Eckhardt, Ulrich: Untersuchungen zur Eisenassimilation in Pflanzen

29

Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Konzept zur Isolierung von Fe-Transporter-cDNA-Klonen aus Tomaten

Die Ähnlichkeit der Fe-Transportergene zwischen verschiedenen Spezies höherer Pflanzen sollte hoch genug sein, um die entsprechenden Sequenzen durch heterologe Hybridisierung identifizieren zu können. Das Konzept zur Isolierung von Fe-Transporter-cDNA-Klonen aus Tomaten umfaßt die Isolierung der IRT1-cDNA durch RT-PCR aus der RNA eisengehungerter Arabidopsis-Wurzeln, die Konstruktion einer cDNA-Bank aus eisengehungerten Tomatenwurzeln und das Screening dieser Bank mit der IRT1-cDNA als Sonde. Zur funktionellen Charakterisierung der cDNAs war die Konstruktion einer eisentransportdefizienten Hefemutante notwendig.

3.2 Konstruktion neuer Hefe-Expressionsvektoren

Das Plasmid pFL61, welches das Rückgrat für die Hefe-Expressions-cDNA-Bank aus Arabidopsis bildet ( Minet et al. 1992 ), zeichnet sich durch ausgezeichnete Expressionseigenschaften in Hefe aus. Es enthält den Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor sowie das 3‘-Ende des PGK-Gens. Dieses Plasmid enthält jedoch nur eine einzige Schnittstelle (NotI) zur Insertion fremder DNA. Darum erschien es sinnvoll, das Plasmid durch Addition mehrerer singulärer Schnittstellen zu erweitern.

Der größte Teil des ursprünglich vorhandenen pUC-Polylinkers in pFL61 wurde durch Verdau mit SmaI und PvuII deletiert. In die NotI-Schnittstelle wurde das 79 bp große NotI-Bsp120I Fragment des pBluescript-Polylinkers inseriert. Durch die zwei möglichen Orientierungen ergaben sich die Plasmide pUE1 und pUE2. Sie unterscheiden sich durch die Orientierung des Polylinkers ( Abb. 7 ).


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Abb. 7: Schematische Restriktionskarten der Hefe-Expressionsplasmide pUE1 und pUE2. Nur singuläre Schnittstellen sind aufgeführt. Die Karten sind nicht maßstabsgetreu. PGK-P: Phosphoglyceratkinase-Promotor, PGK-T: Phosphoglyceratkinase-Terminator, 2µm: Replikationsursprung des in S. cerevisiae natürlich vorkommenden 2µm-Plasmides, Amp: beta-Lactamasegen.

3.3 Konstruktion einer Fe-Transport-defizienten Hefemutante

3.3.1 Deletion des FTR1-Gens im Hefestamm S288C

Das FTR1-Gen codiert für eine Komponente des hochaffinen Fe-Aufnahmesystems in Hefe ( Stearman et al. 1996 ). Ein 1894 bp großes Fragment des FTR1-Gens wurde durch PCR mit den Primern FTR1 und FTR2 aus genomischer Hefe-DNA amplifiziert und mit SalI-Schnittstellen versehen. Dieses Fragment wurde zunächst in den Vektor pUC57-T ligiert und anschließend in das Plasmid pSKDeltaPst, einem Derivat von pBluescriptSK-, dem die SmaI-, die EcoRI, die PstI und die EcoRV-Schnittstellen fehlen, subkloniert. Das LEU2-Gen aus Hefe wurde vom Plasmid YDpL mit SmaI und PstI befreit und in das mit PstI und EcoRV gespaltene und dephosphorylierte FTR1-haltige Plasmid ligiert ( Abb. 8 A).


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Abb. 8: A: Schema der Konstruktion einer „one step gene disruption“-Kassette zur Deletion des FTR1-Gens aus S. cerevisiae. B: Schema der Deletion des FTR1-Gens durch homologe Rekombination.

Das Insert des resultierenden Plasmides pDeltaftr1::LEU2 wurde durch PCR amplifiziert und kompetente Zellen des Hefestammes S288C wurden mit dem Deletionsfragment transformiert ( Abb. 8 B). Die Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit zum Wachstum auf leucinfreiem Medium selektiert. In vier von 12 untersuchten, leucinprototrophen Kolonien konnte das Deletionskonstrukt durch PCR und Southern-Blot-Analysen nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht gezeigt; Mas Marques 1998 ).


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3.3.2 Wachstum der putativen Deltaftr1-Mutanten auf eisenlimitiertem Medium

Kolonien der Stämme AMY42, AMY43 und AMY44 waren nicht in der Lage, auf YPD-Medium mit 200 µM des Fe2+-spezifischen Chelators BPDS zu wachsen, während der Wildtypstamm S288C unter diesen Bedingungen gut wachsen konnte ( Abb. 9 ).

Abb. 9: Wachstum der mit einem Deltaftr1::LEU2-Deletionskonstrukt transformierten Hefekolonien, sowie ihres Elternstammes auf BPDS-haltigem YPD-Medium. A: Wildtypstämme S288C und DBY747. B: Leucin-prototrophe Transformanten AMY 42, AMY43 und AMY44 (mit Genehmigung von Andreas Mas Marques).

Der Stamm AMY43 wurde für die nachfolgenden Analysen ausgewählt ( Mas Marques 1998 ).

3.3.3 Messung der Fe-Transports im Stamm AMY43

Um die Deletion des FTR1-Gens phänotypisch zu untersuchen, wurde der direkte Transport radioaktiv markierten Eisens gemessen. Dazu wurde zunächst ein Testsystem, modifiziert nach Eide et al. 1992 , etabliert: In Vorversuchen wurden die Substratkonzentration, die Länge der Messung, die Zellzahl, der Einfluß verschiedener Filtermaterialien sowie verschiedene Pufferbedingungen variiert. Die daraus resultierenden Testbedingungen sind im Methodenteil ( 2.2.17 ) sowie bei Eckhardt et al. 2000 beschrieben.

Um die Deletion einer Komponente des hochaffinen Fe-Transportsystems in Hefe nachzuweisen, wurde Fe2+ für die Aufnahmemessungen in einer Konzentration von 2 µM angeboten. Unter diesen Bedingungen sollte der niedrigaffine Fe-Transport kaum aktiv sein ( Dix et al. 1994 ). Der Stamm AMY43 zeigte unter den gewählten Versuchsbedingungen mit 0,02 pmol/min/106 Zellen sehr geringe Fe-Aufnahme im Vergleich zu seinem Wildtyp S288C (1,88 pmol/min/106 Zellen; Abb. 10 ; Mas Marques 1998 ).


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Abb. 10: Vergleich der Fe-Aufnahme der Hefestämme S288C und AMY43. Die Zellen wurden über Nacht auf Fe-limitierendem Medium herangezogen, gewaschen und zwei Stunden lang auf Eis gehalten. Die Zellen wurden bei 30°C mit 2 µM radioaktiv markiertem Fe2+ in Gegenwart von Ascorbat inkubiert. Nach 20 sec., 3, 6, 9 und 12 min wurden Aliquots der Zellsuspension in eiskalte Quenchlösung pipettiert, die Lösung wurde über Glasfaserfilter abgesaugt, die Zellen wurden mit Quenchlösung gewaschen und die auf den Filtern verbliebene Radioaktivität wurde gemessen. Kontrollwerte auf Eis wurden von den Meßwerten bei 30°C abgezogen (n = 2; mit Genehmigung von Andreas Mas Marques).

3.4 Konstruktion einer Tomatenwurzel-cDNA-Bank

Zwei Wochen alte Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum Mill., cv. Rutgers) wurden in Hydrokultur fünf Tage lang eisenfrei herangezogen. Die RNA ihrer Wurzeln wurde isoliert und polyadenylierte mRNA wurde durch zweimalige Chromatographie über oligo(dT)-Cellulose angereichert. Eine cDNA-Bank wurde aus dieser mRNA mit Hilfe des Superscript Lambda Systems in dem Phagenvektor LambdaZipLox konstruiert und in vitro in Phagenpartikel verpackt.

Die primäre Bank wurde titriert, sie umfaßte über 6 Millionen plaque-bildende Bakteriophagen. Durch Ausplattieren auf X-Gal/IPTG-haltigem Medium wurde der Anteil rekombinanter Phagen geschätzt: er lag bei über 99 %. Die Analyse 24 zufällig ausgewählter Klone wurde für die Bestimmung der mittleren Insertgröße herangezogen. Alle Klone enthielten Inserts, deren Größe zwischen 0,5 und 2,0 kb lag. Die mittlere Insertgröße lag bei etwa 1,25 kb ( Abb. 11 ).


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Abb. 11: Bestimmung der mittleren Insertgröße der Tomatenwurzel-cDNA-Bank. 24 Kolonien einer in vivo-Exzision der Bank wurden in Flüssigkultur herangezogen. Ihre Plasmid-DNA wurde mit MluI gespalten. Die Bande bei 4,1 kb entspricht der Vektor-DNA. Als Größenstandard wurde PstI-gespaltene Lambda-DNA verwendet. Die Größen der Markerbanden in kb sind links angezeichnet.

3.5 Screening der Tomatenwurzel-cDNA-Bank mit der IRT1-cDNA aus Arabidopsis thaliana

Ein 1074 bp großes cDNA-Fragment von IRT1 ( Eide et al. 1996 ) wurde durch RT-PCR mit Hilfe der Primer IRT1 und IRT2 aus der Wurzel-RNA eisengehungerter Arabidopsis-Pflanzen amplifiziert. Es wurde kloniert und durch Restriktionsanalyse sowie partielle Sequenzanalyse identifiziert.

Etwa 200.000 Phagenplaques der Tomatenwurzel-cDNA-Bank wurden durch Hybridisierung mit dem IRT1-cDNA-Fragment aus Arabidopsis thaliana durchmustert. Dabei konnten elf hybridisierende Plaques isoliert werden. Die Phagen wurden in vivo exzisiert und je 2 Kolonien wurden zur Plasmidpräparation herangezogen. Die Plasmide wurden zunächst durch Restriktionsanalysen analysiert. Anhand der Restriktionsmuster ließen sich zwei Klassen von Klonen finden, die sich durch das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer BamHI-Schnittstelle unterschieden. Allerdings waren die Restriktionsmuster der aus einem Phagenplaque hervorgegangenen Plasmide nicht in allen Fällen gleich, so daß die Identifizierung der putativen Eisentransporterklone durch partielle Sequenzanalyse sowie durch funktionelle Komplementation einer Hefemutante vorgezogen wurde.


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3.6 Isolierung putativer Fe-Transporter-cDNAs aus Tomatenwurzeln

Aufgrund der partiellen Sequenzanalyse der 22 Plasmide ließen sich fünf unterschiedliche Sequenztypen unterscheiden, von denen zwei Ähnlichkeiten zu IRT1 aufwiesen (Sequenztypen I und II), während drei Plasmide weder zueinander noch zu IRT1 Sequenzähnlichkeiten aufwiesen (Sequenztypen III bis V, Mas Marques 1998 ). Letztere wurden nicht weiter analysiert.

Die cDNA-Inserts der Sequenztypen I und II wurden durch Restriktion mit NotI und SalI aus ihrem Plasmid befreit und in den ebenfalls mit SalI und NotI gespaltenen und dephosphorylierten Hefe-Expressionsvektor pUE1 ligiert. Kompetente Zellen der Hefestämme AMY43 und DEY1453 wurden mit den Ligationsgemischen transformiert. Einzelne uracilprototrophe Kolonien wurden auf Fe-limitierendem Medium ausgestrichen. Dieselben Kolonien wurden zur Plasmidpräparation herangezogen. Es zeigte sich, daß alle Kolonien, die auf Fe-limitierendem Medium wachsen konnten, Plasmide mit den cDNA-Inserts enthielten, während die Kolonien, die unter gleichen Bedingungen nicht wuchsen, religierte „leere“ Plasmide enthielten ( Mas Marques 1998 ).

Die cDNAs, die den Hefemutanten die Fähigkeit zum Wachstum auf Fe-limitierendem Medium verliehen hatten ( Abb. 16 ), wiesen deutliche Homologien zu IRT1 aus Arabidopsis auf. Daher wurden sie als „Lycopersicon esculentum iron-regulated transporter“ (LeIRT1 und LeIRT2) bezeichnet.

3.6.1 Sequenzanalyse der putativen Fe-Transporter-cDNAs aus Tomaten

Die cDNA-Inserts der aus Hefe isolierten Plasmide wurden vollständig und doppelsträngig sequenziert und ihre Sequenzen wurden in der GenBank™ unter den Accessionnummern AF136579 und AF136580 veröffentlicht. Beide cDNAs enthalten lange offene Leserahmen, die für ein 350 Aminosäuren (AS, LeIRT1, Abb. 12 )

bzw. für ein 352 AS langes Polypeptid (LeIRT2, Abb. 13 ) codiert.


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Abb. 12: cDNA- und daraus abgeleitete Peptidsequenz von LeIRT1. Die blauen Kästen repräsentieren putative TM-Domänen Der rote Kasten stellt das putative Signalpeptid dar. Der Histidin-Cluster ist blau und unterstrichen.


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Abb. 13: cDNA- und daraus abgeleitete Peptidsequenz von LeIRT2.


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Die aus den cDNA-Sequenzen abgeleiteten Polypeptide sind stark hydrophob. Hydropathie-Analysen ( Kyte und Doolittle 1982 ) wiesen auf 8 oder 9 putative Transmembran(TM)-Domänen hin ( Abb. 14 ). Beide Polypeptide enthalten mehrere Histidinreste zwischen der 4. und der 5. hydrophoben Domäne. Analysen mit dem TopPred- und dem SignalP-Algorithmus ergaben, daß die histidinreichen Domänen (H170-H177, LeIRT1 und H174-H179, LeIRT2) auf der cytosolischen Membranseite lokalisiert sind und daß beide Polypeptide höchstwahrscheinlich N-terminale Signalsequenzen zur Integration ins Endoplasmatische Retikulum aufweisen. Ob diese Signalsequenzen proteolytisch entfernt werden, ist nicht bekannt. Die aus den Sequenzdaten abgeleiteten Eigenschaften der LeIRT-Polypeptide sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Abb. 14: Kyte/Doolittle-Hydropathieanalyse der LeIRT-Proteine bei einer Fenstergröße von 13 Aminosäuren. Rote Balken symbolisieren putative Signalsequenzen, blaue Balken stellen putative Transmembrandomänen dar.


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Tabelle 2: Übersicht über die LeIRT-cDNAs und die daraus abgeleiteten Polypeptide. ORF-Analysen, Glycosylierungsstellen, Kyte/Doolittle-Hydropathie-Analysen, Berechnung des Mr und der Pi. wurden mit dem Programm BlueGene™ der Firma Magic Works erstellt. Weiterhin wurden das TopPred™- und das SignalP™-Programm verwendet.

 

Länge der cDNA

Länge des ORF

putative Signal-sequenz

putative N-Glyco-sylierungs-stellen

putative TM-Domänen

berechnetes Mr des unprozes-sierten Polypeptids

berechneter Pi des unprozes-sierten Polypeptids

LeIRT1

1322 bp

350 AS

25 AS

N40, N297*

8 oder 9**

37,42 kDa

pH 9,40

LeIRT2

1219 bp

352 AS

24 AS

N40, N222, N299*

8 oder 9**

37,63 kDa

pH 9,40

* Sequenz ist Teil einer hydrophoben Domäne, daher ist die Glycosylierung an dieser Stelle eher unwahrscheinlich.
** Falls die Signalsequenz nicht proteolytisch entfernt wird.

3.6.2 Ähnlichkeiten der LeIRT-Proteine mit bekannten Proteinen

Datenbankvergleiche mit Hilfe des Blastp-Algorithmus’ legten Ähnlichkeiten der LeIRT-Proteine zu Eisen- und Zinktransportern aus Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae, der Nematode Caenorhabditis elegans, der Fruchtfliege Drosophila melanogaster sowie Mäusen und Menschen offen ( Abb. 15 ). Diese Proteine gehören zur kürzlich definierten ZIP-Genfamilie (ZRT-IRT-related proteins, Eng et al. 1998 ). Die in dieser Proteinfamilie am stärksten konservierte Signatursequenz in der vierten TM-Domäne ( Eng et al. 1998 ) „[LIVFA] [GAS] [LIVMD] [LIVSCG] [LIVFAS] [H] [SAN] [LIVFA] [LIVFMAT] [LIVDE] [G] [LIVF] [SAN] [LIVF] [GS]“ findet sich in beiden LeIRT-Sequenzen wieder (L203 - G217 in LeIRT1 Die aus den Sequenzdaten abgeleiteten Eigenschaften Abb. 38 ), außerdem wurden konservierte Histidinreste in der zweiten, vierten und fünften TM-Domäne gefunden, die wahrscheinlich Teile amphipatischer Helices sind, und denen eine Rolle im Metallionentransport zugesprochen wurde ( Eng et al. 1998 ). Die höchsten Ähnlichkeiten weisen die LeIRT-Proteine zueinander (89 % identische AS), zu RIT1 aus Erbsen und zu IRT1 aus Arabidopsis auf ( Abb. 15 ; Tabelle 3 ). Die Sequenzen der putativen TM-Domänen sind besonders stark konserviert ( Abb. 15 ).


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Abb. 15: ClustalW-Alignment der aus den cDNA-Sequenzen vorhergesagten LeIRT-Proteine mit verwandten Proteinen der ZIP-Familie aus Pflanzen und Hefe. Schwarze Bereiche symbolisieren identische Aminosäurereste, graue Bereiche sind konservative Substitutionen. Blaue Kästen bezeichnen TM-Domänen. Die ZIP-Signatursequenz ist durch einen gelben Balken markiert und die hochkonservierten Histidine sind rot gekennzeichnet (at, Arabidopsis thaliana; ps, Pisum sativum; tc, Thlaspi caerulescens; sc, Saccharomyces cerevisiae).


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Tabelle 3: Verwandschaft der aus den Tomaten-cDNAs abgeleiteten Polypeptide mit bekannten Proteinen.

 

LeIRT1

LeIRT2

 

identische Aminosäuren

ähnliche Aminosäuren

identische Aminosäuren

ähnliche Aminosäuren

IRT1 (Arabidopsis thaliana)

63 %

77 %

62 %

77 %

RIT1 (Pisum sativum)

67 %

81 %

68 %

83 %

ZIP1 (Arabidopsis thaliana)

42 %

61 %

42 %

61 %

ZIP2 (Arabidopsis thaliana)

15 %

37 %

15 %

37 %

ZIP3 (Arabidopsis thaliana)

43 %

61 %

45 %

61 %

ZIP4 (Arabidopsis thaliana)

37 %

54 %

37 %

54 %

ZRT1 (Saccharomyces cerevisiae)

21 %

41 %

23 %

42 %

ZRT2 (Saccharomyces cerevisiae)

20 %

37 %

20 %

37 %

ZNT1 (Thlaspi caerulescens)

36 %

53 %

36 %

53 %


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3.7 Charakterisierung der cDNA-Klone in Hefe

Die im hochaffinen Fe-Transport defiziente Hefemutante AMY43 (Deltaftr1::LEU2, Mas Marques 1998 ) und die in beiden Fe-Transportsystemen defiziente Mutante DEY1453 (fet3/fet4, Eide et al. 1996 ) wurden mit den LeIRT-cDNA-Klonen sowie mit dem leeren Vektor pUE1 transformiert. Dabei zeigte sich, daß die mit leerem Vektor transformierten AMY43-Kolonien auf Vollmedium mit 200 µM BPDS nicht mehr wachsen konnten, während die mit den putativen Fe-Transporter-cDNAs LeIRT1 und LeIRT2 transformierten Kolonien auf diesen Platten wuchsen (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse waren aber nur schlecht reproduzierbar. Deshalb wurde in den folgenden Analysen die fet3/fet4-Doppelmutante DEY1453 verwendet.

3.7.1 Wachstum einer fet3/fet4-Hefemutante in Abhängigkeit der Tomaten-cDNAs

Das Wachstum der Transformanten wurde auf Vollmedium mit unterschiedlichen Konzentrationen des Fe2+-spezifischen Chelators BPDS untersucht. Bei Konzentrationen unterhalb von 45 µM konnten alle Kolonien, unabhängig vom Plasmid mit dem sie transformiert waren, wachsen. Oberhalb von 60 µM BPDS konnten die DEY1453-Kolonien nicht mehr wachsen. Lediglich ein enger Bereich zwischen 50 und 55 µM ermöglichte das Wachstum der komplementierten im Gegensatz zu den nicht-komplementierten Kolonien ( Abb. 16 ). Die mit leerem Vektor pUE1 transformierten Zellen konnten auf Vollmedium mit 55 µM BPDS nicht wachsen, während die mit den putativen Fe-Transportern LeIRT1 und LeIRT2 transformierten Zellen auf diesen Platten zu deutlichen Kolonien heranwuchsen ( Abb. 16 ).

Abb. 16: Wachstum der Transformanten des Hefestammes DEY1453 auf YPD-Medium mit 55 µM BPDS (A) und auf demselben Medium mit 10 µM zusätzlichem Fe-EDTA (B). Die Hefen wurden ausgestrichen wie in (C) beschrieben.


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3.7.2 Fe-Aufnahme einer fet3/fet4-Hefemutante in Abhängigkeit der Tomaten-cDNAs

Der Transport von Eisen in die transformierten Hefezellen wurde mit Hilfe des Radioisotops 59Fe gemessen. Die DEY1453-Zellen, transformiert mit LeIRT1 und LeIRT2, zeigten deutliche Fe-Aufnahmeraten (5-6 bzw. 4-5 pmol/min.106 Zellen), während die mit dem leeren Plasmid transformierten Zellen nur geringe (0,8-1,2 pmol/min.106 Zellen) Transportraten aufwiesen ( Abb. 17 ).

Abb. 17: 59Fe-Transport des Hefestammes DEY1453 transformiert mit dem Expressionsplasmid pUE1 (Kreise) oder den LeIRT-cDNAs (Dreiecke und Quardate) in pUE1. Abgebildet sind die Meßwerte bei 30 °C (gefüllte Symbole) und Kontrollwerte auf Eis (leere Symbole). Die Daten zeigen Mittelwerte aus drei Experimenten mit ihren Standardabweichungen.


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3.7.3 Valenz des transportierten Eisens

Für Strategie I-Pflanzen ist die Reduktion von Fe3+ zu Fe2+ Vorraussetzung für die Fe-Aufnahme in die Wurzeln ( Chaney et al. 1972 ). Diese Versuche konnten nun auf molekularere Ebene wiederholt und bestätigt werden. Abb. 18 zeigt, daß die LeIRT1-vermittelte Aufnahme von Fe2+ gegenüber der von Fe3+ erheblich bevorzugt wird und daß die Zugabe des Fe2+-spezifischen Chelators BPDS die Fe-Aufnahme fast vollständig inhibiert. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit LeIRT2 erhalten (nicht gezeigt).

Abb. 18: Einfluß des Fe2+-spezifischen Chelators BPDS auf die LeIRT1-abhängige 59Fe-Aufnahme in Zellen des Hefestammes DEY1453. Zwei µM Fe2+-Ascorbat, Fe3+-HEDTA oder Fe3+-HEDTA und 10 µM BPDS wurden als Substrat angeboten (n = 2). Die Aufnahmeraten der mit dem leeren Kontrollplasmid pUE1 transformierten Zellen wurden abgezogen. Sie lagen unter 20 % der abgebildeten Transportraten.

3.7.4 Kinetische Parameter der LeIRT-Proteine

Um Aufschluß über die Transportkinetik zu erlangen, wurden Fe-Transportexperimente mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen durchgeführt. Auch die mit dem leeren Plasmid transformierten Zellen wiesen signifikante Fe-Transportraten auf. Dieser Transport war jedoch selbst bei 200 µM Fe2+ nicht gesättigt, weshalb er als unspezifisch betrachtet wurde. Die Kontroll-Transportraten der Hefen mit leerem Plasmid wurden daher von denen der Hefen mit LeIRT1 oder LeIRT2 abgezogen ( Abb. 19 ).


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Abb. 19: Substratsättigung des Fe2+-Transportes von mit den LeIRT-cDNAs (offene Dreiecke und Quadrate) oder dem leeren Expressionsplasmid pUE1 (offene Kreise) transformierten DEY1453-Hefezellen. Die gefüllten Symbole repräsentieren die LeIRT-abhängigen Transportraten (Raten der LeIRT-transformierten Zellen abzüglich der Kontrollen). Von allen Transportraten wurden die Kontrollraten auf Eis abgezogen. Um das Substrat vollständig zu reduzieren, war in allen Experimenten ein 100-facher Überschuß an Ascorbat vorhanden.

3.7.5 Transportspezifität der LeIRT-Proteine

3.7.5.1 Kompetition des Fe-Transports

In ersten Kompetitionsstudien wurde den Fe-Aufnahmeversuchen ein 100-facher Überschuß an zweiwertigen Metallionen zugesetzt. Die Metallionen wurden unmittelbar nach der Substratlösung zu den Zellen pipettiert. Dabei konnten Co2+, Ni2+, Mn2+, Zn2+ und Cd2+, aber nicht Ca2+, Mg2+ und Sr2+ den Fe-Transport inhibieren (Ergebnisse nicht gezeigt). Durch Mg2+ wurden die Aufnahmeraten stabilisiert, so daß beschlossen wurde, alle weiteren Aufnahmemessungen in Gegenwart von 0,1 mM MgSO4 durchzuführen.

Die Kationen, die den Fe-Transport inhibiert hatten, wurden in neue Kompetitionsstudien mit nur einem zehnfachen molaren Überschuß gegenüber Fe2+ eingesetzt. Dabei zeigten Ni2+, Cd2+ und Zn2+ die stärksten inhibitorischen Effekte während die Inhibition durch Mn2+ weniger deutlich war ( Abb. 20 ). Die Zugabe von Cu2+ zum Fe-Aufnahmetest inhibierte die Aufnahme, jedoch


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waren die Raten nicht linear, und ein erheblich höherer Hintergrund auf Eis war zu beobachten (nicht gezeigt). Vermutlich vermittelten die Cu-Ionen eine erhebliche, unspezifische Bindung von Fe an die Zelloberfläche der Hefen. Auch unter dem Einfluß von Co2+ konnte kein linearer Fe-Transport gemessen werden (nicht gezeigt).

Abb. 20: Einfluß von 20 µM unterschiedlicher Metallionen auf den Fe-Transport transformierter Hefezellen des Stammes DEY1543. Die Substratlösung enthielt 2 µM Fe2+ in Gegenwart von Ascorbat. Die Metallionen wurden unmittelbar nach der Substratzugabe zu den Hefezellen pipettiert. Gezeigt sind die Transportraten gemessen bei 30°C abzüglich der Kontrollwerte auf Eis.

3.7.5.2 Wachstum von Mn-, Zn-, und Cu-Aufnahmemutanten in Abhängigkeit der Tomaten-cDNAs

Das IRT1-Protein aus Arabidopsis thaliana ist in der Lage, die Mn-aufnahmedefiziente efemutante Hefemutante SLY8 (smf1) und die Zn-aufnahmedefiziente Mutante ZHY3 (zrt1, zrt2; Zhao und Eide 1996b ) sowohl in Bezug auf das Wachstum auf metall-limitierendem Medium als auch auf die Metalltransport-Aktivität zu komplementieren ( Korshunova et al. 1999 ).

Um die Spezifität des Kationentransportes der beiden LeIRT-Proteine zu analysieren, wurden dieselben Stämme sowie die Kupfer-Transportmutante 64p (Deltactr1::HIS3, Dancis et al. 1994a ) mit dem leeren Vektor pUE1 oder mit den LeIRT-cDNAs in pUE1 transformiert. In je drei uracilprototrophen Kolonien wurde zunächst die Anwesenheit des Plasmides überprüft und das Wachstum auf Chelator-gepuffertem Vollmedium (YPD) analysiert. Das Wachstum aller drei metallaufnahme-defizienten Mutanten auf metall-limitierenden Medien wurde durch die LeIRT-


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cDNAs, aber nicht durch den leeren Vektor komplementiert ( Abb. 21 ).

Abb. 21: Wachstum von drei metallaufnahme-defizienten Hefemutanten in Abhängigkeit der LeIRT-cDNAs:
Die Transformanten wurden ausplattiert wie in G gezeigt. Die Mn-Aufnahmemutante SLY8 (A) auf YPD mit 50 mM MES (pH 6,2) und 18 mM EGTA und (B) auf gleichem Medium mit 2 mM zusätzlichem MnSO4. Die Cu-Aufnahmemutante 64p (C) auf YPD mit 50 mM MES (pH 6,2) und 0,6 mM EDTA und (D) auf gleichem Medium mit 100 µM zusätzlichem CuSO4. Die Zn-Aufnahmemutante ZHY3 auf (E) YPD mit 50 mM MES (pH 6,2) und 0,7 mM EDTA und (F) auf gleichem Medium mit 150 µM zusätzlichem ZnSO4.


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3.8 Expression der LeIRT-Gene auf RNA-Ebene

Die Expression der LeIRT-Gene auf RNA-Ebene wurde durch Northern-Blot-Analysen untersucht. Dabei erwies es sich als schwierig, zwischen den beiden Transkripten zu unterscheiden, weil die Nukleotidsequenzen so ähnlich sind, daß Kreuzhybridisierungen nicht zu vermeiden waren (Daten nicht gezeigt).

Abb. 22: Transkriptanalyse der LeIRT-Gene in Tomaten durch semiquantitative RT-PCR. Zwei Wochen alte Tomatenkeimlinge wurden sechs Tage lang in Hydrokultur mit und ohne Fe herangezogen und die RNA aus Wurzeln, Stengeln und Blättern wurde isoliert. Eine Pflanze wurde auf Fe-haltiger Nährlösung bis zur Blüte kultiviert bevor ihre Blüten-RNA isoliert wurde. 2 µg DNA-freie RNA aus den angegebenen Geweben wurden mit einem oligo(dT)-Primer revers transkribiert und anschließend wurden PCR-Reaktionen mit LeIRT1- oder LeIRT2-spezifischen sowie Actin-spezifischen Primern durchgeführt. Ein typisches Gel ist gezeigt (n=4).

Die Unterscheidung zwischen den beiden LeIRT-Sequenzen war nur durch „Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion“ (RT-PCR)-Versuche möglich. Hierzu wurden genspezifische Primer verwendet, die kurze, nicht-konservierte Bereiche der beiden LeIRT-Sequenzen erkannten (s. Tabelle 4 ). Als Ladekontrolle wurden PCR-Reaktionen in Gegenwart der Primer To-ACT1 und To-ACT2 durchgeführt. Diese Primer sind so gewählt, daß sie ein 270 bp großes Fragment simultan aus sechs Actin-Genen amplifizieren. Actin-Gene unterliegen kaum


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transkriptioneller Kontrolle, so daß von einer konstitutiven Expression ausgegangen werden kann (Richard Meagher, Athens GA, pers. Mitt.).

In diesen Analysen konnten signifikante Unterschiede in der Expression der beiden LeIRT-Gene gefunden werden: Zum einen fanden sich auch in Fe-suffizienten Wurzeln geringe Transkriptmengen, zum anderen zeigte sich, daß LeIRT1 stark durch Fe-Mangel induziert war, während die Expression von LeIRT2 unverändert blieb. In den Blüten acht Wochen alter Pflanzen konnten geringe Transkriptmengen von LeIRT1 nachgewiesen werden ( Abb. 22 ). Kontrollen zeigten, daß die Produktmenge unter den angegebenen Bedingungen im linearen Amplifikationsbereich, also proportional zur Menge an mRNA war. In PCR-Versuchen ohne die reverse Transkriptionsreaktion wurde kein Produkt erhalten (Daten nicht gezeigt).

3.9 Analyse der LeIRT-Gene

3.9.1 Southern Blot-Analysen

Um die Organisation der LeIRT-Gene im Genom zu charakterisieren, wurde Tomaten-DNA isoliert und mit Enzymen gespalten, die selbst nicht innerhalb der cDNA-Sequenzen schneiden. Diese gespaltenen DNA-Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt und nach „Southern“-Transfer auf Nylonmembran mit LeIRT1- oder LeIRT2-Sonden hybridisiert. Die deutlichsten Hybridisierungssignale wurden nach Spaltung mit den Enzymen BglII, EcoRI, KpnI und HindIII erhalten ( Abb. 23 A). Durch die hohe Sequenzähnlichkeit konnte in diesen Analysen nicht zwischen LeIRT1 und LeIRT2 unterschieden werden (Daten nicht gezeigt).

Insbesondere die etwa 9 kb große Bande, die nach der Spaltung mit BglII hybridisiert hatte, wurde weiter untersucht. Doppelverdaus mit BglII und je einem anderen Enzym wurden durchgeführt, um kleinere Fragmente zu identifizieren ( Abb. 23 B). Dabei erwies sich die 9 kb-große Bande als Doppelbande, deren mit LeIRT2 hybridisierender Anteil durch Spaltung mit ApaI, SalI und XbaI zu Fragmenten der Größe 1,0 kb; 2,4 kb und 3 kb verkleinert wurde. Die diffusen Banden und der hohe Hintergrund weisen auf weitere kreuzhybridisierende Sequenzen im Tomatengenom hin.


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Abb. 23: Southern-Blot-Analyse der LeIRT-Gene im Tomaten-Genom. (A) 30 µg genomische Tomaten-DNA wurden mit den genannten Enzymen gespalten, elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembran überführt. Die Filter wurden mit der 5‘-Sequenz (SalI-NcoI-Fragment) der LeIRT2-cDNA hybridisiert. (B): Analyse der 9 kb-Bande des BglII-Verdaus: 30 µg genomische DNA wurden mit BglII und den angegebenen Enzymen gespalten und wie in (A) hybridisiert.

3.9.2 Intron/Exon-Struktur der LeIRT-Gene

Eine Tomatengenbank stand mir nicht zur Verfügung. Versuche zur Isolierung der LeIRT-Gene durch Konstruktion einer Mini-Genbank in einem Plasmidvektor und anschließender Identifizierung der Gene durch Koloniehybridisierung führten nicht zum Erfolg. Daher wurde beschlossen, die genomischen Sequenzen durch PCR-Experimente zu amplifizieren.

Die Exon-Intron-Struktur der LeIRT-Gene wurde durch PCR-Analysen aufgeklärt: die Primer IRT1-m und Tir-EM amplifizierten in der LeIRT1-cDNA ein 342 bp großes Fragment, während in genomischer Tomaten-DNA ein 540 bp großes Fragment amplifiziert wurde. Dieses Fragment


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wurde kloniert und sequenziert. Es enthielt neben der bekannten cDNA-Sequenz zwei Introns von 116 und 82 bp ( Abb. 24 , Abb. 26 ).

Die Primer IRT2-m und Tir-EM amplifizierten in der LeIRT2-cDNA ein 370 bp großes Fragment, während in genomischer Tomaten-DNA ein 1443 bp großes Fragment amplifiziert wurde. Dieses Fragment enthielt neben der bekannten cDNA-Sequenz zwei Introns von 984 und 89 bp ( Abb. 24 , Abb. 26 ). PCR- und Restriktionsanalysen zeigten, daß außer den genannten keine weiteren Introns in den LeIRT-Genen vorhanden sind.

Abb. 24: Intron/Exon-Grenzen der LeIRT-Gene. Die blau-gedruckten Sequenzen gehören zu Introns.

3.9.3 Inverse PCR-Versuche

Teile der 5‘-untranskribierten Bereiche der LeIRT-Gene wurden durch inverse PCRs amplifiziert. Dazu wurde genomische Tomaten-DNA mit verschiedenen Enzymen gespalten. Die entstandenen DNA-Fragmente wurden durch Behandlung mit T4-Ligase zirkularisiert und die unbekannten Sequenzen durch PCR mit auswärts gerichteten Primern amplifiziert. Dazu wurden zunächst Primer verwendet, die beide LeIRT-Gene erkennen und in einer anschließenden nested PCR solche Primer, die für LeIRT1 oder für LeIRT2 spezifisch sind ( Tabelle 4 ).


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Tabelle 4: Übersicht über die zur Isolation der genomischen DNA-Fragmente verwendeten Primer

Primer

Richtung bzgl. der cDNA

Spezifität

TIR-ME

5‘ rarr 3‘

erkennt beide LeIRT-Gene

TIR-EM

3‘ rarr 5‘

erkennt beide LeIRT-Gene

IRT1-m

5‘ rarr 3‘

spezifisch für LeIRT1

IRT2-m

5‘ rarr 3‘

spezifisch für LeIRT2

IRT-5‘

3‘ rarr 5‘

erkennt beide LeIRT-Gene

IRT-3‘

5‘ rarr 3‘

erkennt beide LeIRT-Gene

IRT15r

3‘ rarr 5‘

spezifisch für LeIRT1

IRT13r

5‘ rarr 3‘

spezifisch für LeIRT1

IRT25r

3‘ rarr 5‘

spezifisch für LeIRT2

IRT23r

5‘ rarr 3‘

spezifisch für LeIRT2

Für LeIRT1 konnte ein 470 bp großes 5‘-Fragment isoliert werden, das durch Spaltung mit BglII und BclI, Zirkularisierung und anschließender PCR mit den Primern IRT-5‘ und TIR-ME sowie nested PCR mit IRT-15r und IRT1-m amplifiziert wurde.

Für LeIRT2 wurde ein 207 bp großes 5‘-Fragment isoliert, das durch Spaltung mit MfeI und EcoRI, Zirkularisierung und anschließender PCR mit den Primern IRT-5‘ und TIR-ME sowie nested PCR mit IRT-25r und IRT2-m amplifiziert wurde.

3.9.4 Direkte PCR-Versuche

In Arabidopis liegt das IRT1-Gen in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem homologen Gen, welches als IRT2 bezeichnet wurde. Diese Kenntnis, sowie ein ca. 2,8 kb großes PCR-Fragment, das in Kontrollversuchen der inversen PCRs immer wieder auftauchte, ließen vermuten, daß auch in Tomaten die beiden LeIRT-Gene direkt benachbart sein könnten. Diese Frage wurde durch PCR-Versuche mit auswärts gerichteten Primern untersucht. Durch den einzelnen Primer IRT-3‘, der beide LeIRT-Gene erkennt, wurde ein etwa 2 kb großes Fragment amplifiziert. Zudem konnte mit den Primern IRT13r und IRT23r, die spezifisch für LeIRT1 oder LeIRT2 sind, ein 1,8 kb großes Fragment amplifiziert werden. Daraus wurde geschlossen, daß die beiden LeIRT-Gene tatsächlich direkt benachbart sind, und zwar in einer Ende-an-Ende-Orientierung ( Abb. 26 ). Diese Vorstellung wurde in Kontrollreaktionen mit Primern, die aufgrund der neuen Sequenzinformation generiert wurden, bestätigt.


53

3.9.5 Transkriptionsstart der LeIRT-Gene

Die Kenntnis der genomischen 5‘-untranslatierten Sequenzen machte es möglich, durch primer extension-Analysen die Transkriptions-Startpunkte der LeIRT-Gene zu finden. Dazu wurden die Primer IRT15r und IRT25r radioaktiv markiert. RNA aus Fe-defizienten Tomatenwurzeln wurde mit ihnen revers transkribiert. Mit denselben Primern wurden Sequenzreaktionen der genomischen Klone durchgeführt ( Abb. 25 ).

Abb. 25: Primer extension-Reaktionen zur Ermittlung des Transkriptionsstarts der LeIRT-Gene: Die Oligonucleotide IRT15r und IRT25r wurden mit 32P endmarkiert und in reverse Transkriptionsreaktionen mit Wurzel-RNA Fe-defizienter Tomaten eingesetzt (mittlere Spuren). Die gleichen Primer wurden für Sequenzreaktionen genomischer Klone von LeIRT1 (links) and LeIRT2 (rechts), verwendet. Putative Transkriptionsstartpunkte sind durch Kästen markiert.

Der Transkriptionsstart des LeIRT1-Gens (A452) liegt 78 bp stromaufwärts zum Translationsstartcodon bzw. 18 bp vor dem 5‘-Ende des cDNA-Klones ( Abb. 25 , Abb. 26 ). Eine putative TATA-Sequenz (419GTATATATAAATAG432) konnte etwa 25 bp upstream des Transkriptionsstarts identifiziert werden. Eine putative CAAT-Box (326CACCAATTAT335) findet sich etwa 120 bp upstream des Transkriptionsstarts.

Der Transkriptionsstart des LeIRT2-Gens war weniger klar zu identifizieren. Als wahrscheinlichster Kandidat kommt G5821, 64 bp stromaufwärts zum Translationsstart in Frage, doch


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auch für G5815 und für G5814 wurden signifikante reverse-Transkription-generierte Banden gefunden. Im 5‘-Bereich des LeIRT2-Gens, 18 - 25 bp upstream des putativen Transkriptionsstarts findet sich zwar eine AT-reiche Regionen, doch wurde die Konsensus-Sequenz für eukaryotische TATA-Boxen nur schwach erfüllt.

3.9.6 Übersicht über die LeIRT-Gene

Die Sequenz der LeIRT-Gene ist unter der Accession-Nummer AF246266 in der GenBank™ veröffentlicht. Aus den genomischen Sequenzen und den cDNA-Sequenzen konnte eine funktionelle Genkarte erstellt werden ( Abb. 26 ):

Abb. 26: Karte der LeIRT-Gene: Exonsequenzen sind gelb, Introns blau dargestellt. Die Transkriptions(TK)-Startpunkte wurden durch Primer Extension gefunden, die Translations(TL)-Startpunkte sind die Startcodons der langen offenen Leserahmen. Einige Restriktionsschnittstellen sind aufgeführt. Die Pfeile geben die Leserichtung an.


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3.10 Fe-Reduktaseaktivität der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii

Die eingangs beschriebenen Schwierigkeiten der molekularen Charakterisierung der Fe-Assimilation höherer Pflanzen, insbesondere die wenig erfolgreichen differentiellen Screening-Versuche auf RNA- und Proteinebene ( Giritch et al. 1997 , Herbik et al. 1996 , Schmidt und Buckhout 1997 ) sowie das Scheitern der Komplementation von fre-Hefemutanten, machten es sinnvoll, einen neuen Modellorganismus zu suchen. Dieser sollte mikrobiologisch und genetisch handhabbar, leicht zu kultivieren und den höheren Pflanzen phylogenetisch näher verwandt sein als die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Hierfür erschien die einzellige, eukaryotische Alge Chlamydomonas reinhardtii als geeignet ( Rochaix 1995 ).

Die Eisenassimilationsreaktionen der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig untersucht. Es wurde zunächst gemessen, ob und mit welcher Kinetik diese Alge Eisenchelate reduzieren kann, ob die Eisenchelatreduktase unter Eisenmangel induziert wird (eine typische „Strategie I“-Reaktion), und ob diese Induktion mit der Eisenaufnahme korreliert ist ( Eckhardt und Buckhout 1998 ).

3.10.1 Pflanzenphysiologische Beobachtungen

Algen, die länger als eine Woche unter Eisenmangel heranwuchsen, zeigten eine deutlich bleichere Farbe gegenüber solchen, denen ausreichend Fe zur Verfügung stand. Diese Chlorosen sind vermutlich auf die eisenabhängige Chlorophyllbiosynthese zurückzuführen. Mikroskopisch erschienen eisengehungerte Algen wesentlich „klebriger“ als eisensuffiziente. Sie hatten gegenüber den Kontrollen eine deutlich höhere Tendenz, sich in Zweier- bis Vierergruppen aneinanderzulagern (nicht gezeigt).

3.10.2 Etablierung eines Eisenchelat-Reduktasetests an Algen

Um die extrazelluläre Reduktion von Fe3+-Chelaten zu messen ( 2.2.3 ) mußte zunächst ein Testsystem erarbeitet werden. Dieser Test ist an die Methode von Dancis et al. 1990 angelehnt und beruht auf der Bindung von BPDS an Fe2+ mit gleichzeitiger Farbänderung. Er ist bei Eckhardt und Buckhout 1998 ausführlich beschrieben.

Fe3+-HEDTA + e- Fe2+ + HEDTA

Fe2+ + 3 BPDS2- [Fe(BPDS)3]4-

(farblos) (rot)

In einem ähnlichen System wurde die Reduktion von Hexacyanoferrat(III) durch Abnahme der Absorption bei 420 nm gemessen. Diese Tests unterschieden sich wenig von denen mit Fe3+-HEDTA als Substrat.


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3.10.3 Induktion der Fe3+-Chelatreduktaseaktivität durch Eisenmangel

In den ersten Voruntersuchungen wies die einzellige Alge Chlamydomonas reinhardtii nach vier Tagen Eisenmangel stark erhöhte Reduktionsaktivität gegenüber Fe3+-HEDTA auf ( Abb. 27 ). Die Chloroplasten-ATPase-defiziente Mutante CC-980 zeigte unter den gleichen Bedingungen kaum Fe3+-Reduktionsaktivität, unabhängig von der Fe-Ernährung ( Eckhardt und Buckhout 1998 ). Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von Hexacyanoferrat(III) gemessen (Daten nicht gezeigt).

Abb. 27: Induktion der Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii unter Eisenmangel. Die Zellen wurden auf TAP-Medium mit oder ohne Fe herangezogen. Nach vier Tagen wurde die Fe3+-Reduktaseaktivität gemessen.


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3.10.4 Abhängigkeit der Induktion von der Eisenkonzentration im Anzuchtmedium

Die Eisenchelat-Reduktase-Aktivität in Chlamydomonas reinhardtii wurde in Abhängigkeit der Eisenkonzentration im Anzuchtmedium untersucht. Dazu wurden die Algen in TAP-Medium mit definierten Eisenkonzentrationen von null bis 15 µM herangezogen. Nach 46 und nach 48 Stunden wurde die Eisenchelat-Reduktion gemessen ( Abb. 28 ). Es zeigte sich ein starker Anstieg der Reduktaseaktivität bei Mediumkonzentrationen unterhalb von 4 µM Fe-EDTA.

Abb. 28: Abhängigkeit der Eisenchelat-Reduktionsaktivität von der Eisenkonzentration im Anzuchtmedium: Algen wurden zwei Tage lang mit den angegebenen Eisenkonzentrationen kultiviert. Die Reduktaseaktivität wurde nach 46 und 48 h gemessen (n = 2).


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3.10.5 Kinetik der Induktion der Fe3+-Chelat-Reduktaseaktivität

Die Kinetik der Induktion wurde untersucht, indem die Algen von eisenreichem auf eisenfreies TAP-Medium überimpft wurden und die Fe3+-Chelatreduktaseaktivität alle zwei Stunden oder öfter gemessen wurde. Die Fe-Ernährung hatte in diesem Zeitraum keinen Einfluß auf das Wachstum der Algen ( Abb. 29 A). Die Reduktionsaktivität stieg nach etwa vier Stunden eisendefizientem Wachstum deutlich an, war nach 20-24 Stunden voll induziert und nahm anschließend wieder ab ( Abb. 29 B). Durch Zufüttern von 10 µM FeCl3 ging die Fe3+-Chelatreduktase-Aktivität der Fe-gehungerten Zellen innerhalb weniger Stunden auf nahezu Kontrollniveau zurück.

Abb. 29: Kinetik der Induktion der Eisenchelatreduktase unter Eisenmangel in Chlamydomonas reinhardtii: Die Algen wurden in TAP-Medium herangezogen, geerntet und in TAP-Medium mit und ohne Fe überführt. Die Reduktaseaktivität wurde alle 1,5 - 2 Stunden gemessen. Nach 24 Stunden wurde die eisengehungerte Kultur geteilt und eine Hälfte mit 10 µM FeCl3 rückgefüttert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes (von drei) sind angegeben.


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3.10.6 Substratsättigung der Fe3+-Chelat-Reduktaseaktivität

Die Reduktaseaktivität Fe-gehungerter Chlamydomonas reinhardtii-Zellen gegenüber Eisenchelaten war sättigbar. Sie wurde konzentrationsabhängig gemessen und ein apparenter Km-Wert für Fe-HEDTA konnte bestimmt werden. Er lag bei 31,5 (±2,3) µM ( Abb. 30 ). Bei Fe-suffizient herangezogenen Zellen waren die Aktivitäten gering. Die gemessenen Kurven waren komplex und konnten nicht in eine Michaelis-Menten-Kinetik eingepaßt werden. Trotz einer geringen Krümmung bei niedrigen Substratkonzentrationen stellte sich selbst bei 300 µM Fe-HEDTA noch keine Sättigung ein ( Abb. 30 ).

Abb. 30: Die Fe3+-Chelat-Reduktaseaktivität von eisengehungerten und eisensuffizient gewachsenen Chlamydomonas reinhardtii-Zellen wurde bei Substratkonzentrationen von 4 bis 300 µM Fe-HEDTA gemessen. Mittelwerte von vier unabhängigen Messungen sind dargestellt. Die eingefügte Abbildung zeigt die doppelt-reziproke (Lineweaver-Burk)-Darstellung der Experimente mit den Fe-gehungerten Zellen. Der daraus ermittelte apparente Km-Wert beträgt 31,5 (± 2,3) µM FeHEDTA.


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3.10.7 pH-Optimum der Fe3+-Chelat-Reduktase

Die Fe3+-Chelatreduktase wurde bei verschiedenen pH-Werten gemessen. Dabei zeigte sich ein breites Optimum im neutralen Bereich ( Abb. 31 ).

Abb. 31: Einfluß des pH-Wertes auf die Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii. Die Zellen wurden einen Tag lang ohne Fe herangezogen, bevor ihre Fe3+-Chelatreduktaseaktivität gemessen wurde (n = 2). Die Testpuffer enthielten 10 mM MES (pH 5 und 5,5), 10 mM HEPES (pH 6 und 6,35) oder 10 mM Tris (pH 6,5 - 8).

3.10.8 Einfluß von Inhibitoren auf die Fe3+-Chelatreduktase

Erste Hinweise auf die Physiologie der Eisenassimilation in Chlamydomonas reinhardtii wurden durch den Einsatz verschiedener Inhibitoren in Fe3+-Chelatreduktasetests erlangt. Dafür wurden Ionophoren (Gramicidin, Valinomycin), Entkoppler des Membranpotentials (FCCP, 2,4-Dinitrophenol), das sulfhydryl-reaktive Reagenz PCMBS, Inhibitoren der Photosynthese (DCMU) und der Respiration (KCN), außerdem Diphenyleniodoniumchlorid (DPI) und ein komplexes Platinsalz (K2PtCl4) fünf Minuten vor der Messung eingesetzt. In den meisten untersuchten Pflanzen konnte die Fe3+-Chelatreduktase durch SH-spezifische Reagenzien inhibiert werden ( Moog und Brüggemann 1994 ). DPI ist ein bekannter Inhibitor der phagozytären NADPH-Oxidase und K2PtCl4 hatte die Fe3+-Reduktaseaktivität des FRE1-Genproduktes in Hefe inhibiert ( Hassett und Kosman 1995 ).

Obwohl Gramicidin keinen Einfluß auf die Fe3+-Chelatreduktase hatte, war die Inhibition durch


61

FCCP deutlich. Auch Valinomycin war bereits in geringer Konzentration (4 µM) in der Lage, die Fe3+-Chelatreduktase deutlich zu inhibieren. Der Entkoppler 2,4-DNP konnte die Fe3+-Chelatreduktase nur gering inhibieren. Dieser Einfluß ist jedoch wahrscheinlich zu gering eingeschätzt, da 2,4-DNP bei pH 7 eine deutliche Eigenabsorption bei 535 nm hat. Diese Daten legen eine Beteiligung des Membranpotentials an der extrazellulären Fe3+-Reduktion nahe. Dabei ist nicht auszuschließen, daß durch FCCP auch die energieliefernden mitochondrialen Membranen entkoppelt wurden.

Die Beteiligung von Sulfhydryl-Gruppen an der Fe3+-Reduktion kann aufgrund der Inhibitionsversuche mit PCMBS mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Die Blockierung der Zellatmung durch KCN und der photosynthetischen Lichtreaktion durch DCMU führten nur zu geringer Inhibition der Fe3+-Chelatreduktase. Demgegenüber hatte Tetrachloroplatinat einen deutlich inhibierenden Effekt auf die Fe3+-Reduktion. Der Effekt von Diphenyleniodonium (DPI) war nur gering, vermutlich aufgrund der geringen Mobilität dieses Ions. Die Ergebnisse der Inhibitionsversuche sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.

Tabelle 5: Inhibitoren der Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii.
Die Zellen wurden fünf Minuten lang mit den angegebenen Reagenzien behandelt, bevor ihre Fe3+-Chelatreduktaseaktivität gemessen wurde. 100 % Aktivität entsprechen 18,4 ± 2,7 nmol Fe2+ (h . 106 Zellen)-1 .

Inhibitor

Konzentration

(mM)

Fe3+-Chelatreduktaseaktivität

(% der Kontrolle)

FCCP

0,1

18,6

FCCP

0,02

25,1

Gramicidin

0,1

100,3

2,4-DNP

0,1

83,8

PCMBS

0,1

100,6

KCN

1,0

82,4

DCMU

0,1

86,1

K2PtCl4

0,1

61,6

DPI

0,1

90,3

Valinomycin

0,004

60,4


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3.10.9 Rolle der Eisenchelat-Reduktase bei der Eisenaufnahme

Um die Frage zu klären, ob die Eisenchelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii zur Eisenassimilation beiträgt, wurden Voruntersuchungen durchgeführt. Wenn die Reduktion von Fe3+-Chelaten zur Eisenassimilation notwendig ist, so sollte die Anwesenheit von BPDS das intermediär gebildete Fe2+ abfangen und dessen Aufnahme verhindern. Die Algen würden dann Eisenmangelsymptome wie Wachstumsretardierung und gesteigerte Fe3+-Reduktaseaktivität zeigen ( Chaney et al. 1972 ).

Abb. 32: Einfluß des Fe2+-spezifischen Chelators BPDS auf das Wachstum und die Fe3+-Chelatreduktaseaktivität eisengehungerter und eisensuffizienter Chlamydomonas reinhardtii-Zellen. Die Algen wurden zwei Tage lang mit und ohne Fe sowie mit und ohne Zusatz von 50 µM BPDS kultiviert. Ihre Fe3+-Chelatreduktaseaktivität wurde nach 17 und 27 Stunden gemessen. Die Mittelwerte von zwei Messungen sind gezeigt.

Die Algen wurden zwei Tage lang mit und ohne Fe (ca. 17 µM) in Gegenwart oder Abwesenheit


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des Fe2+-Chelators BPDS (50 µM) herangezogen. Dabei zeigte sich, daß BPDS die Effekte des Fe-Mangels verstärkt und sogar selbst Fe-Mangelsymptome hervorrufen kann, wenn genügend Eisen vorhanden ist ( Abb. 32 ).

Eisengehungerte Algen wiesen etwa zehnfach erhöhte Reduktaseaktivität verglichen mit den eisensuffizienten Algen auf. In Anwesenheit von BPDS erhöhte sich diese Aktivität noch etwa zweifach. Die eisensuffizienten Algen mit BPDS zeigten ebenfalls stärkere Fe3+-Reduktion. Diese Daten deuten auf eine Rolle der Fe3+-Chelatreduktase in der Eisenaufnahme hin.


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3.11 Fe-Transportaktivität der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii

3.11.1 Induktion des Fe-Transports unter Eisenmangel

Um die Frage zu klären, ob die Reduktion von Fe3+ obligatorisch für die Eisenaufnahme in C. reinhardtii ist, wurde die Aufnahme von radioaktivem Fe gemessen ( Abb. 33 ). Dazu wurde zunächst ein Meßsystem erarbeitet ( Eckhardt und Buckhout 1998 ). Es ist an die Transportstudien in Hefezellen angelehnt, mußte jedoch in Bezug auf die Pufferbedingungen, den Abstand der Meßpunkte, die Filtermembran, die Substratkonzentration und den Wachstumszustand der Zellen modifiziert werden ( 2.2.5 ).

Abb. 33: Aufnahme radioaktiv markierten Eisens in Chlamydomonas reinhardtii. Exponentiell wachsende Algen wurden für 40 Stunden in TAP-Medium mit und ohne Eisen herangezogen, bevor die Aufnahme von 1 µM 59Fe-HEDTA gemessen wurde. Die Kontrollwerte auf Eis sind abgezogen. Mittelwerte und Standardabweichungen von drei Experimenten sind gezeigt.

Die Fe-Transportraten eisensuffizienter Chlamydomonas-Zellen waren gering (etwa 1 pmol / h . 106 Zellen). Nur in Fe-gehungerten Chlamydomonas-Kulturen konnten deutliche Fe-Transportraten von etwa 20 - 22 pmol / h . 106 Zellen gemessen werden ( Abb. 33 ). Auf Eis wurde kaum Fe-Transport gemessen, was darauf hinweist, daß der Fe-Transport ein enzymatischer Prozeß ist.

Abb. 33 zeigt die Eisenaufnahme eisengehungerter und eisensuffizienter Algen. Lineare Transportraten konnten über mindestens 30 Minuten gemessen werden.


65

3.11.2 Valenz des transportierten Eisens

In höheren Pflanzen, mit Ausnahme der Gräser, ist die Reduktion von Fe3+ Vorraussetzung für den Fe-Transport. Die Alge Chlamydomonas reinhardtii hatte unter Fe-Defizienz stark erhöhte Fe3+-Chelatreduktaseaktivität gezeigt, was auf einen ähnlichen Mechanismus schließen läßt ( 3.10.3 ). Der Fe2+-spezifische Chelator BPDS im Wachstumsmedium führte zu erhöhter Fe3+-Chelatreduktase, was ebenfalls darauf hinweist, daß Fe2+, nicht Fe3+ transportiert wird. Um diese Vermutung zu überprüfen, wurden die Fe-Aufnahmestudien mit Fe2+ in Gegenwart eines großen Überschusses an Ascorbat durchgeführt. Tabelle 6 zeigt den direkten Vergleich von Fe3+-Reduktase und Fe-Transport, wobei Fe2+ oder Fe3+ als Substrat angeboten wurde.

Tabelle 6: Vergleich der Fe3+-Chelatreduktase mit den Fe-Transportraten in Chlamydomonas reinhardtii.

Die Zellen wurden zwei Tage lang in TAP-Medium mit und ohne Fe herangezogen, bevor ihre Fe3+-Chelatreduktase und die Aufnahme von radioaktiv markiertem Fe gemessen wurde. Dabei wurde 1 µM Fe3+-HEDTA oder 1 µM Fe2+-HEDTA in Gegenwart von 16,7 µM Ascorbat angeboten.

Anzuchts-bedingungen

Fe3+-Chelatreduktase (nmol / h . 106 Zellen)

Fe-Transport
(pmol / h . 106 Zellen)

 

 

Fe3+-HEDTA

Fe2+-Ascorbat

+ Fe

0,9 ± 0,2

0,9

1,9

- Fe

14,9 ± 4,8

21.1

34,7

Der Transport von Fe2+ war gegenüber dem von Fe3+ etwa 1,5 bis 2-fach erhöht. Obwohl diese Unterschiede gering sind, legen diese Meßdaten den Schluß nahe, daß Fe2+ und nicht Fe3+ in Chlamydomonas reinhardtii Substrat für den Transporter ist. Die relativ hohen Transportraten von Fe3+-HEDTA (etwa 2/3 der Raten von Fe2+-Ascorbat) waren vermutlich auf die starke Fe3+-Chelatreduktaseaktivität zurückzuführen.

3.11.3 Inhibition der Fe-Aufnahme

Die Aufnahme von Kationen in pflanzliche Zellen erfolgt entlang des Membranpotentials ( Marschner 1986 ). Um einen Einblick in den Transportmechanismus zu erlangen, wurden die Zellen jeweils 5 Minuten vor der Aufnahmemessung mit dem Sulfhydrylreagenz PCMBS und dem Protonophor FCCP versetzt. Während PCMBS keinen Einfluß auf den Fe-Transport hatte, wurde er bereits durch 20 µM FCCP komplett inhibiert. Die Erhöhung des pH-Wertes von 6,0 auf


66

7,0 durch Zugabe von Tris bewirkte knapp 20 % Inhibition des Fe-Transportes ( Tabelle 7 ).

Tabelle 7: Einfluß verschiedener Reagenzien auf den Fe2+-Transport in Chlamydomonas reinhardtii.

Die Zellen wurden zwei Tage lang in TAP-Medium ohne Fe herangezogen bevor die Aufnahme von Fe2+ in Gegenwart von Ascorbat gemessen wurde (n = 3).

Behandlung

Konzentration

Fe2+-Aufnahme

 

 

pmol / h . 106 Zellen

% der Kontrolle

Kontrolle (5 % DMSO)

-

32,2 ± 2,6

100

FCCP in 5 % DMSO

20 µM

0,8 ± 0,5

2,5

PCMBS in 5 % DMSO

100 µM

33,0 ± 7,2

102,5

Tris

ca. 1,5 mM

26,1 ± 5,7

81,2

Die Spezifität des Fe2+-Transportes wurde durch Kompetitionsstudien mit einem 100-fachen Überschuß an divalenten Kationen analysiert. Dabei wurden Lösungen der angegebenen Metallsalze unmittelbar nach der Substratzugabe zu den Zellen pipettiert.

Abb. 34: Einfluß divalenter Metallionen auf den Fe-Transport in Chlamydomonas reinhardtii. Eisengehungerte Zellen wurden zu Fe-Transportmessungen herangezogen. Dabei wurde 1 µM radioaktives Fe2+ in Gegenwart von Ascorbat als Substrat eingesetzt, und 100 µM der angegebenen Metallsalze wurden unmittelbar nach Substratzugabe zu den Zellen pipettiert (n = 3).


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Als einziges Metall war Kupfer in der Lage, den Eisentransport deutlich zu inhibieren. Geringe Inhibitionen wurden auch durch Kobalt und Zink beobachtet ( Abb. 34 ).

Die Inhibition des Fe2+-Transportes durch Cu wurde konzentrationsabhängig untersucht. Dabei wurde 1 µM Fe2+ bei CuSO4-Konzentrationen von null bis 50 µM eingesetzt. In diesen Versuchen erwies sich die Inhibition als konzentrationsabhängig mit einer halbmaximalen Inhibition bei etwa 10 µM ( Abb. 35 ).

Abb. 35: Einfluß von Kupfer auf den Fe2+-Transport in eisengehungerte Chlamydomonas reinhardtii-Zellen. 1 µM radioaktiv markiertes Fe2+ wurde als Substrat angeboten und die angegebenen Kupferkonzentrationen wurden unmittelbar nach der Substratzugabe zu den Zellen pipettiert (n = 3).

3.12 Interaktionen des Fe- und des Cu-Stoffwechsels in Chlamydomonas reinhardtii

Verschiedene Beobachtungen verknüpfen den Kupfer- mit dem Eisenstoffwechsel: Cu-defizient ernährte Schweine waren gleichzeitig anämisch, was durch die mangelnde Funktion des kupferhaltigen Serumproteins Ceruloplasmin und aufgrunddessen mit der gestörten Beladung von Transferrin mit Fe erklärt wurde ( Vulpe und Packman 1995 ). In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der Fe-Stoffwechsel ebenfalls an die Cu-Assimilation gekoppelt. Mutationen in den Cu-Transportergenen CTR1, ATX1 und CCC2 verhinderten den Transport von Cu in das Endomembransystem und damit die Beladung des Fet3-Proteins mit Cu. Dies führte zum Ausfall des hochaffinen Fe-Transportsystems bestehend aus der Cu-haltigen Fe-Oxidase Fet3p und dem


68

Fe-Transporter Ftr1p ( Eide 1998 ). Patienten mit den genetisch bedingten „Wilson‘s“- oder „Menkes‘“-Krankheiten weisen neurodegenerative Defekte auf. Bei ihnen sind kupfertransportierende ATPasen betroffen ( Vulpe und Packman 1995 ).

In Erbsenwurzeln wurde gezeigt, daß Cu-Defizienz zu erhöhter Fe3+-Chelatreduktase führte und umgekehrt ( Welch et al. 1993 ). Schließlich wurde spekuliert, daß in Hefe und in der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii die Reduktion von Cu2+ zu Cu+ zur Assimilation von Cu notwendig sei ( Hassett und Kosman 1995 , Hill et al. 1996 ). In höheren Pflanzen gibt es widersprüchliche Meinungen zu dieser Hypothese ( Welch et al. 1993 , Cohen et al. 1997 , Holden et al. 1991 , Holden et al. 1995 ).

Kupfer hatte den Fe-Transport in Chlamydomonas reinhardtii signifikant und konzentrationsabhängig inhibiert ( 3.11.3 ). Es wurde daher untersucht, ob sich die Fe3+-Chelatreduktase und die Cu2+-Reduktase ( Tabelle 8 ) oder der Fe-Transport ( Abb. 36 ) in Abhängigkeit der Kupferernährung unterschieden.

Tabelle 8: Interaktionen der Fe3+- und der Cu2+-Reduktaseaktivität in Chlamydomonas reinhardtii: Die Algen wurden bis zur spät-exponentiellen Phase herangezogen, gewaschen und dann in TAP-Medium mit und ohne Fe oder Cu kultiviert. Nach zwei oder drei Tagen wurden die Fe3+- und die Cu2+-Reduktaseaktivitäten gemessen. Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei Experimenten sind gezeigt.

Behandlung

Cu2+-Reduktase

Fe3+-Reduktase

 

nmol Cu+ / h . 106 Zellen

% der Kontrolle

nmol Fe2+ / h . 106 Zellen

% der Kontrolle

+ Fe, + Cu

1,2 ± 0,4

100

1,1 ± 0,1

100

- Fe, + Cu

1,9 ± 0,2

160

30,6 ± 9,8

2756

+ Fe, - Cu

1,4 ± 0,1

123

1,3 ± 0,4

118

- Fe, - Cu

2,3 ± 0,4

193

19,6 ± 5,1

1768

Die in Tabelle 8 dargestellten Daten zeigen, daß die Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii im wesentlichen von der Fe-Ernährung und nur kaum von der Cu-Ernährung abhängt. Die Cu-Reduktaseaktivität wird durch Cu-Defizienz und durch Fe-Defizienz induziert, wobei die Fe-Defizienz einen stärkeren Anteil hat.

Die Fe2+-Aufnahme in eisengehungerte C. reinhardtii-Zellen war durch Cu inhibiert worden. Dies führte zu der Frage, ob der Fe-Transporter auch Cu transportiert. Sollten Fe und Cu denselben Transporter benutzen, so wäre zu erwarten, daß dieser Transporter auch durch Cu-Mangel induziert wird. Um diese Hypothese zu testen, wurde der Fe-Transport in Abhängigkeit der Fe- und der Cu-Ernährung gemessen. Die Zeit des Fe-Mangels betrug dabei 1,5 Tage, die des Cu-


69

Mangels 3,5 Tage und die des Fe- und Cu-Mangels ebenfalls 3,5 Tage.

Abb. 36: Einfluß der Fe- und der Cu-Ernährung auf den Fe-Transport von Chlamydomonas reinhardtii.

Abb. 36 zeigt, daß Cu-Mangel keinen signifikanten Einfluß auf die Fe-Aufnahme in Chlamydomonas reinhardtii hatte. Die durch Fe-Defizienz hervorgerufene Induktion des Fe-Transportes konnte durch Cu-Defizienz nicht gesteigert werden. Auch Cu-Mangel allein hatte auf die Transportaktivität kaum Effekt.

Der inhibitorische Effekt von Cu auf den Fe-Transport wurde näher untersucht. Dabei wurde in Fe2+-Transportstudien bei konstanten Cu-Konzentrationen die Substratkonzentration variiert. Abb. 37 zeigt den Einfluß von 20 µM Cu auf die Substratsättigung der Fe-Aufnahme. Es konnte keine Kompetition der Fe-Aufnahme durch Cu gemessen werden. Stattdessen war der inhibitorische Effekt von Cu auf geringe Fe-Konzentrationen beschränkt. Bei höheren Fe-Konzentrationen zeigte sich sogar ein stimulierender Effekt von Cu auf den Fe-Transport. Diese Daten führten zu der Auffassung, daß in Chlamydomonas reinhardtii mehrere Fe-Transportsystem existieren, von denen das hochaffine System durch Cu inhibierbar ist. Selbst bei 200 µM Fe2+ war die Aufnahme nicht vollständig gesättigt (Daten nicht gezeigt).


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Abb. 37: Effekt von 20 µM CuSO4 auf die Sättigung des Fe2+-Transportes in Chlamydomonas reinhardtii. Die Algen wurden zwei Tage lang ohne Fe herangezogen, bevor ihre Fe-Transportaktivität gemessen wurde. Als Substrat wurde radioaktiv markiertes FeCl2 in Konzentrationen zwischen 0,3 und 200 µM in Gegenwart eines 16,7-fachen Überschusses an Ascorbat eingesetzt. Eine CuSO4-Lösung (+ Cu, Quadrate) oder Uptake-Puffer (- Cu, Kreise) wurde unmittelbar nach der Substratzugabe zu den Zellen pipettiert. Gezeigt sind Mittelwerte aus drei Experimenten. Ähnliche Effekte wurden auch bei 10 und 50 µM CuSO4 beobachtet.


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Fri Oct 4 9:58:45 2002