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4.  Diskussion

In Endemiegebieten stellt die Malaria tropica in der Schwangerschaft noch immer ein erhebliches Gesundheitsproblem dar (McGregor 1984; Sullivan et al. 1999; Menendez et al. 2000). Nur wenig ist über die Häufigkeit und Bedeutung polyklonaler Infektionen mit P. falciparum in der Schwangerschaft bekannt. Die wenigen hierzu veröffentlichen Arbeiten sind zudem widersprüchlich (Beck et al. 2001; Schleiermacher et al. 2001; Kassberger et al. 2002; Saute et al. 2002). Verschiedene Studien in Endemiegebieten bei Kindern und Erwachsenen über die klonale Zusammensetzung von Infektionen mit P. falciparum haben gezeigt, dass es möglicherweise Zusammenhänge zwischen der Multiplizität der Infektion und klinischer Manifestation der Malaria gibt (Beck et al. 2001; Schleiermacher et al. 2001; Saute et al. 2002). Andere Studien zeigten, dass polyklonale P.-falciparum-Infektionen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Abwehrmechanismen und einer körpereigenen Immunität haben (Felger et al. 1999; Smith et al. 1999; Smith et al. 1999; Beck et al. 2001). Darüber hinaus wurde beschrieben, dass bestimmte Genotypen von P. falciparum mit klinischen Manifestationsformen einer Malaria assoziiert sind (Engelbrecht et al. 1995; Gupta et al. 1995; Robert et. al. 1996; Ariey et al. 2001; Ofosu-Okyere et al. 2001). Die meisten Studien, die diese Themen beleuchteten, führten Analysen auf der Grundlage peripher gewonnener Blutproben durch (Engelbrecht et al. 1995; Gupta et al. 1995; Robert et al. 1996; Felger et al. 1999; Ariey et al. 2001; Beck et al. 2001; Ofosu-Okyere et al. 2001). Es ist jedoch ungeklärt, ob diese die Gesamtheit aller koinfizierenden Genotypen bei Schwangeren darstellen kann (Kamwendo et al. 2002; Kassberger et al. 2002; Schleiermacher et al. 2002). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Zusammenhänge darzustellen, die mit der Infektion von spezifischen Genotypen und der Multiplizität der Infektion bei Schwangeren assoziiert sind. Um die Gesamtheit aller Genotypen darstellen zu können, wurden Analysen aus peripher und plazentar gewonnenen Isolaten durchgeführt. Die wichtigsten in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:

  1. Spezifische Genotypen konnten signifikant häufer in Agogo, andere spezifische Genotypen konnten signifikant häufiger in der ländlichen Umgebung beobachtet werden.
  2. Eine Assoziation spezifischer Genotypen mit der Parität konnte nicht nachgewiesen werden.
  3. Die Genotypisierung aus peripher gewonnen P.-falciparum-Isolaten spiegelte nur in 12% der Fälle das klonale Gesamtbild einer P.-falciparum-Infektion bei schwangeren Frauen wider.[Seite 78↓]
  4. Spezifische Genotypen von P. falciparum konnten signifikant häufiger ausschließlich in plazentar gewonnenen Isolaten nachgewiesen werden, als ausschließlich in peripher gewonnenen.
  5. Die Allelfamilie FC27 war in multivariater Analyse mit Frühgeburtlichkeit assoziiert. Zumindest zeigte sich in univariater Analyse eine Assoziation mit vermindertem Geburtsgewicht und Anämie.
  6. Der Anteil an polyklonalen plazentaren P.-falciparum-Infektion war mit 81% sehr hoch. Die Multiplizität der Infektion korrelierte vor allem mit der Parasitendichte der Infektion. Eine Abhängigkeit der Multiplizität der Infektion von Alter und Parität konnte nur in Abhängigkeit zur Parasitendichte nachgewiesen werden.
  7. Im Vergleich zu monoklonalen plazentaren Infektionen war die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten einer Frühgeburt bei Infektionen mit zwei oder mehr als zwei Stämmen unabhängig von der Parasitendichte erhöht. Dies konnte insbesondere bei Primiparae und zudem bei Patientinnen mit submikroskopischen plazentaren Infektionen beobachtet werden.

Die folgende Diskussion der Arbeit setzt sich zuerst kritisch mit verwendeten Methoden auseinander, anschließend erfolgt die Diskussion der Ergebnisse.

4.1. Diskussion der Methoden

4.1.1. Studiendesign

Die Befund der vorliegenden Arbeit wurden im Rahmen einer Querschnittstudie erhoben. Dieses Studiendesign macht es in erster Linie möglich, Aussagen zur Prävalenz einzelner Genotypen von P. falciparum und von polyklonalen P.-falciparum-Infektionen zu treffen. Die Exploration war somit das Hauptinteresse dieser Studie. Prinzipiell kann bei Querschnittstudien innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums eine große Zahl an Probanden untersucht werden. Innerhalb eines Jahres konnten so am Presbyterian Mission Hospital Agogo insgesamt 893 gebärende Frauen untersucht werden. Gegenstand der hier beschriebenen Analysen waren die Frauen, die eine plazentare Malaria aufwiesen. Eine derartige Probandinnenzahl ermöglicht einen hohen Grad an Repräsentativität. Die Infektion mit P. falciparum stellt jedoch in Endemiegebieten häufig eine chronische Infektion dar (Bulmer et al. 1993; Fried et al. 1996). Deshalb kann davon ausgegangen werden, dass neben den hier untersuchten Faktoren der Verlauf sowie die Dynamik einer Infektion eine wichtige Bedeutung für ihre klinische Manifestation haben. Da für die hier bearbeiteten Fragestellungen plazentare Untersuchungsproben notwendig waren, konnte das Untersuchungsmaterial erst nach der Geburt des Kindes gewonnen werden. Eine schwangerschaftsbegleitende Langzeitstudie war [Seite 79↓]somit nicht möglich, wäre aber aussagekräftiger als eine Querschnittsstudie. Jedoch konnten durch mikroskopische Untersuchungen des plazentaren Blutausstrichs Rückschlüsse auf die Infektionsdauer gezogen werden (Bulmer et al. 1993). Die Rekrutierungszeit von einem Jahr hatte zudem den Vorteil, dass ein Teil der Probandinnen während der Regenzeit und ein anderer während der Trockenzeit ihre Kinder gebaren. Saisonale Einflüsse konnten so ebenfalls berücksichtigt werden. Die 474 untersuchten Frauen kamen aus der Stadt Agogo (n = 243) und aus der umliegenden ländlichen Gegend (n = 231). Die Ergebnisse von Frauen aus Agogo und der ländlichen Umgebung im Bezug auf die Multiplizität der Infektion waren annähernd gleich. Infolgedessen wurde bei der Untersuchung der Multiplizität der Infektion auf eine Unterteilung der statistischen Analysen in Land- und Stadtbevölkerung verzichtet. Die Diversität wurde getrennt nach dem Wohnort der Patientinnen untersucht. Hierdurch konnten lokale Unterschiede erkannt werden.

Nachweis einer plazentaren P.-falciparum - Infektion

Zum Nachweis einer plazentaren Infektion mit P. falciparum erfolgten mikroskopische Untersuchungen. Die Nachweisgrenze der Parasitämie liegt bei einer Parasitendichte von ca. 0,0003% (Clendennen et al. 1995). Zur Sicherung der mikroskopischen Diagnose erfolgte zusätzlich der Nachweis parasitärer DNA mittels diagnostischer PCR. Bei allen Frauen, bei denen keine plazentare Infektion mikroskopisch nachweisbar war, erfolgte ebenfalls eine diagnostische PCR. Hierdurch erhöht sich die Probandenzahl. Die geschätzte Parasitendichte bei Infektionen, die nur mittels diagnostischer PCR, nicht aber mit der Mikroskopie nachgewiesen werden können, entspricht nach Einschätzungen verschiedener Arbeitsgruppen ca. 0,00005% (Snounou et al. 1993; May et al. 1999).

Genotypisierung von P. falciparum

Um die Diversität von P. falciparum und die Multiplizität der Infektion bestimmen zu können, wurden in der hier dargestellten Arbeit msp-1 und msp-2 typisiert. Zur Typisierung dieser hoch polymorphen Gene wurde die von Snounou et al. (1999)etablierte Methode einer kombinierten, geschachtelten PCR verwendet. Diese Methode ist spezifisch für P. falciparum, so dass nur bei positiven P.-falciparum-Proben eine Genotypisierung erfolgte. Infektionen mit P. ovale, P. malariae oder P. vivax führen zu keinem positiven PCR-Ergebnis (Snounou et al. 1999).Zudem ist die Sensitivität der Methode sehr hoch. Snounou et al.(1999)beschreiben, dass auch nach 10-facher Serienverdünnung des ursprünglichen Reaktionsansatzes mit genomischer DNA von nur 10 Parasiten durchgehend ein positives Ergebnis erzielt werden konnte. Snounou et al. (1999)versichern, dass das Ergebnis der PCR nicht durch die ursprüngliche DNA-Menge beeinflusst wurde, so dass die Reaktion nach dem „Alles-oder-Nichts“ Gesetz folgte. Dies hatte den großen Vorteil, dass diese Methode auch bei den submikroskopischen Infektionen, wie sie [Seite 80↓]häufig im Untersuchungsgebiet von Agogo auftreten (Mockenhaupt et al. 2000; Beck et al. 2001), nicht zu falschnegativen Ergebnissen führte. Trotz der hohen Sensitivität der von Snounou etablierten PCR-Methode zur Genotypisierung soll aber betont werden, dass bei anderen PCR-Methoden, die von anderen Arbeitsgruppen verwendet wurden, eine Abhängigkeit der Sensitivität von der Parasitendichte beschrieben wurde. Bei sehr niedrigen Konzentrationen an genetischem Material konnte nicht ausgeschlossen werden, dass einzelne Allele nicht erkannt wurden (Contamin et al. 1995; Schleiermacher et al. 2001). Es könnte also sein, dass auch in der hier beschriebenen Arbeit einzelne Genotypen nicht erkannt wurden und so die Diversität von P. falciparum sowie die Multiplizität der Infektion als zu niedrig eingeschätzt wurden. Um diesen Fehler zu minimieren, wurde bei einem unklaren Ergebnis die PCR wiederholt. Die PCR-Reaktionen lieferten in 474 Fällen ein positiven Ergebnis. Das heißt, dass wenigstens ein Allel in jedem Fall nachgewiesen wurde. Zur Steigerung der Sensitivität einer PCR könnte bei zukünftigen Untersuchungen in Betracht gezogen werden, das PCR-Produkt radioaktiv zu markieren. Eine solche Markierung würde, wie Bottius et al. (1996) beschreiben, die Sensitivität um das 10-fache erhöhen.

In der ersten äußeren Amplifikationsreaktion wurden Primer gewählt, die so strukturiert sind, dass sie alle bis heute für P. falciparum bekannten Sequenzvarianten hybridisieren. Snounou et al. (1999) wiesen nach, dass eine kombinierte äußere Amplifikationsreaktion mit Primerpaaren spezifisch für msp-1 und msp-2 die Spezifität und Sensitivität der inneren PCR nicht beeinflussen. In vorliegender Arbeit wurden ebenfalls die Primerpaare für beide Genloci kombiniert. Hieraus entstand ein großer zeitlicher Vorteil. Zum Nachweis der verschiedenen Gensequenzen der einzelnen Allelfamilien von msp-1 und msp-2 wurde nach der gemeinsamen äußeren PCR mit fünf verschiedenen getrennten inneren PCR-Ansätzen die 3 Allelfamilien von msp-1 (K1, Mad20, Ro33) und die 2 Allelfamilien von msp-2 (FC27, IC) bestimmt.

Nach Amplifikation der für die einzelnen Allelfamilien spezifischen Gensequenzen wurden die einzelnen Allele der jeweiligen Allelfamilie, die sich durch die Unterschiede der Basenpaarlänge auszeichnen, entsprechend ihrer Basenpaarlänge mittels Gelelektrophorese voneinander getrennt. Da die Unterschiede der Basenpaarlänge eines jeden Allels sehr gering sein können, war eine hohe Trennschärfe nötig. Um diese zu erreichen, wurde die kostenintensive GTG-Agarose und eine sehr lange Elektrophoresezeit von 2 Stunden gewählt. Um das höchste Maß an Trennschärfe zu erreichen, wurde auf die von Snounou et al. (1999)vorgeschlage wiederholte Verwendung der GTG-Agarose bewusst verzichtet. Um die Basenpaarlänge eines jeden Amplifikates, die spezifisch für jedes einzelne Allel ist, so genau wie möglich zu ermitteln, wurde sie mit dem digitalen Auswertungsprogramm BioDocAnalyse analysiert (Nuske 1999). Mit BioDocAnalyse können „ungleichmäßig gelaufene Gele“, welche ein störendes Phänomen bei einer derartig langen Elektrophoresezeit darstellen, so entzerrt werden, dass eine Auswertung möglich bleibt (Nuske 1999). Jedoch hat auch ein digitales Auswertungsprogramm Grenzen. [Seite 81↓]Einzelne wenige Allele, die sich in vorliegender Arbeit nur um einzelne Basenpaare unterschieden, konnten möglicherweise nicht als zu unterscheidende Allele erkannt werden und galten fälschlicherweise als identisch. Es wäre also möglich, dass auch hier die Diversität von P. falciparum als zu niedrig eingeschätzt wurde. Ein weiterer Grund zu Fehleinschätzungen sind die methodischen Grenzen der Gel-Elektrophorese. Wie auch von anderen Arbeitsgruppen wurde in der vorliegenden Arbeit bei der Einteilung der Allele eine Varianzbreite von zwanzig Basenpaaren zugelassen (Konate et al. 1999; Snounou et al. 1999). Auch hier besteht, die Möglichkeit, dass einzelne Allele nicht voneinander unterschieden werden konnten. Die Diversität von P. falciparum kann auch durch diese methodischen Grenzen unterschätzt werden.

Die Allele der einzelnen Allelfamilien unterscheiden sich, wie beschrieben, zum einen in ihrer Basenpaarlänge und zum anderen in ihrer Allelsequenz. Die Hauptunterschiede der Allelsequenzen, wie die der einzelnen Allelfamilien, werden problemlos durch die verschiedenen spezifischen Primer in der PCR erkannt. Kleine Sequenzvarianten der DNA einzelner Allelabschnitte, wie sie nach Punktmutationen auftreten können (Contamin et al. 1995; Snounou et al. 1999), sind mit dieser Methode nicht in jedem Fall erkannbar. Zwei Allele, die zufällig eine gleiche Basenpaarlänge besitzen, könnten also kleine Unterschiede in der Sequenz bzw. der Sequenzabfolge aufweisen und würden mit dieser Methode nicht als zu unterscheidende Allele erkannt (Snounou et al. 1998).

Durch ein direktes Sequenzieren eines jeden DNA-Amplifikats könnten theoretisch die zuvor beschriebenen Fehlerquellen ausgeschlossen werden. Es wäre möglich, die genaue Nukleodidabfolge für ein jedes Allel zu erkennen. Verschiedene Genotypen könnten so mit absoluter Sicherheit voneinander unterschieden werden. Jedoch wird das Sequenzieren für epidemiologische Untersuchungen als nicht sehr praktikabel beschrieben, da es aufwendig und kostenintensiv ist (Snounou et al. 1998). Man könnte aber in Erwägung ziehen, eine Genotypisierung auf parasitärer RNA-Eben durchzuführen. Eine derartige Methode konnte sich aber bis heute nicht für die Genotypisierung von msp-1 und msp-2 unter Feldbedingungen durchsetzen, was durch die Instabilität der RNA gegen RNA-zerstörende Enzyme bedingt ist.

Erst kürzlich wurden in einer Multicenterstudie unterschiedliche PCR-Methoden, die von verschiedenen Arbeitsgruppen zur Genotypisierung von msp-1 und msp-2 genutzt werden, auf Vergleichbarkeit ihrer Ergebnisse untersucht (Färnert et al. 2001). Die Sensitivität und die Spezifität der verschiedenen PCR-Methoden waren, mit wenigen Ausnahmen, ähnlich hoch. Internationale Arbeitsgruppen haben abschließend festgestellt, dass trotz der zuvor beschriebenen Grenzen die PCR derzeit die am besten geeignete Methode zur Typisierung polymorpher Gene darstellt. Daraus ergibt sich, dass sie als das wichtigste Werkzeug zur Darstellung der Diversität von P. falciparum und zur Darstellung der Multiplizität der Infektion in epidemiologischen Studien angesehen wird (Färnert et al. 2001). Msp-1 und msp-2 gelten [Seite 82↓]derzeit als die aussagekräftigsten Marker. Die Kombination verschiedener Genloci, wie in der vorliegenden Arbeit die Kombination von msp-1 und msp-2, erhöht deren Aussagekraft zur Bestimmung der Multiplizität der Infektion (Ntoumi et al. 1995; Beck et al. 1997; Babiker et al. 1999; Smith et al. 1999; Beck et al. 2001).

4.2. Diskussion der Ergebnisse

4.2.1.  P.-falciparum-Infektionen in der Schwangerschaft

Die Infektion mit P. falciparum ist ein häufiger Befund bei schwangeren Frauen in hochendemischen Malariagebieten (McGregor 1984; Diagne et al. 1997; Menendez et al. 2000; Shulman et al. 2001). Auch die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Prävalenz einer plazentaren P.-falciparum-Infektion im Endemiegebiet von Agogo hoch ist. So wurde bei 53% aller untersuchten Gebärenden eine plazentare Infektion mit P. falciparum nachgewiesen. Die Prävalenz einer P.-falciparum-Infektion liegt bei Nichtschwangeren der Ashanti Region mit 49% etwas unter der hier ermittelten, wobei die Durchseuchung im Untersuchungsgebiet im Vergleich zu anderen Gebieten Ghanas als hoch einzuschätzen ist (Browne et al. 2000). Ähnlich wie in anderen Untersuchungen (McGregor 1984; Diagne et al. 1997; Sullivan et al. 1999; Menendez et al. 2000; Mockenhaupt et al. 2002) waren in der hier dargestellten Studie die Prävalenz einer mikroskopisch nachweisbaren P.-falciparum-Infektion in der Plazenta sowie die plazentaren Parasitendichten bei Primiparae signifikant höher als bei Multiparae.

Eine plazentare Malaria geht mit schweren Gesundheitskomplikationen für die Mutter und in Folge für das Neugeborene einher. So wiesen neben anderen Sullivan et al. (1999) und Menendez et al. (2000) ein signifikant höheres Risiko für eine Frühgeburtlichkeit und ein vermindertes Geburtsgewicht bei einer plazentaren Malaria nach. Die Prävalenz einer Frühgeburtlichkeit (18%) und eines verminderten Geburtsgewichtes (22%) war bei den hier untersuchten Gebärenden genau wie in anderen Malaria-Endemiegebieten sehr hoch (Sullivan et al. 1999; Menendez et al. 2000). Primiparae waren im Vergleich zu Multiparae signifikant häufiger von einer Frühgeburtlichkeit sowie einem verminderten Geburtsgewicht betroffen (McGregor 1984; Diagne et al. 1997; Ordi et al. 1998; Sullivan et al. 1999; Shulman et al. 2001). Zur Prävention derartiger Komplikationen sollte unter anderem die frühe Diagnosestellung einer plazentaren P.-falciparum-Infektion bei Schwangeren von besonderem klinischen Interesse sein. Ein hoher Anteil an plazentaren Infektionen wird jedoch durch die mikroskopische Untersuchung peripher gewonnener Blutproben nicht nachgewiesen (Leke et al. 1999; Mockenhaupt et al. 2002). So verglichen Mockenhaupt et al. (2002)verschiedene Methoden zur peripheren Diagnostik einer plazentaren P.-falciparum-Infektion. Sie stellten fest, dass im Gegensatz zur mikroskopischen Untersuchung und dem Nachweis von P. falciparum sekretiertem Histidin-Rich-Protein 2 (HRP2) die diagnostische PCR aus einer peripheren [Seite 83↓]Blutprobe zu fast 100% eine plazentare Malaria darstellen kann. Zur Wertung dieses Befundes wurde von Mockenhaupt et al. (2002)wie auch von Snounou et al. (1993)angenommen, dass es bei einer plazentaren Malaria zu einer sehr niedrigen, oft sogar nur submikroskopischen peripheren Parasitämie kommt. Andererseits diskutierten Mockenhaupt et al. (2002), dass der Nachweis nicht vitaler genomischer DNA von Parasiten, die zuvor in der Plazenta phagozytiert wurde, Ursache für ein positives PCR-Ergebnis sein könnte (Snounou et al. 1993; Mockenhaupt et al. 2002). Die diagnostische PCR aus einer peripheren Blutprobe bei einer Schwangeren konnte somit lediglich eine Information darüber geben, ob die Schwangere mit P. falciparum infiziert ist. Eine Aussage über eine plazentare Sequestration einzelner Subtypen von P. falciparum konnte mit dieser Methode nicht getroffen werden. Außerdem konnte keine Informationen darüber gewonnen werden, mit wie viel verschiedenen Genotypen die Schwangere infiziert war. Da jedoch in Endemiegebieten Infektionen mit P. falciparum sehr häufig polyklonal verlaufen (Robert et al. 1996; Beck et al. 1997; Smith et al. 1999; Beck et al. 2001; Schleiermacher et al. 2001), könnte angenommen werden, dass bei einer Genotypisierung der Parasiten aus einer peripheren Blutprobe nur ein Teil der Parasitenpopulation erkannt wurde. Dies ist insofern problematisch, als es in verschiedenen Studien, die Untersuchungen zur Epidemiologie polyklonaler P.-falciparum-Infektionen bei Schwangeren durchgeführt haben, möglicherweise zu Fehlinterpretationen gekommen ist (Beck et al. 2001; Schleiermacher et al. 2001; Saute et al. 2002). Beispielsweise wiesen Beck et al. (2001) im Untersuchungsgebiet der vorliegenden Arbeit einen Zusammenhang zwischen der Multiplizität der Infektion und einer Anämie, dem Alter und der Gravidität nach, was hier nur eingeschränkt bestätigt werden konnte.

4.2.2. Diversität von P. falciparum

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass P. falciparum im holoendemischen Untersuchungsgebiet von Agogo und Umgebung eine sehr hohe genetische Diversität besitzt. Durch die Genotypisierung von msp-1 und msp-2 konnten insgesamt 22 Allele des msp-1 und 40 Allele des msp-2 bestimmt werden. Eine derartig hohe Diversität von P. falciparum konnten Beck et al. (2001) im gleichen Untersuchungsgebiet nicht nachweisen. Bei der damaligen Untersuchung wurden lediglich 12 voneinander zu unterscheidende Allele des msp-1 ermittelt. Dieser Unterschied beim Nachweis der Diversität von Beck et al. (2001) und der vorliegenden Arbeit ist höchstwahrscheinlich auf die weniger sensible PCR-Methode zurückzuführen, die in den Untersuchungen von Beck et al. (2001) verwendet wurde. Zudem erfolgten die Auswertungen der PCR-Amplifikatbanden der Gelelektrophorese nicht rechnergestützt. Da jedoch einzelne Allele nur sehr geringe Unterschiede aufweisen können (Snounou et al. 1998), kann eine manuelle Auswertung dazu führen, dass einzelne Allele nicht voneinander unterschieden werden können. Durch die Verwendung einer hochsensitiven geschachtelten [Seite 84↓]PCR-Methode und der digitalen Auswertung mit dem Auswertungsprogramm BioDocAnalyse konnte bei der vorliegenden Arbeit die für holoendemische Malariagebiete übliche Diversität von P. falciparum ermittelt werden. In Bezug auf die genetische Diversität von P. falciparum entspricht so das Ergebnis der vorliegenden Arbeit anderen Studien in Endemiegebieten Afrikas (Contamin et al. 1995; Robert et al. 1996; Beck et al. 1997; Färnert et al. 1999; Felger et al. 1999; Smith et al. 1999; Peyerl-Hoffmann et al. 2001), dagegen erscheint die von Beck et al. (2001) ermittelte Diversität von P. falciparum für ein holoendemisches Malariagebiet als zu niedrig.

Wie von verschiedenen Autoren beschrieben, ist die Diversität von P. falciparum von der Transmission des Erregers abhängig (Contamin et al. 1995; Robert et al. 1996; Beck et al. 1997; Färnert et al. 1999; Felger et al. 1999; Smith et al. 1999; Peyerl-Hoffmann et al. 2001). So wurde in anderen holo- und mesoendemischen Gebieten eine hohe genetische Diversität von P. falciparum beobachtet (Robert et al. 1996; Felger et al. 1999). Beispielsweise konnten in einer Studie in einem mesoendemischen Gebiet in Senegal 33 msp-1-Allele und 47 msp-2-Allele nachgewiesen werden (Konate et al. 1999). In West Uganda bestimmten Peyerl-Hoffmann et al. (2001) 22 verschiedene msp-1 und 24 msp-2 Allele. Dagegen ist die Diversität von P. falciparum in Gebieten mit geringer Erregerübertragung auch eher niedrig. So wurde im Sudan (msp-1 13 Allele)oder in Honduras (msp-1 5 Allele) eine niedrige Diversität des Erreger beschrieben (Babiker et al. 1997; Haddad et al. 1999).

Als Ursache für die größere genetische Diversität von P. falciparum in Gebieten hoher Erregertransmission wird die erhöhte Rekombinationsrate parasitärer Gene während der Fertilisation männlicher und weiblicher Gameten in der Anophelesmücke verantwortlich gemacht (Babiker et al. 1999). Dagegen kommt es bei der klonalen Teilung des Parasiten im Menschen nicht zu entscheidenden genetischen Veränderungen (Babiker et al. 1999).

Verschiedene Genotypen in Agogo und Umgebung

Bemerkenswert erscheint, dass bei der vorliegenden Untersuchung einzelne Genotypen, nämlich IC-12, FC27-16 und K1-09 signifikant häufiger in Agogo und Mad20-06 signifikant häufiger in der ländlichen Umgebung auftreten (Tab 13). Dass die Verbreitung verschiedener Allele geographisch unterschiedlich ist, konnte in verschiedenen Endemiegebieten nachgewiesen werden (Creasey et al. 1990; Babiker et al. 1997). Ein Unterschied in der Allelverbreitung unmittelbar benachbarter Gebiete mit ähnlicher Erregertransmission erscheint dabei erstaunlich, da die geografische Nähe eine gleiche Allelverteilung erwarten lässt. Ob dieser Befund einen Zufallsbefund darstellt oder bedingt ist durch verschiedene lokale Einflüsse, wie z. B. den Zugang zu antiparasitären Medikamenten und die Bereitschaft zur Einnahme einer Malariaprophylaxe, bedarf sicher weiterer Untersuchungen. Interessanterweise konnten derartige Unterschiede der Genotypenverbreitung auch bei zwei benachbarten Dörfern [Seite 85↓]in Senegal (Dielmo und Ndiop) beobachtet werden (Konate et al. 1999). Im Gegensatz zur vorliegenden Untersuchung weisen jedoch diese Dörfer trotz der geographischen Nähe Unterschiede in der Erregertransmission auf. So wird in Dielmo die Malaria ganzjährig beobachtet, in Ndiop dagegen tritt sie epidemisch während der Regenzeit auf. Der Austausch zwischen beiden Dörfern wird als sehr begrenzt beschrieben (Konate et al. 1999). Im Gegensatz dazu gibt es eine regen Austausch zwischen Agogo und Umgebung.

Auch das Ergebnis der vorliegenden Arbeit zeigt, das die Allelverbreitung geographisch unterschiedlich ist. Es wird deutlich, dass sich die Erregerpopulation selbst bei benachbarten Orten mit gleicher Erregertransmission unterscheiden können. Da MSP-Antigene als potentielle Zielstrukturen für immunotherapeutische Moleküle gelten (Chappel et al. 1993; Keitel et al. 1999), ist es wichtig, zur Entwicklung einer Impfung die Diversität lokaler Parasitenpopulationen im Vorfeld genau zu untersuchen. Eine Übertragung auf verschiedene, sogar benachbarte Endemiegebiete muss so kritisch betrachtet werden.

Keine Assoziation von Parität und spezifischen Genotypen

Insbesondere Erstgebärende sind von einer P.-falciparum-Infektion betroffen (McGregor 1984; Diagne et al. 1997; Sullivan et al. 1999). Verschiedene Thesen versuchen, hierfür eine Erklärung zu geben. Eine besagt, dass Schwangere nur allmählich eine effektive Immunerkennung gegen speziell in der Schwangerschaft exprimierte parasitäre Antigene entwickeln (Fried et al. 1996; Fried et al. 1998; Beeson et al. 2000; Beeson et al. 2001). Antiköper, die sich gegen parasitäre Oberflächenstrukturen, wie zum Beispiel gegen bestimmte Varianten des P.-falciparum-Erythrozyten-Membran-Protein-1, richten, können erst während der ersten Schwangerschaften ausbildet werden (Fried et al. 1996; Beeson et al. 2000; Beeson et al. 2001). Mit P. falciparum infizierte Erythrozyten, die diese spezifischen Varianten des PfEMP-1 exprimieren, sequestrieren besonders in der ersten Schwangerschaft in der Plazenta. Bereits bei folgenden Schwangerschaften konnten effektive Antikörper gebildet werden, die eine plazentare Sequestration verhindern (Abb. 2) (Fried et al. 1996; Beeson et al. 2000; Beeson et al. 2001). Um dieses These zu bestätigen, wurde analysiert, ob spezifische Genotypen im Vergleich zu Multiparae gehäuft bei Primiparae auftreten. Dies war nicht der Fall. Dagegen konnte in einer Studie von Schleiermacher et al. (2001) in Senegal eine Assoziation von Genotypen der Allelfamilie FC27 ausschließlich oder gehäuft bei Erstgebärenden nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit war die Allelfamilie FC27 besonders bei Primiparae mit einer Frühgeburtlichkeit assoziiert. Dies lässt darauf schließen, dass FC27 eine besondere Bedeutung bei plazentarer Malaria speziell für Primiparae hat.

Um den beschriebenen Zusammenhang weiter zu erforschen, sollte bei zukünftigen Untersuchungen überlegt werden, ob es sinnvoller wäre, parasitäre DNA für eine Genotypisierung direkt aus plazentarem Gewebe zu gewinnen, da möglicherweise nicht die [Seite 86↓]Gesamtheit aller Genotypen durch die Gewinnung einer plazentaren Blutprobe erkannt werden konnten. Andererseits könnten fälschlicherweise einzelne Genotypen als solche erkannt werden, die in der Plazenta sequestrieren, die eigentlich im Blut zirkulieren und dadurch die statistischen Analysen beeinflussten.

Vergleich der Genotypenverteilung plazentarer und peripherer P.-falciparum -Isolate

Ob eine Sequestration von P. falciparum in der Plazenta bei polyklonalen Infektionen durch alle oder nur einen Teil von koinfizierenen Genotypen geschieht, ist nicht bekannt. Deshalb wurden die Genotypen plazentar und peripher gewonnener Isolaten miteinander verglichen. Es wurde angenommen, dass bei Schwangeren identische Genotypen in den zusammengehörenden Plazenta- und Blutisolaten erwartet werden können, wenn alle koinfizierenden Genotypen gleichmäßig in den untersuchten Isolaten verteilt sind. Das war aber nicht der Fall. Bei den meisten Frauen wurden neben identischen Genotypen unterschiedliche in den peripheren und dazugehörenden plazentaren Isolaten beobachtet (Abb.8). Nur bei 12% konnten absolut identische Genotypen nachgewiesen werden. Bei den Übrigen waren wenigstens in einer der beiden Isolate Genotypen, die in der anderen nicht bestimmt werden konnten. Diese Beobachtung war weitgehend unabhängig von der Parasitendichte, dem Alter und der Parität.

Eine mögliche Erklärung für den Nachweis unterschiedlicher Genotypen in zusammenhängenden Plazenta- und Blutisolaten wäre das Vorhandensein unterschiedlicher Subpopulationen, die einerseits im mütterlichen Blutkreislauf zirkulieren und anderseits Genotypen, die in der Plazenta sequestrieren. Dies würde für einen parallelen Verlauf einer Infektion von unterschiedlichen Genotypen sprechen und wäre vereinbar mit der Sequestration von spezifischen Subtypen in der Plazenta (Beeson et al. 2000; Beeson et al. 2001).

Der Nachweis identischer Genotypen in zusammengehörenden Proben könnte wie folgt erklärt werden: Ein früheres parasitäres Entwicklungsstadium eines P.-falciparum-Stammes könnte im peripheren Blut zirkulieren. Dagegen sequestriert derselbe Stamm in einem anderen parasitären Stadium in der Plazenta. Vermutlich sind zu diesem Zeitpunk an der Oberfläche infizierter Erythrozyten Rezeptoren exprimiert, die als Liganden fungieren können. Dafür spricht, dass gewöhnlich eine P.-falciparum-Infektion aus einer Komposition verschiedener Entwicklungsstadien besteht. Im zeitlichen Verlauf sequestriert dabei ein Teil der Parasiten in der Plazenta, während ein anderer zirkuliert. Eine ähnliche Dynamik polyklonaler P.-falciparum-Infektionen konnten Färnert et al. (1997) bei Kindern in einer Longitudinalstudie in Tansania beobachten. Bei den täglichen Untersuchungen peripher gewonnener Isolate wurden unterschiedliche Genotypen nachgewiesen. Man ging davon aus, dass bestimmte Stämme im Kapillarbett sequestrierten und so nur zu einem bestimmten Zeitpunkt für die Untersuchung nicht zugänglich waren (Färnert et al. 1997). Entsprechende Beobachtungen wurden ebenfalls von Bruce et al., (2000) in Papua Neuguinea bei Kindern gemacht. Langzeituntersuchungen bei [Seite 87↓]Schwangeren, die eine tägliche Dynamik der Infektion aufzeigen könnten, gibt es hierzu bis heute nicht. Eines der Hauptprobleme, die die Verwirklichung einer solchen Studie erschwert, ist die Gewinnung einer plazentaren Untersuchungsprobe während der Schwangerschaft.

Eine andere Erklärung für den Nachweis identischer Genotypen in beiden Isolaten wäre eine Kontamination der Plazenta mit Parasiten, welche zum Zeitpunkt der Geburt zufällig in der plazentaren Zirkulation vorhanden waren. Wie bereits erwähnt, sollten, um diesen Fehler bei zukünftigen Untersuchungen zu minimieren, Analysen direkt aus plazentarem Gewebe durchgeführt werden.

Zusammengefasst sprechen die Beobachtungen der vorliegenden Arbeit entweder für das vorliegen unterschiedlicher Subpopulationen in der Plazenta und der peripheren Zirkulation oder für die Dynamik einer Infektion, wobei sich unterschiedliche Parasitenstadien zu unterschiedlichen Zeiten entweder in der Plazenta oder in der Peripherie aufhalten. So kann geschlussfolgert werden, dass die klonale Analyse von P.-falciparum-Infektionen ausschließlich aus einem Isolat (plazentares oder peripheres) nur ein unvollkommenes Bild von der Beschaffenheit und der Dynamik der Infektion mit P. falciparum in der Schwangerschaft wiedergibt. Dieses Ergebnis sollte in Zukunft bei epidemiologischen Untersuchungen in der Schwangerschaft berücksichtigt werden.

Parallel zu den hier beschriebenen Resultaten konnten kürzlich ähnliche Ergebnisse von anderen Arbeitsgruppen aus Malariagebieten in Senegal, Malawi und Gabun beschrieben werden (Kamwendo et al. 2002; Kassberger et al. 2002; Schleiermacher et al. 2002).

Sequestration einzelner Genotypen in der Plazenta

Wie beschrieben, wurde in den hier vorgestellten Untersuchungen erkannt, dass sowohl identische Genotypen, als auch nicht identische Genotypen in zusammengehörenden plazentaren und peripheren P.-falciparum-Isolaten nachgewiesen wurden. Weiterhin sollte untersucht werden, ob in der gesamten Untersuchungsgruppe einige Genotypen häufiger primär plazentar oder primär peripher auftreten. Bis auf Parasiten der Allelfamilie RO33 sind Parasiten der Allelfamilien Mad20, K1, IC und FC öfter ausschließlich plazentar als ausschließlich peripher beobachtet worden. Wie im Verlauf dieser Arbeit noch diskutiert wird, ist die Multiplizität der Infektion plazentar gewonnener Isolate signifikant höher als die der peripheren Isolate. Somit scheint die Multiplizität der Infektion hierfür der eigentlich bestimmende Faktor gewesen zu sein.

Interessanter war, dass die Genotypen K1-07, Mad20-02, IC-10, IC-19, IC-20, FC27-08, FC27-12, FC27-16, FC27-18 und FC27-20 häufiger ausschließlich plazentar als ausschließlich peripher bestimmt werden konnten, einige sogar hochsignifikant (Tab.12). Eine direkte Erklärung für diesen Befund erscheint nach dem heutigen Wissensstand schwierig, da derzeit [Seite 88↓]keine direkte Assoziation dieser Gene mit Oberflächenstrukturen, die als Liganden fungieren könnten, beschrieben wurde. Nach allgemeiner Auffassung wird erst Stunden nach Invasion der Merozoiten das P.-falciparum-Erythrozyten-Membran-Protein-1 (PfEMP-1) an der Oberfläche der infizierten Erythrozyten exprimiert (Beeson et al. 2000; Beeson et al. 2001). PfEMP-1 gilt derzeit als das wichtigste Protein, das bei Schwangeren an plazentare Glykosaminokglykane wie Chondroitinsulfat A (CSA) und Hyaloronsäure (HA) binden kann und dadurch eine Sequestration infizierter Erythrozyten in der Plazenta erklärt (Fried et al. 1996; Beeson et al. 2000; Beeson et al. 2001; Fried et al. 2002). Diese Oberflächenproteine werden durch multiple Gene der var-Familie kodiert, die durch eine Expression verschiedener var-Gene ungleiche Varianten des PfEMP-1 mit unterschiedlichen Antigen- und Bindungseigenschaften hervorrufen (Beeson et al. 2001). Diese These ist in Abbildung 15 anschaulich dargestellt.

Abbildung 15: Mögliche Mechanismen einer Sequestration von mit P. falciparum infizierten Erythrozyten

Mögliche Mechanismen, die für eine Sequestration von mit P. falciparum infizierten Erythrozyten in der Plazenta verantwortlich sind. Infizierte Erythrozyten treten mit dem Blut in den intervillösen Spalt der Plazenta ein. Infizierte Erythrozyten, die an ihrer Oberfläche Liganden exprimieren, die an Rezeptoren wie Chodroitinsulfat-A (CSA) oder Hyaloronsäure (HA) binden können, umspülen diese (1), bis es zu einer Adhäsion an CSA und HA kommt (2). Alternativ kommt es zu einer Adhäsion an CSA oder HA oder bis heute unbekannte Rezeptoren (3). Infizierte Erythrozyten ohne schwangerschaftsspezifische Liganden verlassen die Plazenta und zirkulieren als Konglomerat (4) oder unabhängig voneinander im Gefäßsystem der Schwangeren (Beeson et al. 2001).


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Es ist also unklar, ob K1-07, Mad20-02, IC-10, IC-19, IC-20, FC27-08, FC27-12, FC27-16, FC27-18 und FC27-20 selbst für eine Sequestration in der Plazenta verantwortlich sein können. Es wäre aber denkbar, dass sie einen Marker für andere Gene, wie zum Beispiel der var-Familie, darstellen, die eine Sequestration erklären würde. So konnte folgendes Phänomen durch Ariey et al. (2001) in einer Untersuchung in Französisch Guyana beobachtet werden. Dort waren spezifische msp-Allele mit einer schweren klinischen Malaria assoziiert. Außerdem gab es eine Assoziation dieser Allele mit funktional bedeutenden der var-Familie. Es wurde geschlussfolgert, dass msp-Allelein einemVerteilungsungleichgewicht mit funktional bedeutsamen Genen sein könnten. Dies würde die größere Virulenz einzelner Genotypen erklären (Ariey et al. 2001).

Zudem konnte bei In-vitro-Experimenten gezeigt werden, dass neben infizierten Erythrozyten mit Bindungskapazitäten für CSA und HA auch infizierte Erythrozyten ohne diese an plazentare Strukturen banden (siehe Abb. 15) (Beeson et al. 2000; Beeson et al. 2001). Daraus wurde geschlossen, dass bis heute unbekannte Faktoren, wie unbekannte Rezeptoren, neben PfEMP-1 eine Bedeutung für die Sequestration in der Plazenta haben. So wäre es möglich, dass Proteine, die durch msp-1 und msp-2 kodiert werden, selbst oder in Kombination mit anderen eine noch nicht erkannte Bedeutung für die Sequestration von P. falciparum in der Plazenta haben.

Sicherlich sind zur befriedigenden Beantwortung dieser Fragen in der Zukunft sowohl epidemiologische als auch experimentelle Untersuchungen nötig.

Assoziation einzelner Genotypen mit klinischen Manifestationsformen der Malaria

Die Annahme, dass spezifische Subtypen von P. falciparum eine höhere Virulenz besitzen als andere, ist seit Beginn der Malariaforschung Gegenstand wissenschaftlicher Überlegungen. So konnte bereits 1932 bei experimentellen Infektionen am Menschen gezeigt werden, dass spezielle Stämme von P. falciparum schwere Verläufe der Malaria induziert haben (James et al. 1932). In den letzten zehn Jahren wurde dieser Thematik eine erneute Aufmerksamkeit geschenkt (Gupta et al. 1994; Engelbrecht et al. 1995; Ariey et al. 2001). Die Identifikation spezifischer Virulenzfaktoren ist jedoch schwierig, da, wie zuvor beschrieben, die klinische Manifestation der P.-falciparum-Infektion ein breites Spektrum an Symptomen aufweisen kann. Diese Symptome können allein oder in Kombination miteinander auftreten.

Bei schwangeren Frauen sind die Anämie und der pathologische Schwangerschaftsverlauf mit vermindertem Geburtsgewicht und Frühgeburtlichkeit klinische Präsentationsformen der Malaria (Sullivan et al. 1999; Menendez et al. 2000; Mockenhaupt et al. 2000; Beck et al. 2001). Bei Nichtschwangeren wurde eine Assoziation von spezifischen msp-Allelen mit schweren Krankheitsverläufen der Malaria in Französisch Guayana und in Senegal beobachtet (Robert et al. 1996; Ariey et al. 2001). In der hier beschrieben Arbeit konnte, ähnlich wie durch [Seite 90↓]Engelbrecht et al. (1995), in Papua Neu Guinea und durch Ofosu-Okyere et al. (2001) in Ghana, eine Assoziation der Genotypen der Allelfamilie FC27 mit einer klinischen Malaria beobachtet werden. So konnte in multivariaten Analysen gezeigt werden, dass Frauen, die plazentare Stämme mit FC27 aufwiesen, ein mehr als doppelt so hohes Risiko für ein Frühgeburt hatten wie Frauen, die nicht mit diesen Stämmen infiziert waren. Bei Primiparae war das Risiko sogar mehr als dreimal so hoch. In univariater Analyse konnte ebenfalls eine Assoziation zur Anämie und zu einem LBW gezeigt werden. Ob diese Assoziation durch den Genlocus selbst oder durch das kombinierte Auftreten verschiedener Gene bedingt ist, bleibt offen. Das wurde bereits bei der plazentaren Sequestration einzelner Genotypen vermutet. Da aber den Merozoiten-Oberfächen-Proteinen bei der erythrozytären Invasion der Parasiten eine Schlüsselrolle zugeschrieben wird (Ariey et al. 2001), könnte angenommen werden, dass Parasiten, die spezifische MSP-Proteine, wie hier Oberflächeproteine, die durch Allele der Allelfamilie FC27 kodiert werden, mit einer höheren Effizienz neue Erythrozyten befallen und ein schnelles Ansteigen der Parasitendichten hervorrufen.

Es kann vermutet werden, dass es zu einer klinischen Manifestationen der Malaria kommt, bevor effektive Immunmechanismen die Infektion kontrollieren (James et al. 1932; Gupta et al. 1994; Chotivanich et al. 2000). Bedingt durch eine verstärkte Hämolyse, könnte es dadurch zu einer Anämie kommen (Mockenhaupt et al. 2000; Beck et al. 2001).

Anderseits könnte angenommen werden, dass bei einer plazentaren Infektion von Stämmen, die FC27 aufweisen, vermehrt Zytokine, wie zum Beispiel TNF-α und IL-2 produziert werden. Einige Arbeiten beschreiben, dass spezifische Glykosaminoglykane des P. falciparum einen lipopolysaccharidähnlichen Effekt haben, der Monozyten zur vermehrten Produktion von TNF-α anregt (Schofield et al. 1994; Fievet et al. 2001). Zudem waren in einer Studie in Senegal Stämme, die spezifische msp-Allele aufwiesen, mit einem erhöhten Spiegel an TNF-α assoziiert (Robert et al. 1996). Der Überproduktion von Zytokinen wird ebenfalls eine plazentaschädigende Wirkung zugeschrieben. Die Folge dessen wäre eine Störung des Sauerstoff- und Nährstofftransportes, die zu einer intrauterinen Entwicklungsstörung mit vermindertem Geburtsgewicht führen könnte (Menendez et al. 2000; Rogerson et al. 2003). Anderseits kann ein erhöhter Spiegel an TNF-α vorzeitige Wehen induzieren, die zu einer Frühgeburt führen (Silver et al., 1994).

Die hier gewonnen Ergebnisse können als einer der ersten Schritte zur Aufklärung der klinischen Bedeutung des FC27 gewertet werden. Das Ausmaß einer derartigen Assoziationen sollte Inhalt weiterer experimenteller Untersuchungen sein.


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4.2.3.  Multiplizität der Infektion mit P. falciparum

Eine Reihe von Studien, die sich mit der klonalen Zusammensetzung von P.-falciparum-Infektionen auseinandersetzten, haben gezeigt, dass es eine Assoziation zwischen der Multiplizität der Infektion und der klinischen Manifestation der Malaria gibt (Mercereau-Puijalon 1996; Roper et al. 1998; Felger et al. 1999). Andere Arbeiten beschreiben, dass die Multiplizität der Infektion einen wichtigen Faktor bei der Entwicklung von Abwehrmechanismen und einer körpereigenen Immunität darstellt (Felger et al. 1999; Smith et al. 1999; Smith et al. 1999; Beck et al. 2001). Es wurden Zusammenhänge zwischen der Erregertransmission, dem Alter (Felger et al. 1999; Smith et al. 1999; Peyerl-Hoffmann et al. 2001), der Parasitendichten sowie der Einnahme von antiparasitären Medikamenten dargestellt (Beck et al. 2001). Bei Frauen wurde eine Assoziation zur Schwangerschaft und Anzahl der Schwangerschaften beschrieben (Beck et al. 2001; Schleiermacher et al. 2001).

Multiplizität der Infektion

Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass in Gebieten mit geringer Transmission die Multiplizität der Infektion niedriger ist als in Hochendemiegebieten. Beispielsweise hat im Sudan, einem Gebiet, wo die Malaria nur epidemisch auftritt, die Multiplizität der Infektion einen Wert von nur 1,3 (Babiker et al. 1997). Im Gegensatz dazu wird in Hochendemiegebieten von Tansania oder Senegal eine Multiplizität der Infektion von 3,9 bzw. 4,8 beschrieben (Ntoumi et al. 1995; Smith et al. 1999). In verschiedenen Gebieten mit intensiver Malariaübertragung liegt somit die Prävalenz polyklonaler Infektionen bei Kindern, nichtschwangeren Erwachsenen und Schwangeren zwischen 60 und 85% (Babiker et al. 1997; Beck et al. 2001; Schleiermacher et al. 2001). Im holoendemischen Malariagebiet von Agogo zeigte sich bei der vorliegenden Untersuchung, dass ebenfalls die Mehrzahl der Gebärenden von polyklonalen Infektionen mit P. falciparum betroffen war. Die in der vorliegenden Untersuchung aus einem peripher gewonnenen Isolat ermittelte Prävalenz von 72% entsprach ungefähr der Prävalenz von 68%, die zuvor durch Beck et al. (2001) im Untersuchungsgebiet ermittelt wurde. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden nachgewiesen werden, dass die Prävalenz polyklonaler P.-falciparum-Infektionen plazentar gewonnener Isolate mit 81% signifikant höher als die peripher gewonnener Isolate war. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass die Multiplizität der Infektion in der Plazenta mit 2,91 im Vergleich zu peripheren Isolaten mit 2,59 signifikant höher war, wobei beide Größen direkt miteinander korrelierten. Die erhöhte Multiplizität plazentarer Isolate im Vergleich zur Multiplizität peripherer Isolate könnte ein weiteres Indiz dafür sein, dass mit P. falciparum infizierte Erythrozyten, die spezifische Oberflächenproteine exprimieren, in der Plazenta sequestrieren (Fried et al. 1996; Beeson et al. 2001).


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Multiplizität der Infektion und Parasitendichte

In der vorliegenden Arbeit konnte erkannt werden, dass die Parasitendichte einer der wichtigsten Faktoren ist, der die Multiplizität der Infektion beeinflusst. Diese Abhängigkeit wurde sowohl für plazentare als auch periphere Isolate nachgewiesen (Tab. 19-20). Eine derartige Abhängigkeit wurde ebenfalls in anderen Arbeiten beschrieben. Unter anderem wiesen Peyerl-Hoffmann et al. (2001) eine solche Assoziation in Endemiegebieten in Westuganda bei Erwachsenen nach (Peyerl-Hoffmann et al. 2001). Felger et al.(1999) und Smith et al. (1999) zeigten dies bei Kindern in Tansania. In Ghana und Senegal beobachteten Beck et al. (2001) und Schleiermacher et al. (2001) bei schwangeren Frauen, dass die Multiplizität der Infektion von der Parasitendichte beeinflusst wird. Lediglich in einer Studie in Mosambik konnten Saute et al. (2002) kein klares Abhängigkeitsmuster zwischen der Parasitendichte und Multiplizität der Infektion bei Schwangeren nachweisen. Vielleicht liegt der Grund hierfür in der relativ kleinen Zahl (n = 156) an untersuchten Fällen. Saute et al.(2002) diskutieren dagegen, dass möglicherweise die HIV-Durchseuchung, die mit einer HIV-Seroprävalenz von 15% im mosambikanischen Untersuchungsgebiet einen beeinflussenden Faktor für dieses Ergebnis darstellt. Jedoch kann angenommen werden, dass die Prävalenz einer HIV-Infektion in den anderen afrikanischen Untersuchungsgebieten genau so hoch ist.

Derzeit versuchen verschiedene Thesen, die Abhängigkeit zwischen der Multiplizität der Infektion und der Parasitendichte zu erklären: Felger et al. (1999) behaupten beispielsweise, dass eine hohe Multiplizität der Infektion bei hohen Parasitendichten die Folge einer hohen Nachweiswahrscheinlichkeit verschiedener parasitärer Genotypen darstellt. Eine niedrige Multiplizität der Infektion bei niedrigen Parasitendichten ist nach dieser Auffassung auf die Sensitivität der Nachweismethode zurückzuführen. Diese Ansicht spricht jedoch gegen die von Snounou et al. (1999)zuvor gezeigte hohe Sensitivität der geschachtelten PCR-Methode. So könnte alternativ angenommen werden, dass hohe Parasitendichten ein Resultat aus einer Vielzahl von Super- und Koinfektionen mit verschiedenen P.-falciparum-Genotypen darstellen. Ein hohe Infektionsrate führt zu einer hohen Multiplizität der Infektion und erst als Folge dessen zu hohen Parasitendichten. Diese These wird ebenfalls von Schleiermacher et al. (2001) vertreten, die in einer Longitudinalstudie die Bedeutung der Multiplizität der Infektion in einem senegalesischen Dorf bei Frauen vor, während und nach einer Schwangerschaft untersuchten.

Multiplizität der Infektion und Schwangerschaft

Schleiermacher et al. (2001)konnten in der oben beschriebenen Studie nachweisen, dass eine Schwangerschaft per se mit einer erhöhten Multiplizität der Infektion assoziiert ist. Diese Assoziation erklärten sie mit der in der Schwangerschaft auftretenden Immunsuppression. Die verminderte zelluläre Immunantwort während einer Schwangerschaft (Weinberg et al., 1984; Smith et al., 1996) wurde dafür verantwortlich gemacht, dass es zu einer verminderten Kontrolle [Seite 93↓]präerythrozytärer Parasitenstadien kommt. Eine große Anzahl an Klonen erreichen nach der Auffassung von Schleiermacher et al. (2001) das erythrozytäre Stadium. Außerdem ist die Immunantwort gegen erst kürzlich aufgenommene Parasiten (z.B. schwangerschaftsspezifische Parasiten) eingeschränkt. Die Folge ist eine erhöhte Multiplizität der Infektion, die zu einer hohen Parasitendichte führt.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Erstgebärende im Vergleich zu Mehrfachgebärenden eine signifikant höhere Multiplizität der Infektion aufwiesen. Entsprechend fiel die Multiplizität der Infektion signifikant mit der Parität (Tab. 23-24). Dieses Ergebnis entspricht der Untersuchung von Beck et al. (2001), die ebenfalls eine klare Abhängigkeit der Multiplizität der Infektion von der Parität nachweisen konnten. Dagegen konnte in der schon zuvor zitierten Untersuchung von Saute et al. (2002) eine derartige Assoziation in Mosambik nicht dargestellt werden. Als Erklärung für dieses Ergebnis in Mosambik machen Saute et al. (2002) wiederum den Einfluss von HIV auf eine P.-falciparum-Infektion verantwortlich. Wie Saute et al. (2002) beschreiben, beeinflusst eine Infektion mit HIV die für die Malaria sonst typischen Assoziationen von Alter, Parasitendichten und klinischer Manifestation.

Abgesehen davon, dass die Schwangerschaft an sich mit einer hohen Multiplizität der Infektion assoziiert ist, ergaben die Studien von Schleiermacher et al. (2001), dass bei Schwangeren das Alter neben der Parität einen starken Einfluss auf die Multiplizität der Infektion hat. Dieser Einfluss konnte auch in der vorliegenden Untersuchung nachgewiesen werden.

Multiplizität der Infektion und Parität/Alter

Die Altersabhängigkeit der Multiplizität der Infektion wurde in verschiedenen Hochendemiegebieten beobachtet. In Tansania wurde zum Bespiel gezeigt, dass in den ersten Lebensmonaten bei den Untersuchungen die Multiplizität der Infektion mit < 2 niedrig war (Felger et al., 1999). Im Kleinkindalter stieg die Multiplizität der Infektion an und erreichte bei einem Alter von fünf Jahren ihr Maximum (ca. 5 Genotypen) (Beck et al., 1997). Mit steigendem Alter fiel die Multiplizität der Infektion und stellte sich bis ins hohe Alter auf einen Wert von ca. 3 Genotypen ein (Smith et al., 1999). Eine hohe Multiplizität der Infektion war bei Kleinkindern mit klinischen Manifestationen der Malaria assoziiert. Dagegen schien eine hohe Multiplizität der Infektion bei älteren Kindern und Erwachsenen einen Schutz vor klinischer Malaria zu geben (Robert et al. 1996; Beck et al. 1997; Smith et al. 1999).

Bei den hier beschrieben Untersuchungen waren im Vergleich zu älteren Frauen jüngere von einer erhöhten Multiplizität der Infektion betroffen. Diese Beobachtungen konnten sowohl bei plazentar als auch bei peripher gewonnenen Isolaten gemacht werden (Tab. 21-22). Jedoch muss betont werden, dass die beschriebene Abhängigkeit der Multiplizität der Infektion zur Parität und zum Alter der Gebärenden aufgrund der Kolinearität von Multiplizität und Parasitendichte der Infektion nicht unabhängig voneinander gesehen werden können, da [Seite 94↓]entsprechend der Multiplizität der Infektion jüngere Frauen und Primiparae signifikant höhere Parasitendichten aufwiesen als ältere Frauen und Multiparae. Ein signifikanter Einfluss der Parität sowie des Alters auf die Korrelation von der Multiplizität der Infektion und der Parasitendichte konnte in der hier dargestellten Untersuchung ebenfalls nicht nachgewiesen werden.

Bei Nichtschwangeren dagegen, insbesondere bei Kindern, konnte dargestellt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen dem Alter und der Stärke der Korrelation von der Multiplizität der Infektion und der Parasitendichte gab. Durch Untersuchung der Korrelation schloss man auf den Status einer entwickelten Immunität. So wurde unter anderen von Beck et al. (1997); Smith et al., (1999) und Felger et al. (1999) diskutiert, dass eine hohe positive Korrelation mit einem gering ausgeprägten malariaspezifischen Immunstatus einhergeht. Dies wurde vor allem bei Kleinkindern beobachtet. Mit zunehmendem Alter fiel die Korrelation und wurde bei jungen Erwachsenen sogar negativ. Man nahm an, dass durch Prämunition die Infektionen kontrolliert wurden. Auf diese Weise konnten durch eine hohe Multiplizität der Infektion hohe Parasitendichten vermieden werden (Ntomie et al. 1995; Beck et al. 1997; Smith et al. 1999; Felger et al., 1999). Sollte es als Ausdruck für eine sich entwickelnde Immunität möglich sein, dieses Model auf plazentare P.-falciparum-Infektionen zu übertragen, müsste die positive Korrelation zwischen der Multiplizität der Infektion und der Parasitendichte mit der Parität fallen. Frauen, die mit zunehmender Anzahl an vorangegangenen Schwangerschaften einem immer breiterem Spektrum an spezifischen Subtypen von P. falciparum ausgesetzt sind, entwickeln wie ältere Kinder effiziente Immunmechanismen, die eine Infektion kontrollieren und so hohe Parasitendichten vermeiden. Diese Hypothese würde eine Studie von Maubert et al. (1999)stützen, die beschreibt, dass mit vorangegangenen Schwangerschaften die Prävalenz von Antikörpern gegen Stämme, die mit einer Schwangerschaft assoziiert waren, stiegen (Maubert et al. 1999).

Nach den Ergebnissen der hier beschriebenen Studie wäre jedoch ebenfalls zu diskutieren, ob Immunreaktionen bei Schwangeren gleichzeitig die Multiplizität der Infektion und die Parasitendichte senken. Gestützt wird diese These dadurch, dass in der vorliegenden Studie weder das Alter der Patientin noch die Parität die Korrelation von Multiplizität der Infektion und Parasitendichte beeinflussten (Abb. 10).

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es bei Mehrfachgebärenden, die eine erhöhte Multiplizität der Infektion aufwiesen, nicht signifikant häufiger zu einer Frühgeburt des Kindes kam. Dagegen konnte bei Primiparae im Vergleich zu monoklonalen Infektionen bei einer plazentaren Infektion von 2, 3 oder mehr Klonen ein um den Faktor 10 bis 13 erhöhtes Risiko für eine Frühgeburt beobachtet werden (Tab. 35, 36). Bei Primiparae könnte es folglich, bedingt durch eine schwächer ausgeprägte Immunität, zu einer höheren Sequestrationsrate in der Plazenta kommen (Abb. 4). Diese ist dadurch bedingt, dass in der ersten Schwangerschaft [Seite 95↓]die primäre Auseinandersetzung des Immunsystems mit bislang unbekannten Parasitenstämmen stattfindet. Mit zunehmender Anzahl der Schwangerschaften erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass das Immunsystem bereits mit Antigenstrukturen, die für eine Sequestration verantwortlich sind, bekannt ist (Ricke et al. 2000). Deshalb kann bei Primiparae eine hohe Multiplizität der Infektion zu hohen Parasitendichten in der Plazenta führen. Anhalt dafür, dass die Multiplizität der Infektion neben der Parasitendichte eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Frühgeburt bei einer plazentaren Malaria spielt, geben die Ergebnisse der multivariaten Analysen (Tab. 35, 36). Zudem zeigte sich auch bei submikroskopischen plazentaren Infektionen eine Assoziation zwischen hoher Multiplizität und erhöhter Frühgeburtsrate (Tab. 37).

Eine vergleichbare Beobachtung konnte in der zuvor beschriebenen Arbeit von Beck et al. (2001) gemacht werden. Dort wurde eine Assoziation von hoher Multiplizität der Infektion mit einer Anämie nur bei Frauen bis zur vierten Schwangerschaft nachgewiesen. Bei Frauen mit einer größeren Zahl vorangegangener Schwangerschaften konnte eine derartige Assoziation nicht mehr nachgewiesen werden. Beck et al.(2001) machten ebenfalls die entwickelte Immunität für diese Beobachtungen verantwortlich. In der hier vorgestellten Arbeit konnte eine Assoziation von hoher Multiplizität der Infektion mit einer moderaten Anämie (Hb < 9 g/dl) lediglich in univariater Analyse bestätigt werden (Tab. 30). In multivariater Analyse zeigte sich jedoch, dass die Parasitendichte der entscheidende Risikofaktor für das vorliegen einer Anämie war (Tab. 30). Ursache für diese unterschiedlichen Ergebnisse könnten vieler Natur sein. Einerseits muss das Ergebnis von Beck et al. (2001) kritisch betrachtet werden, da wahrscheinlich durch die verwendete PCR-Methode nur ein Teil der Genotypen nachgewiesen werden konnten. Dies kann behauptet werden, da Beck et al. (2001) im Vergleich zu anderen für ein holoendemisches Malariagebiet eine zu niedrige Diversität von P. falciparum feststellten. Außerdem kann vermutet werden, dass der Einfluss der Parasitendichten auf das Vorliegen einer Anämie unterschätzt wurde. Andererseits führten Beck et al. (2001) ihre Analysen auf der Basis von peripher gewonnen Isolaten durch, was einen Vergleich mit dem Ergebnis der vorliegenden Arbeit erschwert. Neben Beck et al. (2001) untersuchten auch Saute et al. (2002) den Einfluss der Multiplizität der Infektion auf eine Anämie. Diese Arbeitsgruppe konnte keine derartige Assoziation feststellen. Hierfür machen Saute et al. (2002) wiederum die hohe Durchseuchung mit HIV im Untersuchungsgebiet verantwortlich.

Um letztendlich mehr Klarheit über die Bedeutung der Multiplizität der Infektion auf die Entwicklung einer natürlichen Immunität bei Schwangeren zu bekommen, sollten in der Zukunft weitere epidemiologische Untersuchungen durchgeführt werden.


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4.3.  Schlussfolgerung

In den letzten Jahren konnte durch moderne molekularbiologische Methoden wie zum Beispiel die PCR ein großer Wissenszuwachs im Verständnis um die Pathophysiologie der Malaria gewonnen werden. Jedoch bleiben viele Fragen unbeantwortet. Welche Bedeutung beispielsweise die Multiplizität der Infektion auf die Entwicklung einer Immunität bei Schwangeren hat, konnte nicht bis ins Detail geklärt werden. Warum Frauen mit einer höheren Anzahl an vorangegangenen Schwangerschaften seltener von mit P. falciparum assoziierten Syndromen (z.B. pathologische Schwangerschaftsverläufe) betroffen sind, ist bis heute nur teilweise verstanden. Ebenso gibt es nur wenig befriedigende Antworten, die die komplexen Interaktionen von Parasit und Wirt, wie beispielsweise die Sequestration von P. falciparum in der Plazenta, erklären. Die Einfachheit, mit der infiziertes Plazentagewebe nach einer Geburt gewonnen werden kann, gibt hier eine einmalige Gelegenheit, den Parasiten und seine spezifischen pathologischen Mechanismen zu erforschen. Aus diesem noch zu gewinnenden Wissen können in der Zukunft neue Interventionen, wie Impfungen oder Chemotherapeutika, zur Behandlung der Malaria in der Schwangerschaft erwachsen. Die vorliegende Arbeit kann in diesem Zusammenhang als ein kleiner Baustein dienen.

So konnte in der vorliegenden Arbeit durch die Genotypisierung von P. falciparum aus zusammengehörenden plazentar und peripher gewonnenen Isolaten gezeigt werden, das P. falciparum im Untersuchungsgebiet ein hohe genetische Diversität besitzt. Es wurde deutlich, dass die Multiplizität der Infektion plazentarer Isolate deutlich höher war als die von peripher gewonnenen Isolaten. Außerdem wurde gezeigt, dass sich die Verteilungsprofile der Genotypen zusammengehörender plazentarer und peripherer Isolate grundlegend unterschieden. Dies ist insofern ein Ergebnis von großer Tragweite, da in der Vergangenheit bei einer Vielzahl von Studien dieser Problematik keine oder nur unzureichende Beachtung geschenkt wurde. Es kann hier sogar vermutet werden, dass auch bei nichtschwangeren Patienten die Sequestration des Parasiten in Kompartimenten, die dem Untersucher nicht zugänglich sind, eine größere Rolle spielt als bisher angenommen. Seit die PCR-Genotypisierung ein wichtiges Handwerkszeug bei der Malariakontrolle zur Untersuchung von parasitären Resistenzentwicklungen gegen antiparasitäre Medikamente oder einer Vaccine darstellt, sind möglicherweise bei der Untersuchung peripher gewonnener Isolate nicht alle an einer Infektion beteiligten Genotypen erkannt worden. Es ist durchaus möglich, dass es aus diesem Grund in der Vergangenheit sogar zu Fehlinterpretationen gekommen ist. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wird deutlich, dass, entsprechend der Fragestellung, peripher gewonnene Isolate nicht in jedem Fall ein vollständiges Bild der P.-falciparum-Infektion wiedergeben können. Daraus ergibt sich, dass in der Zukunft nach Strategien und Methoden gesucht werden sollte, dieser Problematik entgegenzuwirken.


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Die Multiplizität der Infektion ist ein entscheidender Faktor für die Entwicklung einer natürlichen Immunität. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass es bei Gebärenden komplexe Zusammenhänge zwischen der Multiplizität der Infektion und dem Alter, der Parität und der Parasitendichte gibt. Um diese Zusammenhänge weiter zu beleuchten, sind in der Zukunft weiterführende Untersuchungen zu diese Thematik nötig. Derartige prospektive Untersuchungen sollten über mehrere Jahre gehen, wobei bei einer großen Anzahl an Patientinnen Untersuchungen sowohl vor, während und nach einer Schwangerschaft durchgeführt werden sollten. Denn auch hierdurch können aus einem besseren Verständnis neue und effektive Regime zur Behandlung der Malaria bei Schwangeren erarbeitet werden.

Weithin konnte in der hier vorgestellten Studie gezeigt werden, dass die Allelfamilie FC 27 in multivariater Analyse mit einer Frühgeburtlichkeit assoziiert war. Eine Assoziation zu einem verminderten Geburtsgewicht und einer Anämie konnte zumindest in univariater Analyse gezeigt werden. Diese Ergebnisse sind als erste Schritte zu werten, die eine Assoziation bestimmter Genotypen mit erhöhter Morbidität bei Schwangeren versuchen zu erklären. Zukünftige epidemiologische Studien müssen derartige Ergebnisse bestätigen. Experimentelle Untersuchungen sollten versuchen, die Pathopysiologie zu erklären. Durch die Einmaligkeit des Plazentagewebes kann P. falciparum nach einer Geburt in seiner natürlichen Umgebung erforscht werden.

Um die Malaria, als eine der bedeutendsten parasitären Infektionskrankheiten der Menschheit, zu beherrschen, ist es dringend notwendig, noch umfangreichere Erkenntnisse über P. falciparum und die menschliche Immunabwehr zu gewinnen. Es lässt hoffen, dass diese Bemühungen intensiviert werden; denn es gibt dringenden medizinischen Bedarf, Frauen und ihre Kinder vor einer Malaria in der Schwangerschaft zu schützen.


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25.05.2004