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2.  Patientinnen, Material und Methoden

Die in dieser Arbeit beschriebenen Querschnittsuntersuchungen wurden im Rahmen einer Kooperationsstudie des Department of Medicine, School of Medical Sciences, University of Science and Technology, Kumasi, Ghana und dem Institut für Tropenmedizin Berlin am Presbyterian Mission Hospital Agogo, Ghana durchgeführt. Das Projekt wurde vom Committee on Human Research, Publication and Ethics der School of Medical Sciences, University of Science and Technology, Kumasi, Ghana begutachtet und zur Durchführung freigegeben. Klinische, parasitologische und hämatologische Untersuchungen erfolgten in Agogo. Die Aufbereitung der in Agogo gewonnen Blutproben, wie DNA-Extraktion sowie die molekularbiologischen Untersuchungen wurden am Institut für Tropenmedizin in Berlin durchgeführt. Pharmakologische Untersuchungen, wie die Bestimmungen der Plasmakonzentrationen von Chloroquin und Pyrimethamin, erfolgten in Amsterdam (Department of Clinical Pharmacology, Academic Medical Centre, University of Amsterdam).

2.1. Studienort

Das Studiengebiet von Agogo liegt östlich der Stadt Kumasi in ländlicher Umgebung des Asante Akim North District in Ghana, Westafrika. (Abbildung 5).

Im holoendemischen Untersuchungsgebiet von Agogo ist die Infektionsrate der Malaria ganzjährig hoch. P. falciparum, der Erreger der Malaria tropica,wird hier als vorherrschender Parasit beschrieben, gefolgt von P. malariae bzw. P. ovale. Die Prävalenz einer Plasmodienparasitämie bei Einwohnern (≥ 2 Jahre) der Ashantiregion beträgt ca. 50%. Die mittlere Parasitendichte bei mit P. falciparum infizierten Patienten liegt bei ca. 550 Parasiten je μl (Browne et al. 2000). Die Inzidenz einer klinischen Malaria erreicht während und kurz nach den beiden Regenzeiten (Mai-Juli bzw. September-Oktober) ihren Höhepunkt. Am Ende der Trockenzeit d.h. im Februar zeigt die Erkrankungshäufigkeit ihren niedrigsten Wert (Quarterly Health Statistics, Presbyterian Hospital Agogo). Eine 1998 durchgeführte Studie im Einzugsgebiet des Presbyterian Hospital Agogo zeigte eine Prävalenz von 63% einer P.-falciparum-Infektion bei schwangeren Frauen. Davon hatten 32% der infizierten Frauen eine mikroskopisch nachgewiesene periphere Parasitämie (mittlere Parasitendichte: 304/μl). 31% der Frauen hatten eine submikroskopische Infektion. P. falciparum war auch hier der vorherrschende Parasit. Bei 91% der Infektionen stellte P. falciparum die alleinige Parasitenspezies dar. Mit steigender Zahl vorangegangener Schwangerschaften fiel die Prävalenz einer Infektion sowie die Parasitendichten der Infektionen (Mockenhaupt et al. 2000).


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Abbildung 5: Geographische Darstellung von Ghana und dem Studiengebiet

2.2. Studiengruppe

Vom 24. Januar 2000 bis 24. Januar 2001 wurden 893 gebärende Frauen und ihre neugeborenen Kinder untersucht. Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren 474 Patientinnen mit einer P. falciparum Infektion der Plazenta. Alle untersuchten Patientinnen stammten aus Agogo oder dem ländlichen Einzugsgebiet des Presbyterian Hospital Agogo und gehörten fast ausschließlich dem Stamm der Akan an.

2.3. Klinische Untersuchungen

Die Anamnese sowie die klinischen Untersuchungen und Blutentnahmen wurden durch das Personal der Abteilung für Geburtshilfe des Presbyterian Hospital Agogo und durch Mitarbeiter des Instituts für Tropenmedizin Berlin durchgeführt. Demographische Daten der Schwangeren wie Alter, Wohnort, Ausbildungsgrad, Parität sowie Daten über die Einnahme von Antimalariamedikamenten wurden erhoben. Die Körpertemperatur wurde axillär gemessen.

Die neugeborenen Kinder wurden direkt nach der Geburt zur Prüfung ihrer Vitalität und ihres


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Reifezustandes untersucht. Die Vitalitätsprüfung erfolgte nach Apgar 1, 5 und 10 Minuten nach der Geburt. Das Geburtsgewicht, die Körpergröße und der Kopfumfang wurden gemessen. Die Bestimmung des Gestationsalters des Neugeborenen erfolgte nach Finnstrom (1977). Die Geburt eines Kindes mit einem Gestationsalter von weniger als 37 Wochen galt als eine Frühgeburt. Ein Geburtsgewicht von weniger als 2500g galt als ein vermindertes Geburtsgewicht (Finnstrom 1977).

2.4. Gewinnung, Lagerung, Aufbereitung und Transport der Blutproben

Zur Durchführung der verschiedenen Blutuntersuchungen wurde den Gebärenden vor der Geburtseinleitung eine periphere venöse Blutprobe von 8 ml entnommen. Diese Blutentnahme erfolgte aus einer Unterarm- bzw. Kubitalvene. Eine zweite Blutprobe von ca. 2 ml wurde nach Beendigung der Nachgeburtsphase aus der Plazenta durch Inzision in die maternale Seite der Plazenta gewonnen. Es wird davon ausgegangen, dass sich diese plazentare Blutprobe aus einem Gemisch von mütterlichem und kindlichem Blut zusammensetzt. Die Proben wurden sofort in Aliquots aufgeteilt (mit EDTA- Zusatz, ohne Zusatz zur Serumgewinnung). In den folgenden 12 Stunden wurde das Serum durch Zentrifugieren abgetrennt. Für spätere molekularbiologische Untersuchungen wurde ein Teil des EDTA-Blutes DNA-stabilisiert: Das heißt: Nach dem Zentrifugieren wurde das Plasma aus dem Überstand entnommen und verworfen. Im Anschluss erfolgte ein Resuspendieren (90 μl Blutsediment, 90 μl PBS- Puffer [engl. Phosphat buffered saline] und 180 AS- Puffer [Puffer auf der Basis von Guanidiniumhydrochlorid]). Dieses Gemisch wurde in Aliquots gegeben. Alle Proben wurden bis zum Transport nach Berlin bei +4°C, bzw. –20°C (Serum) gelagert. Der Transport von Ghana nach Berlin bzw. Amsterdam erfolgte in Kühlbehältern, dabei wurde die Kühlkette während des Transportes nicht unterbrochen. Teil des Plasmas wurde zur Bestimmung der Konzentrationen von Pyrimethamin und Chloroquin nach Amsterdam ins Academic Medical Centre (Department of Clinical Pharmacololgy) transportiert.

2.5. Hämatologische Untersuchungen

Sofort nach der Blutabnahme wurde von jeder Blutprobe der Hämoglobingehalt (Hb) mit HemoCue Photometer bestimmt (Angelholm, Schweden, [Schenk et al. 1986]). Weitere hämatologische Parameter, wie Erythrozyten- und Leukozytenzahl (EZ und LZ), mittleres korpuskuläres Volumen der Erythrozyten (MCV), Hämatokrit (Hkt), Hämoglobingehalt (Hb) sowie die mittlere korpuskuläre Hb- Konzentration (MCH), wurden innerhalb von 12 Stunden nach der Blutabnahme mit einem halbautomatischen Zellzählgerät (HC555, Clinicon, Mannheim) bestimmt.


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2.6.  Mikroskopische Untersuchungen

Von jeder Blutprobe wurden „Dicke Tropfen“ zur Bestimmung der Parasitämie und Blutausstriche zur Speziesdifferenzierung angefertigt. Bei eintausendfacher Vergrößerung wurden die Präparate mit dem Ölimmersionsobjektiv im Lichtmikroskop (Zeiss) beurteilt. Zur Auswertung der „Dicken Tropfen“ wurde die Zahl asexueller Parasiten pro 500 Leukozyten bestimmt. Die Parasitämie (Parasiten pro Mikroliter Blut) errechnet sich auf der Basis der Leukozytenzahl pro Mikroliter Blut. Die Mikroskopie der Präparate wurde durch Mitarbeiter des Instituts für Tropenmedizin Berlin durchgeführt. Zur Auswertung der plazentaren Parasitendichten wurden Parasiten pro Blickfeld (BF) bei eintausendfacher Vergrößerung mit Ölimmersionsobjektiv betrachtet. Die Angabe der plazentaren Parasitämien erfolgte als Parasit / 100 Blickfelder.

Zur Begutachtung des Typs der P.-falciparum-Infektion wurden die „Dicken Tropfen“ zusätzlich auf die Anwesenheit von Malariapigment in Phagozyten untersucht. Entsprechend der Klassifikation nach Bulmer et al. (1993) wurden die Befunde in die folgenden vier Gruppen eingeteilt:

1)

keine Infektion:

Parasiten (nein)

Malariapigment (nein)

2)

akute Infektion:

Parasiten (ja)

Malariapigment (nein)

3)

akut-chronische Infektion

Parasiten (ja)

Malariapigment (ja)

4)

abgelaufene chronische Infektion

Parasiten (nein)

Malariapigment (ja)

Diese mikroskopischen Untersuchungen der plazentaren Präparate wurden von Dr. Mockenhaupt am Institut für Tropenmedizin in Berlin durchgeführt und zur Auswertung zur Verfügung gestellt.

2.7. Bestimmung von Chloroquin und Pyrimethamin

Die Bestimmung der Konzentrationen von Chloroquin und Pyrimethamin im Blut erfolgte mittels ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) durch Dr. T.A. Eggelte am Department of Clinical Pharmacology, Academic Medical Centre, University of Amsterdam.

Im Einzelnen erfolgte die Konzentrationsbestimmung von Chloroquin wie folgt:

Es wurden monoklonale Antikörper (F73-8) , die sich gegen die 4-Amino-7-Chlorochinolin Struktur des Chloroquinmoleküls richten, eingesetzt (Witte et al. 1990). Dabei werden sowohl Chloroquin als auch der Metabolit Desethyl-Chloroquin erfasst. Mikrotiterplatten (96-Loch) wurden mit 4- (1,3-Diaminoprpoyl)-7-Chlorochinolin als Antigen beschichtet. 50 μl der Proben [Seite 25↓]wurden in seriellen Verdünnungen in PBS/Tween-20 aufgebracht. Es folgte die Zugabe von 50 μl einer Lösung des Peroxidase-gekoppelten Chloroquinantikörpers. Diese wurden bei 37°C für 1 Stunde gemischt und inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde das Substrat Diaminobenzidin zugegeben und die optische Dichte nach einer Stunde mittels eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes (Titertek, Flow Laboratories) ermittelt. Mit Standardlösungen des Chloroquin-Phosphat wurde eine Kalibirierungskurve für jede Mikrotiterplatte erstellt. Die Ergebnisse wurden als prozentuale Hemmung der optischen Dichte im Vergleich zum Standard angegeben. Aus der Kalibrierungskurve ließ sich die Konzentration von Chloroquin in der jeweiligen Probe ableiten. Eine Konzentration von ≥ 10ng/ml im Plasma galt als therapeutisch wirksam und somit als Chloroquin-positiv (Witte et al. 1990).

Im Einzelnen erfolgte die Konzentrationsbestimmung von Pyrimethamin wie folgt:

Es wurden monoklonale Antikörper (F119-3), die sich gegen Cycloguanil richten verwendet. Es besteht eine 100%ige Kreuzreaktivität zwischen Pyrimethamin und Cycloguanil. Mikrotiterplatten (96-Loch) wurden mit 100 μl F119-3-Gemisch (Verdünnung 1:10000 Phosphat-NaCl- Puffer + F119-3) beschichtet. 50 μl der Proben wurden in seriellen Verdünnungen in PBS/Tween-20 aufgebracht. Es folgte die Zugabe von 50 μl einer Lösung des Cycloguanilantikörpers. Diese wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde gemischt und inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde das Substrat Diaminobenzidin zugegeben, und die optische Dichte nach einer Stunde durch ein Mikrotiterplatten-Lesegerätes (Titertek, Flow Laboratories) ermittelt. Mit Standardlösungen des Cycloguanils wurde eine Kalibirierungskurve für jede Mikrotiterplatte erstellt. Die Ergebnisse wurden als prozentuale Hemmung der optischen Dichte im Vergleich zum Standard angegeben. Aus der Kalibrierungskurve ließ sich die Konzentration von Pyrimethamin in der jeweiligen Probe ableiten. Eine Konzentration von ≥ 10ng/ml im Plasma galt als Pyrimethamin-positiv.

2.8. Extraktion genomischer DNA

Für die im weiteren Verlauf dieser Arbeit beschriebenen Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurde vom Verfasser genomische DNA aus den peripheren und plazentaren Blutproben extrahiert. Die Extraktionen erfolgten aus den mit DNA konservierten peripher venösen und plazentaren Blutproben. Bei der Gewinnung genomischer DNA werden primär die zellulären Bestandteile des Blutes unter Einwirkung von Guanidiniumhydrochlorid und Proteinase K lysiert. Freiliegende DNA kann dann an Silikamoleküle binden. Nach wiederholenden Waschschritten mit alkoholischen Lösungsmitteln erfolgt schließlich eine Elution der DNA in wässriger Lösung (Gillespie et al. 1979).


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2.8.1.  Substanzen

2.8.2. Geräte

2.8.3. Protokoll

Es wurden 200 µl Blut (DNA stabilisiertes Blut-Puffer-Gemisch) mit 200 µl Puffer AL und 25 µl Proteinase K (1,1 g/ml) versetzt und auf einem Zellvortexgerät vermischt. Die Proben wurden bei 65°C für 20 min inkubiert und anschließend mit 200 µl absolutem Ethanol versetzt. Dieses Reaktionsgemisch wurde auf eine mit einem Silika-Filter versehene Zentrifugationssäule mit Auffanghülse (Microspin columns, Qiagen, Hilden) übertragen und für eine Minute bei 8000 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert. Das gewonnene Filtrat wurde verworfen. Es folgten zwei Waschschritte. Hierzu wurden für den ersten Waschschritt 500 µl Waschpuffer (AW1) auf den Silika-Filter gegeben und es wurde abermals für eine Minute bei 8000 U/min zentrifugiert. Beim zweiten Waschschritt wurden 500 µl Waschpuffer (AW2) auf den Silika-Filter gegeben. Diesmal wurde für drei Minuten bei 14000 U/min zentrifugiert. Im Anschluss wurden durch Zugabe von 100 µl Elutionspuffer und einminütigem Zentrifugieren bei 8000 U/min die an den Silika-Filter gebundenen Nukleinsäuren eluiert. Aus 200 µl Blut (DNA- stabilisiertes Blut-Puffer-Gemisch) konnten durch dieses Verfahren ungefähr 6 µg genomische DNA gewonnen werden. Die DNA lag in einer Konzentration von ca. 60 ng/µl vor und wurde für die nachfolgenden Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR) sofort eingesetzt oder bei -80°C gelagert.


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2.9.  Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR)

Die PCR ist eine hochsensitive Methode zum Nachweis kleinster Mengen genetischen Materials (Saiki et al. 1985). Sie ist eine Imitation der DNA-Replikation, wie sie in allen Lebewesen vorkommt. Ausgehend von einem doppelsträngigen DNA-Abschnitt, der als Matrize dient, wird die gesuchte Gensequenz in repititiven Reaktionsschritten exponentiell vervielfältigt (amplifiziert). Initial wird der DNA-Doppelstrang bei Temperaturen zwischen 94°C und 99°C denaturiert. Es entsteht einzelsträngige DNA. Durch Temperatursenkung auf die spezifische Temperatur der synthetischen Oligonukleotide werden die den nachzuweisenden Sequenzen anliegenden DNA-Abschnitte durch diese hybridisiert. Die Ansatzstellen dieser kurzkettigen Oligonukleotide oder Primer dienen einer DNA-Polymerase als Ausgangspunkt für die Synthese komplementärer DNA-Sequenzen. Diese hitzestabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) synthetisiert nach Temperaturanstieg bei ca. 70°C unter Verbrauch eines Gemisches aus Desoyxnukleotidtriphosphaten (dNTPs) einen der Zielsequenz komplementären DNA-Strang. Diese PCR-Zyklen (Denaturierung, Hybridisierung, Polymerisierung) werden je nach gewünschter Reaktion 20-50 mal durchlaufen und führen zu einer exponentiellen Amplifikation des markierten Zielbereiches. Ein abschließender Reaktionsschritt beim Temperaturoptimum der DNA-Polymerase führt zur Vervollständigung teilweise synthetisierter DNA-Stränge.

2.10. Nachweis einer Infektion mit P. falciparum durch PCR

Zur Diagnosesicherung der Plasmodienspezies (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae), sowie zum Nachweis einer submikroskopischen Infektion, wurden aus den peripher und plazentar gewonnenen Blutproben PCR-Untersuchungen durchgeführt. Da in dieser Arbeit nur die Infektion mit P. falciparum untersucht wurde, wird hier ausschließlich auf die diagnostische PCR des P. falciparum Bezug genommen. Die speziesspezifische PCR wurde nach Vorgaben von Snounou et al. (1993) durchgeführt.

2.10.1. Substanzen

 

rPUL5 (5´-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC-3´)

 

rPUL6 (5´-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3´)

 

rFAL1 (5´-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3´)

 

rFAL2 (5´-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3´)

2.10.2. Geräte

2.10.3. PCR-Protokoll

Der Nachweis einer plazentaren Infektion mit P. falciparum erfolgte in zwei Schritten. In einem ersten Schritt (äußere PCR) wurde unter Verwendung der Primer rPUL5 und rPUL6 und 2 μl genomischer DNA das spezifische ssRNA (small subunit ribosomal nucleid acid) -Gen der Gattung Plasmodium amplifiziert. Dieses Amplifikat diente in einem zweiten Schritt (innere PCR) als Matrize für die Amplifikation spezifischer Bereiche des ssrRNA-Gens der Spezies P. falciparum. Für diese innere PCR wurden die Primer rFAL1 und rFAL2 sowie 0,5 μl des Produktes der äußeren PCR verwendet. Die Tabelle 1 beschreibt die Zusammensetzung der Reaktionsansätze sowohl der inneren als auch äußeren PCR. Zur Vermeidung einer DNA-Kontamination wurden die Ansätze unter sterilen Bedingungen auf einer DNA-freien Arbeitsbank zusammengestellt. Die Temperaturzyklen der einzelnen zuvor beschriebenen Amplifikationsschritte beschreibt Tabelle 2 Alle Reaktionen erfolgten im Trithermoblock, Biometra.

Das für P. falciparum spezifische Amplifikationsprodukt hat eine Länge von 205 Basenpaaren. Der Längennachweis erfolgt durch Gel-Elektrophorese (siehe unten).


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Tabelle 1: Reaktionsansätze: diagnostische (innere und äußere) PCR (P. falciparum)

Substanz

Volumen / (μl )

Molarität im Ansatz

Wasser

900

 

Puffer

100

50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2

DNTP-Gemisch

6

500 μM

Primer 1

10

160 nM

Primer 2

10

160 nM

Taq-Polymerase

6

1 U/l

Tabelle 2: Reaktionsschritte: diagnostische (innere und äußere) PCR (P. falciparum)

 

Reaktionsschritt

Temperatur in °C

Reaktionsdauer in min

1.

Initiale Denaturierung

95

5

2.

25 Zyklen

  

2.1

Denaturierung

94

1

2.2

Primeranlagerung

58

2

2.3

Extension

72

2

3.

Abschließende Extension

72

5

2.10.4. Längenbestimmung der DNA- Amplifikate durch Gel- Elektrophorese

DNA-Moleküle und ihre Fragmente sind wegen ihrer chemischen Struktur bei neutralem pH-Wert negativ geladen. In einem elektrischen Feld bewegen sie sich deshalb von der Kathode zur Anode. Bei einer Agarose-Gel-Elektrophorese wandern sie durch die Poren des Agarose-Gels. Dabei werden größere Fragmente stärker in ihrer Mobilität gehindert als kleinere. Somit kommt es zur Auftrennung des DNA-Molekülgemisches nach der Größe der Basenpaarlänge. Die Qualität der Agarose sowie ihr Anteil an der Gelmatrix, die anliegende Spannung und die Elektrophoresezeit beeinflussen die Trennschärfe. Ethidiumbromid interkaliert mit DNA-Molekülen und fluoresziert in ultraviolettem Licht. Wird das Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt, können DNA-Fragmente im durchscheinenden UV-Licht sichtbar gemacht werden. Da zugleich DNA-Standards bekannter Basenpaarlänge in der Gel-Elektrophorese aufgetrennt werden, kann die Größe der untersuchten Proben ermittelt werden. Zur Durchführung der Gel-Elektrophorese wurde einem modifizierten Protokoll von Sharp et al. (1973) gefolgt.


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2.10.4.1.  Substanzen

2.10.4.2. Geräte

2.10.4.3. Protokoll

Für ein 1,5%iges Agarose-Gel wurden 0,6 g Agarose in 40 ml 0,5 x TBE gelöst und in der Mikrowelle erhitzt. Die entstandene visköse Flüssigkeit wurde mit 1 µl Ethidiumbromid-Lösung (0,2 µl/ml) versetzt und in eine Form gegeben. Bei einer Temperatur von ca. 4°C härtete das Gel aus. Durch seine Form entstanden ca. 0,5 X 1,5 mm Taschen, in die später 4,5 µl des PCR-Produkts, versetzt mit 1,5 µl Blaumarker, gegeben wurden. Um die Basenpaarlänge der Amplifikate abzuschätzen, wurden 2 µl der standardisierten Längenmarker (1/5 Vol DNA-Molekulargewichts-Marker V oder VI; 4/5 Vol Blaumarker) parallel aufgetragen. Die Agarose-Gel-Elektrophorese wurde in einer horizontalen Minigelkammer (Biorad) bei einer anliegenden Gleichspannung von 6 V/cm für 40 min durchgeführt. Anschließend wurden DNA-Fragmente im durchscheinenden ultravioletten Licht mit einer Wellenlänge von 254 nm dargestellt und mit Polaroidfotos dokumentiert.


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2.11.  Genotypisierung von P. falciparum

Zur Genotypisierung von P. falciparum wurden die Gene, die für die Merozoiten-Oberflächen-Proteine (msp-1, msp-2) kodieren, typisiert. Hierzu wurde vom Verfasser das von Snounou et al. (1999) beschriebene PCR-Protokoll verwendet. Die PCR erfolgt ebenfalls in zwei Schritten, einer äußeren und einer inneren PCR. Die Abbildungen 2 und 3 zeigen schematisch die amplifizierten Genbrüche des msp-1 und msp-2.

2.11.1. Geräte

2.11.2. Substanzen

Primer:

msp-1

Sequenz

Äußere

M1- OF

5’-CTAGAAGCTTTAGAAGATGCAGTATTG -3’

 

M1- OR

5’-CTTAAATAGTATTCTAATTCAAGTGGATCA -3’

K1

M1- KF

5’-AAATGAAGAAGAAATTACTACAAAAGGTGC-3’

 

M1- KR

5’-GCTTGCATCAGCTGGAGGGCTTGCACCAGA -3’

Mad 20

M1- MF

5’-AAATGAAGGAACAAGTGGAACAGCTGTTAC-3’

 

M1- MR

5’-ATCTGAAGGATTTGTACGTCTTGAATTACC-3’

Ro 33

M1- RF

5’-TAAAGGATGGAGCAAATACTCAAGTTGTTG-3’

 

M1- RR

5’- CATCTGAAGGATTTGCAGCACCTGGAGATC-3’


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Primer:

msp-2

Sequenz

Äußere

M2- OF

5’-ATGAAGGTAATTAAAACATTGTCATATTATA -3’

 

M2- OR

5’-CTTTGTTACCATCGGTACATTCTT-3’

FC27

M2- FCF

5’-AATACTAAGAGTGTAGGTGCARATGCTCCA-3’

 

M2- FCR

5’-TTTTATTTGGTGTCATTGCCAGAACTTGAAC-3’

IC

M2- ICF

5’-AGAAGTATGGCAGAAAGTAAKCCTYCTACT -3’

 

M2- ICR

5’-GATTGTAATTCGGGGGATTCAGTTTGTTCG -3’

2.11.2.1. Protokoll

Unter Verwendung der Primer M1-OF, M1-OR, M2-OF und M2-OR wurden in einer gemeinsamen äußeren PCR die konservierten Gensquenzen von msp-1 und msp-2 amplifiziert. Als Matrize dienten 2 μl genomische DNA. Die Amplifikation erfolgte in einem Reaktionsansatz von 24 μl, dessen Zusammensetzung Tabelle 3 beschreibt. Dieser Reaktionsansatz wurde unter sterilen Bedingungen auf einer PCR-Bank zusammengestellt. Sowohl äußere als auch innere PCR wurden im T3-Thermocykler (Biometra) nach den in Tabelle 2 bzw. 4 gezeigten Temperaturzyklen durchgeführt.

Tabelle 3: Reaktionsansätze der äußeren PCR (msp-1, msp-2)

Substanz

Volumen / (μl )

Molarität im Ansatz

   

Wasser

19

 

Puffer

2,5

50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2

Gelatine 1mg/ml

2,5

0,1mg/ml

dNTP- Gemisch

0,125

500 μM

M1-OF

0,2

160 nM

M1-OR

0,2

160 nM

M2-OF

0,2

160 nM

M2-OR

0,2

160 nM

Taq- Polymerase

0,2

1 U/l


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Tabelle 4: Reaktionsschritte der äußeren PCR (msp-1, msp-2)

 

Reaktionsschritt

Temperatur in °C

Reaktionsdauer in min

1.

Initiale Denaturierung

95

5

2. 35 Zyklen

  

2.1

Denaturierung

94

1

2.2

Primeranlagerung

58

2

2.3

Extension

72

2

3

Abschließende Extension

72

10

Als Matrize zur Amplifikation der Allele von msp-1 und msp-2 diente 1 μl des Produktes der äußeren Reaktionen. Hierzu wurden entsprechend der Allelfamilien (K1, Mad20, Ro33 und FC27, IC) fünf unabhängige innere PCRs durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung spezifischer Primer in einem Reaktionsgemisch von 49 μl. Tabelle 5 beschreibt die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches. Tabelle 6 zeigt den Reaktionsablauf im T3-Thermocycler.

Tabelle 5: Reaktionsansätze der innere PCR (K1, Mad20, Ro33 und FC27, IC)

Substanz

Volumen / (μl )

Molarität im Ansatz

Wasser

38

 

Puffer

5

50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2

Gelatine

5

1mg/ml (Konzentration)

dNTP- Gemisch

0,35

500 μM

Spez. Primer 1

0,4

160 nM

Spez. Primer 2

0,4

160 nM

Taq- Polymerase

0,3

1 U/l


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Tabelle 6: Reaktionsschritte der inneren PCR (K1, Mad20, Ro33 und FC27, IC)

 

Reaktionsschritt

Temperatur in °C

Reaktionsdauer in min

1.

Initiale Denaturierung

95

5

2. 30 Zyklen

  

2.1

Denaturierung

94

1

2.2

Primeranlagerung

61

2

2.3

Extension

72

2

3.

Abschließende Extension

72

5

2.12. Nachweis der Längenpolymorphismen von msp-1 und msp-2

Die Längenpolymorphismen der einzelnen Allele des msp-1-Gens und msp-2-Gens wurden durch hochauflösende Gelelektrophorese und anschließende rechnergestützter Bildanalyse nachgewiesen und ausgewertet.

2.12.1. Substanzen

2.12.2. Geräte


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2.12.3.  Protokoll

Zur hochauflösenden Gel-Elektrophorese wurde ein 2%ige GTG-Agarose-Gel mit einem Volumen von 200 ml und einer Lauflänge von ca. 8 cm genutzt. Es wurden 4 g reine GTG-Agarose mit 200 ml TBE-Puffer versetzt und in einer Mikrowelle für ca. 3 min verkocht. Die visköse Flüssigkeit wurde mit 5 µl Ethidiumbromid (0,2 µl/ml) versetzt und in eine Gelform gegeben. Nach einer Aushärtzeit von ca. 20 min bei einer Temperatur von 4°C wurde das Gel in einer horizontalen Elektrophoresekammer platziert. Die Substrattaschen (0,5 x 1,5 mm) wurden mit einem Gemisch aus je 10 μl des Reaktionsproduktes der inneren PCR und 0,6 μl Bromphenolblaumarker gefüllt. Zum besseren Vergleich wurden PCR-Amplifikate plazentar und peripher gewonnener Isolate von einer Patientin in direkt nebeneinanderliegende Substrattaschen gegeben. Als Referenz wurden in zwei Taschen Längenstandards mit einer Schrittweite von 100 Basenpaaren gegeben. Nach einer Elektrophoresezeit von 2 h bei einer Spannung von 80 V wurden bei Durchleuchtung mit UV-Strahlung die Amplifikatbanden durch Polaroid-Fotografie dokumentiert. Die Bilder wurden zur weiterführenden Auswertung mit dem PC-Scanner eingelesen und in eine digitales Format umgewandelt. Diese wurden in das Auswertungsprogramm BioDocAnalyze (Biometra) importiert. Suchalgorithmen dieses Programms durchsuchten den zur Auswertung bestimmten Bereich der Bildvorlage. Dabei wurden primär horizontale Spuren definiert. In einem zweiten Schritt wurden die vertikalen Amplifikatbanden durch eine standardisierte Densitographie ermittelt und graphisch gekennzeichnet. Da es aufgrund der Größe der Elektrophoresegele und der relativ langen Elektrophoresedauer in einigen Fällen zu einem ungleichmäßigen Laufmuster kam, musste bei einem Teil der Bildvorlagen eine programmgesteuerte Entzerrung vorgenommen werden. Dazu wurde eine Reihe von vorgegebenen Kurven dem tatsächlichem Verlauf so angepasst, dass Banden mit gleichem bekanntem Molekulargewicht sich auf gleicher Linie befanden. Hierzu mussten einige Gitterlinien nachträglich definiert werden. Die Koordinaten der gekennzeichneten Banden waren damit festgelegt. Zur Auswertung dieser Banden wurden den standardisierten Banden das spezifische Molekulargewicht bzw. die bekannte Basenpaarlänge zugeordnet. BioDocAnalyze konnte nun den gekennzeichneten Banden ein entsprechendes spezifisches Molekulargewicht bzw. eine spezifische Basenpaarlänge zuordnen.


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2.13.  Allel-Einteilung entsprechend der Basenpaarlänge der PCR-Amplifikate

Zur Bestimmung der Diversität von P. falciparum wurden die Amplifikate gruppiert. Aus Amplifikaten mit entsprechender Basenpaarlänge konnte auf einzelne Allele geschlossen werden. In Anlehnung an Snounou et al. (1999) erfolgte die Alleleinteilung entsprechend der Allelfamilien K1, Mad 20 und Ro 33 für das msp-1-Gen und FC27 und IC für das msp-2-Gen. PCR-Fragmente einer Allelfamilie, die bei der Gelelektrophorese in einem definierten Bereich von 20 Basenpaaren lagen, galten als identische Allele und wurden mit steigendem Zahlenwert benannt (Snounou et al. 1999). Diese Allele waren spezifisch für die Infektion mit spezifischen Klonen bzw. Genotypen. Zur Vereinfachung werden in dieser Arbeit die Begriffe Allel, Genotyp und Stamm als Synonyme gebraucht (Einteilung siehe Tabelle 8).

2.14. Multiplizität der Infektion mit P. falciparum

Die Bestimmung der Multiplizität der Infektion mit P. falciparum richtete sich ebenfalls nach Vorgaben von Snounou et al. (1999). Hierzu wurden jeweils aus peripher und plazentar gewonnenen Isolaten die Summe aller nachgewiesenen Allele sowohl für msp-1 als auch für msp-2 unabhängig voneinander bestimmt und nachfolgend addiert. Die Summe mit dem größeren Betrag ergab die Multiplizität der Infektion. Die Tabelle 7 zeigt einzelne Beispiele zur Bestimmung der Multiplizität der Infektion:

Tabelle 7: Beispiele zur Bestimmung der Multiplizität der Infektion (MOI)

 

FC27

IC

msp-2

Σ FC27; IC

K1

Mad 20

Ro 33

msp-1

Σ K1; Mad20; Ro 33

MOI

Max (msp-1; msp-2)

Anzahl der Fragmente

2

3

5

2

2

2

6

6

4

2

6

3

1

1

5

6

0

3

3

1

1

1

3

3

msp-1 = Summe aller nachgewiesenen Allele der Allelfamilien K1; Mad20; Ro 33, msp-2 = Summe aller nachgewiesenen Allele der Allelfamilien FC 27, IC; Summe mit dem größeren Betrag ergab die Multiplizität der Infektion = MOI Max (msp-1; msp-2).


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Tabelle 8: Einteilung der Genotypen

BP-Länge der

PCR- Fragmente

Genotypen (peripheres Isolat)

Genotypen (plazentares Isolat)

       
       

120-139

K1M01

MAD20M01

 

K1P01

MAD20P01

 

140-159

K1M02

MAD20M02

 

K1P02

MAD20P02

 

160-179

K1M03

MAD20M03

 

K1P03

MAD20P03

 

180

  

Ro33M1

  

Ro33P1

180-199

K1M04

MAD20M04

 

K1P04

MAD20P04

 

200-219

K1M05

MAD20M05

 

K1P05

MAD20P05

 

220

  

Ro33M2

  

Ro33P2

220-239

K1M06

MAD20M06

 

K1P06

MAD20P06

 

240-259

K1M07

MAD20M07

 

K1P07

MAD20P07

 

260-279

K1M08

MAD20M08

 

K1P08

MAD20P08

 

280-299

K1M09

MAD20M09

 

K1P09

MAD20P09

 

300-319

K1M10

MAD20M10

 

K1P10

MAD20P10

 

320-339

K1M11

MAD20M11

 

K1P11

MAD20P11

 
       

120-139

ICM01

FCP01

 

ICM01

FCP01

 

140-159

ICM02

FCP02

 

ICM02

FCP02

 

160-179

ICM03

FCP03

 

ICM03

FCP03

 

180-199

ICM04

FCP04

 

ICM04

FCP04

 

200-219

ICM05

FCP05

 

ICM05

FCP05

 

220-239

ICM06

FCP06

 

ICM06

FCP06

 

240-259

ICM07

FCP07

 

ICM07

FCP07

 

260-279

ICM08

FCP08

 

ICM08

FCP08

 

280-299

ICM09

FCP09

 

ICM09

FCP09

 

300-319

ICM10

FCP10

 

ICM10

FCP10

 

320-339

ICM11

FCP11

 

ICM11

FCP11

 

340-359

ICM12

FCP12

 

ICM12

FCP12

 

360-379

ICM13

FCP13

 

ICM13

FCP13

 

380-399

ICM14

FCP14

 

ICM14

FCP14

 

400-419

ICM15

FCP15

 

ICM15

FCP15

 

420-439

ICM16

FCP16

 

ICM16

FCP16

 

440-459

ICM17

FCP17

 

ICM17

FCP17

 

460-479

ICM18

FCP18

 

ICM18

FCP18

 

480-499

ICM19

FCP19

 

ICM19

FCP19

 

500-519

ICM20

FCP20

 

ICM20

FCP20

 

520-539

ICM21

FCP21

 

ICM21

FCP21

 

540-559

ICM22

FCP22

 

ICM22

FCP22

 

560-579

ICM23

FCP23

 

ICM23

FCP23

 

580-599

ICM24

FCP24

 

ICM24

FCP24

 

600-620

ICM25

FCP25

 

ICM25

FCP25

 

Dargestellt sind einzelne Allele des msp-1 und msp-2 mit Basenpaarlängen (BP-Länge) der PCR-Amplifikate der inneren PCR; peripheres Isolat (M), plazentares Isolat (P).


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2.15.  Statistische Berechnungen

Die Grundlagen der in dieser Arbeit durchgeführten statistischen Berechnungen basieren auf den Handbüchern von Wernecke (Institut für medizinische Biometrie, HU-Berlin), Kreienbrock und Schach (2000), sowie Sachs (1999). Alle Berechnungen wurden mit den Programmen Excel (Microsoft) oder SPSS 10.0 durchgeführt.

2.15.1. Assoziationsberechnungen

Um Assoziationen von Variablen nominalen Charakters zu analysieren, wurden mehrere Verfahren zur Überprüfung von Unterschiedshypothesen durchgeführt. Zuerst wurde die Nullhypothese mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 formuliert. Traf die Nullhypothese zu, so waren die Merkmale voneinander unabhängig. Traf sie nicht zu, so wurde die Alternativhypothese formuliert, d.h. es bestand ein Zusammenhang zwischen den Merkmalen. Um die Häufigkeiten dieser Merkmale bzw. Merkmalskombinationen zu analysieren, wurden die Daten jeweils auf 2 x 2 Felder-Tafeln (Tab. 9) überführt und dann der Chi2-Test durchgeführt. Bei diesem Test werden die tatsächlichen gegenüber den erwarteten Beobachtungen verglichen.

Tabelle 9: 2 x 2 Felder-Tafel unabhängiger Stichproben; Häufigkeiten (w, t, u, v)

 

Polyklonalität

 

ja

nein

gesamt

Frühgeburtlichkeit

ja

w

t

w+t

nein

u

v

u+v

gesamt

w+u

t+v

n

Wurden im Chi2-Test signifikant von der Nullhypothese der Unabhängigkeit abweichende Häufigkeiten von Merkmalsausprägungen gefunden, erfolgte bei geeigneten Vergleichen die Bestimmung der Odds Ratio (OR) als Maß für die Stärke der Assoziation. Die Odds-Ratio ist als das „Chancenverhältnis“, mit der eine Merkmalsausprägung in einer Stichprobe auftritt, zu verstehen. Die Odds-Ratio aus dem obigen Beispiel berechnet sich als: OR = a x d / b x d. Dabei wurde mit einem Konfidenzintervall von 95% gearbeitet. Mit Hilfe des Chi²-Test für Trend wurden Assoziationen zwischen ordinalen Variablen, die zu Gruppen zusammengefasst wurden, berechnet. Dabei wurde die Hypothese überprüft, ob sich Ausprägungen zwischen Variablen, die in logischer Reihe standen, signifikant voneinander unterscheiden.


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Waren vergleichende Stichproben voneinander abhängig (oder verbunden), wurde der Chi²-Test nach McNemar angewandt. Dieser Test wird nachfolgend näher beschrieben. Die 2x2-Tafel wird in Tabelle 10 gezeigt.

Tabelle 10: 2 x 2 Felder-Tafel abhängiger Stichproben; Häufigkeiten (w, t, u, v)

 

Allelnachweis (plaz. Isolat)

 

Allel ja

Allel nein

gesamt

Allelnachweis

(periph. Isolat)

Allel ja

w [π (x,x)]

t [π (x,y)]

w+t

Allel nein

u [π (y,x)]

v [π (y,y)]

u+v

 

gesamt

w+u

t+v

n

In der Tabelle stehen die Wahrscheinlichkeiten [π (x,x), π (x,y), π (y,x), π (y,y)] der Populationen hinter den Häufigkeiten (w,t,u,v) in Klammern, um deren Vergleich es geht. Bei der Beurteilung möglicher Unterschiede spielen nur unterschiedliche Merkmalsausprägungen eine Rolle. Bei verbundenen Stichproben lässt sich deshalb die Nullhypothese als H0: π (x,y) = π (y,x) angeben.

Die verbundenen Stichproben unterscheiden sich nicht, wenn die Wahrscheinlichkeiten für das Auftreten ungleichartiger Ausprägungen gleich sind.

Als Prüfgröße dient der McNemar-Test: χ²= (t-u)²/ t+u

Die Nullhypothese wird abgelehnt bei p < 0,05. Es wird die Alternativhypothese formuliert (Wernecke, Skript Medizinische Biometrie, HU-Berlin).

Waren stetige Variablen normal verteilt, so erfolgte der t-Test nach Student, um Assoziationen zu bestimmten Merkmalsausprägungen zu analysieren. Dieser Test vergleicht die Mittelwerte zweier Stichproben und klärt die Frage, ob auftretende Mittelwertabweichungen sich durch zufällige Schwankungen erklären lassen oder nicht.

Im Falle von stetigen Variablen, die nichtparametrisch verteilt waren, wurde der U-Test nach Mann-Whitney angewandt. Dieser auf dem sogenannten Wilcoxon-Test für unabhängige Stichproben basierende Rangtest ist das verteilungsunabhängige Gegenstück zum parametrischen t-Test für den Vergleich zweier Mittelwerte stetiger Verteilungen. Mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurde bei beiden Testverfahren die Nullhypothese formuliert, so dass zwischen zwei verglichenen Messreihen kein Unterschied vorliegt.


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Um mehrere unabhängige Stichproben zu vergleichen, wurde der H-Test nach Kruskal-Wallis angewandt. Dieser H-Test ist eine Verallgemeinerung des oben angeführten U-Tests. Bei unabhängigen Stichproben, die durch eine Gruppenvariable definiert waren und aus derselben Grundgesamtheit stammten, wurde der H-Test nach Jonckheere-Terpstra durchgeführt. Dieser Test eignet sich für stetige oder geordnete kategoriale Daten. Er ist aussagekräftiger als der Kruskal-Wallis-Test, wenn die Grundgesamtheiten ordinales Messniveau aufweisen.

Um den unabhängigen Einfluß von verschiedenen Variablen auf eine binare Zielgröße zu untersuchen, wurden logistische Regressionsmodelle verwendet. Die sich daraus ergebenden adjustierten Odds-Ratios mit ihren 95% Konfidenzintervallen beschreiben demnach die Wahrscheinlichkeit, dass eine Variable mit der Zielgröße assoziiert ist, und berücksichtigt dabei den potentiellen Einfluss anderer, ebenfalls assoziierter Variablen. Multiple logitische Regressionen wurde verwendet, um unabhängige Risikofaktoren für das Auftreten zum Beispiel einer Frühgeburtlichkeit zu definieren. Dadurch konnten sich überlappende Einflussgrößen, wie z.B. die Parasitdichte, eine Anämie sowie die Multiplizität der Infektion, in ihrer Auswirkung getrennt analysiert werden. Unabhängige Variablen wurden in das Regressionsmodell eingegeben, wenn sie in univariater Analyse signifikant mit der abhängigen Variablen assoziiert waren (p < 0,05).


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25.05.2004