4 Diskussion

▼ 56 (fortgesetzt)

Metabolische Energie ist bedeutsam für die Auseinandersetzung von Körperzellen mit ihrer Umwelt. Die Energiegewinnung aus Glukose durch die Glykolyse und die Prozesse in der mitochondrialen Atmungskette sind von entscheidender Bedeutung für die Funktionsfähigkeit und das Überleben der Zelle. Beide Stoffwechselwege liefern hierbei den Energieträger ATP mit unterschiedlicher Effizienz.

In besonderem Maße sind die Zellen des Immunsystems, zu denen die untersuchten CD4+-Zellen gehören, vom lokalen Angebot an Sauerstoff und Glukose im Entzündungsgebiet betroffen. Sauerstoffspannungen in humanen Lymphknoten sind bislang nicht untersucht. Es existieren jedoch Messdaten aus Mausexperimenten, die vermutlich auch bei Menschen zu erwarten sind. So finden sich verminderte Sauerstoffspannungen zwischen 0,5 % (v/v) und 4,5 % (v/v) in Lymphknoten und lymphoiden Organen von Mäusen (54).

▼ 57 

Physiologisch zeigt sich in Thymusgewebe von Mäusen eine niedrige Sauerstoffspannung (~10mmHg; ~7%(v/v)). Sie wird als ein Regulationsmechanismus angesehen, der Bestandteil der Lymphozytenselektion im Thymus ist. Die Selektion ist wichtig, weil nur an Hypoxie adaptierte T-Lymphozyten in der Lage sind, ihrer Funktion im Entzündungsgebiet nachzukommen (55).

Erkrankungen mit entzündlichem Charakter, wie zum Beispiel RA, zeichnen sich durch eine hohe Infiltrationsrate von CD4+-Zellen in das Synovialgewebe aus. Giatromonolaki et al. konnten zeigen, dass neben Zellen der Synovialis auch die zellulären Infiltrate bei RA in vermehrtem Maße HIF-1α positiv sind (16). Dies lässt vermuten, dass bei Patienten mit RA im Entzündungsgebiet ein vermindertes Sauerstoffangebot herrscht. Die Präsenz von HIF-1α im Entzündungsgebiet reicht jedoch nicht aus, um von einer hypoxischen Umgebung auszugehen, da dieser Faktor auch unter normoxischen Bedingungen durch den Einfluss von beispielsweise Eisenmangel stabilisiert werden kann. Eine andere Forschergruppe um Lund-Olesen konnte 1970 eine signifikant verminderte Sauerstoffkonzentration in Kniegelenkspunktaten von Patienten mit RA gegenüber Patienten mit Osteoarthrose oder Unfallopfern feststellen (56). Diese Untersuchung stellt einen direkten Nachweis von Hypoxie im Gelenk von RA-Patienten dar. Einen weiteren Beweis zwischen Ödem und Hypoperfusion stellt die Arbeit von Wallis et al. dar (57). Diese Gruppe wies eine verminderte Iodclearance aus ödematös geschwollenen Gelenken von RA Patienten nach.

Somit kann man zusammenfassend sagen, dass hypoxische Zustände im Körper unter physiologischen und pathologischen Bedingungen auftreten können, und dass T-Lymphozyten in solchen Regionen anzutreffen sind. Es ist daher notwendig, das Verhalten von CD4+-Zellen unter Bedingungen zu betrachten, wie sie sich im frisch entzündeten Gewebe finden. Im vorliegenden in-vitro-Modell entspricht dies anfangs dem Zustand der Stimulation unter freiem Sauerstoffangebot und bei guter Glukoseverfügbarkeit und endet dann im Zustand mit geringem Glukose- und Sauerstoffangebot. In vivo kann man diese Bedingungen perivaskulär im Entzündungsgebiet finden.

4.1 Verhalten von CD4+-Zellen in unterschiedlichen Situationen

4.1.1 Verhalten von CD4+-Zellen bei Normoxie im glukosehaltigen Medium unter Stimulation

▼ 58 

Im glukosehaltigen Medium bei guter Sauerstoffversorgung und Stimulierung mit PMA und Ionomycin ist HIF-1α nicht nachweisbar. Die Zellen zeigen eine Überlebensrate von 81 ± 11 % nach sechs Stunden Inkubation. Der ATP-Gehalt liegt bei ca. 0,85 ± 0,27 nmol ATP pro 107 Zellen. Die Hierarchie der Zytokine zeigt IL-2 und TNF- als hoch, IL-8, IL-6 und IL-10 als mittelgradig und MCAF und IL-1β als gering exprimiert. In dieser Situation ist die Transkription des Hexokinasegens nach sechs Stunden mit der initialen Transkriptionsstärke vergleichbar, während die Transkription der SOD1 tendenziell (p<0,063) stärker als zu Beginn des Experiments ist.

Die Abwesenheit von HIF-1α ist durch den normoxischen Zustand zu erklären. Dieser ermöglicht es den Prolylhydroxylasen, wie schon in der Einleitung zu diesem Transkriptionsfaktor (Abschnitt 1.4) beschrieben, das Protein zu hydroxylieren. Das so veränderte HIF-1α wird danach ubiquitiniert und proteasomal degradiert. Die Überlebensrate von 80% ist vermutlich auf das Vorhandensein von Glukose zurückzuführen. Die Rolle von Glukose ist nicht nur auf die eines energieliefernden Moleküls reduzierbar. Vielmehr ist sie über den pentoseliefernden Hexosemonophosphatweg an der Nukleotidbiosynthese und der Produktion von NADPH/H+ beteiligt. Dieses Molekül ist in der Lage, Glutathion-disulfid zu Glutathion zu reduzieren, und dadurch einen Schutz der Thiolgruppen von Membranproteinen vor der Oxidation durch Sauerstoffradikale zu garantieren.

Man kann vermuten, dass die Bereitstellung von Energie in Form von ATP, die Gewährleistung der Nukleotidbiosynthese und die Aufrechterhaltung des antioxidativen Status der Zellen zu dieser Überlebensrate führt. CD4+-Zellen nehmen in der HIV-Forschung als Wirtszellen für das HI-Virus einen wichtigen Stellenwert ein. Über die Rolle des Mangels an antioxidativen Substanzen und Enzymkomplexen und ihrer Korrelation mit der CD4+-T-Lymphozytendepletion in AIDS-Patienten gibt es jedoch bislang nur Hypothesen. Das Vorhandensein einer geringen Menge an Bcl-2 als anti-apoptotisches und antioxidatives Protein in CD4+-Lymphozyten von AIDS-Patienten, ein Rückgang der Apoptoserate unter Behandlung mit Antioxidantien sowie der Nachweis von makrophagenassoziierten pro-oxidativen und pro-apoptotischen Zytokinen lassen auf eine große Sensibilität der CD4+-Lymphozyten auf oxidativen Stress und eine Dysregulation unter AIDS schließen (58).

▼ 59 

Die starke Präsenz der proinflammatorischen Zytokine IL-2 und TNF-α sowie IL-6 und IL-8 ist auf die Stimulation der Zellen mit PMA und Ionomycin zurückzuführen. PMA wird hierbei als Analogon zum physiologisch wirksamen Diacylglycerol (DAG) eingesetzt und führt wie DAG selbst zu einer Aktivierung der Proteinkinase C.

Das Auftreten von IL-2 in großen Mengen lässt auf eine große TH1-Fraktion in der Zellsuspension schließen. Dies würde bedeuten, dass die naiven T-Lymphozyten unter Stimulation durch PMA und Ionomycin in einen vorwiegend IL-2 produzierenden Zustand polarisiert werden. Dies konnte durch Long et al. gezeigt werden (59).

Die Tatsache, dass IL-2 stimulationsbedingt hoch exprimiert wird, lässt sich durch folgenden Artikel von Dreikhausen et al. belegen. Dieser Gruppe ist es gelungen, zwischen der Aktivierung der Proteinkinase-C-β (PKC-β) und der Expression von IL-2 einen Zusammenhang herzustellen. Demzufolge ist die PKC-β für die Phosphorylierung der Jun-N-terminal-kinase (JNK) verantwortlich. Die JNK-Kaskade ihrerseits bewirkt die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors N-FAT und dessen Bindung an die Promotorregion des IL-2-Gens (60).

▼ 60 

Dies führt zu einer verstärkten Expression von IL-2. Diesen Mechanismus kann man auch für die in der vorliegenden Arbeit verwendeten CD4+-Zellen annehmen, da bei ihnen durch PMA-Stimulation die Proteinkinase-C verstärkt aktiv war.

Eine Abhängigkeit zwischen den Isoformen α und β der PKC und der Produktion von TNF-α sowie der PKC-zeta und IL-10 konnte durch Foey et al. demonstriert werden (61). Mit einer Suppressionsanalyse der IL-8 Expression wurde indirekt durch Na et al. gezeigt, dass PMA, als Aktivator der Proteinkinase-C für eine vermehrte Expression von IL-8 verantwortlich ist. Diese Gruppe untersuchte die Wirkung des Fungizids Radicicol auf die Expression von IL-8 durch Monozyten. Es zeigten sich eine Unterdrückung der p38 / ERK1 & 2 Signalkaskade und eine verminderte Bindung der PKC abhängigen Transkriptionsfaktoren NFκB und AP-1 in der Promotorregion des IL-8 Gens (62). Durch Schaerli et al. konnte gezeigt werden, dass CD4+-Lymphozyten aus peripherem Blut IL-8 exprimieren können (35). Kim et al. bestätigten die Aussage einer PKC-Abhängigkeit für TNF-α und stellten auch für IL-6 und IL-1β in Leukozyten aus peripherem Blut einen Einfluss der PKC auf die Expression dieser Zytokine fest. Diese Erkenntnisse gewannen sie aus Infektionsversuchen von peripheren Leukozyten mit Anaplasma phagocytophila, einem obligat intrazellulären Bakterium in Granulozyten, welches als Erreger der humanen granulozytären Ehrlichiose gilt (63).

Somit kann man schlussfolgern, dass die beobachtete Expression der Zytokine IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α und IL-10 infolge der Aktivierung der Proteinkinase C durch PMA eintritt und somit einen Stimulationseffekt darstellt. Es stellen sich nun die Fragen, inwieweit sich die Sauerstoffversorgung und das Angebot an Glukose auf (a) die Produktion von ATP, (b) das Überleben der Zellen und (c) die Expression der betrachteten Zytokine auswirken. Zunächst soll hierbei der Entzug von Sauerstoff, also die Auswirkungen einer hypoxischen Umgebung auf diese Zellfunktionen, betrachtet werden.

4.1.2 Auswirkungen von Hypoxie in glukosehaltigem Medium unter Stimulation

▼ 61 

Die Untersuchung des Zellverhaltens unter Hypoxie bei ausreichender Glukoseverfügbarkeit diente primär dazu, einen definierten Datensatz zu erhalten, der sich mit den anderen Situationen vergleichen lässt. Die beschriebene Situation mit Hypoxie, Stimulation und Glukoseversorgung kann in vivo als äußerst selten angenommen werden. Eine Entsprechung in vivo wäre der Zustand nach einer akuten Verschlusssymptomatik in einem Entzündungsgebiet. Je nach Verschlusslokalisation ergeben sich unterschiedliche Krankheitsbilder. Ist die Lungenstrombahn betroffen, handelt es sich um eine Lungenembolie mit akuter Rechtsherzbelastung, Atemnot und kompensatorischer Tachykardie, die bei fulminantem Verlauf mit einem Herzstillstand einhergehen kann. Ist jedoch das intracranielle Gefäßsystem betroffen, ergeben sich je nach Stromgebiet unterschiedliche neurologische Symptome. Physiologischerweise liegt eine Situation mit Hypoxie, ausreichender Glukoseversorgung und aktivierten Lymphozyten im Lymphknoten vor.

Aus den Experimenten ergibt sich für diese Situation folgendes Bild. Die stimulierten CD4+-Zellen zeigen eine Überlebensrate von 80 ± 10 %, welche vergleichbar mit dem in Abschnitt 4.1.1 besprochenen Zustand ist. Sie weisen nach sechsstündiger Inkubation einen ATP-Gehalt von 1,12 ± 0,39 nmol pro 107 Zellen auf, und liegen damit signifikant höher als unter normoxischen Bedingungen mit 0,85 ± 0,27 nmol pro 107 Zellen (p=0,031, n=6). Aus Abbildung 4 geht hervor, dass der ATP-Gehalt von in glukosehaltigem Medium inkubierten Zellen anfangs absinkt. Dies kann man als Folge des verstärkten Verbrauchs an ATP durch Stimulation interpretieren. Als Reaktion auf den verstärkten Verbrauch wird die Synthese von ATP durch Glykolyse und oxidative Phosphorylierung gesteigert. Diese Steigerung ist möglicherweise überschießend und führt zur Einstellung eines neuen ATP-Niveaus. Hypoxie könnte beispielsweise über die Stabilisierung des Transkriptionsfaktors HIF-1α Einfluss auf diese Veränderung haben, und führt möglicherweise zum beobachteten Unterschied. Ist HIF in vermehrtem Maße vorhanden, so werden die Enzyme der Glykolyse vermehrt exprimiert, was zu einer verstärkten glykolytischen ATP-Produktion führt. Durch Krauss et al. konnte an Thymozyten der Einfluss von Stimulation durch Con A, einem zur spezifischen Stimulation von Thymozyten häufig verwendeten Lectin, auf das Membranpotential der Mitochondrien gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass durch Stimulation der Thymozyten mit Con A die Atmungsrate zunächst anstieg, das mitochondriale Membranpotential bei Zugabe von höheren Konzentrationen jedoch abgesenkt wurde (64).

Da für die erhöhte Nachfrage nach ATP während der Stimulation die Aufrechterhaltung eines hohen Membranpotentials erforderlich ist, muss die ATP Synthese somit in verstärktem Maße durch die Glykolyse erfolgt sein. Stimulation bewirkt also nach der Beurteilung dieses Sachverhalts eine Präferenz der Glykolyse als ATP liefernden Stoffwechselweg. Diese Präferenz kann durch die Arbeit von Barnd et al. belegt werden. Diese Gruppe zeigte, dass in proliferierenden Rattenthymozyten, die in glukosehaltigem Medium inkubiert wurden, die ATP Produktion zu über 80 % durch Glykolyse realisiert wurde. Sie vermuteten, dass hierdurch die durch OXPHOS typische ROS-Entstehung vermieden wird (65). Hypoxie scheint sich auf diese Präferenz verstärkend auszuwirken. Welche Mechanismen hierfür eine Rolle spielen, ist noch unklar.

▼ 62 

Unter hypoxischen Bedingungen im Medium mit Glukose ist in den Zellen eine signifikante Menge des Transkriptionsfaktors HIF-1α nachweisbar. Sie zeigen eine hochgradige Expression von TNF-α und IL-2, eine mittelgradige von IL-10, IL-8, IL-6 und IL-1β und eine niedrige Expression von MCAF. Es ergibt sich eine der Normoxie vergleichbare Zytokinhierarchie. Unterschiede sind jedoch in der Expressionsstärke aller Zytokine nachweisbar. Bis auf TNF-α werden alle Zytokine auf einem signifikant höheren Niveau exprimiert. Hypoxie fördert demzufolge die Expression dieser Faktoren. Im Falle von IL-1β ist dies so stark, dass dieses Protein in der mittleren Expressionskategorie zu finden ist. Bei TNF-α zeigte sich im Gegensatz dazu eine signifikante Verringerung der Expressionsstärke unter Hypoxie. Für die Genexpression von Hexokinase ergab sich eine tendenzielle Transkriptionssteigerung gegenüber Normoxie, während die Transkription von SOD1 nicht signifikant durch Hypoxie beeinflusst wurde.

Unter diesen Bedingungen lassen sich Aussagen über die Sauerstoffverbrauchskinetik der Zellen treffen. Es zeigte sich eine kontinuierliche Atmung, wie in Abbildung 2 zu erkennen. Der Vergleich dieser Atmungskurven wird im nächsten Abschnitt behandelt. Aus dem Vergleich zwischen der eben behandelten hypoxischen Situation und den normoxischen Bedingungen des vorherigen Abschnittes ergeben sich folgende Fragen:

1.) Was ist die Ursache für die vergleichbare Überlebensrate unter hypoxischen und normoxischen Bedingungen?

▼ 63 

2.) Ist der beobachtete Hypoxieeinfluss auf die Expression der untersuchten Zytokine auch in anderen Situationen zu beobachten? Wenn dem so ist, welche Mechanismen liegen ihm zu Grunde? Gibt es eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors HIF-1α?

Ad 1.) Der Vergleich der Überlebensraten lässt vermuten, dass Glukose einen protektiven Einfluss auf die Lebensfunktionen der Zellen hat. Vermutlich ist dies auf die Bereitstellung von Synthesebausteinen für die Nukleotidsynthese und die Produktion von NADPH/H+ als Reduktionsmolekül für das Glutathionsystem zurückzuführen. Eine genauere Aussage lässt erst der Vergleich mit einer glukosefreien Umgebung zu, wo die Zellen in Abhängigkeit der Verfügbarkeit von Sauerstoff eine unterschiedliche Überlebensrate zeigen. Näheres hierzu wird im folgenden Abschnitt behandelt.

Ad 2.) Durch Naldini et al. konnte gezeigt werden, dass sich Hypoxie positiv auf die Expression von IL-2 auswirkt. Es wurde beobachtet, dass unter dem Einfluss einer 2%-igen Sauerstoffatmosphäre über 40 Stunden Inkubation eine erhöhte Expression von IL-2 und IL-4 durch PHA-stimulierte PBMCs erfolgte (66).Wang et al. konnten 2003 an Wistar Ratten mit hypoxischer pulmonaler Hypertension zeigen, dass die IL-6 Niveaus von Ratten unter Hypoxie zumindest auf der Ebene der mRNA gegenüber den normoxisch gehaltenen Vergleichstieren erhöht waren. Diese Gruppe stellt einen möglichen Zusammenhang der Hypoxiereaktion zur Familie der Januskinasen her, welche bei der Expressionssteigerung von IL-6 beteiligt sein könnten (67).Für IL-8 wurde durch Rydberg et al. eine hypoxiebedingte Expressionssteigerung durch Makrophagen festgestellt (68).Die Untersuchung von Plasmazytokinkonzentrationen von hypoxämischen C3H/HeN Mäusen zeigte eine Erhöhung des IL-10-, IL-6- und TNF-α-Spiegels unter Hypoxie. Interessanterweise waren hiervon nur männliche Mäuse betroffen. Die Gruppe um Knoferl vermutete eine höhere Toleranz weiblicher Mäuse dieses Stammes gegenüber Hypoxie (69). Die Verallgemeinerung der Daten aus den Mausexperimenten ist jedoch nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragbar. Man muss beachten, dass es sich bei den Versuchstieren um Individuen aus Inzuchtstämmen handelt, die durch ihre begrenzte Alleldiversität in ihren Zellfunktionen beeinträchtigt sein könnten.

▼ 64 

Zur hypoxischen Expressionssteigerung von IL-1β ist zurzeit für Leukozyten wenig bekannt.

Andere Zelltypen wie z.B. Mikrogliazellen reagieren den Untersuchungen von Kim et al. zu Folge mit einer Steigerung der Caspase-1 Aktivität über die Induktion von Caspase-11. Dadurch kommt es zu einer vermehrten Freisetzung von IL-1β(70).

Mikrogliazellen sind entwicklungsgeschichtlich mit den Makrophagen der Peripherie vergleichbar. Es könnte also sein, dass zumindest Makrophagen als Vertreter des peripheren Immunsystems ein ähnliches Verhaltensmuster aufweisen. Um die Expression von IL-1β durch T-Zellen beweisend zu klären, wäre es in Folgeexperimenten notwendig, eine intrazelluläre Färbung der CD4+-Zellen auf IL-1β durchzuführen und die Produktion im FACS nachzuweisen.

▼ 65 

Betrachtet man den Einfluss der Hypoxie auf die Expression von MCAF, so ist die Signifikanz dieser Erhöhung zwar gegeben, jedoch ist das Ausmaß der Expressionssteigerung eher unbedeutend. In der Literatur gibt es zu diesem Faktor die übereinstimmende Meinung, dass Hypoxie einen suppressiven Effekt auf seine Expression ausübt. Allerdings sind bisher nur Fibroblasten und Makrophagen untersucht worden (71, 72). Für CD4+-Zellen existieren bislang keine Daten zu diesem Zytokin.

Mit Ausnahme des Faktors MCAF unterstehen die untersuchten Zytokine einem Hypoxieeinfluss. Es handelt sich somit um eine universelle Erscheinung. Einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen liefert möglicherweise der Transkriptionsfaktor HIF-1α. Daher wurden mit Hilfe einer Analyse der Promotorregionen der Zytokingene potenzielle Bindungsstellen für das Heterodimer aus HIF-1α und HIF-1β oder ein anderes Heterodimer aus HIF-1β mit beispielsweise HIF-2α identifiziert. Eine Datenbankrecherche der 3kB-Promotorregionen all dieser Zytokingene ergab für IL-1β eine Bindungsstelle für das HIF-1α/HIF-1β Heterodimer. Für IL-2 ergaben sich vier, für IL-6 eine, für das HIF-1α- / HIF-1β- Heterodimer eine und eine weitere für ein anderes HIF-1β-Heterodimer, für IL-8 ergab sich eine mögliche Bindungsstelle für ein HIF-1β-Heterodimer, für IL-10 zeigten sich drei mögliche Bindungsstellen für ein HIF-1β-Heterodimer und eine Bindungsstelle für das HIF-1α- / HIF-1β-Heterodimer. Für TNF-α ergab sich eine mögliche Bindungsstelle für ein HIF-1β-Heterodimer. In der Promotorregion des Gens für MCAF fanden sich keine Bindungsstellen für HIF.

Die Ergebnisse der Datenbankanalyse weisen auf eine mögliche Beeinflussung der Gentranskription dieser Zytokingene durch HIF hin, sind jedoch nicht beweisend. Nicht jede mögliche Bindungsstelle in der Gendatenbank wird auch in vivo verwendet. Deshalb ist es in zukünftigen Experimenten notwendig, nach Beweisen für einen Zusammenhang zwischen HIF und der Transkription der behandelten Zytokine zu suchen. Hierzu bietet sich das folgende von Jeong et al. beschriebene Experiment an. Von dieser Gruppe wurden Mastzellen der Linie HMC-1 unter dem Einfluss von Desferrioxamin, einem Eisenchelator, unter Eisenmangel gesetzt. Dieser Mangel an Eisen verhindert den Abbau von HIF-1α über die Hemmung der Prolylhydroxylasen und es kommt folglich zu einer intrazellulären Konzentrationserhöhung von HIF-1α. Diese HIF-1α-Erhöhung führte nun in der untersuchten Zelllinie zu einer vermehrten Produktion von IL-6, IL-8 und TNF-α, welche sich durch die Zugabe von Eisen oder eines Hemmstoffes für NFκB unterdrücken ließ (73). Die Aussage von Jeong et al. zu TNF-α ist konträr zu den Beobachtungen der eigenen Experimente. Dies ist möglicherweise auf den verwendeten Zelltyp zurückzuführen. Für die anderen Zytokine existieren bisher keine direkt beweisenden Versuche, die einen funktionellen Zusammenhang rechtfertigen würden. Dies bedeutet, dass hier ein Ansatzpunkt für weitergehende Experimente gegeben ist, um die Verknüpfung zwischen HIF und IL-10, IL-1β oder MCAF zu beweisen. Als Startpunkt für ein solches Vorgehen bietet sich eine Chromatin-Immunpräzipitation an. Hierbei werden gegen das HIF-1α-/ HIF-1β-Dimer gerichtete Antikörper dazu verwendet, das Heterodimer mit der gebundenen DNA aus dem vorher durch Sonifizierung fragmentierten Erbgut zu isolieren. Im Anschluss daran wird das Heterodimer von der DNA getrennt. Man kann nun mit geeigneten Primern und einer PCR gezielt aus dem Fragmentgemisch das vermutete Gensegment amplifizieren. Ergibt sich ein Produkt gegenüber einer Negativkontrolle, welche mit einem Antikörper gegen ein HIF fremdes Epitop gewonnen wurde, ist dies ein Beweis für die Bindung von HIF an die HIF Bindungsstelle des identifizierten Gens. Die Bindung von HIF muss jedoch nicht direkt an einer HIF Bindungsstelle sein. Sie kann auch über eine Bindung an andere Transkriptionsfaktoren wie Jab-1 oder AP-1 erfolgen. Diese Interaktionsmöglichkeit mit anderen Transkriptionsfaktoren macht es unmöglich vorherzusagen, an welchen Transkriptionssteigerungen HIF indirekt beteiligt ist. Sichere Interaktionen lassen sich demnach nicht aus Datenbankrecherchen sondern nur experimentell ermitteln. Die Betrachtung der verstärkten Zytokinexpression in Folge der Wirkung von HIF-1α stellt nur eine mögliche Methode zur Beurteilung des Zusammenhangs zwischen HIF und den Zytokinen dar. Es gibt auch die Möglichkeit, dass Zytokine ihrerseits die Wirkung von HIF beeinflussen. Diese Art der Beeinflussung von HIF-1α ist durch einen Versuch von Jung et al. demonstriert worden. Die Gruppe konnte zeigen, dass die HIF-1-Signalkaskade durch die Gabe von IL-1β in A549-Zellen (Lungenepithelkarzinomzelllinie) insofern beeinflusst wurde, als dass die untersuchten Zellen mehr VEGF produzierten. Bei VEGF handelt es sich um ein Protein, welches, wie andere Forscher gezeigt haben, durch die Wirkung von HIF-1α vermehrt exprimiert wird. Der Wirkmechanismus von IL-1β auf HIF ist durch Jung et al. als eine Hemmung der Degradation dieses Transkriptionsfaktors beschrieben worden. Da IL-1β auch die Transkription von COX-2 verstärkte und die Gruppe zeigen konnte, dass Protaglandin E2 als Produkt dieses Enzyms die HIF-1α Wirkung dosisabhängig steigerte, sahen sie hierin einen weiteren Beweis für die positive Wirkung von IL-1β auf HIF-1α(74). Interessanterweise stellte die Gruppe mit ihrer Arbeit einen Zusammenhang zwischen einem proinflammatorischen Zytokin und den pathologischen Mechanismen dar, welche zur Tumorgenese und zur Versorgung von Tumorzellen mit Nährstoffen durch vermehrte Angiogenese beitragen.

▼ 66 

In Hep-G2-Zellen konnte durch Stiehl et al. eine vermehrte DNA-Bindung des HIF-Heterodimers in Folge einer IL-1β und Insulinwirkung gezeigt werden. Diese Bindung konnte durch Blockierung der PI3K Signalkaskade unterdrückt werden. Hier konnte die HIF-induzierte Expression von VEGF und EPO selbst unter Normoxie beobachtet werden (75).

Aus diesen Betrachtungen ergibt sich folgende Hypothese. Wenn, wie in den Versuchen gezeigt, die Expression von IL-1β durch Hypoxie in CD4+-Zellen gesteigert werden kann und IL-1seinerseits einen verstärkenden Einfluss auf die Wirkung von HIF hat, und wenn HIF wiederum die Expression von IL-1verstärkt, was für CD4+-Zellen noch zu beweisen wäre, dann ergibt sich dadurch ein positiver, sich selbst verstärkender Zyklus, der die Inflammation vorantreibt.

Ein Hinweis auf das Zutreffen dieser Hypothese kann der Versuch von Williams et al. sein. Diese Gruppe untersuchte die Wirkung von IL-1-Antagonisten auf das Krankheitsbild der kollageninduzierten Arthritis bei Mäusen. Sie zeigten, dass die Gabe von Anti-IL-1 den Ausbruch der Erkrankung verzögern konnte. Sie stellten außerdem einen Zusammenhang zwischen der IL-1-Konzentration und der Produktion von TNF-α her. Beide Zytokine schienen sich gegenseitig in ihrer Expression zu verstärken. Als wirksamsten therapeutischen Schritt zur kompletten Unterdrückung der IL-1 Expression im Gelenk fanden die Forscher eine Kombination aus einer anti-TNF-α - und einer anti-CD4 +-Therapie (76).

▼ 67 

Dies beweist, dass die IL-1 Expression durch CD4+-Lymphozyten und durch die TNF-α-Konzentration beeinflusst wird. Klinische Versuche mit IL-1 Rezeptorantagonisten haben bisher eine Verbesserung des Krankheitsbildes gezeigt. Hierbei ist die Multicenterstudie von Bresnihan et al. zu nennen. Es konnte in einem Zeitraum von 24 Wochen unter Therapie mit einem IL-1-Rezeptorantagonisten versus Placebo an über 400 Patienten mit RA eine Verbesserung des Krankheitsbildes in 44% der Fälle gezeigt werden (77).

Sollte sich die aufgestellte Hypothese über die Selbstverstärkung von IL-1 unter Hypoxie bestätigen, so bietet eine Behandlung, die auf die Unterdrückung dieses Effektes abzielt eine Möglichkeit, das Voranschreiten der Erkrankung zu verhindern. Als Beispiel einer solchen Therapie ist hier die Behandlung mit IL-1-Rezeptoragonisten zu nennen.

Nach der Diskussion über die Auswirkungen von Hypoxie auf die Zellen unter Verfügbarkeit von Glukose stellt sich nun die Frage, wie die Zellen auf einen Mangel dieses Moleküls reagieren. Diese soll in den folgenden zwei Abschnitten diskutiert werden. Zuerst wird die Situation unter freier Sauerstoffverfügbarkeit demonstriert und ausgewertet. Dem soll sich das Verhalten der Zellen unter Hypoxie anschließen.

4.1.3  Auswirkungen von Glukosemangel unter Normoxie

▼ 68 

Die Betrachtungen zur Situation unter Normoxie bei Glukosemangel bieten sich als Kontrollparameter für den Zustand unter Hypoxie und Glukosemangel an, der in gewissen pathologischen Situationen möglich ist. Es soll nun erläutert werden, wie sich der Glukosemangel auf die Normoxiesituation auswirkt.

Erwartungsgemäß ist HIF-1α unter Normoxie auch bei Glukosemangel nicht nachweisbar. Die Zellen zeigen eine sehr geringe Überlebensrate von lediglich 30 ± 22,6 % (n=8) und unterscheiden sich damit signifikant von der glukosereichen Situation. Dies ist ein Beweis der Protektionswirkung von Glukose auf die Zellfunktionen, wie im vorherigen Abschnitt erläutert. Betrachtet man die Entwicklung der ATP-Niveaus unter Normoxie bei Glukosemangel über den Zeitraum des experimentellen Ablaufes, so kann man ein signifikantes, graduelles Absinken des ATP-Vorrats beobachten. Da die ATP-Messwerte auf die Zellzahl normiert sind, ist dieses Absinken durch die hohe Mortalität und die daraus resultierende Zellzahlreduktion nicht zu erklären. Vielmehr stellt sich hier eine Situation dar, in welcher in der einzelnen Zelle das ATP-Niveau absinkt.

Bei der Interpretation dieser Daten muss berücksichtigt werden, dass man von der ATP-Menge nicht automatisch auf die Synthese oder den Verbrauch schließen kann. Das ATP-Niveau ist das Netto-Resultat, das sich aus Produktion und Verbrauch ergibt. Ein Absinken kann daher aus einer verminderten Produktion und / oder einem erhöhten Verbrauch resultieren. Im nächsten Abschnitt (4.1.4) bei der Betrachtung der Hypoxie wird noch einmal genauer auf dieses Thema eingegangen.

▼ 69 

Auf die Frage, wie sich der Glukoseentzug auf das Zytokinprofil auswirkt, geben die Abbildungen 17a und 17b Antwort. Es ergibt sich folgendes Bild. Während, wie unter glukosehaltigen Bedingungen auch, TNF-α und IL-2 hochgradig exprimiert sind, zeigen sich IL-8 und IL-6 als mittel- und IL-10, MCAF und IL-1β als geringgradig exprimiert (Abbildung 17a). Betrachtet man in Abbildung 17b den Einfluss der Glukose auf die Expression der Zytokine, so fällt auf, dass IL-10 als stark reguliertes Protein auftritt, gefolgt von IL-2 und TNF-α.

Man muss klären, ob dieser Einfluss von Glukose auch durch andere Forscher beobachtet werden konnte und ob es ein Erklärungsmodell für diese Beobachtung gibt.

Hier lassen sich die Messungen der Gruppe um Jeschke als Hinweis auf eine Existenz dieser Beobachtungen in vivo anführen. Jeschke et al. untersuchten, wie die Gabe von Insulin das Serumzytokinprofil verändert. Man hatte beobachtet, dass Patienten mit septischem Schock unter Insulingabe ein besseres Überleben aufzeigten. Die Gruppe beobachtete bei mit Endotoxin behandelten Ratten einen insulinbedingten Anstieg der Zytokine IL-4, IL-2, TNF-α, IL-10, IL-1β und IL-6. Da man nach Insulingabe jedoch keine signifikante Änderung des Plasmaglukosespiegels feststellen konnte, schrieb die Gruppe dem Insulin eine spezifische Beeinflussung der Zytokintranskription zu und schloss eine Wirkung über den Glukosestoffwechsel aus (78).

▼ 70 

Die Ergebnisse der in dieser Arbeit vorliegenden Zytokinmessungen an CD4+-Zellen lassen jedoch auch eine andere Theorie zu. Insulin wirkt über die Beeinflussung von GLUT-4 Transportern auf die Glukoseaufnahme durch die Zellen. Nimmt man an, dass dieser Mechanismus auch für CD4+-Zellen gilt, ermöglicht die Gabe von Insulin den Zellen eine bessere intrazelluläre Verfügbarkeit von Glukose. Damit ist nicht auszuschließen, dass neben einer spezifischen Wirkung von Insulin auf die Zytokinsynthese eine unspezifische über die Verbesserung der Glukoseverfügbarkeit besteht.

Das Enzym Glukose-6-phosphatdehydrogenase dient dem Hexosemonophosphatweg als Eingangsenzym. Liese et al. wollten mit ihrem Versuch die Frage beantworten, warum Patienten mit einem Mangel des Enzyms eine stärkere inflammatorische Antwort auf Traumen zeigten als Traumapatienten mit intaktem Enzym. Sie verglichen unter anderem die IL-10-Produktion beider Gruppen durch PMA-Stimulation der Monozyten in vitro und fanden ein signifikant niedrigeres IL-10-Niveau bei Patienten mit dem Enzymdefekt. Dieses war auf 10% abgesunken. Daraus schlossen sie auf einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Enzymdefekt und der starken Immunantwort durch einen niedrigen IL-10-Spiegel (79). Mit diesem Versuch bewiesen Liese et al. jedoch auch einen relevanten Einfluss des Hexosemonophosphatweges mit der Glukose-6-phosphatdehydrogenase als wichtigem Enzym auf die Produktion von IL-10. Da der Enzymdefekt genetisch bedingt ist, liegt er in allen Zellen vor und sollte sich demnach auch in CD4+-Zellen dieser Individuen zeigen.

Eine andere Gruppe um Kuga konnte zeigen, dass IL-10 in humanen Monozyten die Expression von NADPH-Oxidase, einem Enzym, welches für die Superoxidanion-Synthese verantwortlich ist, senkt und sich somit negativ auf den respiratorischen Burst auswirkt(80).

▼ 71 

Man kann zusammenfassen, dass IL-10 (a) in Anwesenheit von Glukose verstärkt exprimiert wird, (b) für diese Expressionssteigerung eine funktionstüchtige G-6-PDH benötigt und (c) die Generierung von Sauerstoffradikalen durch Monozyten hemmt. Hieraus resultiert eine weitere mögliche Erklärung für die hohe Mortalität der CD4+-Zellen unter Normoxie bei Glukosemangel. Da Glukose die IL-10 Expression verstärkt, ergibt sich durch den oben beschriebenen Effekt eine Senkung der Superoxidanionen-Konzentration in der Zelle. Fehlt Glukose, sind die Zellen gezwungen ihre Energie aus der oxidativen Phosphorylierung zu gewinnen. Hierbei produzieren sie vermehrt ROS, also auch Superoxid-Anionen, welche die Membran schädigen. Wird in Folge des Glukosemangels weniger IL-10 gebildet, kann der membranschädigenden Wirkung der Radikale nichts entgegengesetzt werden und die Zellen sterben ab.

Es bietet sich in Folgeexperimenten an, diesem Effekt nachzugehen. Durch die Zugabe von rekombinantem IL-10 zu den unter Glukosemangel inkubierten CD4+-Zellen könnte man den Einfluss dieses Zytokins auf das Zellüberleben charakterisieren. Superoxiddismutase-1 (SOD) dient als ein wichtiges Enzym im Radikalstoffwechsel. Es konnte beobachtet werden, dass unter den Bedingungen des Glukose- und Sauerstoffmangels die Gentranskription dieses Enzyms verstärkt wurde. Nähere Erläuterungen hierzu sind im Abschnitt 4.2.2 zu finden.

Die Situation unter Normoxie und Glukosemangel ist unphysiologisch, da ein Mangel an Glukose nur in Extremsituationen auftritt. Anders verhält es sich jedoch, wenn zum Glukosemangel ein Sauerstoffmangel hinzukommt. Dieser Umstand soll im folgenden Abschnitt diskutiert werden.

4.1.4  Verhalten bei Glukosemangel und Hypoxie

▼ 72 

Ein Zustand, bei dem Glukose fehlt und Sauerstoff begrenzt oder nicht verfügbar ist, findet sich in Gewebegebieten mit chronischer Ischämie. Hierzu zählt auch das Pannusgewebe bei RA, in welchem bedingt durch die Gelenkschwellung ein relativer Mangel an Glukose und Sauerstoff besteht. Es stellt sich die Frage, wie sich CD4+-Zellen unter diesen Bedingungen verhalten.

Unter den genannten Umständen lässt sich in Folge der Hypoxie HIF-1 nachweisen. Die Zellen zeigten eine ähnliche Überlebensrate von 73 % ± 11 % wie bei freier Glukoseverfügbarkeit. Dies beweist abermals die schädigende Wirkung von Sauerstoff auf das Zellüberleben. Ein anderer Grund für diese hohe Überlebensrate könnte in der Anwesenheit von HIF-1 liegen. Walmsley et al. konnten jüngst zeigen, dass die Induktion von HIF-1 in peripheren humanen neutrophilen Zellen durch Eisenchelatoren oder Hypoxie zu einer Unterdrückung der Apoptose führte. An myeloiden Zellen eines HIF-1 konditionellen Knock-out-Mausmodells zeigte sich eine hohe Apoptoserate unter Hypoxie. Durch weitere Untersuchungen führten sie diesen Effekt auf die HIF-1 abhängige Aktivität von NFκB zurück (81). Den gleichen anti-apoptotischen Effekt könnte die Anwesenheit von HIF-1 bei CD4+-Zellen auslösen und somit das gute Überleben im Experiment erklären. Vergleicht man die Atmungskurve unter Glukosemangel mit der bei Glukoseverfügbarkeit aus Abbildung 2, so sieht man nicht mehr eine konstante Atmungsrate. Die Zellen weisen besonders im Bereich zwischen 80 und 150 Minuten eine stärkere Atmung auf, um dann schneller in die Anoxiephase überzugehen. Aus lässt sich entnehmen, dass die Unterschiede in der Atmungsrate sich besonders bei einer Sauerstoffsättigung zwischen 10 % und 40 % bemerkbar machten. Aus einer Zusammenfassung der beiden und über die Berechnung der Clearance lässt sich erklären, wie die Zellen dem verstärkten Energiemangel begegnen. Ein Vergleich der Clearanceraten in zwischen den Bedingungen mit Glukose und ohne Glukose veranschaulicht die Steigerung der Extraktionsleistung der Zellen unter Glukosemangel ab einer Sättigung von 40 % und darunter. In dieser Situation gibt es für die Zellen aus Mangel an Glukose nur die gesteigerte Extraktion von Sauerstoff aus dem Medium zur verstärkten Energiegewinnung über die OXPHOS, während die Zellen im glukosehaltigen Medium die Glykolyse als zusätzlichen Weg zur Energiegewinnung verwenden. Das Verhalten bei Glukosemangel zeigt, dass die Zellen grundsätzlich in der Lage sind, diese Leistungssteigerung zu erbringen.

Das ATP-Niveau der Zellen präsentiert sich unter Hypoxie ähnlich wie unter Normoxie nach sechs Stunden Inkubation (0,19 ± 0,18 nmol ATP pro 107Zellen). Somit scheint die Verfügbarkeit von Sauerstoff auf die Bilanz zwischen ATP-Produktion und ATP-Verbrauch weniger Einfluss zu haben als die Verfügbarkeit von Glukose. Glukose steigert den ATP-Gehalt der Zellen. Diese Steigerung des ATP-Niveaus kann hypothetisch Konsequenzen für die Reaktion auf Glukokortikoidgabe haben. Es ist bekannt, dass hohe ATP-Niveaus zu einer besseren inhibitorischen Wirkung von Glukokortikoiden auf die Immunantwort führen (82).Hierbei ist die höhere Apoptoserate von mit Dexamethason behandelten Thymozyten zu erwähnen. Lässt sich diese Beobachtung verallgemeinern, so ergibt sich die Frage, ob in Geweben mit chronischer Ischämie eine effektive Wirkung von Glukokortikoiden möglich ist. Ist möglicherweise, durch den niedrigen ATP-Spiegel bedingt, eine höhere Dosis an Glukokortikoiden zur Einleitung einer Apoptose der autoreaktiven Immunzellen notwendig?

▼ 73 

Widmet man sich dem Zytokinprofil unter Hypoxie und Glukosemangel, so erkennt man die schon bei den anderen Zuständen beobachtete Hierarchie. Hierbei sind IL-2 und TNF-α hoch exprimiert, während sich IL-8, IL-6 und IL-10 im Mittelfeld befinden und die Expression von IL-1 und MCAF niedrig ist. Betrachtet man die Auswirkung von Hypoxie auf die Zytokinexpression, wie sie in Abbildung 15 dargestellt ist, dann fällt auf, dass IL-1 und IL-10 stark und IL-8 und IL-2 mäßig beeinflusst sind. TNF-α präsentiert sich im Gegensatz zur Situation mit Glukose als positiv durch Hypoxie reguliert. Man kann also für TNF-α eine Situation beobachten, bei der der Einfluss von Glukose die Expressionsverhältnisse ins Gegenteil verkehrt. Es findet sich unter Normoxie wie unter Hypoxie eine starke Beeinflussung der IL-10-Produktion durch Glukose. Dies rechtfertigt eine weitergehende Untersuchung von IL-10 in zukünftigen Experimenten.

Man kann aus den vorliegenden Daten schließen, dass die gemessenen Zytokine durch die Präsenz von Glukose vermehrt exprimiert werden. Dies ist wahrscheinlich durch die anabole Wirkung von Glukose über den Pentosephosphatweg zu erklären. Es könnten jedoch auch sensitive Bindungsstellen in der Promotorregion dieser Zytokingene existieren, die durch die Wirkung von Glukose oder anderer von ihr abhängiger Stoffwechselprodukte aktiviert werden. Hypoxie hat auf die Expressionssteigerung in den meisten Fällen einen verstärkenden Effekt. Somit ist die Unterhaltung des proinflammatorischen Status der CD4+-Zellen von den beiden Faktoren Glukoseverfügbarkeit und Hypoxie abhängig.

4.1.5  Ausblick

Alle Beobachtungen in dieser Arbeit basieren auf Daten von Normalspendern. Es stellt sich nun die Frage, ob sich die CD4+-Zellen bei Krankheitsbildern wie Rheumatoider Arthritis anders verhalten. Es wurde bei den hier vorgestellten Experimenten ein großer Einfluss von Hypoxie auf die Expression von IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α und IL-10 gezeigt. Daher ergibt sich die Frage, ob dies unter pathologischen Bedingungen auch der Fall ist. Die erwähnten Zytokine spielen besonders bei RA-Patienten, aber auch im folgenden Mausmodell, eine wichtige Rolle.

▼ 74 

Das SKG Mausmodell zur Simulation von einem Krankheitsbild bei Mäusen ähnlich dem humanen Krankheitsbild der Rheumatoiden Arthritis beruht auf einer Mutation im ZAP-70 Gen, welches für die positive und negative Selektion von CD4+-T-Lymphozyten im Thymus während ihrer Reifung verantwortlich ist. Durch Verlust dieser Selektionsfähigkeit werden zufällig entstandene autoreaktive T-Lymphozyten nicht mehr aussortiert und persistieren im Organismus. Der Phänotyp dieser Mäuse zeichnet sich durch typische Zeichen der Rheumatoiden Arthritis aus. Hierzu zählen Schwellungen der kleinen und später der großen Gelenke mit histologisch eindeutiger Synovitis, Pannusbildung und Knorpel-Knocheninvasion durch Immunzellen mit nachfolgender Zerstörung, hohen Titern von Rheumafaktoren IgM und IgG mit Spezifität für Kollagen II (IgG) und extraartikulären rheumaknotenähnlichen Strukturen. Als Begleitphänomen treten interstitielle Pneumonitiden und Vaskulitiden auf.

Ein Transfer der CD4+-T-Lymphozyten dieses Mäusestammes auf SKG-Mäuse mit BALB/c Background, BALB/c Mäuse ohne eigene funktionelle T-Lymphozyten oder SCID Mäuse ohne eigene T- und B-Lymphozyten, induziert bei diesen die oben beschriebenen Symptome. Es kann davon ausgegangen werden, dass CD4+-T-Zellen als Hauptmediatoren dieses Krankheitsbildes wirken. Sakaguchi et al. zeigten unter anderem, dass in der Synovialflüssigkeit von 32 Wochen alten SKG Mäusen mit schwerwiegenden Gelenkschwellungen hohe Mengen an IL-1β, IL-6 und TNF-α vorlagen, während sich im Serum von 20% der Mäuse nur IL-6 in signifikanten Mengen nachweisen ließ. Immunhistochemisch wurden zwei Zellpopulationen entdeckt, wovon erstere IL-1β und TNF-α exprimierte und in der der Gelenkhöhle zugewandten Zellschicht der Synovialmembran zu finden war. Die andere bestand aus IL-6 produzierenden Zellen, welche unter dieser Schicht diffus verteilt waren. Um nun den Einfluss der Zytokine IL-1α und β, IL-6 und TNF-α zu untersuchen, wurden IL6-/-, IL1α/β -/- und TNF-/- und IL10-/-Mäuse gezüchtet. Bei den IL-6 defizienten Mäusen zeigten sich keinerlei Symptome einer Arthritis oder interstitiellen Pneumonie, was diesem Faktor einen sehr wichtigen Stellenwert in der Unterhaltung dieses Krankheitsbildes einräumt. Bei den IL1-/- Mäusen zeigte sich eine bei weitem mildere Verlaufsform der Erkrankung mit nur 60% betroffenen Tieren und einer durchschnittlichen Schwellung von nur zwei Gelenken. Bei TNF-α defizienten Mäusen zeigte sich eine Inzidenz von nur 20% und eine ebenfalls mildere Verlaufsform der Arthritis. IL-10 defiziente Mäuse waren allgemein schwerer betroffen als die in ihrer Zytokinexpression unveränderte Vergleichsgruppe. Dies belegt einen anti-inflammatorischen Effekt durch IL-10 bei dieser Erkrankung. Alle heterozygoten Tiere zeigten mittlere Symptomstärke, so dass auf eine Abhängigkeit der Gendosis auf diese Effekte geschlossen werden kann. Auch die Rolle der Rheumafaktoren wurde von Sakaguchi et al. untersucht. Man stellte bei den zytokindefizienten Mäusen wie bei den Vergleichstieren vergleichbare Titer von IgM-RF fest, während die Präsenz von IgG-RF für Kollagen Typ II nur bei den Tieren mit Synovitis auftrat. Somit scheint IgG-RF für Kollagen II entweder als Ursache oder als Folge der Synovitis aufzutreten (83).

An diesem Modell lässt sich die Relevanz der untersuchten Zytokine für das Krankheitsbild der Rheumatoiden Arthritis belegen. Inwieweit dieses Modell auf den Menschen übertragbar ist, wird sich in Experimenten und klinischen Studien zeigen.

▼ 75 

In Fortsetzung der Arbeiten zu dieser Dissertation ist eine Versuchsreihe mit T-Lymphozyten von RA-Patienten geplant. Diesen neuen Untersuchungen könnten ein abweichendes Verhalten der CD4+-Zellen aufdecken. Hieraus ergäben sich Ansatzpunkte welchen Stoffwechselweg man beeinflussen könnte, um den inflammatorischen Circulus vitiosus, der das Wesen der RA ausmacht, zu durchbrechen. Ansätze hierzu sind mit der Therapie mit Anti-TNF-α und den IL-1-Rezeptorantagonisten schon vorhanden. Möglicherweise ergeben sich durch weitere Forschungen in dieser Richtung spezifischere und ökonomischere Therapiemöglichkeiten.

4.2 Regulation der Expression von Zielgenen

Zur Untersuchung der Wirkung von Hypoxie- und Glukosemangel auf die Genexpression von ausgewählten Zielgenen wurde sich in dieser Arbeit bewusst auf jeweils einen Vertreter zweier bedeutsamer Stoffwechselwege festgelegt, weil diese in den entsprechenden Stoffwechselwegen von entscheidender Bedeutung sind. Zum einen ist dies die Superoxiddismutase-1 als Vertreter des Radikalstoffwechsels der Lymphozyten und zum anderen die Hexokinase als Schlüsselenzym der Glykolyse, wobei hier alle fünf existierenden Transkriptvarianten für die mRNA dieses Enzyms zusammengefasst wurden. Mit dieser Untersuchung sollte geklärt werden, wie sich die Expression dieser wichtigen Schlüsselenzyme unter den verschiedenen Bedingungen verhält. Hexokinase ist ein stark reguliertes Schlüsselenzym der Glykolyse. Seine Expression ist möglicherweise durch die Wirkung des Transkriptionsfaktors HIF-1 beeinflusst. Die Beeinflussung der Expression von SOD1 als ein wichtiges Enzym des Radikalstoffwechsels sollte Aufschluss über mögliche Zellschädigungen geben, die das Zellüberleben und die Zellfunktion beeinflussen.

4.2.1  Hexokinase (Typ 1)

In Abbildung 18 erkennt man deutlich die Erhöhung der Transkription des Hexokinasegens unter Hypoxie, jedoch nur, wenn Glukose im Medium vorhanden ist. Diese Erhöhung (Faktor 3.2 gegenüber glukosefreier Hypoxie bzw. Faktor 4 gegenüber Ausgangsexpression) ist auf die gesteigerte Anforderung an die Glykolyse zur Energiebereitstellung zurückzuführen.

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Die Fähigkeit dieser Expressionssteigerung lässt den Schluss zu, dass die Transkription des Hexokinasegens durch den Glukosegehalt im Medium reguliert wird. Das alleinige Vorhandensein von Glukose reicht jedoch nicht für die Transkriptionssteigerung aus, wie man unter Normoxiebedingungen beobachten kann. Zusätzlich muss, um Energie aus dem anaeroben Glukosestoffwechsel zu gewinnen, die Bedingung der Hypoxie erfüllt sein. Nur wenn die Notwendigkeit (Hypoxie) und die Möglichkeit (Glukoseanwesenheit) zur gesteigerten ATP-Synthese durch die Glykolyse vorhanden sind, dann wird die Transkription des Hexokinasegens gesteigert. Also muss es für diese Anpassungen auch einen Sensor- und einen Regulationsmechanismus geben.

Für die Regulation der Transkription unter Hypoxie käme das in Abschnitt 1.3 beschriebene HIF-1 Protein in Frage. Eine Promotorstudie auf Basis der Genomatix Software (www.genomatix.de) der Transkriptionsvariante 1 des Hexokinasegens (NM_00188), welche sich bis zu 3 Kilobasen vor den Transkriptionsstart erstreckt, ergibt 3 potentielle Bindungsstellen für HIF-1β-Heterodimere und eine Bindungsstelle für den HIF-1α-/HIF-1β-Komplex. Eine Bindung von HIF-1 in der Promotorregion des Hexokinasegens und somit ein Einfluss auf die Transkription dieses Gens ist laut Genanalyse möglich. Das Vorhandensein von HIF-1 Protein im Zellkern durch die beiden im Vorfeld erwähnten zur HIF-Stabilisierung möglichen Mechanismen (Hypoxie und / oder TNF-α-Stimulation) ist somit als möglicher Hypoxieregulator der Zelle anzusehen.

Durch Yasuda et al. konnte für Leberzellkarzinomzellen gezeigt werden, dass eine erhöhte HIF-1α-Konzentration in der Zelle für eine verstärkte Expression von Hexokinase II sorgt (84). Warum CD4+-Zellen in der Lage sind nur bei Hypoxie und Anwesenheit von Glukose im Medium die Transkription von Hexokinase zu steigern, ist schwierig zu erklären. Möglicherweise ist hier auch eine Akkumulation von 5´-AMP (5´-Adenosin-Monophosphat) als Ursache für eine verstärkte Hexokinasetranskription zu sehen. 5´-AMP wirkt als Aktivator der 5´-AMP Kinase. Dieses Enzym ist in Muskelzellen dafür bekannt, die Expression von Hexokinase und GLUT-4 Transportern zu steigern. Somit würde ein Energiemangel, welcher sich durch den Anstieg von AMP auszeichnen würde, zu einer Aktivierung der Glykolyse und der Glukoseaufnahme führen (85). Wenn 5´AMP unter Hypoxie verstärkt anfällt, würde es nur in dieser Situation zu einem Anstieg der Transkription des Hexokinasegens kommen.

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Die folgende Promotoranalyse gibt nur einen Hinweis auf den Zusammenhang zwischen der Transkriptionsregulation des Hexokinasegens und HIF-1 Wirkung. Es bietet sich im Anschluss zur Verifikation eine Chromatin-Immunpräzipitation an. Der experimentelle Ablauf hierzu ist in Abschnitt 4.1.2beschrieben worden.

Die Analyse der Promotorregionen der anderen, im Anschluss an Abbildung 20 näher beschriebenen Transkriptionsvarianten von Hexokinase, ergibt, dass für einen möglichen Regulationsmechanismus durch Bindung von HIF-1 an Bindungsstellen im Promotorbereich nur noch die Variante 2 (NM_033496) in Frage kommt. Im Bereich von 3kB vor dem Transkriptionsstart existieren noch zwei Bindungsstellen für das HIF-1α-/HIF-1β-Heterodimere. Untersucht man die Promotorregion im Bereich um 3kB vor den Varianten 3, 4 und 5(NM_033497; -498; -500) so findet sich weder eine Bindungsstelle für HIF1β-Heterodimere noch für HIF-1α-/HIF-1β-Heterodimere. Dies lässt vermuten, dass diese Varianten von Hexokinase bei der Regulation unter Hypoxie durch HIF-1 keine Rolle spielen. Allerdings ist hier ein experimenteller Beweis nötig. Es ist zukünftig notwendig, nicht wie im Ansatz dieser Dissertation ein Primerpaar für die Gesamtheit aller Transkriptionsvarianten zu verwenden, sondern für jede einzelne ein spezifisches Primerpaar zu konstruieren, und die cDNA-Proben der vorliegenden Experimente nochmals auf die Expression der einzelnen Transkriptvarianten zu untersuchen. Bestätigt sich dann die Hypothese, dass Variante 1 und 2 die vorherrschend exprimierten Transkriptionsprodukte unter Hypoxie darstellen, so stellt dies ein sehr energiesparendes und auf eine schnelle Reaktion ausgelegtes Konzept dar. Während nämlich bei Aktivierung der Transkription von Variante 1 nur 83kb in hnRNA transkribiert werden müssen, sind es bei Variante 2 schon 86kb und bei den Varianten 3 bis 5 knapp je 132 kB. Interessant ist auch, dass sich innerhalb der 3kB, um die Variante 2 länger ist als Variante 1, drei Bindungsstellen für HIF1β-Heterodimere und eine Bindungsstelle für das HIF-1α-/HIF-1β-Heterodimer befinden. Aus der vorausgegangenen Betrachtung lässt sich die Vermutung ableiten, dass HIF konzentrationsabhängig die Expression dieser beiden Transkriptvarianten reguliert.

In folgender Abbildung sind die Lokalisationen der einzelnen Transkriptionsvarianten auf Chromosom 10 dargestellt. Man kann den Längenunterschied zwischen ihnen erkennen.

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Abbildung 20 Darstellung der Transkriptionsvarianten für das Hexokinase 1 Gen auf Chromosom 10 (Variante 1 NM_000188; Variante 2 NM_033496; Variante 3 NM_033497; Variante 4 NM_033498; Variante 5 NM_033500) und ihrer relativen Positionen zueinander (erstellt über UCSC-Genome)

Die fünf Varianten unterscheiden sich wie folgt. Das Produkt von Variante 1 kommt ubiquitär in allen Zelltypen vor und zeigt N-terminal eine Porinbindungsdomäne (PBD), worin es sich zu allen anderen Varianten unterscheidet. Diese Bindungsdomäne ermöglicht es dem Enzym, auf der Mitochondrienmembran zu binden. Ein Defekt dieser Variante führt zu nicht sphärozytischer hämolytischer Anämie. Während die anderen Formen aus Mangel an dieser Porinbindungsdomäne frei im Zytosol vorkommen, ist die Hexokinase 1 (Variante 1) mit der Mitochondrienmembran assoziiert.

Variante 2 ist vorwiegend in Zellen der erythroiden Reihe zu finden, wo sie besonders in der Entwicklung zu RBCs aus Progenitorzellen aktiv ist, während die Varianten 3 bis 5 viele testisspezifische N-terminale Bindungsdomänen aufweisen. Demzufolge ist die Zunahme an Länge der Transkriptionsvarianten mit einer verstärkten Gewebespezifität assoziiert (86, 87).

4.2.2 Superoxiddismutase-1 (Cu/Zn)

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Das Enzym Superoxiddismutase-1 spielt eine wichtige Rolle im Radikalstoffwechsel. Wie im Vorfeld schon beschrieben dient die Betrachtung dieses Enzyms dazu, die mögliche Reaktion der Zellen auf Unterschiede im Nährstoffangebot und im Energiestoffwechsel und der damit einhergehenden Änderung der Radikalentstehung einzuschätzen. Es gibt zwei Formen der SOD, die sich evolutionär getrennt voneinander entwickelt haben und sogenannte funktionelle Analoga bilden. Zum einen ist dies die Kupfer/Zink abhängige Form des Enzyms mit ihrer Genlokalisation auf dem p-Arm des Chromosoms 21 (21p22.1), zum anderen ist es die Mangan abhängige Analogform, welche ihren Genlokus auf dem q-Arm von Chromosom 6 hat (6q25.2). Zusätzlich zu diesen beiden Formen ist noch eine dritte unter dem Namen SOD3 bekannt, welche durch den Genlokus auf dem p-Arm des Chromosoms 4 (4p15.3-15.1) kodiert wird. Während SOD1 im Zytoplasma vorkommt, findet man SOD2 mitochondrial und SOD3 extrazellulär. Die von allen drei Enzymtypen katalysierte Reaktion dient der Umwandlung von Superoxidradikalen in Wasserstoffperoxyd, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Mutationen im SOD1 Gen werden in Verbindung mit der Pathogenese von amyotropher Lateralsklerose bei 15-20% der betroffenen Personen gebracht.

Ackerman et al. präsentierten in einem Fallbericht einen Jungen mit partieller Monosomie 21, welche den Genlokus für SOD1 einschloss. Dieser Patient zeigte eine nur 40%ige Aktivität der SOD1. Durch Hyperventilation mit 100% Sauerstoff während einer Narkosesituationen war er von oxidativen Lungenschäden schwerer betroffen als durch eine Ventilation mit 30%igem Sauerstoffanteil. Er zeigte eine Enzymaktivität der Cu/Zn-SOD von nur 45% im Vergleich zu disomen gleichaltrigen Kindern. Daraus schlossen die Forscher, dass durch Monosomie 21 betroffene Individuen anfälliger für Lungenschäden sind, die durch einen zu hohen Sauerstoffanteil verursacht sind. Ihr Umkehrschluss, dass trisome Patienten besser auf Hyperventilationsstress reagieren können, blieb jedoch nur theoretisch formuliert (88).

Aus der Lokalisation auf Chromosom 21 und aus der nachgewiesenen gesteigerten Aktivität der SOD1 bei Trisomie 21 Patienten ließe sich hypothetisch ableiten, dass diese Individuen einen Vorteil in Bezug auf den Abbau von Superoxidradikalen haben, und somit einen besseren Schutz der Zellmembranen vor Lipidperoxidation gegenüber dem disomen Individuum zeigen. Erstaunlicherweise ist dies nicht der Fall. Die Gründe hierfür sind noch unklar, es existieren jedoch Hypothesen, inwieweit alternative Radikalstoffwechselwege zu diesen Schädigungen beitragen. Im Folgenden sind diese näher beschrieben:

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1. Hypothese: Das Cu/Zn-SOD-Enzym existiert in zwei Zuständen, einem oxidierten (Cu(II)/Zn-SOD) und einem reduzierten Zustand (Cu(I)/Zn-SOD). Während der oxidierte Zustand die Reaktion von Superoxidradikalen zu Sauerstoffmolekülen begünstigt, ist die zweite Form in der Förderung der Reaktion von Superoxidradikalen zu Wasserstoffperoxyd aktiv. Somit ergeben sich zwei, dem Oxidationsstatus der Zelle angepasste Reaktionswege für das Superoxidradikal:

Eine Verlagerung des SOD Zyklus könnte zu einer vermehrten Bildung von Wasserstoffperoxyd führen. Dies konnte experimentell gezeigt werden und dürfte besonders für trisome Patienten mit gesteigerter Enzymmenge zutreffen. Diese Verlagerung wirkt sich ihrerseits membranschädigend aus, wenn ein anderer Elektronendonator die Stelle des Superoxidradikals einnimmt und das Enzym in einem reduzierten Status (Cu(I)/Zn-SOD) hält (89).

▼ 81 

Möglicherweise wäre auch eine erhöhte Protonenkonzentration in Folge der verstärkt ablaufenden Glykolyse unter Hypoxie für eine Verschiebung der Superoxiddismutasereaktivität in Richtung Wasserstoffperoxyd möglich. Somit wäre bei niedrigem pH die Reaktion von Superoxidradikal zu Wasserstoffperoxyd begünstigt.

2. Hypothese: Es gibt die Möglichkeit einer Reaktion von SOD mit Wasserstoffperoxyd und Anionenverbindungen unter Bildung eines hochreaktiven Hydroxylradikals. Nachgewiesen wurde diese Möglichkeit über die Spin-Trap Technik, bei welcher ein diamagnetisches Edukt durch Bindung an ein kurzlebiges Radikal in ein mittellebiges und damit gut nachweisbares Addukt überführt wird. In diesem Fall wurde als Spin-Trap-Molekül N-tert-butyl-α-phenyl-nitrone (PBN) verwendet. Es konnte folgende Reaktion nachgewiesen werden, welche eine Bildung von Hydroxylradikalen durch SOD zeigt(90):

(Cu/Zn)-SOD + PBN + H2O2 -------> (Cu/Zn)-SOD + PBN-OH

▼ 82 

Wird angenommen, dass bei Trisomie 21 mehr aktives Enzym vorherrscht, so könnte es in Folge dessen zu einem relativen Mangel an Superoxidradikalen kommen. Das entstehende Wasserstoffperoxyd würde bei einem Insult durch Hyperoxie nicht vollständig durch Katalasen in ungefährliches Wasser und Sauerstoff umgewandelt, sondern ein Teil würde durch die Superoxiddismutase in Hydroxylradikale überführt werden. So ist dadurch das Paradoxon der mehr als ausreichenden Enzymmenge bei vermehrter Schädigung der Zellmembranen erklärt.

In den der vorliegenden Arbeit zu Grunde liegenden Experimenten zeigte sich, wie in Abbildung 19 dargestellt, ein signifikanter Unterschied in der Transkriptionsstärke von SOD1 unter Hypoxie bei Glukosemangel gegenüber Hypoxie bei freier Glukoseverfügbarkeit. Unter Normoxieeinfluss ist kein signifikanter Unterschied in der Transkription zwischen den beiden Inkubationsmodalitäten ersichtlich. Man kann also feststellen, dass CD4+ -Zellen unter dem Einfluss von Hypoxie nur in Abwesenheit von Glukose mit einer Transkriptionssteigerung für SOD1 reagieren. Demnach ergibt sich wieder die Frage nach einem Sensormechanismus sowohl für die Verfügbarkeit von Glukose als auch für die Sauerstoffversorgung der Zellen.

Inwieweit der Status der Glukoseversorgung erfasst wird, lässt sich mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren nicht erklären. Eine Promotoranalyse des SOD1-Gens auf Bindungsstellen für HIF ergibt jedoch eine Bindungsstelle für den HIF-1α-/HIF-1β-Komplex und fünf Bindungsstellen für HIF-1β-Heterodimere. Es kann also als eine Möglichkeit die Regulation dieses Gens durch HIF vermutet werden. Im Gegensatz zur Hexokinasetranskription ergibt sich im Hinblick auf die Verfügbarkeit von Glukose ein hemmender Effekt auf die Transkription der SOD1.

▼ 83 

Takamya et al. untersuchten die Auswirkungen von Glykosylierung auf die Aktivität von drei unterschiedlichen SOD1 Mutanten gegenüber Wildtypkontrollen. Sie stellten eine glykosylierungsbedingte Aktivitätssteigerung der Enzyme fest. Hierbei waren die mutierten Varianten stärker betroffen. Es zeigte sich eine Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit des Glykosylierungsgrades und der damit verbundenen Aktivitätssteigerung(91).

Setzt man voraus, dass auch die Wildtypform des Enzyms durch Glykosylierung in seiner Aktivität gesteigert werden kann, so würde sich hieraus die geringe Transkriptionssteigerung für die SOD1 unter Glukoseeinfluss erklären lassen. Wenn das Enzym in der Lage ist mehr Superoxid-Anionen umzusetzen, d.h. durch eine Aktivitätssteigerung den erhöhten Bedarf an Enzymaktivität zu decken, so ist eine verstärkte Enzymexpression nicht notwendig.

Ein anderer Erklärungsversuch für die hier beobachtete, weitgehend unbeeinflusste Transkription der SOD1 unter dem Einfluss von Glukose ergibt sich aus der oben beschriebenen Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes durch einen Überschuss von Protonen (niedriger pH) zu Gunsten der Produktion von Wasserstoffperoxyd. Wird diese Reaktion durch den pH begünstigt und läuft die Umsetzung von Superoxidradikalen bei niedrigem pH schneller ab, so ist die Notwendigkeit einer Transkriptionssteigerung und einer de novo Synthese für das Enzym ebenfalls nicht mehr gegeben. Um diese Behauptungen zu beweisen, müsste untersucht werden, ob die Transkriptionsfaktoren von SOD1 durch eine Veränderung des pH Wertes direkt oder indirekt reguliert werden. Für das VHL-Protein, welches für die Degradation von HIF-1α verantwortlich ist, ist eine Abhängigkeit vom intrazellulären pH beschrieben worden. Es zeigte sich, dass das VHL-Protein in azidotischer Umgebung in seiner Wirkung gehemmt wird(92). Somit wird HIF-1α bei niedrigem pH nicht degradiert und kann die Expression seiner Zielgene verstärken, zu denen auch das SOD1-Gen gehören könnte.

4.3 Diskussion zur Korrelationsanalyse

▼ 84 

Korrelationsanalysen dienen dem Zweck, mögliche Zusammenhänge zwischen verschiedenen Variablen einer Versuchsreihe zu erkennen. Dieses Verfahren wurde hier angewandt, um Verbindungen zwischen einzelnen Versuchsvariablen zu identifizieren, die Einfluss auf die Messergebnisse gehabt haben können. Hierzu zählen die Auswirkung der Probenreinheit auf die Zytokinproduktion und besonders die möglichen Interaktionen der gemessenen Zytokine untereinander. Die in den Tabellen 3a, 3b, 4a und 4b dargestellten Ergebnisse basieren auf einer Korrelationsanalyse nach Pearson, bei welcher der lineare Zusammenhang zweier Variablen untersucht wird. Alle dargestellten Ergebnisse sind signifikant (p<0,05). Bei manchen Aussagen ist der P-Wert geringer. Diese Analyse sollte die Fragen beantworten, ob die Verunreinigung mit CD4low-Zellen einen Einfluss auf die Expression bestimmter Zytokine hatte, und ob diese Zellpopulation möglicherweise die Produzenten des betreffenden Zytokins waren.

In Tabelle 3a zeigen sich positive Korrelationen zwischen TNF-α und IL-2 sowie zwischen TNF-α und IL-8 für Normoxie in glukosehaltigem Medium. Betrachtet man diese für die unter Normoxie gehaltenen Zellen, so stellt man einen Zusammenhang zwischen TNF-α und IL-2, sowie TNF-α und IL-8 fest. Dies ist wahrscheinlich durch eine dritte Variable zu erklären. Gemeinsam haben diese drei Zytokine, dass sie nur unter Stimulation sekretiert werden. Wahrscheinlich ist die in den Experimenten verwendete PMA- / Ionomycinstimulation für das Ansteigen der Expression aller drei Faktoren verantwortlich. Somit ist eine Aussage, welches Zytokin die Produktion eines der anderen beiden initiiert aus der Datenlage nicht zu beantworten. Bekannt ist, dass TNF-α über die Aktivierung von NFκB in der Lage ist, die Expression von IL-8 in fibroblastenähnlichen Synoviozyten (FLS) zu verstärken (93). Demzufolge wäre nicht nur durch die reine Stimulation mit PMA/ Ionomycin sondern auch durch die induzierte TNF-α-Wirkung über NFκB die beobachtete positive Korrelation zwischen TNF α und IL-8 zu erklären.

In Tabelle 3b zeigt sich eine unabhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit bestehende Korrelation zwischen der Population der schwach positiven CD4-Zellen und der Zytokinexpression von IL-1β. Diese Zellpopulation zeichnet sich durch eine schwache Expression des CD4-Moleküls an der Zelloberfläche aus. Es lässt sich vermuten, dass diese Population in besonderem Maße an der IL-1β Produktion durch die Zellsuspension beteiligt ist. Eine weitere Charakterisierung dieser Subpopulation durch andere Marker würde sich in diesem Fall anbieten. Entscheidend hierbei wäre eine intrazelluläre Färbung mit einem fluorochrommarkierten Antikörper gegen IL-1β im FACS in Verbindung mit einer Simultanfärbung gegen das Oberflächenepitop CD4 sowie möglicher anderer Oberflächenmarker zur weiteren Charakterisierung dieser Population.

▼ 85 

In ähnlicher Weise muss der mögliche Zusammenhang zwischen dieser Population und der IL-8 Produktion unter Hypoxie aufgeklärt werden.

Betrachtet man die Korrelationen der Zytokine unter Hypoxie, so steht lediglich IL-8 in Verbindung mit dem Anteil an schwach CD4 positiven Zellen in der Zellsuspension. In dem IL-8 behandelnden Einleitungsteil (Abschnitt 1.4.5) wird an einer Stelle die Hypothese geäußert, dass CD4-positive T-Lymphozyten möglicherweise nicht die Quelle des Zytokins sind, sondern eine verunreinigende Population die Ursache für die IL-8 Expression darstellen könnte.

In dem Artikel von Smyth et al. wurden PBMC in vier Subpopulationen fraktioniert. Zum einen waren dies CD4-positive Zellen, welche IL-8 lediglich auf mRNA Ebene in messbarem Umfang produzierten, zum anderen wurden CD8+-Lymphozyten gewonnen, die sich ähnlich verhielten. Als dritte Subpopulation wurde LGL (Large granular lymphocytes) genannt, welche in der Lage war, IL-8 auch auf Proteinebene zu exprimieren. Des Weiteren wurden Monozyten fraktioniert, welche als Prototypen der IL-8 Produzenten gelten und dieses Protein auch synthetisieren.

▼ 86 

Nimmt man an, dass es sich bei den CD4low-Zellen um LGL oder Monozyten handelt, so ist die Ursache der Korrelation zwischen CD4low und IL-8 Expression geklärt. Erstaunlicherweise ist diese Korrelation nur unter Hypoxie zu beobachten, was durch den verstärkenden Effekt der Hypoxie auf die Expression von IL- 8 erklärbar wäre.

In einer Untersuchung zum Krankheitsbild der akuten generalisierten exanthematösen Pustulose (AGEP) konnte die Gruppe um Schaerli et al. entgegen den Beobachtungen von Smyth et al. nachweisen, dass T-Lymphozyten nicht in ihrer IL-8 Expression auf posttranskriptioneller Ebene geblockt werden. Sie sind in der Lage sind, das Zytokin tatsächlich zu exprimieren (35).

Die in den Tabellen 4a und 4b dargestellten Korrelationen lassen eine generelle, sauerstoffunabhängige positive Korrelation zwischen IL-8 und dem Anteil an schwach positiven CD4-Zellen (CD4low) sowie eine positive Korrelation zwischen der TNF-α und der IL-2 Expression erkennen. Die Erläuterungen aus der Diskussion um die Tabellen 3a und 3b lassen sich auch hier anwenden. Interessant ist, dass sich der Zusammenhang zwischen IL-8 und CD4low in Abwesenheit von Glukose als unabhängig von der Sauerstoffversorgung der Zellen zeigt. Es verdichtet sich die Vermutung, dass bei den stimulierten Zellsuspensionen die CD4low-Zellen für die IL-8 Expression von Bedeutung ist. Es wäre interessant herauszufinden, welchen spezifischen Phänotyp diese CD4low-Zellen aufweisen, und ob sie möglicherweise den LGL-Zellen von Smyths Untersuchungen entsprechen.

▼ 87 

Die weiterhin beobachtbare positive Korrelation zwischen IL-2 und TNF-α ist auf die Stimulation der Zellen als kleinsten gemeinsamen Nenner zurückzuführen. Hierbei ist erstaunlich, dass sich diese Korrelation von einem rein unter Normoxie beobachtbaren Phänomen zu einem generellen verändert hat. Somit scheint die Anwesenheit der Glukose in Verbindung mit Hypoxie den Zusammenhang zwischen der Expression von TNF-α und IL-2 unter PMA-/Ionomycinstimulation zu maskieren. Diese Maskierung hängt möglicherweise mit einer unterschiedlichen Sensitivität der Synthesewege auf Glukose für die beiden Zytokine zusammen. Für die Synthese von TNF-α ist bereits ein suppressiver Effekt von Glukose und Osmolarität bei stimulierten PBMCs gezeigt worden (94). Für IL-2 liegen hierzu keine Daten vor. Hat Glukose auf die Expression von TNF-α einen anderen Effekt als auf die von IL-2, so erklären sich daraus die Unterschiede der Korrelationsdaten unter den verschiedenen Bedingungen.

Bei den Verhältnissen unter glukosefreier Normoxie fällt auf, dass IL-6 mit IL-1β und IL-2 korreliert. Ein Zusammenhang aller drei Zytokine stellt sich über ihre Funktion als pro-inflammatorische Zytokine dar. Houssiau et al. postulierten einen Zusammenhang der drei Zytokine in humanen TH -Zellen. Während IL-1 die Expression von IL-2 verstärkt, bewirkt IL-6 ein besseres Ansprechen der T-Lymphozyten auf einen IL-2 Proliferationsstimulus. Insofern wirken IL-1 und IL-6 synergistisch auf die IL-2-Antwort der T-Lymphozyten. Wahrscheinlich wirkt IL-6 durch eine Überführung der Zellen von der G0 in die G1 Phase des Zellzyklus (21). Möglicherweise stellt der von Houssiau beobachtete Zusammenhang die Ursache für das oben genannte Korrelationsmuster dar.

Wendet man sich den weiteren Korrelationen unter Normoxie in Tabelle 4a zu, so findet man einen möglichen Zusammenhang zwischen der MCAF Produktion und der IL-8 Expression.

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Da beide Zytokine als hauptsächlich von Monozyten exprimierte Proteine bekannt sind, ist der mögliche Zusammenhang in einer gemeinsamen Quelle zu sehen. Betrachtet man die CD4 low-Zellen als vorwiegend monozytär, was in einer späteren flowzytometrischen Charakterisierung mit der Auswahl geeigneter Oberflächenmarker gezeigt werden muss, so ergibt sich eine Erklärung für die vorliegenden Korrelationsdaten.

Betrachtet man die in Tabelle 4b angegebenen Korrelationen in der Hypoxiespalte, so ergibt sich ein möglicher Zusammenhang zwischen der Quantität von IL-1β und dem Anteil von CD4low-Zellen an der Suspension. Hier lässt sich vermuten, dass die IL-1β Produktion von diesen Zellen beeinflusst wird. Die Frage ist, ob diese Zellen direkte IL-1β Produzenten sind oder ob sie die größere Population der deutlich CD4 positiven Zellen dazu anregt, IL-1β zu produzieren. Aufklärung in dieser Frage würde eine intrazelluläre Färbung gegen IL-1β bringen.


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11.08.2006