Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie
der medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Untersuchungen zur Wirkung von Hypoxie auf bioenergetisch relevante Funktionen von stimulierten CD4⁺-Zellen

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
René Dziurla
aus Berlin

Dekan: Dekan: Professor Dr. med. M. Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. B. Manger, Erlangen
2. Prof. Dr. R. Straub, Regensburg
3. Prof. Dr. F. Buttgereit, Berlin

eingereicht am: 3.5.2005

Datum der Promotion: 21.11.2005

Kurzdarstellung

Die Versorgung von Immunzellen mit Energie in Form von ATP ist Grundlage eines funktionstüchtigen Immunsystems. Diese wird durch die mitochondriale OXPHOS oder durch die zytosolische Glykolyse gewährleistet. Sauerstoff und Glukose stellen die Hauptsubstrate dieser Stoffwechselprozesse dar.

Unter pathologischen Bedingungen wie sie in Entzündungsgebieten herrschen, konnte ein relativer Sauerstoffmangel experimentell nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, in welcher Weise die Funktionen einer definierten Lymphozytenpopulation (CD4+) durch Sauerstoffmangel beeinflusst werden.

Nach Isolation von CD4+ Zellen aus peripherem Blut gesunder Spender, wurden definierte Zellmengen stimuliert und in einem mit einer Sauerstoffelektrode ausgestatteten Gefäß unter Luftabschluß inkubiert. Zu definierten Zeitpunkten wurden Proben zur ATP-Messung entnommen, sowie Protein- und RNA-Lysate hergestellt. Die Vitalität zu Anfang und zum Ende der Inkubation wurde mittels Propidium-Jodid-Färbung im FACS bestimmt. Aus gesammelten Überständen wurden mittels Multiplex-ELISA die Konzentrationen von IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-alpha und MCAF gemessen. Als Kontrollen dienten unter Normoxie inkubierte Aliquots der Zellsuspensionen. HIF-1alpha wurde mit Immunoblotting nachgewiesen. Transkriptionsänderungen von SOD1 und HK1 wurden durch SYBR-Green Real-Time-PCR quantifiziert.

Stimulierte CD4⁺-Zellen von Normalspendern schütten unter dem Einfluss von Hypoxie vermehrt proinflammatorische und chemotaktisch wirksame Zytokine, sowie zur Differenzierung notwendige antiinflammatorische Zytokine aus. Die Verfügbarkeit von Glukose hat hierauf einen verstärkenden Effekt. Eine hypoxische Umgebung sorgt in Abhängigkeit von der Versorgung mit Glukose für eine Anpassung der zellulären Atmungsrate. Glukose ist für die Aufrechterhaltung eines konstanten ATP-Levels verantwortlich. Die glykolytische Energiegewinnung unter Hypoxie kompensiert den Ausfall der OXPHOS. Hypoxie führt bei stimulierten CD4⁺-Zellen bei freier Glukoseverfügbarkeit zu einer vermehrten Transkription des Hexokinase1-Gens. Glukosemangel bewirkt dagegen in hypoxischer Umgebung eine Transkriptionssteigerung des SOD1-Gens.

Eigene Schlagworte: Glukose, Hypoxie, Hexokinase-1, SOD1, HIF-1alpha, CD4+ Lymphozyten, Zytokine

Abstract

Background: The energy supply of immune cells in form of ATP is the cornerstone of a functional immune system. This supply is realized by either mitochondrial OXPHOS or cytosolic glycolysis. Oxygen and glucose present the main substrates in these metabolic processes.

Objective: Relative shortness of oxygen could be determined experimentally under pathological conditions present in inflamed tissues. The aim of this study was to determine the extent of hypoxic influence on the cellular function of CD4+ lymphocytes.

Methods: Human CD4+ cells were isolated from peripheral blood of healthy blood donors by MACS sorting. Following a defined protocol cells were stimulated and incubated in a sealed container with a Clark type electrode. Samples were taken for measurements of ATP content. RNA- and Protein lysates were made to quantify the transcription of SOD1 and HK1 by SYBR green RT-PCR and look for the presence of HIF-1alpha by immunoblot analysis respectively. Supernatants were used to measure the expression of IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-alpha and MCAF using a multiplex ELISA assay. Aliquots of cell supspensions incubated under normoxic conditions served as controls.

Results / Conclusion: Under the influence of hypoxia stimulated CD4⁺ express proinflammatory and chemotactically active as well as anti-inflammatory cytokines important for cell differentiation. The availability of glucose leads to an increase of this effect. An hypoxic environment dependant on the availability of glucose leads to an adaptation of cellular respiration. Glucose deficiency provokes an increase in cellular oxygen utilization. The availability of glucose is responsible for a constant intracellular ATP level. This proves that in CD4⁺ lymphocytes glycolysis is capable of compensating for hypoxically impaired oxidative phosphorylation thus providing enough ATP to enable cellular function. Hypoxia under glucose provision leads to an increase in mRNA expression for HK1, a key enzyme of glycolysis. Lack of glucose under hypoxic conditions results in an increase in mRNA expression for SOD1. Glucose therefore serves in CD4⁺ cells as an agent of constant energy supply that leads to cell survival and an upkeep of a proinflammatory environment through cytokine expression.

Keywords: Hypoxia, CD4+ Lymphocytes, SOD1, HIF-1alpha, Hexokinase-1, Glucose, Cytokines

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Das Immunsystem und Unterscheidungsmerkmale für verschiedene T-Lymphozyten
  • 1.2 Die Energieversorgung der Zelle, Entstehung von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die funktionelle Bedeutung von Adenosintriphosphat (ATP)
  • 1.3 Die zentrale Rolle von HIF-1α, seine Struktur und seine Funktion als Transkriptionsfaktor
    • 1.3.1  Die Relevanz von Hypoxia Inducible Factor-1 (HIF-1) für Autoimmunerkrankungen am Beispiel der Rheumatoiden Arthritis
  • 1.4 Zytokine als lokale Immunregulatoren
    • 1.4.1  Zell-Zell-Kontakt, Zytokinproduktion und Autoimmunerkrankung
    • 1.4.2 IL-1β
    • 1.4.3 IL-2
    • 1.4.4 IL-6
    • 1.4.5 IL-8
    • 1.4.6 IL-10
    • 1.4.7 TNF-α
    • 1.4.8 MCAF
• 2 Materialien und Methoden
  • 2.1 Präparation humaner CD4+ Zellen
  • 2.2 Messung des Sauerstoffverbrauchs mittels Clark-Elektrode
  • 2.3 Bestimmung der ATP-Menge
  • 2.4 HIF-1α Nachweis mittels Westernblot
  • 2.5 Bestimmung der Konzentrationen von TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 und MCAF aus den Überständen
  • 2.6 Aufarbeitung der RNA und Umschreiben in cDNA
    • 2.6.1 Präparation der total RNA
    • 2.6.2 Light Cycler Realtime PCR im Sybr Green Format
  • 2.7 Klonierung und Sequenzierung der PCR Produkte
• 3 Ergebnisse
  • 3.1 Kinetik des Sauerstoffverbrauchs von PMA- / Ionomycin-stimulierten CD4⁺ Zellen
  • 3.2 Ergebnisse der Quantifizierung von ATP
  • 3.3 Überlebensrate der Zellen unter verschiedenen Inkubationsbedingungen
  • 3.4 Westernblot zur Darstellung von HIF-1α
  • 3.5 Messung der Zytokinkonzentrationen mittels Multiplex-ELISA
  • 3.6 Light Cycler PCR für Superoxiddismutase1, Hexokinase und β-Aktin
  • 3.7 Korrelationsanalysen
    • 3.7.1 Experimente mit glukosehaltigem Medium
    • 3.7.2 3.7.2 Experimente mit glukosefreiem Medium
• 4 Diskussion
  • 4.1 Verhalten von CD4⁺-Zellen in unterschiedlichen Situationen
    • 4.1.1 Verhalten von CD4⁺-Zellen bei Normoxie im glukosehaltigen Medium unter Stimulation
    • 4.1.2 Auswirkungen von Hypoxie in glukosehaltigem Medium unter Stimulation
    • 4.1.3  Auswirkungen von Glukosemangel unter Normoxie
    • 4.1.4  Verhalten bei Glukosemangel und Hypoxie
    • 4.1.5  Ausblick
  • 4.2 Regulation der Expression von Zielgenen
    • 4.2.1  Hexokinase (Typ 1)
    • 4.2.2 Superoxiddismutase-1 (Cu/Zn)
  • 4.3 Diskussion zur Korrelationsanalyse
• 5 Zusammenfassung
• 6. Literaturverzeichnis
• Eidesstattliche Erklärung
• Abkürzungsverzeichnis

Tabellen

• Tabelle1 Puffer- und Medienliste
• Tabelle 2 a Primerkombinationen und Zugriffsnummern der verwendeten Zielgene
• Tabelle 3 a Korrelationsbestimmung für mögliche Zytokinabhängigkeiten nach Pearson (lineare Korrelation) Darstellung aller signifikanten Korrelationen für die Inkubation im Medium mit Glukose mit Angabe des  Korrelationskoeffizienten und der Signifikanz
• Tabelle 3b: Korrelationsbestimmung nach Pearson (linear)  Möglichkeit der Auswirkung der CD4^low-Population auf die Zytokinexpression im glukosehaltigen Medium
• Tabelle 4a Korrelationsbestimmung nach Pearson (lineare Korrelation) für Glukosemangel:  Darstellung aller signifikanten Korrelationen
• Tabelle 4 b Korrelationsbestimmung nach Pearson (lineare Korrelation) für Glukosemangel Darstellung aller signifikanten Korrelationen im Zusammenhang mit schwach CD4⁺-Zellen (CD4^low)

Bilder

• Abbildung 1a Aufbau der Versuchskammer
• Abbildung 1b Experimenteller Aufbau
• Tabelle 2b: Light Cycler Bedingungen verschiedener genspezifischer Primerpaare
• Abbildung 2: Sauerstoffverbrauch stimulierter CD4 Mittels Clark Elektrode gemessener Sauerstoffverbrauch von PMA- / Ionomycin- stimulierten CD4⁺- Lymphozyten während sechsstündiger Inkubation in nmol / (10⁷ Zellen x min); * – signifikanter Unterschied im Sauerstoffverbrauch der Zellen im Medium ohne Glukose bzw. mit Glukose (p<0,05).
• Abbildung 3a: Atmungsrate stimulierter CD4⁺-Zellen bezogen auf den Sauerstoffgehalt im Medium: Sauerstoffverbrauch von PMA- / Ionomycin- stimulierten CD4+ Lymphozyten (in nmol pro min und 10 Abhängigkeit vom Sauerstoffgehalt im Medium (in % des Ausgangswertes).* signifikanter Unterschied im Verbrauch zwischen Zellen im Medium ohne bzw. mit Glukose (p<0,05).
• Abbildung 3b Sauerstoffclearance PMA- / Ionomycin-stimulierter CD4⁺-Zellen:
• Abbildung 4: ATP Mengenmessung in stimulierten CD4⁺-Lymphozyten
• Abbildung 5: Viabilitätsmessung durch FACS Analyse mittels Propidiumjodidfärbung
• Abbildung 6a: Westernblot zum Nachweis von HIF-1α im Medium mit Glukose CD4+-Lymphozyten wurden mit PMA und Ionomycin stimuliert. Der Immunoblot zum Nachweis von HIF-1α erfolgte unter Verwendung von Proteinlysaten dreier Experimente (0753,1143 und 1306) Zur Normierung wurde das Strukturprotein β-Aktin verwendet.
• Abbildung 6b: Westernblot zum Nachweis von HIF-1α im Medium ohne Glukose CD4+-Lymphozyten wurden mit PMA und Ionomycin stimuliert. Der Immunoblot zum Nachweis von HIF-1α erfolgte unter Verwendung von Proteinlysaten dreier Experimente (1906,2075 und 0919) Zur Normierung wurde das Strukturprotein β-Aktin verwendet.
• Abbildung 6c Immunoblot von HIF-1α und β-Aktin von Lysaten von PMA- / Ionomycin- stimulierten CD4⁺-Medienvergleich
• Abbildung 7 Interleukin-1β-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)
• Abbildung 8 Darstellung der Interleukin-2-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)
• Abbildung 9 Interleukin-8-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)
• Abbildung 10 Interleukin-10-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)
• Abbildung 11 Interleukin-6-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)
• Abbildung 12 TNF-α-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)
• Abbildung 13 MCAF (MCP-1)-Konzentration in pg bezogen auf die Zellzahl im Vergleich zwischen den Inkubationsbedingungen: Fehlerbalken als SEM; signifikante Unterschiede markiert mit * - (p < 0,05)
• Abbildung 14 Hypoxieeinfluss auf die Expression der dargestellten Zytokine im Medium mit Glukose bei stimulierten CD4⁺-Zellen. Fehlerbalken repräsentieren SEM; Hypoxieeinfluss = Hypoxieexpression / Normoxieexpression
• Abbildung 15 Hypoxieeinfluss auf die Expression der dargestellten Zytokine im Medium ohne Glukose bei stimulierten CD4⁺-Zellen. Fehlerbalken repräsentieren SEM; Hypoxieeinfluss = Hypoxieexpression / Normoxieexpression
• Abbildung 16a Expressionsprofil PMA- / Ionomycin-stimulierter CD4⁺-Zellen unter Einfluss von Glukose: Zytokinmenge in pg bezogen auf 10⁷ Zellen; Fehlerbalken repräsentieren SEM (n=6)
• Abbildung 16b Expressionsprofil PMA- / Ionomycin-stimulierter CD4⁺-Zellen unter Glukosemangel: Zytokinmenge in pg bezogen auf 10⁷ Zellen; Fehlerbalken repräsentieren SEM (n=6)
• Abbildung 17a Einfluss von Glukoseverfügbarkeit auf die Zytokinexpression unter Normoxie (n=6)
• Abbildung 17b Einfluss von Glukoseverfügbarkeit auf die Zytokinexpression unter Hypoxie (n=6)
• Abbildung 18 mRNA Expression von Hexokinase in stimulierten humanen CD4⁺-Zellen: Darstellung der mRNA Expression von Hexokinase (Transkriptvarianten 1-5) zu Beginn (0h), nach sechs Stunden Normoxie (N6h) und Hypoxie (H6h), normalisiert auf β-Aktin im Vergleich zwischen glukosereichen und glukosefreien Inkubationsbedingungen; Fehlerbalken repräsentieren SEM; (n=4); (*-p < 0,05)
• Abbildung 19 mRNA Expression von Superoxiddismutase-1 (Cu/Zn) in stimulierten humanen CD4⁺-Zellen: Darstellung der mRNA Expression von Superoxiddismutase-1 zu Beginn (N0h), nach sechs Stunden Normoxie (N6h) und Hypoxie (H6h), normalisiert auf β-Aktin im Vergleich zwischen glukosereichen und glukosefreien Inkubationsbedingungen; Fehlerbalken repräsentieren SEM; (n=4); (*-p < 0,05)
• Abbildung 20 Effizienzreihe zur PCR von Superoxiddismutase-1: Es ergibt sich eine Effizienz von 1,916. Die Messungen sind Doppelwerte einer Standardverdünnungsreihe.
• Abbildung 21 Effizienzbestimmung Hexokinase 1 TV1-5 am Light Cycler System ; Effizienz 1,987. Die Messungen sind Einzelbestimmungen einer Standardverdünnungsreihe, die sich in mehreren folgenden Läufen bestätigt haben.
• Abbildung 22 Schmelzkurve zur Effizienzbestimmung von Superoxiddismutase-1. Es zeigt sich ein spezifisches Produkt mit einer Schmelztemperatur von ca. 89°C. Die Wasserkontrolle bleibt produktfrei.
• Abbildung 23 Schmelzkurven zur Effizienzbestimmung für Hexokinase 1 TV1-5. Es zeigt sich ein spezifisches Produkt mit einer Schmelztemperatur von ca. 85,5°C. Ein weiteres Produkt bei 82°C tritt nur in der Wasserkontrolle auf und ist für die eigentlichen Proben und die Effizienzbestimmung nicht von Bedeutung.
• Abbildung 24 Sequenzierungsergebniss für das Hexokinase-1 Amplikon
• Abbildung 25 Sequenzierungsergebniss für das β-Aktin (ACTB) Amplikon
• Abbildung 26 Sequenzierungsergebniss für das SOD1 Amplikon
• Abbildung 20 Darstellung der Transkriptionsvarianten für das Hexokinase 1 Gen auf Chromosom 10 (Variante 1 NM_000188; Variante 2 NM_033496; Variante 3 NM_033497; Variante 4 NM_033498; Variante 5 NM_033500) und ihrer relativen Positionen zueinander (erstellt über UCSC-Genome)