Eckhardt, Ulrich: Untersuchungen zur Eisenassimilation in Pflanzen

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Pflanzen, Stämme und Vektoren

Tomaten (Lycopersicon esculentum Mill.)

Cultivar „Rutgers“

 

Meyer‘s Seed Co, Baltimore, MD

Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana)

Öcotyp „Landsberg erecta“

 

Samen erhalten von Dr. Thomas Altmann, IGF-Berlin

Öcotyp „Columbia“

 

Algen (Chlamydomonas reinhardtii)

11-32b

mt-

Sammlung von Algenkulturen, Göttingen

Chlamydomonas Genetic Center, Durham, NC

11-32c

mt+

83.81

mt-, cw15

CC-980

mt+, F50

Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)

S288C

MATa leu2 ura3

Georgatsou und Alexandraki 1994

AMY43

MATa ura3 Dftr1::LEU2

diese Arbeit

DEY1453

MATalpha trp1 ura3 Dfet3::LEU2 Dfet4::HIS3

Eide et al. 1996

SLY8

MATa ade2 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 smf1::HIS3

Korshunova et al. 1999

ZHY3

MATa ade6 can1 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 zrt1::LEU2 zrt2::HIS3

Zhao und Eide 1996b

64p

MATa gcn4 his3 trp1 ura3 Dctr1::LEU2

Dancis et al. 1994b

Bakterien (Escherichia coli)

DH5a

Standard-Propagation von Plasmiden

Hanahan 1983

Y1090(ZL)

Wirtsstamm für lZipLox-Phagen

Gibco

DH10B(Zip)

In vivo-Exzision von lZipLox-Phagen

Gibco

cDNA-Banken

Arabidopsis thaliana

im Hefe-Expressionsvektor pFL61

Minet et al. 1992

Tomaten

im Phagenvektor LambdaZipLox (Gibco)

Eckhardt und Buckhout 1998

Plasmide und Vektoren

PBluescript

Ampr

Stratagene, Heidelberg

pFL61

Ampr, URA3, 2 µm, PGK-P, PGK-T

Minet et al. 1992

pUC57-T

Ampr

MBI-Fermentas, Litauen

pUE1 und pUE2

Ampr, URA3, 2 µm, PGK-P, PGK-T

diese Arbeit

YDpL

Ampr, LEU2

Berben et al. 1991


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2.1.2 Geräte

Die in einem molekularbiologischen Labor übliche Grundausstattung stand mir zur Verfügung.

2.1.3 Chemikalien und Reagenzien

Amersham: Hybond-Membranen, Röntgenfilme, alk. Phosphatase; Applichem: Phenol, Tris, verschiedene Feinchemikalien; Biozym: Agarose, Pipettenspitzen, „Easy Pure“ Gelextraktions-Kit; Difco: Bacto Agar, Bacto Peptone, Bacto Tryptone, Yeast Nitrogen Base, NZ-Amin; Fluka: Isoamylalkohol, DPI, FCCP, CTAB, Sarcosyl; Gibco: „SuperscriptII“ Reverse Transkriptase, DNase I (Amplification Grade), Restriktionsenzyme NotI, SalI, ClaI, Taq-Polymerase, „Superscript-Lambda-System“-cDNA-Synthesekit, Phagenarme lambdaZipLox; MBI Fermentas: Restriktionsenzyme, Taq-Polymerase, T4-Ligase, T4-Kinase, dNTPs, Klenow-Fragment der DNA-PolymeraseI, Random Primed Labelling Kit; Merck: Chloroform, Dichlordimethylsilan, verschiedene Feinchemikalien; Pharmacia: T7-Sequencing-Kit, Sephadex G50 (fine), GFX-Gelextraktions-Kit; Qiagen: Qiaspin, Qiagen Tip100, Plasmidpräparations-Kits; Roth: Phenol, Chloroform, Acrylamidlösung, Ethanol (abs.), Glycin, SDS; Serva: Ampicillin, Kanamycin, Tris, Harnstoff; Sigma: diverse Feinchemikalien, BSA, GAM-AP (sek. Antikörper); Stratagene: Pfu-DNA-Polymerase, GigapackIII-Phagenverpackungsextrakte.

2.1.4 Radiochemikalien

Amersham: alpha35S-dATP (1000 Ci/mmol), alpha32P-dCTP (3000 Ci/mmol), gamma32P-ATP (3000 Ci/mmol); NEN: 55FeCl3 (300 Ci/mmol), 59FeCl3 (3000 Ci/g).

2.1.5 Synthetische Oligonucleotide

Die Oligonucleotide wurden von TIB Molbiol, Gibco oder NAPS synthetisiert.

Bezeichnung

Sequenz (5‘ rarr 3‘)

FTR1

TAGCAGAGTC GACAACCTCA CTTAAGGC

FTR2

CGAGCACCGT CGACGCAGTA AGAAGG

gIRT1-1

TCATATTTTG TAAAATCCAG ATAGGATAGG

gIRT2 -1

AAGAAATTCT ATCACTCTAT AGCTGTTGG

gIRT3-1

ATTATAATGT ATCATGATGT TGAAACGAAA GC

gIRT3-2

TTAGTATTGA GCTTACCTAA TTAGTTCGAG G

IRT1

CGAATTCAGC ACTTCTCATG AAAACAATCT TCC

IRT2

CCACATGATT TGAATTCCGC AATATCTGGA G

IRT1-m

TGGCTGTGGC TGGAAATCAT GTTC

IRT1-mr

ATGGGAATGA ACATGATTTC CAGCCACAG

IRT2-m

AATCCAGAAA CTGGTGGTGC TG

IRT2-mr

TGCACCCATT TCTTGATCAG CACCACCAGT

IRT-3‘

AACTACAAAT TAAGTCTTAC ATGGC TG

IRT-5‘

GCTCCACAAT CTTCTACTAC TGAT


25

IRT13

AGAATTTTTT TGCAACTCCC AATAGGT

IRT13-r

TCTTTTATCT TCATGACCTA TTGGGAG

IRT15

AACATATTCT TATACTAAAA AAATTCTTC

IRT15-r

ATTGTGCAAT TGTGAAGAAT TTTTTTAGTA

IRT23

GAAAAGTATA CACGATTACA ATTTTCC

IRT23-r

CCTTTATTGA ATTGCAAAAT TGTAATCG

IRT25

ACATTCCTAC TCAAAATTCA AAAACCTCT

IRT25-r

TGCAAATGTA GAGGTTTTTG AATTTTGAG

T18-Pac

AGTACTTAAT TAAGCGGCCG CTTTTTTTTT TTTTTTTTTV

Tir-ME

CGATGGCTAT TGACTCTATA GC

Tir-EM

ATGCTATCCC AAGTGCTATA CCA

To-ACT1

AAGAGYTAYG ARYTNCCWGA TGG

To-ACT2

TTRATCTTCA TGCTRCTWGG AGC

2.2 Methoden

2.2.1 Anzucht von Tomatenpflanzen

Tomaten (Lycopersicon esculentum Mill., cv. „Rutgers“) wurden auf feuchtem Filterpapier ausgesät. Sie wurden vier Tage nach dem Keimen auf Vermiculit® mit 1/2-fach konzentrierter Hoagland-Lösung ( Epstein 1972 ) bei einem Licht-Dunkel-Rythmus von 14h/10h und 60 % rel. Luftfeuchtigkeit in Klimakammern vorgezogen und nach einer Woche in Flüssigkultur in Hoagland-Lösung herangezogen. Für Eisenmangelversuche wurden sie in eisenfreie Nährlösung überführt, die alle drei Tage gewechselt wurde. Nach vier bis fünf Tagen waren Eisenmangelsymptome erkennbar.

2.2.2 Anzucht der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii

Alle Methoden wurden in Anlehnung an das Standardwerk von Harris 1988 durchgeführt. Die Algen wurden mixotroph in TAP-Medium herangezogen. Auf Platten wurde dem TAP-Medium 0,3 % Yeast Extract zugesetzt. Für Eisen- und Kupfermangelversuche wurden die darin enthaltenen Spurenelemente ohne Fe oder ohne Cu eingesetzt..

2.2.3 Eisenchelat-Reduktasetest in Chlamydomonas reinhardtii

Die Reduktasetests wurden beschrieben ( Eckhardt und Buckhout 1998 ).

2.2.4 Kupferreduktasetest in Chlamydomonas reinhardtii

Die extrazelluläre Reduktion von Cu2+ wurde nach Eckhardt und Buckhout 1998 gemessen.


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2.2.5 Messung der Eisenaufnahme in Chlamydomonas reinhardtii

Die Eisentransportmessungen wurden bei Eckhardt und Buckhout 1998 beschrieben.

2.2.6 RNA-Isolation aus Pflanzen und Northern-Blot-Analyse

Pflanzliche Gesamt-RNA wurde nach Logemann et al. 1987 isoliert. Für Northern Blot-Analysen wurden je 30 µg Gesamt-RNA über formaldehydhaltige Agarosegele ( Lehrach et al. 1977 ) aufgetrennt, auf Nylonmembranen überführt und nach einer einstündigen Prähybridisierung in NSEB (125 mM Na-Phosphat, 7 % SDS, 5 mM EDTA, 1 % BSA, pH 7,2) über Nacht bei 65°C mit genspezifischen Sonden ( Feinberg und Vogelstein 1983 ) hybridisiert. Die Membranen wurden stringent gewaschen (2 x 15 min, 2-fach SSC, 0,2 % SDS bei 50°C sowie 1 x 15 min mit 0,2-fach SSC, 0,2 % SDS). Ein Röntgenfilm wurde bei -80°C auf den Membranen exponiert.

2.2.7 DNA-Isolation aus Pflanzen und Southern Blot-Analyse

Pflanzliche DNA wurde nach Rogers und Bendich 1985 isoliert. Southern Blot-Analysen wurden nach Sambrook et al. 1989 durchgeführt. Die Sonden wurden mit dem „Renaissance“-System von NEN nicht-radioaktiv markiert und mit Hilfe eines Peroxidase-gekoppelten anti-Fluorescein-Antikörpers durch eine Chemilumineszenz-Reaktion detektiert.

2.2.8 PCR-Amplifikation von DNA mit spezifischen Primern

Zur PCR-Amplifikation wurden 0,01 - 0,1 µg DNA-Templat mit 20 nM Primer, 200 nM dNTPs, 1,5 - 2,5 mM MgCl2, 1 - 3 U Taq-Polymerase, PCR-Puffer nach Herstellerangaben (Gibco) in einem Volumen von 30 - 100 µl eingesetzt. Nach 4 Minuten Denaturierung bei 94 °C wurden 28 - 38 Zyklen von 30 s Denaturierung bei 94°C, 45 s Annealing bei 48-60°C und 60-90 s Polymerisation bei 72°C durchlaufen. Anschließend wurde die Polymerisation 5 Minuten lang bei 72°C fortgesetzt und die Ansätze wurden auf 4°C gekühlt. 10 µl der PCR-Ansätze wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt. Der Rest wurde aufgereinigt und in den Vektor pUC57-T (MBI) ligiert.

2.2.9 RT-PCR

2 µg Gesamt-RNA wurde für 5 Minuten bei 68°C denaturiert, mit 20 pmol Oligo(dT)-Primer, 20 µM dNTPs, 2 mM DTT, 1xErststrangpuffer (Gibco), 0,2 u/µl RNase-Inhibitor (MBI) und 10 u/µl Superscript(II)-Reverse Transkriptase (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 20 µl bei 37-45°C revers transkribiert. 1-2 µl des RT-Ansatzes wurden als Templat in eine PCR-Reaktion eingesetzt.

2.2.10 Konstruktion von cDNA-Banken

Polyadenylierte mRNA wurde aus Gesamt-RNA mit dem PolyA-Spin® Kit von NEB angereichert. 4-5 µg mRNA wurden mit Hilfe des Superscript-Lambda-Systems (Gibco) nach Herstellerangaben in doppelsträngige cDNA überführt. Nach Addition von Linkern, Restriktionsspaltung und Größenselektion über Gelfiltrationssäulen wurden die Fraktionen mit


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den größten cDNAs in den Phagenvektor LambdaZipLox ligiert. Das Ligationsgemisch wurde mit Hilfe des Gigapack III-Verpackungsextraktes (Stratagene) in Phagenpartikel verpackt und geeignete Wirtszellen wurden mit den Phagen infiziert.

2.2.11 Sequenzanalyse doppelsträngiger DNA

Die Sequenzierungen wurden nach der Didesoxymethode ( Sanger et al. 1977 ) mit Hilfe des T7-Sequencing Kits (Pharmacia) mit alpha35S-dATP durchgeführt. Außerdem konnte der Sequenzierservice der Arbeitsgruppe für Genetik (Biologie, HU-Berlin) genutzt werden.

2.2.12 Computergestützte Analyse der DNA-Sequenzen

Die NCBI-Server: Blast und Entrez wurden benutzt, um eigene Sequenzen mit der GenBank® und der Swissprot®-Datenbank zu vergleichen oder um Sequenzen zu importieren. Die erhaltenen Sequenzen wurden auf einem IBM-kompatibelen PC mit Hilfe des BlueGene®-Programmes (MagicWorks, Teltow) analysiert. Sequenzalignments wurden mit dem ClustalW-Algorithmus ( Thompson et al. 1994 ) durchgeführt und mit Hilfe des GeneDoc-Programmes (

www.cris.com/~ketchup/genedoc.shtml

) dargestellt. Das SignalP- ( Nielsen et al. 1997 ) und das TopPredII-Programm ( Claros und v. Heijne 1994 ) wurden online benutzt.

2.2.13 Sonstige molekularbiologische Methoden

Alle anderen molekularbiologischen Methoden wurden nach Sambrook et al. 1989 durchgeführt.

2.2.14 Transformation von Saccharomyces cerevisiae

Hefezellen wurden nach der Methode von Dohmen et al. 1991 transformiert.

2.2.15 Präparation von Plasmid- und genomischer DNA aus Saccharomyces cerevisiae

10-ml-Kulturen wurden in Voll- oder Selektivmedium bis zur stationären Wachstumsphase herangezogen und durch Zentrifugation geerntet. Nach 30-minütigem Zellwandabbau durch Lyticase in SCE-Puffer (0,9 M Sorbit, 50 mM Na-Citrat, 10 mM EDTA, 0,1 % betaME) wurden die Hefen in Lysispuffer (2 % Triton-X100, 1 % SDS, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8) mit Glaskügelchen (_ 0,5 mm) in Gegenwart von Phenol/Chloroform fünf Minuten lang geschüttelt. Die wässrige Phase wurde abgenommen, die Nucleinsäuren wurden ethanolpräzipitiert, in TE-RNase gelöst, nach 20 min bei 37 °C erneut mit Chloroform extrahiert und präzipitiert. Die gewaschenen Sedimente wurden in 50 µl TE gelöst. Fünf µl davon wurden zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen, 15 µl für Restriktionsspaltungen für Southern-Blots und 0,5 µl als Templat in analytische PCR-Reaktionen eingesetzt. Die aus E. coli isolierten Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse oder PCR identifiziert.

2.2.16 Eisenchelat-Reduktasetest in Saccharomyces cerevisiae

Die Eisenreduktase in Hefe wurde zunächst mit einem Filtertest ( Dancis et al. 1990 ) detektiert.


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Dieser Test wurde später durch die eindeutigere Nitroprussid-Methode von Lesuisse et al. 1995 ersetzt. Quantitativ wurde die Eisenreduktase durch eine Modifikation der Methode von Dancis et al. 1990 bestimmt.

2.2.17 Messung der Eisenaufnahme in Saccharomyces cerevisiae

Fe-Transportmessungen wurden bei Eckhardt et al. 2000 beschrieben.

2.2.18 Sonstige hefegenetische Methoden

Alle anderen hefegenetischen Arbeiten wurden nach dem Standardwerk von Rose et al. 1990 durchgeführt.


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