3 Ergebnisse

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In diesem Abschnitt werden die Ergebnisse der einzelnen Messungen zum Sauerstoffverbrauch, zur ATP-Messung, zum Zellüberleben, zur HIF-1α-Expression und zur Expression ausgewählter Zytokine sowie zur Regulation der Zielgene Hexokinase-1 und SOD1 dargestellt.

3.1 Kinetik des Sauerstoffverbrauchs von PMA- / Ionomycin-stimulierten CD4+ Zellen

Abbildung 2 zeigt, dass der Sauerstoffverbrauch von CD4+ -Zellen von den verwendeten Kulturbedingungen abhängig ist. Lymphozyten weisen im Medium mit Glukose unter Hypoxie einen kontinuierlichen Abfall ihres Sauerstoffverbrauchs bis zum Erreichen der Anoxie auf. Dagegen zeigen Lymphozyten im Medium ohne Glukose einen konstanten Verbrauch über die ersten 120 Minuten, danach tritt eine deutliche Verminderung der Atmungsrate ein. Ab 160 Minuten ist der mittlere Verbrauch der Zellen im Medium ohne Glukose geringer als im Medium mit Glukose.

Abbildung 2: Sauerstoffverbrauch stimulierter CD4 Mittels Clark Elektrode gemessener Sauerstoffverbrauch von PMA- / Ionomycin- stimulierten CD4+- Lymphozyten während sechsstündiger Inkubation in nmol / (107 Zellen x min); * – signifikanter Unterschied im Sauerstoffverbrauch der Zellen im Medium ohne Glukose bzw. mit Glukose (p<0,05).

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Die im Mittel eingesetzten 5.6 x 106 Zellen (entspricht einer Konzentration von durchschnittlich 4 x 10 6 Zellen / mL Medium) erreichten den Anoxiezustand im Medium mit Glukose nach 236 46 Minuten während im Medium ohne Glukose der Sauerstoff schon nach 185 42 Minuten vollständig aufgebraucht war. Dieser Unterschied zeigt sich mit einem p-Wert von 0,069 nur als Trend.

In Abbildung 3a ist die Atmungsrate in Bezug zum verbrauchten Sauerstoffanteil im Medium gesetzt. Hier kann man erkennen, dass die CD4 + -Lymphozyten im Medium ohne Glukose im Bereich zwischen 70% und 10% Sauerstoffsättigung eine konstante Atmungsrate zeigen. Dagegen sinkt sie bei den im Medium mit Glukose kultivierten Zellen kontinuierlich.

Abbildung 3a: Atmungsrate stimulierter CD4+-Zellen bezogen auf den Sauerstoffgehalt im Medium: Sauerstoffverbrauch von PMA- / Ionomycin- stimulierten CD4+ Lymphozyten (in nmol pro min und 10 Abhängigkeit vom Sauerstoffgehalt im Medium (in % des Ausgangswertes).* signifikanter Unterschied im Verbrauch zwischen Zellen im Medium ohne bzw. mit Glukose (p<0,05).

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Signifikante Unterschiede zeigen sich hier, wenn 60 % des Sauerstoffs verbraucht sind, also ab einer Sauerstoffsättigung im Medium von 40% der Ausgangssättigung. In Abbildung 3b ist die Sauerstoffclearance dargestellt. Sie errechnet sich aus dem Quotienten der Atmungsrate [nmol O2 /(10 7 Zellen x min)] und der Sauerstoffkonzentration im Medium [nmol O 2 / mL] und hat die Einheit mL Medium/(10 7 Zellen x min). Sie gibt die Menge Medium an, die durch 10 7 Zellen in einer Minute komplett von Sauerstoff befreit wird.

Abbildung 3b Sauerstoffclearance PMA- / Ionomycin-stimulierter CD4+-Zellen:

Die Clearance gibt an, wieviel mL Medium von 107 Zellen pro Minute komplett von Sauerstoff befreit werden. Sie ist ein Maß für die Intensität, mit der Sauerstoff durch die Zellen aus dem Medium extrahiert wird. * signifikante Unterschiede zwischen den Inkubationsmedien (p<0,05). Δ zeigt die Phasenverschiebung.

Die Clearancekurve der Zellen im Medium mit Glukose ist ab einer Sättigung von 50% bis zu einer Sättigung von 20% gegenüber der Kurve ohne Glukose phasenverschoben. Die Phasenverschiebung (Δ) beträgt ungefähr 10% Sättigung oder ca. 25 nmol O 2 / mL.

3.2 Ergebnisse der Quantifizierung von ATP

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Es wurde festgestellt, dass der ATP-Gehalt bei im Medium mit Glukose inkubierten Zellen eine relative Konstanz aufweist. Zellen unter Glukosemangel zeigen anfänglich einen höheren ATP-Gehalt, der dann jedoch deutlich absinkt und auch durch die Inkubation ohne Sauerstoffbeschränkung nicht mehr auf den Ausgangswert angehoben wird.

Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der Messungen des ATP-Gehalts der Zellen in beiden Medien zu verschiedenen Zeitpunkten der Inkubation.

Abbildung 4: ATP Mengenmessung in stimulierten CD4+-Lymphozyten

Messung des ATP-Gehalts (in nmol/10 einer repräsentativen Probe von 50 µL Zellsuspension am Anfang, in der Mitte und am Ende der Inkubation mit einem Luciferin / Luciferase System (Roche) im Luminometer ; * signifikante Unterschiede im ATP Gehalt zwischen beiden Kulturbedingungen (p < 0,05)

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Der zelluläre ATP-Gehalt ist bei Inkubation der Lymphozyten im Medium mit Glukose für die Zeitpunkte 3h Normoxie und 6h Normoxie und Hypoxie signifikant höher als im Medium ohne Glukose. Anfänglich zeigen Zellen, die in glukosefreiem Medium präpariert wurden einen signifikant höheren ATP-Gehalt.

3.3 Überlebensrate der Zellen unter verschiedenen Inkubationsbedingungen

Einen wichtigen Aspekt zur Beurteilung der Zellfunktion stellt die Überlebensrate der Zellen dar. Nur funktionell intakte Zellen sind für die Entzündungsprozesse von Bedeutung. Dadurch ergab sich die Notwendigkeit, die Überlebensrate der Zellen per FACS-Analyse zu bestimmen. Propidiumjodid lagert sich hierbei in die DNA von permeablen Zellen ein und färbt diejenigen dauerhaft an, welche den Farbstoff nicht mehr aktiv an ihre Umgebung abgeben können. Somit kann eine mit Propidiumjodid gefärbte Zelle als funktionell eingeschränkt betrachtet werden. Dieser Einschränkung liegen meist Prozesse des Zelluntergangs zu Grunde.

Abbildung 5 zeigt die Überlebensrate der Zellen unter den verschiedenen Inkubationsbedingungen in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer.

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Abbildung 5: Viabilitätsmessung durch FACS Analyse mittels Propidiumjodidfärbung

Veränderung der Propidiumjodidanfärbbarkeit unter den unterschiedlichen Inkubationsbedingungen. Für die FACS Analyse wurden pro Messung mindestens 10.000 Zellen analysiert. *-signifikante Unterschiede zwischen den Inkubationsbedingungen (p < 0,05)

Die Abbildung zeigt, dass nach sechs Stunden unter allen Inkubationsbedingungen etwa 70-80% der Zellen noch vital sind. Eine Ausnahme bildet die Inkubation unter Normoxie und ohne Glukose, wo nur noch 10-30 % der Zellen vital sind.

3.4 Westernblot zur Darstellung von HIF-1α

Die Zellproteinlysate wurden zur Bestimmung der HIF-1α Expression durch die Zellen in einem Acrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran übertragen und mit Antikörpern markiert. An diese Antikörper waren Peroxydasen gebunden, die ein Substrat unter Lumineszenzbildung umsetzten. Mit dem durch die Lumineszenz erzeugten Licht war es möglich, einen Film zu belichten. Es konnte gezeigt werden, dass HIF-1α als ein Indikatorprotein für hypoxischen Stress in vermehrtem Maße bei den hypoxisch inkubierten Zellen auftrat. Diese Aussage illustrieren die Abbildungen 6a und 6b.

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Abbildung 6a: Westernblot zum Nachweis von HIF-1α im Medium mit Glukose CD4+-Lymphozyten wurden mit PMA und Ionomycin stimuliert. Der Immunoblot zum Nachweis von HIF-1α erfolgte unter Verwendung von Proteinlysaten dreier Experimente (0753,1143 und 1306) Zur Normierung wurde das Strukturprotein β-Aktin verwendet.

HIF-1α war bei den Zellen am Anfang der Inkubation (0h) nicht nachweisbar. Nach sechs Stunden unter sauerstoffreichen Bedingungen (6hN) zeigte sich kein HIF-1α. Nach sechs Stunden unter Luftabschluss (6hH) war jedoch eine deutliche HIF-1α Bande zu erkennen.

Abbildung 6b: Westernblot zum Nachweis von HIF-1α im Medium ohne Glukose CD4+-Lymphozyten wurden mit PMA und Ionomycin stimuliert. Der Immunoblot zum Nachweis von HIF-1α erfolgte unter Verwendung von Proteinlysaten dreier Experimente (1906,2075 und 0919) Zur Normierung wurde das Strukturprotein β-Aktin verwendet.

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In beiden Abbildungen ist deutlich die Expression von HIF-1α durch die verminderte HIF-1α Degradation unter Hypoxie, wie in der Einleitung erwähnt, zu erkennen.

Somit konnte man auf eine intrazelluläre Präsenz des HIF-1α Proteins bei den hypoxischen Proben schließen.

In Abbildung 6c sind die Proteinproben von einem Versuch mit Glukose und einem Versuch ohne Glukose nebeneinander dargestellt. Es ist ein deutlicher quantitativer Unterschied in der Expression von HIF-1α zum Zeitpunkt 6hH erkennenbar.

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Abbildung 6c Immunoblot von HIF-1α und β-Aktin von Lysaten von PMA- / Ionomycin- stimulierten CD4+-Medienvergleich

3.5 Messung der Zytokinkonzentrationen mittels Multiplex-ELISA

In den Abbildungen 7 bis 13 sind die Ergebnisse der Zytokinquantifizierung aus den Kulturüberständen dargestellt. Jede Abbildung gibt die Konzentration des jeweiligen Zytokins in Pikogramm bezogen auf die Zellzahl für die verschiedenen Inkubationsbedingungen wieder. Die Fehlerbalken der folgenden Abbildungen sind jeweils der SEM. Signifikante Unterschiede wurden ab p < 0,05 angenomen und mit -*- gekennzeichnet. Als statistische Tests wurden der Wilcoxon-Test für verbundene und der Mann-Whitney-U-Test für unverbundene Stichproben verwendet. Anhand der Ergebnisse lassen sich die Zytokine in vier verschiedene Reaktionskategorien einteilen.

1. Zur ersten Gruppe gehören die Zytokine IL-1β, IL-2, IL-8 und IL-10 (Abbildungen 7 bis 10). Zytokine dieser Gruppe weisen eine Abhängigkeit ihrer stimulierten Expression vom Glukoseangebot auf, wobei Glukoseverfügbarkeit eine signifikant stärkere Zytokinexpression im Vergleich zu Glukosemangel bewirkt. Bei allen Zytokinen dieser Gruppe zeigt sich auch, dass Hypoxie unabhängig vom Glukoseangebot ihre Expression signifikant verstärkt.

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2. IL-6 weist ein Expressionsprofil auf, das sich von dem der Zytokine in der ersten Gruppe unterscheidet (Abbildung 11). Es zeigt sich ebenfalls, dass Glukose die Zytokinexpression verstärkt. Hypoxie verstärkt jedoch nur im Medium mit Glukose die Expression von IL-6 signifikant.

3. Zur dritten Art von Expressionsprofil gehört das von TNF-α, das in Abbildung 12 dargestellt ist. Hier zeigt sich wieder ein signifikanter Einfluss der Glukoseverfügbarkeit. Im Gegensatz zu allen anderen Zytokinen kann man hier jedoch beobachten, dass Hypoxie die Expression von TNF-α im Vergleich zur Normoxie signifikant vermindert.

4. Eine vierte Art von Expressionsprofil ist das von MCAF (Abbildung 13). Es zeigt sich kein signifikanter Einfluss von Glukose auf die Expressionsstärke von MCAF, und ein schwacher aber signifikanter Hypoxieeinfluss lässt sich lediglich unter der Wirkung von Glukose beobachten.

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Kategorie 1:

Abbildung 7 Interleukin-1β-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)

Abbildung 8 Darstellung der Interleukin-2-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)

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Abbildung 9 Interleukin-8-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)

Abbildung 10 Interleukin-10-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)

Kategorie 2:

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Abbildung 11 Interleukin-6-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)

Kategorie 3:

Abbildung 12 TNF-α-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)

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Kategorie 4:

Abbildung 13 MCAF (MCP-1)-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)

Bezieht man die Expressionsstärken der Zytokine unter Hypoxie auf die Expressionsstärken unter Normoxie, dann ergeben sich die Abbildungen 14 und 15. Hier werden die Quotienten aus Hypoxieexpression und Normoxieexpression dargestellt. Das Ausmaß des Hypoxieeinflusses ergibt sich aus folgender Gleichung, wobei dieVariable c die Konzentration des Zytokins darstellt:

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Abbildung 14 zeigt berechneten Quotienten im Medium mit Glukose.

Abbildung 14 Hypoxieeinfluss auf die Expression der dargestellten Zytokine im Medium mit Glukose bei stimulierten CD4+-Zellen. Fehlerbalken repräsentieren SEM; Hypoxieeinfluss = Hypoxieexpression / Normoxieexpression

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Aus dieser Art der Darstellung wird eine Hierarchie der verschiedenen Zytokine erkennbar. IL-1-β stellt sich hierbei als am stärksten durch Hypoxie beeinflusstes Zytokin dar. Ihm folgen IL-10, IL-8, IL-6, IL-2 und MCAF. TNF-α ist ein durch Hypoxie negativ beeinflusstes Zytokin. Alle dargestellten Effekte sind signifikant (p < 0,05).

Unter diesen Umständen kann man IL-1β und IL-10 als hochgradig, IL-8 und IL-6 als mittelgradig, IL-2 und MCAF als geringradig und TNF-α als negativ beeinflusst bewerten.

Abbildung 15 zeigt berechneten Quotienten im Medium ohne Glukose.

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Abbildung 15 Hypoxieeinfluss auf die Expression der dargestellten Zytokine im Medium ohne Glukose bei stimulierten CD4+-Zellen. Fehlerbalken repräsentieren SEM; Hypoxieeinfluss = Hypoxieexpression / Normoxieexpression

Sowohl im Medium mit Glukose als auch bei Glukoseabwesenheit zeigt sich ein großer Einfluss der Hypoxie auf die Expression von IL-1β, IL-10, IL-2, IL-8. Der Einfluss auf die Expression von TNFα, IL-6 und MCAF ist jedoch nicht signifikant. Somit stellen sich IL-10 und IL-1β als stark, IL-2 und IL-8 als mittelgradig und die anderen Zytokine als nicht oder geringgradig hypoxiereguliert dar.

In den folgenden Abbildungen 16 und 17 sind zum Vergleich die Absolutwerte der Zytokinsynthese unter den unterschiedlichen Bedingungen dargestellt. Da in der Expressionsstärke starke quantitative Unterschiede zwischen den einzelnen Zytokinen existieren, ist die Ordinate in logarithmischer Form skaliert.

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Abbildung 16a Expressionsprofil PMA- / Ionomycin-stimulierter CD4+-Zellen unter Einfluss von Glukose: Zytokinmenge in pg bezogen auf 107 Zellen; Fehlerbalken repräsentieren SEM (n=6)

Abbildung 16b Expressionsprofil PMA- / Ionomycin-stimulierter CD4+-Zellen unter Glukosemangel: Zytokinmenge in pg bezogen auf 107 Zellen; Fehlerbalken repräsentieren SEM (n=6)

Man kann feststellen, dass die Zellen unter Glukoseeinfluss insgesamt größere Zytokinmengen produzieren. In ihrem Expressionsprofil zeigen sie, was die Mengenverteilung dieser Zytokine anbelangt, jedoch glukoseunabhängig ähnliche Muster. Aus der Abbildung 16a lässt sich entnehmen, dass die Zytokine IL-2 und TNF-α sehr stark exprimiert werden (> 5 x 103pg / 107 Zellen), IL-10, IL-8 und IL-6 im mittleren Expressionsbereich liegen ( > 5 x 102 pg / 107 Zellen) und IL-1β und MCAF eher im unteren Expressionsbereich zu finden sind (< 5 x 102 pg / 107 Zellen). Die Situation unter Glukosemangel, die in Abbildung 16b dargestellt ist, ergibt insgesamt niedrigere Expressionen für alle Zytokine. Hier gelten IL-2 und TNF-α als hoch exprimierte Zytokine, während IL-8, IL-6 und IL-10 auf mittlerem Niveau produziert und IL-1β und MCAF wiederum auf niedriger Stufe ausgeschüttet werden.

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Es stellte sich die Frage, welchen Einfluss Glukose auf die Zytokinexpression hat. Daher ergab sich die Notwendigkeit, die Expression unter jeweils Normoxie bzw. Hypoxie unter Glukosean- und ~abwesenheit miteinander zu vergleichen. Zu diesem Zweck wurde der folgende Quotient berechnet:

In den folgenden zwei Abbildungen sind diese Quotienten dargestellt.

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Abbildung 17a Einfluss von Glukoseverfügbarkeit auf die Zytokinexpression unter Normoxie (n=6)

Abbildung 17b Einfluss von Glukoseverfügbarkeit auf die Zytokinexpression unter Hypoxie (n=6)

Aus den Abbildungen geht ein starker Einfluss von Glukose auf die Expression von IL-10 hervor, der bei Normoxie am stärksten ist. Unter Normoxie stellen sich auch TNF-α und IL-2 als stark von Glukose beeinflusst dar, während unter Hypoxie TNF-α und IL-1β als deutlich beeinflusst angesehen werden können.

3.6 Light Cycler PCR für Superoxiddismutase1, Hexokinase und β-Aktin

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Die Bestimmung der mRNA-Expression für die Enzyme Hexokinase und Superoxiddismutase-1 erfolgte mit der Fragestellung, welchen Einfluss Hypoxie auf die Transkription von Schlüsselgenen der Glykolyse (Hexokinase) und des Radikalstoffwechsels (Superoxiddismutase-1) hat. Es bestand die Arbeitshypothese, dass auch in Lymphozyten eine Erhöhung der Transkription des Hexokinasegens unter dem Einfluss von Glukose auftritt. Der Radikalstoffwechsel sollte in einer sauerstoffreichen Umgebung ohne Glykolyse am intensivsten sein.

Die folgenden Abbildungen illustrieren unsere Ergebnisse zu Art und Ausmaß dieser Hypoxieanpassung auf transkriptioneller Ebene.

Abbildung 18 mRNA Expression von Hexokinase in stimulierten humanen CD4+-Zellen: Darstellung der mRNA Expression von Hexokinase (Transkriptvarianten 1-5) zu Beginn (0h), nach sechs Stunden Normoxie (N6h) und Hypoxie (H6h), normalisiert auf β-Aktin im Vergleich zwischen glukosereichen und glukosefreien Inkubationsbedingungen; Fehlerbalken repräsentieren SEM; (n=4); (*-p < 0,05)

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Abbildung 18 widmet sich der Fragestellung, ob die Expression des Hexokinasegens durch Hypoxie und Glukosemangel beeinflusst werden. Man kann erkennen, dass Hypoxie im Medium mit Glukose zu einer signifikanten Transkriptionssteigerung des Hexokinasegens führt. Unter Normoxie zeigt sich sowohl im Medium mit Glukose als auch im Medium ohne Glukose keine signifikant gesteigerte Transkription im Vergleich zum Ausgangswert.

Abbildung 19 mRNA Expression von Superoxiddismutase-1 (Cu/Zn) in stimulierten humanen CD4+-Zellen: Darstellung der mRNA Expression von Superoxiddismutase-1 zu Beginn (N0h), nach sechs Stunden Normoxie (N6h) und Hypoxie (H6h), normalisiert auf β-Aktin im Vergleich zwischen glukosereichen und glukosefreien Inkubationsbedingungen; Fehlerbalken repräsentieren SEM; (n=4); (*-p < 0,05)

Abbildung 19 gibt Antwort auf die Frage, inwieweit das Superoxiddismutase-1-Gen transkriptionell durch den Einfluss von Sauerstoff- und Glukosemangel beeinflusst wird. Es ist eine signifikante Steigerung der Transkription von Superoxiddismutase-1 unter der Kombination aus Sauerstoff- und Glukosemangel erkennbar.

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Die folgenden vier Abbildungen 20-23 dokumentieren die Etablierung der PCR Reaktionsläufe am Light Cycler. Hier war es zuerst nötig, die geeigneten Reaktionsbedingungen wie Temperatur und Magnesiumchloridkonzentration in den Reaktionsgemischen festzustellen, da diese für jede Primerpaarkombination unterschiedlich ausfallen können. Mit diesen Temperatur- und MgCl2-Konzentrationseinstellungen war es nun möglich, eine Verdünnungsreihe von cDNA mit dem geeigneten Programm einer PCR zu unterziehen. Die Ergebnisse hierzu finden sich in den folgenden Abbildungen:

Abbildung 20 Effizienzreihe zur PCR von Superoxiddismutase-1: Es ergibt sich eine Effizienz von 1,916. Die Messungen sind Doppelwerte einer Standardverdünnungsreihe.

Abbildung 21 Effizienzbestimmung Hexokinase 1 TV1-5 am Light Cycler System ; Effizienz 1,987. Die Messungen sind Einzelbestimmungen einer Standardverdünnungsreihe, die sich in mehreren folgenden Läufen bestätigt haben.

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Die Effizienz wurde durch folgende Formel bestimmt:

Der Terminus „Slope“ gibt den Anstieg der blauen Geraden aus den Abbildungen 20 und 21 an. Die Effizienz gibt an, wie viele Kopien des zu amplifizierenden Produktes pro PCR-Zyklus erzeugt werden. Im Idealfall ergibt sich eine Verdopplung, also eine Effizienz von zwei. Um die Aussagen über die Effizienzläufe aus den Abbildungen 20 und 21 zu validieren, müssen die Schmelzkurven der entstandenen Produkte kritisch beurteilt werden. Dazu wurden die Produkte unter kontinuierlicher Fluoreszenzmessung der Proben erwärmt. Da Sybr Green als Farbstoff seine Emissionsintensität verliert, sobald einzelsträngige DNA vorliegt, ist es möglich zu beurteilen, ob in den Proben tatsächlich nur ein spezifisches Produkt amplifiziert wurde. Es ist sogar möglich, dessen genaue Schmelztemperatur zu bestimmen. Diese Messungen sind in den Abbildungen 22 und 23 wiedergegeben.

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Abbildung 22 Schmelzkurve zur Effizienzbestimmung von Superoxiddismutase-1. Es zeigt sich ein spezifisches Produkt mit einer Schmelztemperatur von ca. 89°C. Die Wasserkontrolle bleibt produktfrei.

Abbildung 23 Schmelzkurven zur Effizienzbestimmung für Hexokinase 1 TV1-5. Es zeigt sich ein spezifisches Produkt mit einer Schmelztemperatur von ca. 85,5°C. Ein weiteres Produkt bei 82°C tritt nur in der Wasserkontrolle auf und ist für die eigentlichen Proben und die Effizienzbestimmung nicht von Bedeutung.

Zur Verifizierung der Amplikons für Hexokinase-1, Superoxiddismutase-1 und β-Aktin müssen die jeweiligen PCR Produkte sequenziert werden. In den folgenden Abbildungen 24-26 sind die Sequenzierungsergebnisse dargestellt. Zusammenfassend ist zu sagen, dass alle Sequenzen den gewünschten Amplikons entsprechen und somit die auf Grundlage der Realtime-PCR ermittelten Ergebnisse valide sind.

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Abbildung 24 Sequenzierungsergebniss für das Hexokinase-1 Amplikon

Abbildung 25 Sequenzierungsergebniss für das β-Aktin (ACTB) Amplikon

Abbildung 26 Sequenzierungsergebniss für das SOD1 Amplikon

3.7 Korrelationsanalysen

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Aus den Ergebnissen der Zytokinmessungen ergaben sich Fragen zu möglichen Zusammenhängen zwischen den Zytokinen untereinander und verschiedenen ausgesuchten Einflussfaktoren auf die Zytokinproduktion. Um Anhaltspunkte für die Beantwortung der Fragen zu möglichen Zusammenhängen zu erhalten, wurden die Zytokindaten einer Korrelationsanalyse unterzogen. Die Ergebnisse dieser Analyse finden sich in tabellarischer Form in den folgenden Abschnitten getrennt nach Glukoseanwesenheit bzw. ~abwesenheit.

3.7.1 Experimente mit glukosehaltigem Medium

Die nachfolgenden zwei Tabellen zeigen die Korrelationsdaten zu signifikant korrelierenden Zytokinkombinationen (Tabelle 3a) und die Daten zur Korrelation zwischen der Population der schwach CD4+-Zellen und einzelner Zytokine ( Tabelle 3b).

Tabelle 3 a Korrelationsbestimmung für mögliche Zytokinabhängigkeiten nach Pearson (lineare Korrelation)
Darstellung aller signifikanten Korrelationen für die Inkubation im Medium mit Glukose mit Angabe des
Korrelationskoeffizienten und der Signifikanz

Korrelationspartner

Koeffizient

Signifikanz

Bemerkung

IL2:TNFα

0,82

0,046

nur bei Normoxie

IL-8:TNFα

0,87

0,024

nur bei Normoxie

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Tabelle 3b: Korrelationsbestimmung nach Pearson (linear)
Möglichkeit der Auswirkung der CD4low-Population auf die Zytokinexpression im glukosehaltigen Medium

Korrelationspartner

Koeffizient

Signifikanz

Bemerkung

CD4low: IL1β

0,955

0,003

bei Normoxie und

CD4low: IL-8

0,846

0,034

nur bei Hypoxie

Man kann in Tabelle 3a einen Zusammenhang zwischen den IL-2- und TNF-α-Konzentrationen sowie den IL-8- und TNF-α-Konzentrationen unter Normoxie erkennen.

Aus Tabelle 3b geht eine signifikant positive Korrelation zwischen der Zahl der schwach positiven CD4-Zellen (CD4low) und der Expression von IL-8 unter dem Einfluss von Hypoxie hervor. Die Expression von IL-1korreliert unabhängig von der Sauerstoffversorgung mit der Zahl der CD4-positiven Zellen.

3.7.2 3.7.2 Experimente mit glukosefreiem Medium

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In den folgenden zwei Tabellen sind die Ergebnisse der Korrelationsanalyse für die Inkubation in glukosefreiem Medium dargestellt. Tabelle 4a zeigt die signifikant korrelierenden Zytokine, während in Tabelle 4b der korrelative Zusammenhang zwischen der Population schwach CD4-positiver Zellen und einzelnen Zytokinen dargestellt ist.

Tabelle 4a Korrelationsbestimmung nach Pearson (lineare Korrelation) für Glukosemangel:
Darstellung aller signifikanten Korrelationen

Korrelationspartner

Koeffizient

Signifikanz

Bemerkung

IL-6 : IL-2

0,845

0,034

nur bei Normoxie

IL-6 : IL1β

0,854

0,031

nur bei Normoxie

IL-8 : MCAF

0,826

0,043

nur bei Normoxie

TNF α : IL-2

0,881

0,847

0,02

0,033

bei Normoxie und Hypoxie

Tabelle 4 b Korrelationsbestimmung nach Pearson (lineare Korrelation) für Glukosemangel
Darstellung aller signifikanten Korrelationen im Zusammenhang mit schwach CD4+-Zellen (CD4low)

Korrelationspartner

Koeffizient

Signifikanz

Bemerkung

CD4low : IL-8

0,903

0,825

0,014

0,043

bei Normoxie und Hypoxie

CD4low : IL-1β

0,944

0,005

nur bei Hypoxie

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Aus Tabelle 4a kann man entnehmen, dass es unter Normoxie einen positiven Zusammenhang zwischen der IL-6-Konzentration und den Konzentrationen von IL-2 bzw. IL-1β gibt. Die IL-8- und die MCAF-Konzentrationen scheinen unter normoxischen Bedingungen ebenfalls verbunden. Die TNF-α Produktion korreliert unabhängig von der Sauerstoffversorgung mit der IL-2 Konzentration. Aus Tabelle 4b kann man entnehmen, dass sich unter hypoxischen Bedingungen eine positive Korrelationen zwischen der Konzentration an CD4low-Zellen und der IL-1β Produktion zeigt. Die Berechnungen ergaben ferner, dass eine positive Korrelation zwischen Anzahl der CD4low-Zellen und der IL-8 Konzentration sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie besteht.


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HTML-Version erstellt am:
11.08.2006