMED (Roth) auf zwei Elektrophoresekammern, die bis zum Abschluss der Polymerisierung mit Aqua dest überschichtet wurde. Nach Dekantieren des Wassers wurde dann eine Sammelgelmischung aus 1,45 mL Aqua dest.; 0,5 mL 30 % Acrylamidmix; 2,5 mL 0,25M Tris (pH 6,8); 0,05 mL SDS 10%; 0,025 mL APS 10% und 6 µL TEMED auf die zwei Trenngele geschichtet, ein Kamm eingesteckt und bis zum Abschluss der Polymerisierung der Sammelgele nach Bedarf Sammelgelmischung nachpipettiert, um die Taschenform optimal zu halten. Nach Abschluss der Polymerisation wurden dann die beiden Kämme entfernt und die Taschen mittels Kanüle mit einem Tris-Glycinpuffer (25mM Tris; 250mM Glycin (pH 8,3); 0,1% SDS) ausgespült. Dadurch wurden die Beladungsbedingungen für jede Tasche zu vereinheitlicht, weil eventuell nicht polymerisierte Reste entfernt werden konnten.

Die im Experiment gewonnenen und mit fünffachem Laemmli-Puffer (Bromphenolblau 100 mg; 3,5 mL Glycerin; 2,5 mL β-Mercaptoethanol; 1,5 g SDS, 1 M Tris-HCl pH 6,8) versetzten Proteinproben wurden nun im Heizblock für ca. 5 Minuten bei 96°C erwärmt. In jede Tasche wurde eine definierte Menge Probe geladen, deren Proteingehalt dem von 0,5 x 106 Zellen des jeweiligen Experimentes entsprach (zwischen 15 und 25 µL). Der Marker (Precision Plus Protein Standards von Bio-Rad) mit 10 Banden zwischen 250 und 10 kDa wurde im Volumen von 10 µL pro Gel asymmetrisch aufgetragen, um Verwechslungen der beiden Gele zu vermeiden. Nun wurde für die ersten 30 Minuten eine Stromstärke von 15 mA pro Gel angelegt, welche nach dem Durchlauf der Bandenfront durch das Sammelgel auf 30 mA pro Gel für weitere 90 Minuten erhöht wurde. Nach dieser elektrophoretischen Auftrennung der Proteine wurden die Gele in einer mit Blottingpuffer gefüllten Wanne auf je eine mit Methanol equilibrierten Blottingmembran aus PVDF mit einer Porengröße von 0,45 µm (Immobilon-P, Millipore) bestückten Blottingvorrichtung übertragen. Diese wurden in einer Kammer mit Blottingpuffer befestigt, welche durch einen Rührmagneten und Magnetrührer sowie einen Eisakku kontinuierlich über Nacht bei einer angelegten Spannung von 30V im Kühlraum gekühlt werden musste. Am nächsten Morgen wurden dann nach Eiswechsel die Spannung auf 100 V für eine weitere Stunde erhöht. Um die Übertragung von den Gelen auf die Membran zu überprüfen, wurden die Membranen nun 5 Minuten mit Penceau-S inkubiert und mit Aqua dest. gewaschen. Anschließend wurden die Blotmembranen mit der proteintragenden Seite nach innen gerollt und in ein 50 mL Falconröhrchen überführt. Nun erfolgte der Block unspezifischer Bindungsstellen für die folgenden Antikörper mittels je 25 mL 5% Magermilchpulverlösung (2,5 g Magermilchpulver in 50 mL TBS-Tween20 (Tris-buffered saline; Tweenanteil 0,05%) für 2 Stunden auf einem Falconrotator (Miltenyi) bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C. Danach wurde dreimal für je 10 Minuten mit TBS-Tween gewaschen und anschließend der spezifische murine IgG1 Antikörper (BD) gegen ein Epitop von humanem HIF-1α in einer Verdünnung in TBS-Tween zwischen 1:500 bis 1:300 in einem Volumen von 10 mL in die Falconröhrchen gegeben und für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Falconrotator inkubiert. Nach nochmaligem dreifachen Waschen mit TBS-Tween wurde nun der zweite, an eine Peroxidase gekoppelte, anti murin IgGHeavy and light (HRP-gekoppelt PROMEGA) Antikörper in einem Volumen von 10 mL und einer Verdünnung von 1:10000 in die Falconröhrchen gegeben und für eine weitere Stunde inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Blots nun aus den Falconröhrchen heraus auf eine Folie gelegt und mit ECL-Lösung (Amersham) für 5 Minuten inkubiert, bevor sie dann in einer Filmkassette (Hypercassette; Amersham) in einer Dunkelkammer für 5 Minuten und 13 Minuten dem Film ausgesetzt wurden. Der Film wurde in einer Kodak Maschine (X-OMAT 1000 Processor) entwickelt. Um den gleichmäßigen Auftrag der Proteinproben zu überprüfen, wurde nun ein Abgleich mit dem unregulierten Strukturprotein β-Aktin durchgeführt. Hierzu wurden die Blots mit einer β-Mercaptoethanollösung (100 mM) für 25 Minuten bei 50 °C inkubiert, um die auf den Blots befindlichen Antikörper der ersten Prozedur zu denaturieren und ihre Bindung zu zerstören. Nach mehrmaligem Waschen und erneutem Blocken mit 5% Magermilchpulver für 2 Stunden waren die Blots dann wieder für eine weitere Immunoblottingprozedur mit einem murinen Anti-β-Aktin-IgG1-Antikörper (Sigma) in einer Verdünnung in TBS-T von 1:10000 und dem Peroxidase gekoppelten anti murin IgG Antikörper in einer Verdünnung von 1:10000 zu verwenden. Die ECL-Lösung wurde dabei erst in der Dunkelkammer unmittelbar vor der Filmbelichtung zugesetzt, da das Leuchtsignal schon mit bloßem Auge zu erkennen war und der Substratumsatz durch die Peroxidase sehr schnell erfolgte. Die Filmbelichtungszeit wurde bedingt durch das starke Signal auf zehn Sekunden herabgesetzt. Die Filme beider Detektionen wurden digitalisiert und übereinander gelegt, so dass man die Auftragsqualität parallel zur HIF1-α Expression der einzelnen Proben beurteilen konnte.

2.5 Bestimmung der Konzentrationen von TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 und MCAF aus den Überständen

▼ 17 

Die Messung von Proteinen aus den Zellsuspensionsüberständen beruht auf einem Multiplex ELISA Prinzip, das von Biorad entwickelt wurde. Dabei werden mit spezifischen Antikörpern beschichtete synthetische Kügelchen (Beads), die in ihrem Innern eine Mischung aus zwei Fluoreszenzfarbstoffen mit spezifischer Absorptions- und Emissionswellenlänge besitzen, mit den Überständen inkubiert. Ein zweiter Detektionsantikörper bindet das jeweilige Zytokin an einem anderen Epitop. Nun wird dieser Antikörper über Streptavidin an PE gekoppelt. Aus der Anzahl spezifisch leuchtender Beads und der simultanen Messung der durch PE hervorgerufenen Emission pro Bead, lässt sich mittels Standardverdünnungsreihe einer definierten Zytokinmischung die Zytokinkonzentration aus den Überständen bestimmen.

Hierzu wurde eine Standardverdünnungsreihe im Medium durch sukzessive 1:4 Verdünnung einer 500 ng/mL Stocklösung in 7 Verdünnungsstufen hergestellt. Eine MultiScreen™ 96 well Mikrotiterplatte (Millipore) wurde nun mit 100 µL pro Vertiefung PBS / BSA / ACID equilibriert. Anschließend wurde eine Mischung der mit dem Primärantikörper konjugierten Beads mit PBS / BSA /ACID in solcher Weise hergestellt, dass man pro Vertiefung 0,4 µL Beads der jeweiligen Zytokinspezifität (=>2,8 µL Beads mit allen 7 zu bestimmenden Zytokinen) in 50 µL Endvolumen PBA erhielt. Nach zwei Waschschritten mit PBS / 0,05% Tween-20 wurden pro well 50 µL Standard oder Probe gegeben und die Platte dunkel bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (IKA KS 130 basic) für 30 Minuten inkubiert. In der Zwischenzeit wurde das BIOPLEX Gerät nach Herstellerangaben kalibriert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS / 0,05% Tween-20 wurde die Mischung der sieben spezifischen Detektionsantikörper mit PBA in jede Vertiefung gegeben, wobei die Antikörper 1 : 400 in einem Volumen von 25 µL pro Vertiefung verwendet wurden. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation im Dunkeln und bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln mit 300 rpm und erneutem dreimaligem Waschen wurde eine Mischung aus Streptavidin PE und PBA im Verhältnis 1:100 so eingesetzt, dass pro Vertiefung 50 µL verbraucht wurden. Dann wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 300 rpm Schütteln im Dunkeln inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS / 0,05%Tween-20 wurden in jede Vertiefung 125 µL PBA gegeben und die Platte im BIOPLEX Gerät ausgelesen.

Die Wahl der gemessenen Zytokine beruhte auf einem Screening von Überständen zweier Experimente auf zehn verschiedene Zytokine. Als Kandidaten für weitere Messungen wurden die Zytokine gewählt, die in diesen Pilotexperimenten am stärksten durch Hypoxie beeinflusst waren.

2.6 Aufarbeitung der RNA und Umschreiben in cDNA

2.6.1 Präparation der total RNA

▼ 18 

Zur Aufbereitung der RNA Proben, die mittels β-Mercaptoethanol versetztem RLT-Puffer während der Versuche gewonnen wurden, wurde das RNAeasy Minikit mit Homogenisierungssäulen (QIAshredder™, Qiagen) und DNAse (Qiagen) nach Herstellerprotokoll verwendet. Hierzu wurden die mit RLT-Puffer versetzten Proben aufgetaut und durch eine Homogenisierungssäule zentrifugiert, wobei die genomische DNA entfernt und die Viskosität der Lysate verringert wurde. Danach wurde Ethanol im Verhältnis 1:2 zum Eluat gegeben, um die Bindungsfähigkeit der RNA an die folgende Säule zu optimieren. Nun wurde das RNA-Ethanol Gemisch durch eine zweite Säule (RNeasy spin column) zentrifugiert, um die RNA an der Säulenmembran zu binden. Durch Waschschritte mit RW1-Puffer aus dem Kit wurde die Säule von etwaigen Kontaminationen befreit. Anschließend wurde, um mögliche DNA-Reste vollständig zu entfernen ein 20minütiger Verdau von DNA bei Raumtemperatur auf der Membran mittels einer DNAse (DNAse I von Qiagen) durchgeführt. Nach Waschen mit RW1-Puffer wurde dann zweimal mit ethanolversetztem RPE-Puffer aus dem Kit gewaschen. Schließlich wurde die RNA mittels 30 µL RNAse freien Wassers in ein neues Eppendorffgefäß ausgewaschen.

Der Gehalt an RNA in den Eluaten wurde mittels Bioanalyser auf der Grundlage der 18S- und 28S-RNA-Banden und eines Standards bestimmt. Hierzu werden in einem elektrophoretischen Prozess die Stärke der 28S- und 18S-Banden, welche typisch für humane RNA sind, gegen einen Standard mit bekannter RNA-Konzentration abgeglichen. Hierbei ergaben sich Gesamt-RNA Mengen zwischen 300 ng und 3 µg in jeweils 30 µL Endvolumen.

Umschreiben in cDNA

▼ 19 

Um die im vorigen Abschnitt gewonnenen RNA Proben für die PCR Analyse nutzbar zu machen, musste diese in stabilere und für die DNA-Polymerase verwendbare cDNA umgeschrieben werden. Jeweils 300 – 400 ng RNA wurden zum Umschreiben in cDNA mit dem TaqMan Kit von Applied Biosystems verwendet. Hexamere mit zufälliger Basenabfolge (Random Hexamere) als Nucleotidhexamere und Oligo-dTs wurden als unspezifische Primeräquivalente der cDNA Synthese im Mischungsverhältnis 1:2 eingesetzt, um möglichst die gesamte RNA in cDNA umzuschreiben. Setzt man Oligo-dTs, also eine Abfolge von Desoxythymidinbausteinen allein ein, so erhält man nur die cDNA, welche aus mRNA mit ausreichend langen Polyadenylierungssequenzen umgeschrieben wird. Random Hexamere ermöglichen auch das Umschreiben von RNA mit fehlender (t-RNA, r-RNA) oder zu kurzer Poly-A Sequenz (in Degradation befindliche mRNA).

Es wurde folgender Ansatz zum Umschreiben in cDNA verwendet:

▼ 20 

Als Programm für den Thermocycler wurde unten stehende Schrittabfolge verwendet. Dieses Programm ermöglicht zunächst das Anlagern der Oligo-dTs und der Random Hexamere (Schritt 1) an die RNA, gibt anschließend der Reversen Transkriptase die Möglichkeit, alle markierten Fragmente in cDNA umzuschreiben (Schritt 2), und zerstört schließlich die Reverse Transkriptase durch Denaturierung bei 95°C (Schritt 3).

Nach dem Umschreiben wurden die 20 µL Proben bei –20°C eingefroren. Vor der ersten PCR

▼ 21 

wurden von jeder Probe Verdünnungen im Verhältnis 1:10 hergestellt, von denen je 5 µL pro Probe und PCR verwendet wurden.

2.6.2 Light Cycler Realtime PCR im Sybr Green Format

Das Design der Primer für Hexokinase-1 erfolgte mit dem Programm Oligo-4 (Molecular Biology Insights, Inc. USA) basierend auf einer durch Multiple Alignment erstellten Konsensussequenz der fünf bekannten Transkriptvarianten mit den in Tabelle 2a dargestellten Zugriffsnummern. Die Primerpaare für das Superoxiddismutase-1 Gen und das β-Aktin-Gen wurden ebenfalls mit Oligo-4 erstellt.

Tabelle 2 a Primerkombinationen und Zugriffsnummern der verwendeten Zielgene

Genname

Variante

Zugriffsnummer

Primersequenz

Hexokinase-1

1

2

3

4

5

NM_000188

NM_033496

NM_033497

NM_033498

NM_033500

Forward:

5´ GTG CTG CTG GTG AAA ATC CGT AGT 3´

Reverse:

5´ CCT TTG ATC CCC ATG TAG TCC AAG A 3´

Superoxiddismutase

Typ 1 (Cu/Zn)

 

NM_000454

Forward:

5´ TCA TCA ATT TCG AGC AGA AG 3´

Reverse:

5´ AGA CTA CAT CCA AGG GAA TG 3´

β-Aktin

 

NM_001101

Forward:

5´ GAC AGG ATG CAG AAG GAG ATC ACT 3´

Reverse:

5´ TGA TCC ACA TCT GCT GGA AGG T 3´

▼ 22 

Die Light Cycler Realtime PCR zeichnet sich dadurch aus, dass man online nach jedem PCR Zyklus die relative Menge an DNA im Probenansatz bestimmen kann. Dies erfolgt über die Messung der Fluoreszenz eines sich in die doppelsträngige DNA einlagernden Farbstoffes (Sybr Green). Sybr Green besitzt die Eigenschaft, an doppelsträngige DNA gebunden ca. einhundertfach stärker auf eine Anregung durch einen Laserstrahl mit der Emission von Licht zu reagieren, als an einzelsträngige DNA gebundener Farbstoff. Erhöht sich nun die Kopienzahl durch die Vervielfältigung innerhalb eines PCR Zyklus, so steigt parallel die Leuchtintensität des Farbstoffes. Voraussetzungen für eine Sybr-Green basierte Realtime PCR sind spezifische, also nur ein Produkt liefernde Primerpaare, eine geeignete Fragmentlänge des Amplikons (zwischen 100 und 500 bp) und eine geeignete Kopiereffizienz des Systems. Optimal ist die Effizienz von 2, also eine Verdopplung der Kopienzahl pro Zyklus. In der Realität ist jedoch meistens mit einer Effizienz zwischen 1,8 und 2 zu rechnen. Effizienzen unter 1,8 eignen sich sehr schlecht für die spätere Quantifizierung der Produkte, da man hier pro Zyklus von einer Fehlerrate von 20% ausgehen kann. Dieser Fehler summiert sich besonders, wenn einzelne Proben mehrere Zyklen Differenz aufweisen. Wie auch bei der konventionellen PCR muss vorher das Mischungsverhältnis der Einzelkomponenten eines Ansatzes optimiert werden. Hierbei spielen die Magnesiumchloridkonzentration sowie die Anlagerungstemperatur für das Primerpaar eine entscheidende Rolle.

In Vorexperimenten wurden mit Verdünnungsreihen von Magnesiumchlorid und durch Veränderungen in der Reaktionstemperatur die optimalen Messbedingungen gefunden. Diese sind für jedes Primerpaar unterschiedlich und in der dem Ansatz folgenden Tabelle 1b dargestellt. Die Zeiten für die PCR Programme richten sich nach der Fragmentlänge und dem eingesetzten Primerpaar. Man kann abschätzen, dass das hier verwendete Enzym eine Syntheserate von 25 bp pro Sekunde aufweist. Demzufolge wurden die Kopierzeiten (Transkription) an die jeweiligen Fragmentlängen angepasst.

Für die Light Cycler PCR wurde folgender Ansatz pro 20 µL verwendet:

▼ 23 

Tabelle 2b: Light Cycler Bedingungen verschiedener genspezifischer Primerpaare

Gen

MgCl2 Konzentration

Programm

Denaturierung – Annealing –Transkription

optimale Annealing

Temperatur

Produktlänge

Hexokinase-1

TV 1-5

8 mM

10 s - 5 s - 8 s

68 °C

161 bp

SOD 1

7 mM

15 s – 15 s – 22 s

59 °C

434 bp

β-Aktin

7 mM

5 s - 5 s - 9 s

64 °C

141 bp

Zur Ermittlung der Effizienzen für die einzelnen Light Cycler PCR Läufe wurde bei jedem Lauf eine Standardverdünnungsreihe verwendet. Für die Etablierung wurde cDNA von HeLa-Zellen verwendet, die in DFX-haltigem Medium inkubiert waren. DFX als Eisenchelator simulierte hierbei einen hypoxischen Zustand. Als Kalibrator wurde eine unabhängig erstellte 1:100 Verdünnung von dieser cDNA eingesetzt, über die dann die einzelnen Läufe gegeneinander abgeglichen werden konnten.

2.7 Klonierung und Sequenzierung der PCR Produkte

▼ 24 

Die aus den PCR gewonnenen Produkte für β-Aktin, Hexokinase und SOD1 wurden mit dem TOPO-TA 2.1 Cloning Kit von Invitrogen in chemokompetente E. coli kloniert. Hierzu wurde das Herstellerprotokoll verwendet.

In der Zwischenzeit wurden Petrischalen mit Ampicillin (100 µg/mL) versetztem Agar-Agar (1,5%)-LB Medium unter sterilen Bedingungen gegossen. Nach der Inkubation im Brutschrank wurden 200 µL der transformierten Bakterien auf mit Ampicillin versetzte Medienträgern ausplattiert und über Nacht inkubiert. Danach wurde eine repräsentative Zahl von Bakterienkolonien pro Platte einer PCR unterzogen. Dadurch konnten positive Klone identifiziert werden, welche das Plasmid mit dem PCR Produkt in ihrem Zytoplasma inkorporiert hatten. Jeweils zwei positive Klone wurden über Nacht in mit Ampicillin versetztem LB Flüssigmedium bei 37°C vermehrt. Am folgenden Tag erfolgte eine Plasmid-DNA-Isolation aus den im Flüssigmedium gewachsenen Kolonien nach dem Protokoll des Plasmid DNA Purification Kit (Macherey / Nagel) mittels NucleoSpin Säulen. Die gewonnene Plasmid DNA wurde einem Restriktionsverdau durch das Restriktionsenzym ECO-I unterzogen. Das Verdauprodukt wurde neben unverdautem Plasmid auf ein Ethidiumbromid-Agarosegel aufgetragen und nach elektrophoretischer Auftrennung unter UV-Licht fotografiert. Die gesamte Prozedur der Transfektion der PCR Fragmente in E. coli Bakterien über dieses Vektorsystem diente der Vermehrung der Fragmente für die anschließende Sequenzierung. Der Restriktionsverdau wurde zur Kontrolle des Klonierungserfolges verwendet.

Sequenzierung

Um die Sequenz des durch die PCR amplifizierten Fragmentes zu verifizieren, wurde die isolierte Plasmid-DNA einer Markierungs- und Vermehrungsreaktion nach der Methode von Sanger et al. unterzogen (53). Das Prinzip dieser Reaktion ist, auf der Grundlage einer PCR ähnlichen Amplifikationsreaktion mit fluoreszenzfarbstoffmarkierten Abbruchnukleotiden (ddNTPs) dem Zufall nach unterschiedlich lange Amplifikate zu erzeugen, deren endständiges Nukleotid mit einem basenspezifischen Farbstoff markiert ist. Trennt man das entstandene Gemisch an Fragmenten elektrophoretisch auf und regt die fluoreszenzmarkierten Nukleotide mit einem Laserstrahl an, so kann man anhand der Farbabfolge im Gel die Basenabfolge der Sequenz herleiten.

▼ 25 

Die isolierte Plasmid-DNA wurde in folgender Weise für den Sequenzierungsansatz verwendet:

Als Amplifikationsprogramm wurden folgende Einstellungen am PCR-Cycler vorgenommen:

▼ 26 

Programm:

Nach der Vervielfältigung wurden die Produkte mit Ethanol gefällt. Hierzu wurden zum 10 µL Ansatz aus der Amplifizierung 80 µL Aqua dest., 10 µL 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 250 µL Ethanol (96%v/v) gegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 13.000 rpm (16.000 x g) pelletiert. Nach Abgießen des Überstandes wurde mit 250 µL 70% Ethanol resuspendiert und nochmals für 15 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Pellet mit 20 µL Aqua dest. resuspendiert und in die Sequenzierungsmaschine (Applied Biosystems, ABI PRISM™ 310 Genetic Analyser) gegeben. Hier regte ein Laserstrahl die Abbruchnukleotide der in einer mit Agarosegel gefüllten Kapillare elektrophoretisch aufgetrennten Produkte aus dem Amplifikationsgemisch zur Emission von Licht definierter Wellenlänge an. Die Abfolge der Emissionspeaks ergab nun die Basenabfolge des ursprünglich klonierten PCR Produktes. Die Sequenzierungsergebnisse wurden nun mittels CHROMAS145-95 und BLAST ausgewertet.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
11.08.2006