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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Pflanzen, Stämme und Vektoren

Tomaten (Lycopersicon esculentum Mill.)
Cultivar „Rutgers“		Meyer‘s Seed Co, Baltimore, MD
Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana)
Öcotyp „Landsberg erecta“		Samen erhalten von Dr. Thomas Altmann, IGF-Berlin
Öcotyp „Columbia“
Algen (Chlamydomonas reinhardtii)
11-32b	mt-	Sammlung von Algenkulturen, Göttingen Chlamydomonas Genetic Center, Durham, NC
11-32c	mt+
83.81	mt-, cw15
CC-980	mt+, F50
Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)
S288C	MATa leu2 ura3	Georgatsou und Alexandraki 1994
AMY43	MATa ura3 Dftr1::LEU2	diese Arbeit
DEY1453	MAT trp1 ura3 Dfet3::LEU2 Dfet4::HIS3	Eide et al. 1996
SLY8	MATa ade2 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 smf1::HIS3	Korshunova et al. 1999
ZHY3	MATa ade6 can1 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 zrt1::LEU2 zrt2::HIS3	Zhao und Eide 1996b
64p	MATa gcn4 his3 trp1 ura3 Dctr1::LEU2	Dancis et al. 1994b
Bakterien (Escherichia coli)
DH5a	Standard-Propagation von Plasmiden	Hanahan 1983
Y1090(ZL)	Wirtsstamm für lZipLox-Phagen	Gibco
DH10B(Zip)	In vivo-Exzision von lZipLox-Phagen	Gibco
cDNA-Banken
Arabidopsis thaliana	im Hefe-Expressionsvektor pFL61	Minet et al. 1992
Tomaten	im Phagenvektor LambdaZipLox (Gibco)	Eckhardt und Buckhout 1998
Plasmide und Vektoren
PBluescript	Ampr	Stratagene, Heidelberg
pFL61	Ampr, URA3, 2 µm, PGK-P, PGK-T	Minet et al. 1992
pUC57-T	Ampr	MBI-Fermentas, Litauen
pUE1 und pUE2	Ampr, URA3, 2 µm, PGK-P, PGK-T	diese Arbeit
YDpL	Ampr, LEU2	Berben et al. 1991

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2.1.2 Geräte

Die in einem molekularbiologischen Labor übliche Grundausstattung stand mir zur Verfügung.

2.1.3 Chemikalien und Reagenzien

Amersham: Hybond-Membranen, Röntgenfilme, alk. Phosphatase; Applichem: Phenol, Tris, verschiedene Feinchemikalien; Biozym: Agarose, Pipettenspitzen, „Easy Pure“ Gelextraktions-Kit; Difco: Bacto Agar, Bacto Peptone, Bacto Tryptone, Yeast Nitrogen Base, NZ-Amin; Fluka: Isoamylalkohol, DPI, FCCP, CTAB, Sarcosyl; Gibco: „SuperscriptII“ Reverse Transkriptase, DNase I (Amplification Grade), Restriktionsenzyme NotI, SalI, ClaI, Taq-Polymerase, „Superscript-Lambda-System“-cDNA-Synthesekit, Phagenarme _ZipLox; MBI Fermentas: Restriktionsenzyme, Taq-Polymerase, T4-Ligase, T4-Kinase, dNTPs, Klenow-Fragment der DNA-PolymeraseI, Random Primed Labelling Kit; Merck: Chloroform, Dichlordimethylsilan, verschiedene Feinchemikalien; Pharmacia: T7-Sequencing-Kit, Sephadex G50 (fine), GFX-Gelextraktions-Kit; Qiagen: Qiaspin, Qiagen Tip100, Plasmidpräparations-Kits; Roth: Phenol, Chloroform, Acrylamidlösung, Ethanol (abs.), Glycin, SDS; Serva: Ampicillin, Kanamycin, Tris, Harnstoff; Sigma: diverse Feinchemikalien, BSA, GAM-AP (sek. Antikörper); Stratagene: Pfu-DNA-Polymerase, GigapackIII-Phagenverpackungsextrakte.

2.1.4 Radiochemikalien

Amersham: ³⁵S-dATP (1000 Ci/mmol), ³²P-dCTP (3000 Ci/mmol), ³²P-ATP (3000 Ci/mmol); NEN: ⁵⁵FeCl₃ (300 Ci/mmol), ⁵⁹FeCl₃ (3000 Ci/g).

2.1.5 Synthetische Oligonucleotide

Die Oligonucleotide wurden von TIB Molbiol, Gibco oder NAPS synthetisiert.

Bezeichnung	Sequenz (5‘ 3‘)
FTR1	TAGCAGAGTC GACAACCTCA CTTAAGGC
FTR2	CGAGCACCGT CGACGCAGTA AGAAGG
gIRT1-1	TCATATTTTG TAAAATCCAG ATAGGATAGG
gIRT2 -1	AAGAAATTCT ATCACTCTAT AGCTGTTGG
gIRT3-1	ATTATAATGT ATCATGATGT TGAAACGAAA GC
gIRT3-2	TTAGTATTGA GCTTACCTAA TTAGTTCGAG G
IRT1	CGAATTCAGC ACTTCTCATG AAAACAATCT TCC
IRT2	CCACATGATT TGAATTCCGC AATATCTGGA G
IRT1-m	TGGCTGTGGC TGGAAATCAT GTTC
IRT1-mr	ATGGGAATGA ACATGATTTC CAGCCACAG
IRT2-m	AATCCAGAAA CTGGTGGTGC TG
IRT2-mr	TGCACCCATT TCTTGATCAG CACCACCAGT
IRT-3‘	AACTACAAAT TAAGTCTTAC ATGGC TG
IRT-5‘	GCTCCACAAT CTTCTACTAC TGAT

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IRT13	AGAATTTTTT TGCAACTCCC AATAGGT
IRT13-r	TCTTTTATCT TCATGACCTA TTGGGAG
IRT15	AACATATTCT TATACTAAAA AAATTCTTC
IRT15-r	ATTGTGCAAT TGTGAAGAAT TTTTTTAGTA
IRT23	GAAAAGTATA CACGATTACA ATTTTCC
IRT23-r	CCTTTATTGA ATTGCAAAAT TGTAATCG
IRT25	ACATTCCTAC TCAAAATTCA AAAACCTCT
IRT25-r	TGCAAATGTA GAGGTTTTTG AATTTTGAG
T18-Pac	AGTACTTAAT TAAGCGGCCG CTTTTTTTTT TTTTTTTTTV
Tir-ME	CGATGGCTAT TGACTCTATA GC
Tir-EM	ATGCTATCCC AAGTGCTATA CCA
To-ACT1	AAGAGYTAYG ARYTNCCWGA TGG
To-ACT2	TTRATCTTCA TGCTRCTWGG AGC

2.2 Methoden

2.2.1 Anzucht von Tomatenpflanzen

Tomaten (Lycopersicon esculentum Mill., cv. „Rutgers“) wurden auf feuchtem Filterpapier ausgesät. Sie wurden vier Tage nach dem Keimen auf Vermiculit^® mit ¹/₂-fach konzentrierter Hoagland-Lösung ( Epstein 1972 ) bei einem Licht-Dunkel-Rythmus von 14h/10h und 60 % rel. Luftfeuchtigkeit in Klimakammern vorgezogen und nach einer Woche in Flüssigkultur in Hoagland-Lösung herangezogen. Für Eisenmangelversuche wurden sie in eisenfreie Nährlösung überführt, die alle drei Tage gewechselt wurde. Nach vier bis fünf Tagen waren Eisenmangelsymptome erkennbar.

2.2.2 Anzucht der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii

Alle Methoden wurden in Anlehnung an das Standardwerk von Harris 1988 durchgeführt. Die Algen wurden mixotroph in TAP-Medium herangezogen. Auf Platten wurde dem TAP-Medium 0,3 % Yeast Extract zugesetzt. Für Eisen- und Kupfermangelversuche wurden die darin enthaltenen Spurenelemente ohne Fe oder ohne Cu eingesetzt..

2.2.3 Eisenchelat-Reduktasetest in Chlamydomonas reinhardtii

Die Reduktasetests wurden beschrieben ( Eckhardt und Buckhout 1998 ).

2.2.4 Kupferreduktasetest in Chlamydomonas reinhardtii

Die extrazelluläre Reduktion von Cu²⁺ wurde nach Eckhardt und Buckhout 1998 gemessen.

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2.2.5 Messung der Eisenaufnahme in Chlamydomonas reinhardtii

Die Eisentransportmessungen wurden bei Eckhardt und Buckhout 1998 beschrieben.

2.2.6 RNA-Isolation aus Pflanzen und Northern-Blot-Analyse

Pflanzliche Gesamt-RNA wurde nach Logemann et al. 1987 isoliert. Für Northern Blot-Analysen wurden je 30 µg Gesamt-RNA über formaldehydhaltige Agarosegele ( Lehrach et al. 1977 ) aufgetrennt, auf Nylonmembranen überführt und nach einer einstündigen Prähybridisierung in NSEB (125 mM Na-Phosphat, 7 % SDS, 5 mM EDTA, 1 % BSA, pH 7,2) über Nacht bei 65°C mit genspezifischen Sonden ( Feinberg und Vogelstein 1983 ) hybridisiert. Die Membranen wurden stringent gewaschen (2 x 15 min, 2-fach SSC, 0,2 % SDS bei 50°C sowie 1 x 15 min mit 0,2-fach SSC, 0,2 % SDS). Ein Röntgenfilm wurde bei -80°C auf den Membranen exponiert.

2.2.7 DNA-Isolation aus Pflanzen und Southern Blot-Analyse

Pflanzliche DNA wurde nach Rogers und Bendich 1985 isoliert. Southern Blot-Analysen wurden nach Sambrook et al. 1989 durchgeführt. Die Sonden wurden mit dem „Renaissance“-System von NEN nicht-radioaktiv markiert und mit Hilfe eines Peroxidase-gekoppelten anti-Fluorescein-Antikörpers durch eine Chemilumineszenz-Reaktion detektiert.

2.2.8 PCR-Amplifikation von DNA mit spezifischen Primern

Zur PCR-Amplifikation wurden 0,01 - 0,1 µg DNA-Templat mit 20 nM Primer, 200 nM dNTPs, 1,5 - 2,5 mM MgCl₂, 1 - 3 U Taq-Polymerase, PCR-Puffer nach Herstellerangaben (Gibco) in einem Volumen von 30 - 100 µl eingesetzt. Nach 4 Minuten Denaturierung bei 94 °C wurden 28 - 38 Zyklen von 30 s Denaturierung bei 94°C, 45 s Annealing bei 48-60°C und 60-90 s Polymerisation bei 72°C durchlaufen. Anschließend wurde die Polymerisation 5 Minuten lang bei 72°C fortgesetzt und die Ansätze wurden auf 4°C gekühlt. 10 µl der PCR-Ansätze wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt. Der Rest wurde aufgereinigt und in den Vektor pUC57-T (MBI) ligiert.

2.2.9 RT-PCR

2 µg Gesamt-RNA wurde für 5 Minuten bei 68°C denaturiert, mit 20 pmol Oligo(dT)-Primer, 20 µM dNTPs, 2 mM DTT, 1xErststrangpuffer (Gibco), 0,2 u/µl RNase-Inhibitor (MBI) und 10 u/µl Superscript(II)-Reverse Transkriptase (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 20 µl bei 37-45°C revers transkribiert. 1-2 µl des RT-Ansatzes wurden als Templat in eine PCR-Reaktion eingesetzt.

2.2.10 Konstruktion von cDNA-Banken

Polyadenylierte mRNA wurde aus Gesamt-RNA mit dem PolyA-Spin^® Kit von NEB angereichert. 4-5 µg mRNA wurden mit Hilfe des Superscript-Lambda-Systems (Gibco) nach Herstellerangaben in doppelsträngige cDNA überführt. Nach Addition von Linkern, Restriktionsspaltung und Größenselektion über Gelfiltrationssäulen wurden die Fraktionen mit

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2.2.11 Sequenzanalyse doppelsträngiger DNA

Die Sequenzierungen wurden nach der Didesoxymethode ( Sanger et al. 1977 ) mit Hilfe des T7-Sequencing Kits (Pharmacia) mit ³⁵S-dATP durchgeführt. Außerdem konnte der Sequenzierservice der Arbeitsgruppe für Genetik (Biologie, HU-Berlin) genutzt werden.

2.2.12 Computergestützte Analyse der DNA-Sequenzen

Die NCBI-Server: Blast und Entrez wurden benutzt, um eigene Sequenzen mit der GenBank^® und der Swissprot^®-Datenbank zu vergleichen oder um Sequenzen zu importieren. Die erhaltenen Sequenzen wurden auf einem IBM-kompatibelen PC mit Hilfe des BlueGene^®-Programmes (MagicWorks, Teltow) analysiert. Sequenzalignments wurden mit dem ClustalW-Algorithmus ( Thompson et al. 1994 ) durchgeführt und mit Hilfe des GeneDoc-Programmes (

www.cris.com/~ketchup/genedoc.shtml

2.2.13 Sonstige molekularbiologische Methoden

Alle anderen molekularbiologischen Methoden wurden nach Sambrook et al. 1989 durchgeführt.

2.2.14 Transformation von Saccharomyces cerevisiae

Hefezellen wurden nach der Methode von Dohmen et al. 1991 transformiert.

2.2.15 Präparation von Plasmid- und genomischer DNA aus Saccharomyces cerevisiae

10-ml-Kulturen wurden in Voll- oder Selektivmedium bis zur stationären Wachstumsphase herangezogen und durch Zentrifugation geerntet. Nach 30-minütigem Zellwandabbau durch Lyticase in SCE-Puffer (0,9 M Sorbit, 50 mM Na-Citrat, 10 mM EDTA, 0,1 % ME) wurden die Hefen in Lysispuffer (2 % Triton-X100, 1 % SDS, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8) mit Glaskügelchen (_ 0,5 mm) in Gegenwart von Phenol/Chloroform fünf Minuten lang geschüttelt. Die wässrige Phase wurde abgenommen, die Nucleinsäuren wurden ethanolpräzipitiert, in TE-RNase gelöst, nach 20 min bei 37 °C erneut mit Chloroform extrahiert und präzipitiert. Die gewaschenen Sedimente wurden in 50 µl TE gelöst. Fünf µl davon wurden zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen, 15 µl für Restriktionsspaltungen für Southern-Blots und 0,5 µl als Templat in analytische PCR-Reaktionen eingesetzt. Die aus E. coli isolierten Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse oder PCR identifiziert.

2.2.16 Eisenchelat-Reduktasetest in Saccharomyces cerevisiae

Die Eisenreduktase in Hefe wurde zunächst mit einem Filtertest ( Dancis et al. 1990 ) detektiert.

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2.2.17 Messung der Eisenaufnahme in Saccharomyces cerevisiae

Fe-Transportmessungen wurden bei Eckhardt et al. 2000 beschrieben.

2.2.18 Sonstige hefegenetische Methoden

Alle anderen hefegenetischen Arbeiten wurden nach dem Standardwerk von Rose et al. 1990 durchgeführt.

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