Eckhardt, Ulrich: Untersuchungen zur Eisenassimilation in Pflanzen

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Kapitel 4. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen der Fe-Assimilation in Tomaten auf molekularer Ebene und in der Alge Chlamydomonas reinhardtii auf physiologischer Ebene durchgeführt. Obwohl Fe-Defizienz ein erstzunehmendes Problem in der Landwirtschaft darstellt, wurde der Fe-Transport auf molekularer Ebene bisher nur in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana beschrieben ( Eide et al. 1996 ). Dies ist der erste Bericht über die Charakterisierung von Fe-Transportern aus Ertragspflanzen ( Eckhardt et al. 2000 ). Er könnte zu einer Verbesserung der Eiseneffizienz in Tomaten durch molekulare Pflanzenzüchtung beitragen.

Die Fe3+-Chelatreduktase höherer Pflanzen war zu Beginn dieser Arbeit auf molekularer Ebene nicht bekannt. Es war jedoch abzusehen, daß Methoden wie zweidimensionale Gelelektrophorese oder differentielles Screening in dieser Frage nicht zum Ziel führten ( Herbik et al. 1996 , Giritch et al. 1997 , Schmidt und Buckhout 1997 , H. Bäumlein, pers. Mitt.). Daher wurde mit der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii ein neuer Modellorganismus zur Untersuchung der Fe-Assimilation etabliert.

4.1 Molekulare Charakterisierung des Fe-Transportes in Tomaten

Seit den grundlegenden Arbeiten von Minet et al. 1992 hat sich die Komplementation von Hefemutanten als ausgezeichnetes Werkzeug zur Isolation pflanzlicher cDNAs bewährt. In vielen Fällen konnte das in Hefe exprimierte Protein physiologisch charakterisiert werden. Dabei darf nicht vergessen werden, daß Hefen keine Pflanzen sind und daher die physiologischen Eigenschaften nur als „apparent“ betrachtet werden können. Dennoch haben sich die in Hefe gemessenen Daten in vielen Fällen als physiologisch sinnvoll bewährt und ließen sich gut mit den in Pflanzen gemessenen Daten vergleichen ( Pence et al. 2000 ).

Basierend auf dem Plasmid pFL61 ( Minet et al. 1992 ) wurden die Hefe-Expressionsplasmide pUE1 und pUE2 konstruiert. Sie ermöglichen in Hefe die konstitutive Genexpression unter der Kontrolle des Phosphoglyceratkinase-Promotors und erlauben vielfältige Klonierungsmöglichkeiten, da sie zwischen dem Promotor und dem Terminator über sechs singuläre Restriktionsschnittstellen verfügen ( Abb. 7 ). Diese Plasmide wurden zur Expression pflanzlicher cDNAs in Hefe verwendet, was ihre Funktionalität deutlich macht. Eine cDNA-Bank wurde aus der Wurzel-mRNA fünf Tage lang eisengehungerter Tomatenpflanzen konstruiert. Diese Bank erwies sich als außerordentlich groß und komplex ( Abb. 11 ). Außerdem wurde der Hefestamm AMY43 (Deltaftr1::LEU2) konstruiert, der im hoch-, aber nicht im niedrigaffinen Fe-Transport defizient ist ( Abb. 8 , Abb. 9 , Mas Marques 1998 ). Die Hefemutante, die Expressionsplasmide und die cDNA-Bank stehen nun der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung.


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4.1.1.1 Isolierung zweier putativer Fe-Transporter

Durch Hybridisierung mit der IRT1-cDNA aus Arabidopsis thaliana konnten aus der Tomatenwurzel-cDNA-Bank zwei cDNAs (LeIRT1 und LeIRT2) isoliert werden, die den Wachstumsdefekt eisentransportdefizienter Hefemutanten komplementieren. Die vorliegenden Daten legen den Schluß nahe, daß es sich bei LeIRT1 und LeIRT2 um Fe-Transporter handelt. Insbesondere die Suppression des Wachstumsdefektes der Hefemutanten DEY1453 (fet3, fet4) und AMY43 (ftr1) auf eisenlimitierendem Medium und die im Stamm DEY1453 nachgewiesene Fe-Transportaktivität befürworten diese Auffassung. Außerdem wurden für LeIRT1 erhöhte mRNA-Level unter Fe-Mangel nachgewiesen, was für eine physiologische Rolle im Fe-Transport spricht.

4.1.1.2 Physiologie des LeIRT-vermittelten Fe-Transports

Die Funktion der isolierten cDNA-Klone konnte durch die Komplementation der Hefemutante DEY1453 überprüft und kinetische Parameter konnten in Hefe gemessen werden. Sowohl der LeIRT1- als auch der LeIRT2-vermittelte Fe-Transport waren temperaturabhängig und sättigbar ( Abb. 19 ). In Übereinstimmung mit den grundlegenden Beobachtungen von Chaney et al. 1972 bevorzugte der LeIRT-vermittelte Fe-Transport Fe2+ und nicht Fe3+ als Substrat. Dieser Mechanismus wurde in allen bisher untersuchten Pflanzen mit Ausnahme der Gräser gefunden und als „Strategie I“ bezeichnet ( Bienfait 1988 ). Der dabei geschwindigkeitsbestimmende Schritt, Fe3+-Reduktion oder Fe2+-Transport variierte mit der untersuchten Art ( Grusak et al. 1990 ).

Obwohl auch mit leerem Plasmid transformierte fet3,fet4-Hefezellen bei hohen Fe-Konzentrationen deutlichen Fe-Transport zeigten, lag dieser erheblich unter dem der mit LeIRT1 und LeIRT2 transformierten Zellen. Zudem war dieser Transport selbst bei 100 µM Fe2+ nicht gesättigt. Diese verbliebene Fe-Transportaktivität kann auf Metalltransportsysteme zurückgeführt werden, die von Fet4p und dem hochaffinen Fet3p/Ftr1p-Komplex unabhängig sind, beispielsweise die der Nramp-Proteine ( Eide 1998 ). Da sie keine Sättigungskinetik zeigte, wurde diese Fe-Transportaktivität als unspezifisch angesehen. Die in Hefe gemessenen, apparenten Km-Werte der LeIRT-Proteine für Fe2+ lagen unter 1 µM, was etwas niedriger ist, als die im gleichen Stamm gemessenen Km-Werte von IRT1 aus Arabidopsis (6 ± 1 µM; Eide et al. 1996 ). Diese Konzentrationen liegen im physiologischen Bereich, wenn man den Fe-Bedarf höherer Pflanzen berücksichtigt ( Epstein 1972 ). Verglichen mit IRT1 vermitteln LeIRT1 und LeIRT2 hochaffinen Fe2+-Transport.

In verschiedenen Studien wurde berichtet, daß in Pflanzen unter Fe-limitiertem Wachstum oder in Mutanten mit gestörter Fe-Assimilation der Gehalt an divalenten Metallionen, speziell Mn2+ und Zn2+, in den Sprossen ansteigt ( Welch et al. 1993 ; Yi und Guerinot 1996 ; Delhaize 1996 ; Scholz et al. 1985 ). Diese Beobachtung könnte erklärt werden, wenn der Fe-Transport, der unter Fe-defizienten Bedingungen induziert wird, wenig spezifisch ist. Der LeIRT1- und LeIRT2-vermittelte Fe2+-Transport konnte in Kompetitionsstudien durch einen 100-fachen Überschuß der Übergangsmetalle Cd2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, Ni2+ und Zn2+, aber nicht durch die Erdalkalimetalle


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Ca2+, Mg2+ und Sr2+, inhibiert werden. Genauere Untersuchungen mit nur einem 10-fachen Überschuß bestätigten die inhibitorischen Effekte von Ni2+, Zn2+ und Cd2+ ( Abb. 20 ). Mit Mn2+ konnte nur eine geringe Fe2+-Transportinhibition gemessen werden. Die Effekte von Cu2+ und Co2+ waren komplex, da mit ihnen keine linearen Fe-Transportkurven gemessen wurden. Es ist unwahrscheinlich, daß die Inhibition des Fe-Transportes durch Ni2+, Zn2+ und Cd2+ auf Metall-Toxizität beruht, da in einer ähnlichen Studie gezeigt wurde, daß selbst 500 µM Co oder Cd über einen Zeitraum von 15 Minuten keinen Einfluß auf die Viabilität von Hefezellen hatten ( Dix et al. 1994 ).

Neben der Inhibition des Fe-Transportes durch divalente Metallionen führte eine zweite Evidenzlinie zu der Auffassung, daß die LeIRT-Proteine wenig spezifischen Metalltransport vermitteln: die Komplementation von Mn-, Zn-, und Cu-Transportmutanten. Sowohl LeIRT1 als auch LeIRT2 waren in der Lage, den Wachstumsdefekt von Mn-, Zn-, und Cu-Transportmutanten zu supprimieren ( Abb. 21 ). In einer Suche nach Mn-Transportern wurde IRT1 aus Arabidopsis zum zweitenmal isoliert ( Korshunova et al. 1999 ). Genauere Untersuchungen zeigten, daß IRT1 eine Mn- und eine Zn-, aber nicht eine Cu-Transportmutante komplementierten. Außerdem wurden IRT1-vermittelte Mn- und Zn-Transportaktivitäten nachgewiesen ( Korshunova et al. 1999 ). Dies bekräftigt die Vorstellung, daß die Fe-Transporter aus Tomaten und Arabidopsis eher unspezifischen Metalltransport vermitteln. Sie unterscheiden sich allerdings im Bezug auf den Cu-Transport.

Wie bei IRT1 wurde der LeIRT-vermittelte Fe2+-Transport auch durch Zn2+ und Cd2+ inhibiert. In Arabidopsis schien Zn2+ sogar mit höherer Affinität transportiert zu werden als Fe2+, da der apparente Km-Wert für Fe2+ etwa doppelt so hoch war wie der für Zn2+ während die vmax-Werte ähnlich waren ( Eide et al. 1996 , Korshunova et al. 1999 ). Obwohl keine direkte Evidenz vorliegt, deuten diese Daten darauf hin, daß LeIRT1 und LeIRT2 auch Zn2+ transportieren. Diese Hypothese bedarf jedoch weiterer Untersuchung durch direkte Zn-Transportmessungen.

Obwohl für Cd keine essentielle Funktion in irgendeinem Organismus bekannt ist, wurde Cd-Transport in verschiedenen Pflanzen nachgewiesen ( Pence et al. 2000 ). Er erfolgt wahrscheinlich aufgrund seiner chemischen Ähnlichkeit mit Zn. In Fe-defizienten Erbsenpflanzen wurde erhöhte Cd-Aufnahme gemessen ( Cohen et al. 1998 ). Außerdem erwiesen sich transgene Arabidopsis-Pflanzen (M.L. Guerinot, pers. Mitt.) und Hefen (D. Eide, pers. Mitt.), die das IRT1-Protein überexprimierten, als hypersensitiv gegenüber Cd in ihrer Nährlösung. Dennoch kann nicht ausgeschlossen werden, daß die Inhibition des Fe-Transportes durch Cd außerhalb der Zelle erfolgt. In LeIRT1 und LeIRT2 wurden je vier Cysteinreste gefunden, deren Position in extrazellulären Regionen vorausgesagt wurde und die potentielle Angriffspunkte für Cd darstellen (LeIRT1: Cys 30, 38, 113 und 223; LeIRT2: Cys 30, 38, 113 und 225). Cys 113 ist hochkonserviert ( Abb. 15 ). Diese Cysteine wären eine lohnendes Objekt für ortsgerichtete Mutagenese. Das Hefe-System macht es leicht, den Einfluß von Cystein-Mutanten im Vergleich zu ihren Wildtyp-Allelen zu messen. In Versuchen mit sulfhydrylreaktiven Reagenzien konnten jedoch keine inhibitorischen Effekte auf den LeIRT-vermittelten Fe-Transport beobachtet werden (nicht gezeigt). Dies spricht gegen eine Beteiligung der extrazellulären Cysteine im Fe-Transport und


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unterstützt die Vermutung, daß Cd durch die LeIRT-Proteine transportiert wird.

In einem kürzlich erschienenen Bericht wurde die Rolle von IRT1 im Cd-Transport in Arabidopsis thaliana bezweifelt und stattdessen eine Rolle von Proteinen der Nramp-Familie im Fe- und Cd-Transport vorgeschlagen ( Thomine et al. 2000 ). Diese Proteine komplementierten eine fet3,fet4-Hefemutante und die Transkriptmenge zweier der drei Gene war eisenmangelinduziert. Dennoch erscheinen die präsentierten Daten zum Fe-, und erst recht zum Cd-Transport als spekulativ. Die vorgestellten Fe-Transportstudien beschränken sich auf zwei Meßpunkte. Statt Cd-Transport wurden nur Cd-Gehalte transformierter Hefen gemessen und es wurden Cd-Sensitivitätstests in Hefe durchgeführt. Die Resistenz oder Sensitivität gegenüber Schwermetallen kann jedoch auf einer Reihe von Mechanismen beruhen und muß keineswegs nur durch den Aufnahmetransporter reguliert sein ( Williams et al. 2000 ). In Pflanzen bezogen sich die Schlußfolgerungen auf die bestenfalls 30 % größere Wurzellänge einer entsprechenden Arabidopsis-Mutante und die höchstens 20 % kürzere Wurzellänge der Überexpressionspflanzen in Gegenwart von 1 µM Cd2+ (beides ein Unterschied von unter 5 mm; Thomine et al. 2000 ). Es erscheint denkbar, daß sowohl die ZIP-Proteine als auch die Nramp-Proteine wenig spezifische Metall-Transportaktivitäten verleihen.

Interessanterweise wurde der LeIRT-vermittelte Fe-Transport effizient durch Ni2+ inhibiert. Die Inhibition des LeIRT-abhängigen Fe-Transportes durch Ni2+ kann durch unspezifischen Transport erklärt werden. Es ist denkbar, daß die Fe-Transporter Ni2+ transportieren, wenn ihre physiologischen Substrate nicht vorhanden sind. Ähnliche Effekte wurden bisher in keiner anderen Pflanze gefunden. Nickel wurde erst kürzlich als essentielles Spurenelement für Pflanzen beschrieben, und zwar als Cofaktor von Ureasen ( Zonia et al. 1995 ). Ni-Transporter sind in Pflanzen bisher nicht bekannt. Lediglich eine Spalthefe-Mutante, die im Nic1-Gen defizient ist, war nicht in der Lage, Ni2+ spezifisch zu transportieren, obwohl in hohen Konzentrationen Ni2+ durch Mg2+-Aufnahmesysteme transportiert wurde ( Eitinger et al. 2000 ). Das Nic1-Protein wurde als Ni2+-Transporter beschrieben, der mit sehr hohen Affinitäten arbeitet (Km < 50 nM; O. Degen und T. Eitinger, pers. Mitt.). Der LeIRT-vermittelte Transport von Ni2+ ist eine interessante Frage, die in Zusammenarbeit mit Dr. Thomas Eitinger (Mikrobiologie, Humboldt-Universität) analysiert werden kann.

Der inhibitorische Effekt von Mn2+ auf den LeIRT-vermittelten Fe2+-Transport war bei einem 100-fachen Überschuß an Mn deutlich, bei einem zehnfachen Überschuß jedoch nur gering. Dennoch legt die Komplementation einer Mn-Transportmutante (Deltasmf1) den Schluß nahe, daß die LeIRT-Proteine auch Mn-Aufnahme in die Zellen vermittelten. Die geringe Inhibition könnte eine geringere Affinität von Mn2+ gegenüber Fe2+ widerspiegeln. Der Mn2+-Transport würde dann erst bei höheren Mn-Konzentrationen eine signifikante Rolle spielen.

Auch das Wachstum der Cu-Transportmutante 64p wurde durch die LeIRT-Proteine ( Abb. 21 ), aber nicht durch IRT1 aus Arabidopsis komplementiert ( Korshunova et al. 1999 ). Der Effekt von Cu auf den Fe-Transport bei einem 100-fachen Überschuß war inhibitorisch. Bei geringen Cu-Konzentrationen war er komplex: die Cu-Ionen bewirkten offenbar eine schnelle, unspezifische Bindung von Fe2+ an die Zelloberfläche, wie aus den ebenfalls erhöhten Raten auf Eis


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hervorging, denen geringe Fe-Transportraten folgten (Daten nicht gezeigt). Dieser Effekt war durch die LeIRT-Proteine vermittelt. Er trat in den mit leerem Plasmid transformierten Kontrollzellen nicht auf. Diese Daten weisen auf eine Beteiligung der LeIRT-Proteine an der Kupferaufnahme hin, der Mechanismus scheint sich jedoch von dem des Fe-Transportes grundlegend zu unterscheiden. Die direkte Messung des Cu-Transportes ist eine interessante aber schwierige Aufgabe, da das einzige, kommerziell erhältliche Cu-Isotop 64Cu eine Halbwertszeit von nur etwa 12 Stunden hat.

Ein Vergleich der Ionenradien der transportierten und nicht transportierten Metalle konnte nicht zur Klärung des Transportmechanismus beitragen. Durch die Beteiligung von d-Elektronen in der Hülle der Übergangsmetallionen liegen ihre Radien in einem engen Bereich von 69 (Fe3+, oktaedrisch, low spin) - 92 pm (Cd2+, tetragonal). Dies ist signifikant kleiner als die Radien der Erdalkalimetalle Ca2+ und Sr2+. Mg2+-Transport wurde bisher für keins der ZIP-Proteine gefunden, obwohl sein Ionenradius mit 86 pm im Bereich der Übergangsmetalle liegt. Offenbar kann die Transportspezifität der einzelnen Metallionen nicht durch ihre Größe erklärt werden. Weiterhin bleibt offen, ob die Hydrathülle der Metallionen beim Transport abgestreift wird oder erhalten bleibt. Die Metalltransportspezifität der ZIP-Proteine wird durch die cytosolischen Histidin-Reste der „variablen Domäne“ bestimmt. Der Austausch einzelner Histidine in IRT1 führte zum Verlust der Transportaktivität oder zur Änderung der Spezifität (M.L. Guerinot, pers. Mitt.). Vermutlich interagieren die freien Elektronen der Histidin-Stickstoffatome mit den d-Orbitalen der Übergangsmetalle aber nicht mit den p-Orbitalen der Erdalkalimetalle.

Die physiologischen Eigenschaften der LeIRT-Proteine sind in Tabelle 9 zusammengefaßt und mit denen von IRT1 verglichen.

4.1.1.3 Sequenzanalyse der zwei cDNAs

Die LeIRT-cDNAs enthalten offene Leserahmen von 350 bzw. 352 Aminosäuren. Die daraus abgeleiteten Polypeptide sind hydrophob und haben Sequenzähnlichkeit zu IRT1, weshalb sie als LeIRT1 und LeIRT2 bezeichnet wurden ( Eckhardt et al. 2000 ). Die Hydropathieprofile der LeIRT-Proteine ( Abb. 14 ) weisen neun hydrophobe Domänen aus. Die ersten davon werden als Signalpeptide angesehen, die vermutlich proteolytisch abgespalten werden (SignalP-Analyse; Nielsen et al. 1997 ). Daraus ergeben sich acht putative Transmembran-(TM)-Domänen.


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Tabelle 9: Übersicht über die Eigenschaften der Fe-Transporter aus Tomaten und Arabidopsis

 

IRT1

LeIRT1

LeIRT2

Induktion durch Fe-Mangel?

ja

ja

nein

Transport von Fe2+:

nachgewiesen *

nachgewiesen

nachgewiesen

Km für Fe2+:

6 µM

0,7 µM

0,8 µM

vmax für Fe2+:

1,9 pmol/min.106 Zellen

11 pmol/min.106 Zellen

9 pmol/min.106 Zellen

Inhibition des Fe2+-Transportes durch:

Cd, (Zn, Mn)

Zn, Cd, (Mn)

Zn, Cd, (Mn)

Transport von Fe3+:

unwahrscheinlich *

unwahrscheinlich

unwahrscheinlich

Transport von Zn2+:

nachgewiesen **

wahrscheinlich

wahrscheinlich

Km für Zn2+:

2,8 µM

n. g.

n. g.

vmax für Zn2+:

1,85 pmol/min.106 Zellen

n. g.

n. g.

Inhibition des Zn2+-Transportes durch:

Cu, Fe3+, Cd, Co, (Mn)

n. g.

n. g.

Transport von Mn2+:

nachgewiesen **

wahrscheinlich

wahrscheinlich

Km für Mn2+:

9 µM

n. g.

n. g.

vmax für Mn2+:

0,4 pmol/min.106 Zellen

n. g.

n. g.

Inhibition des Mn2+-Transportes durch:

Cu, Fe2+, Cd, Zn

n. g.

n. g.

Komplementation einer Zn-Transportmutante?

ja

ja

ja

Komplementation einer Mn-Transportmutante?

ja

ja

ja

Komplementation einer Cu-Transportmutante?

nein

ja

ja

Referenzen: * Eide et al. 1996 ; ** Korshunova et al. 1999 ; n. g. = nicht gemessen.

LeIRT1 und LeIRT2 gehören der kürzlich entdeckten ZIP-Proteinfamilie (ZRT/IRT-like proteins) an, die Zink- und Eisentransporter umfaßt ( Abb. 15 ). Diese Proteine sind über das gesamte eukaryotische Reich verteilt, was auf ihre universelle Bedeutung schließen läßt. ZIP-Proteine wurden in Pflanzen, Nematoden, Insekten, Hefen, Mäusen und Menschen gefunden ( Eng et al. 1998 ).


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Fast alle bekannten ZIP-Proteine enthalten acht TM-Domänen. Lediglich einige entfernt ähnliche Proteine wie das growth arrest-inducible protein aus Säugern sowie ZIP-Proteine aus Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans weichen von dieser Zahl ab. Eng et al. 1998 wiesen eine zwischen allen ZIP-Proteinen konservierte, 15 Aminosäuren lange Signatur-Sequenz aus. Diese wurde auch in LeIRT1 und LeIRT2 gefunden ( Abb. 15 , Abb. 38 ). Der Sequenzbereich aller ZIP-Proteine zwischen der dritten und der vierten TM-Domäne weist hohe Variabilität auf. Er wurde als die „variable Region“ bezeichnet ( Eng et al. 1998 ). Diese Region ist vermutlich cytosolisch (TopPred-Analyse, Claros und v. Heijne 1994 ) und sie enthält eine histidinreiche Domäne. In IRT1 aus Arabidopsis erwiesen sich diese Histidine als verantwortlich für die Substraterkennung und -spezifität (M.L. Guerinot, pers. Mitt.). Weiterhin enthalten alle ZIP-Proteine hochkonservierte Histidin-Reste in der 2., 4. und 5. TM-Domäne. Diese Histidine sind Teile amphipatischer Helices. Auch ihnen wurde eine Rolle im Metalltransport zugesprochen ( Eng et al. 1998 ). Möglicherweise sitzen diese Histidinreste, zusammen mit denen der „variablen Region“, an der Innenseite eines hydrophilen Kanals, durch den die Metallionen transportiert werden. Histidinreiche Domänen wurden auch in Zink- und Schwermetall-Export-Proteinen gefunden. Dazu gehört das ZAT1-Protein aus Arabidopsis ( van der Zaal et al. 1999 ), die mammalischen ZnT-Proteine, Cot1p und Zrc1p aus Hefe und das CzcD-Protein des Bakteriums Alcaligenes eutrophus. Diese Proteine vermitteln den Export von Metallen aus der Zelle oder in die Vakuole. Sie gehören der CDF-Familie (cation diffusion facilitator) an und haben bis auf die Histidin-Cluster keine Ähnlichkeit mit der ZIP-Familie.

In beiden LeIRT-Sequenzen wurden N-Glycosylierungsstellen gefunden ( Abb. 38 ). Die aminoterminalen Glycosylierungsstellen (N40) sind zwischen LeIRT1 und LeIRT2, aber nicht innerhalb der ZIP-Familie konserviert. Die Glycosylierungsstelle (N222) zwischen der vierten und der fünften TM-Helix ist zwischen LeIRT2 und dem Rest der ZIP-Familie konserviert, findet sich aber nicht in LeIRT1. Außerdem existieren in LeIRT1 und -2 nahe der C-Termini Glycosylierungssignale, deren Glycosylierung jedoch unwahrscheinlich ist, da sie innerhalb einer putativen TM-Helix lokalisiert sind. In Hefe wurde die Glycosylierung des ZRT1-Proteins, eines Mitgliedes der ZIP-Familie, nachgewiesen ( Gitan et al. 1998 ). Die insgesamt geringe Konservierung der N-Glycosylierungsstellen läßt eine Rolle der N-Glycosylierung im ZIP-vermittelten Metalltransport als eher unwahrscheinlich erscheinen. Aus den Sequenzdaten wurde ein zusammenfassendes Modell der Membrantopologie erstellt ( Abb. 38 ).


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Abb. 38: Modell der aus den Sequenzdaten abgeleiteten Membrantopologie der LeIRT-Proteine. Die blauen Säulen repräsentieren Transmembrandomänen. Die cytosolische, histidinreiche Domäne ist hellblau hervorgehoben. Rote Pfeilspitzen symbolisieren putative N-Glycosylierungsstellen. Die ZIP-Signatur-Sequenz ist in gelb angegeben und die hochkonservierten Histidinreste sind rot eingezeichnet.

4.1.1.4 Expression der LeIRT-Gene

Die Expression der LeIRT-Gene wurde auf RNA-Ebene untersucht. In Northern Blot-Analysen wurde die Expression beider Gene in den Wurzeln Fe-gehungerter Tomatenpflanzen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Kontrollexperimente wiesen aus, daß die beiden Transkripte aufgrund ihrer hohen Sequenzähnlichkeit in Hybridisierungsexperimenten selbst unter stringenten Bedingungen nicht zu unterscheiden waren. Daher wurden, um zwischen den Transkripten der beiden LeIRT-Gene zu diskriminieren, halbquantitative RT-PCR-Analysen durchgeführt. Diese zeigten, daß die Transkriptmenge von LeIRT1 in Wurzeln von Tomaten unter Fe-Mangel stark ansteigt, während die von LeIRT2 offenbar nicht durch den Fe-Ernährungszustand der Pflanzen reguliert ist ( Abb. 22 ). Aufgrund dieser Daten wird angenommen, daß LeIRT1 ein eisenregulierter Metallionentransporter ist, während die Funktion von LeIRT2 vorerst unklar bleibt. Es bleibt zu untersuchen, ob die Transkriptmenge von LeIRT2 durch andere Metalle reguliert wird (zum Beispiel Zink).

Geringe Transkriptmengen von LeIRT1 konnten auch in den Blüten acht Wochen alter, vollernährter Tomatenpflanzen nachgewiesen werden ( Abb. 22 ). Die Expression des LeIRT1-Gens in Blüten könnte auf einen Metalltransporter hinweisen, der die neugebildeten Samen mit Fe2+ oder anderen Metallionen versorgt. Im Lebenszyklus von Erbsen stieg die Fe3+-Chelatreduktase während der Blüte stark an ( Grusak 1995 ). Vermutlich stellt dieser Aktivitätsanstieg die Versorgung der sich entwickelnden Samen mit Eisen sicher ( Grusak 1995 ). Da Eisen im Xylem als Fe3+-Citrat transportiert wird ( Marschner 1986 ), die LeIRT-Proteine aber Fe2+ transportieren, stellt sich die Frage, ob ein weiterer Reduktionsschritt zur Entladung des Xylems notwendig ist. Dafür sprechen auch die bisher nicht verstandenen Fe3+-Chelatreduktasen in Blättern ( Moog und Brüggemann 1994 ).


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Kürzlich wurde ein solches Enzym aus Spinatblättern zur Homogeneität gereinigt (P. Moog, Frankfurt/M, pers. Mitt.). Zur Überprüfung dieser Hypothese sind detaillierte räumliche und zeitliche Expressionsanalysen der LeIRT-Gene durch in situ-Hybridisierung oder immunhistochemische Experimente notwendig. Weiterhin muß untersucht werden, ob die LeIRT1-Transkriptmenge in Blüten auch durch die Fe-Versorgung der Pflanzen reguliert wird, oder ob die Induktion durch Fe-Mangel auf Wurzeln beschränkt bleibt.

Eine andere Hypothese geht von der Entladung der Xylems durch einen Fe3+-Nicotianamin-Transporter aus. Dieser Vorstellung wurde durch die molekulare Charakterisierung des Phytosiderophor-Rezeptor-Gens (ys1) aus Mais neue Nahrung gegeben, da ys1-homologe Gene im Genom von Arabidopsis thaliana gefunden wurden (Elsbeth L. Walker, Bericht auf dem 10th International Symposium on Iron Nutrition and Interactions in Plants; 14.-19.- Mai 2000, Houston TX). Da Arabidopsis eine typische Strategie I-Pflanze ist, deren Fe-Assimilation keine Phytosiderophoren gebraucht, wurde der Transport der chemisch ähnlichen Nicotianamin-Fe3+-Komplexe durch die entsprechenden Genprodukte postuliert. Dieser Hypothese liegen jedoch keinerlei in begutachteten Fachzeitschriften veröffentlichte Daten zugrunde.

In transgenen Arabidopsis-Pflanzen führte die Überexpression eines epitop-markierten IRT1-Proteins unter der Kontrolle des Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotors nur zu geringen phänotypischen Änderungen. Obwohl hohe konstitutive Expression auf mRNA-Ebene nachgewiesen wurde, war die Proteinmenge durch den Fe-Ernährungszustand reguliert (M.L. Guerinot, pers. Mitt.). Dies wurde durch posttranslationale Regulation erklärt. Ähnliche posttranslationale Modifikationen wurden für ZRT1 und für Metalltransporter der Nramp-Familie in Hefe gefunden ( Gitan et al. 1998 , Liu und Culotta 1999 ). Ein Ziel für die Zukunft ist daher, die translationale Regulation der LeIRT-Proteine sowie posttranslationale Ereignisse zu untersuchen und eventuelle Fe-regulierte Proteinasen zu identifizieren.

4.1.1.5 Analyse der LeIRT-Gene

In Southern-Blot-Experimenten wurde die Organisation der LeIRT-Gene untersucht. Dabei wurde genomische Tomaten-DNA mit Restriktionsenzymen gespalten, die „klebrige“ Enden (sticky ends) hinterlassen und die innerhalb der cDNA nicht schneiden. Nur mit den Enzymen BglII, HindIII und EcoRI konnten deutlich hybridisierende Banden unter 11 kb erhalten werden. Alle anderen Enzyme spalteten die genomische DNA offenbar in Fragmente, die zu groß waren, um in dem verwendeten System sauber getrennt zu werden, da sie nur verschmierte Signale lieferten. Der hohe AT-Gehalt genomischer Tomaten-DNA macht das Schneiden von Enzymen mit GC-reicher Erkennungssequenz unwahrscheinlich. Dies könnte die fehlenden oder verschmierten Hybridisierungssignale mit PstI, NotI, KpnI AatII, SalI und SacI, aber nicht mit XbaI erklären. Die erstgenannten Restriktionsenzyme haben vier oder mehr GC-Paare in ihrer Erkennungssequenz und schneiden daher mit geringerer Wahrscheinlichkeit im Tomaten-Genom. Die Hybridisierungsmuster mit LeIRT1 oder mit LeIRT2 waren in beiden Fällen gleich. Lediglich die Hybridisierungssignale, die durch Spaltung mit HindIII erhalten wurden, zeigten einen geringen, quantitativen Unterschied (nicht gezeigt).


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Das durch Spaltung mit BglII erhaltene, hybridisierende 9 kb große DNA-Fragment erwies sich als Doppelbande. Es ließ sich mit XbaI zu einem Fragment von etwa 3 kb und mit SalI zu einem Fragment von etwa 2,3 kb verkleinern ( Abb. 23 ). Außerdem blieben nicht unerhebliche Teile der 9 kb-Bande erhalten, obwohl ein Überschuß an Enzym eingesetzt wurde und unvollständiger Verdau daher nicht zu erwarten war. Dies zeigt deutlich, daß die 9 kb große Bande tatsächlich aus zwei DNA-Fragmenten besteht. Vermutlich handelt es sich dabei um LeIRT1 und LeIRT2, die beide mit der LeIRT2-Sonde hybridisierten. Weiterhin fand sich in der mit BglII gespaltenen Tomaten-DNA eine schwach hybridisierende Bande bei etwa 5 kb. Diese Bande wurde durch zusätzlichen Verdau mit ApaI zu einem 1 kb großen Fragment verkleinert, wobei die 9 kb-Bande nicht betroffen war. In dem sequenzierten genomischen Fragment wurde keine ApaI-Schnittstelle gefunden. Dies läßt vermuten, daß die 5 kb große Bande von einem ähnlichen, kreuzhybridisierenden Gen herrührt, das bisher nicht identifiziert worden ist. In Arabidopsis thaliana wurden bislang über 16 Vertreter der ZIP-Genfamilie gefunden. Ihre Nucleotidsequenzen sind ähnlich genug, um selbst unter stringenten Waschbedingungen mit Sequenzen der anderen Familienmitglieder zu hybridisieren. Es ist durchaus zu erwarten, daß auch in Tomate weitere ZIP-Gene vorhanden sind.

Aus den Southern-Blot- und den genomischen Sequenzdaten läßt sich eine grobe Kartierung der LeIRT-Gene vornehmen ( Abb. 39 ). Dabei konnte eine Bande des HindIII-Verdaus nicht eindeutig zugeordnet werden. Die Sequenz der LeIRT-Gene weist eine HindIII-Schnittstelle an Position 4662 aus. Man würde daher zwei mit LeIRT2 hybridisierende Fragmente erwarten, wenn LeIRT1 kreuzhybridisiert. Tatsächlich wurden drei hybridisierende Banden gefunden. Dies deutet auf mindestens ein weiteres LeIRT-ähnliches Gen im Tomatengenom hin.

Abb. 39: Karte der LeIRT-Gene. Die sequenzierten Bereiche sind blau markiert. Die ungefähren Positionen der Restriktionsschnittstellen sind Ergebnis der Southern-Blot-Analysen. Der grau gezeichnete Bereich des LeIRT2-Gens symbolisiert die Hybridisierungssonde der in Abb. 23 gezeigten Autoradiogramme.

Die LeIRT-Gene wurden durch PCR-Experimente amplifiziert und sequenziert. Dabei wurden in beiden Genen je zwei Introns identifiziert ( Abb. 24 , Abb. 26 ). Dies entspricht der Intronzahl der


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in Arabidopsis gefundenen IRT1 und IRT2-Gene (Acc.-Nr. AL024486; T16H5.50 und T16H5.40) und der vieler anderer ZIP-Gene.

Bezüglich der Peptidsequenz waren die Positionen der Introns sowohl innerhalb der LeIRT-Gene als auch zwischen Tomate und Arabidopsis konserviert ( Tabelle 10 ). Das erste Intron lag immer bei einem konservierten Valin-Rest am Beginn der vierten TM-Domäne, das zweite 50 Aminosäuren dahinter bei einem ebenfalls konservierten Alanin-Rest. Jedoch variierte die Länge der Introns in Tomaten zwischen 89 und 986 bp, während sie in Arabidopsis um die 100 bp lag.

Tabelle 10: Positionen der Introns in den putativen Fe-Transportergenen aus Tomate und Arabidopsis, bezogen auf ihre Aminosäuresequenz

Gen

Intron 1

Intron 2

IRT1:

V189

A238

IRT2:

V200

A250

LeIRT1:

V200

A250

LeIRT2:

V202

A252

Die Exon-Intron-Grenzen der IRT-Gene in Arabidopsis folgten der Konsensussequenz für pflanzliche Introns (

http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/splice_site.html

):

Exon --- (TA)G | GT --- Intron --- AG | G(TC) --- Exon.

Die Tomatengene erfüllen im ersten Intron diese Regel, während 5’-Splice-Stellen ihrer zweiten Introns von dieser Regel abweichen (vgl. Abb. 24 ):

(1. Intron) Exon --- TG | GT --- Intron 1 --- AG | GT --- Exon.

(2. Intron) Exon --- AG | GC --- Intron 2 --- AG | GC --- Exon.

Dies kann damit erklärt werden, daß die meisten Gene, die zur Ermittlung solcher Konsensussequenzen herangezogen werden, aus Arabidopsis stammen. Obwohl Arabidopsis thaliana in herausragender Weise als Modellpflanze geeignet ist, könnte möglicherweise der Splice-Apparat in Tomaten eine höhere Variabilität der 5‘-Splice-Stelle erlauben. Die Guanylyl-Nucleotide der 3‘-Splice-Stellen sind jedoch in beiden Pflanzen vollkommen invariabel.

Das Genom von Tomaten umfäßt knapp 1 Gbp und ist damit etwa siebenfach größer als das von Arabidopsis (

http://http.tamu.edu:8000/~creel/INTRO.html

). Erstaunlicherweise waren die LeIRT-Gene, trotz dieser Größe, direkt zueinander benachbart und zwar in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung ( Abb. 26 ). IRT1 und IRT2 aus Arabidopsis sind ebenfalls direkt zueinander benachbart. Ihre Orientierung ist jedoch Kopf-zu-Schwanz. Die hohe Ähnlichkeit der LeIRT- und der IRT-Gene, die konservierten Exon-Intron-Grenzen und die nachgewiesene Funktion der

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Genprodukte im Metalltransport weisen auf mehrere Genduplikationen in der Evolution der ZIP-Metalltransporter höherer Pflanzen hin. Diese Genduplikationen haben aber im Vergleich zur Trennung der Arten wahrscheinlich erst spät stattgefunden. Darauf weisen die unterschiedlichen Orientierungen der benachbarten Gene in Tomaten und Arabidopsis hin. Die komplette Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana wird in wenigen Wochen abgeschlossen sein. Mit dieser Information werden möglicherweise weitere IRT1-ähnliche Gene identifiziert werden. Die evolutionären Wurzeln der Metalltransporter können dann detailliert untersucht werden.

Durch inverse PCR-Experimente wurden 5’-Sequenzen der beiden Gene amplifiziert und isoliert. Der Transkriptionsstartpunkt von LeIRT1 ist an einer Adeninbase, 79 Nucleotide upstream zum Translations-Startcodon lokalisiert. Eine Sequenz, die gut mit der Konsensussequenz eukaryotischer TATA-Boxen übereinstimmt, wurde 22 - 30 bp upstream des Transkriptionsstarts gefunden und eine putative CAAT-Box an Position -120 bis -125 war ebenso vorhanden. In LeIRT2 gibt es drei putative Transkriptionsstartpunkte: der am weitesten entfernte ist C an Position -65 relativ zum Startcodon. Eine AT-reiche Region wurde 17 bis 25 bp upstream zu diesem Nukleotid gefunden. Sie stimmt nur schwach mit der TATA-Konsensussequenz überein. Schließlich konnte keine gute Übereinstimmung mit CAAT-Sequenzen in LeIRT2 gefunden werden. Diese Daten und die schwächere Expression von LeIRT2 unter Fe-Mangel, geben Grund zu der Annahme, daß LeIRT1 eine größere Funktion als LeIRT2 im Fe- und Metalltransport hat.

Die Analyse der genomischen Sequenz der LeIRT-Gene wird es ermöglichen, regulatorische Mechanismen der Geninduktion unter Fe-Mangel aufzuklären. Experimente sind im Gange, um die Promotoren von LeIRT1 and LeIRT2 zu identifizieren. Ein Plasmid, das es ermöglicht, Promotor-GUS-Fusionen für transiente Expressionen zu konstruieren, wurde in dieser Arbeit erstellt. Vorversuche zur Isolation von Tomatenwurzel-Protoplasten, die anschließend transient transformiert werden sollten, waren ohne Erfolg (Daten nicht gezeigt). Hier bietet sich die Möglichkeit der transienten Genexpression in Blattscheiben von Tabak an ( Kapila et al. 1997 ). Sie wurde erfolgreich mit Arabidopsis-Promotoren durchgeführt und sollte mit Promotoren aus Tomaten, die Tabak verwandter sind als Arabidopsis, ebenfalls funktionieren.

Southern-Blot-Analysen der LeIRT-Gene deuten auf eine große Genfamilie hin. Die Funktion der Genprodukte im Fe-Transport wurde gezeigt. Dieser erwies sich jedoch als recht unspezifisch gegenüber den transportierten Metallionen. In Arabidopsis thaliana wurden vier Zinktransporter (ZIP1-ZIP4) identifiziert ( Grotz et al. 1998 ). Ein weiterer ist in der Datenbank zu finden (ZIP5). Es wurde gezeigt, daß die Zinktransporter sich nicht durch Fe in ihrer Funktion inhibieren ließen ( Grotz et al. 1998 ), während der Fe-Transporter IRT1, ebenso wie die in dieser Arbeit beschriebenen Transporter, stark durch Zn inhibiert wurde ( Eide et al. 1996 ). Schließlich wurde Zn-Transport durch IRT1 nachgewiesen ( Korshunova et al. 1999 ). Es stellt sich daher die Frage, ob man die Fe-Transporter von den Zn-Transportern anhand ihrer Polypeptidsequenzen unterscheiden kann. Eine hierzu angestellte phylogenetische Analyse stellt die LeIRT-Proteine in eine Gruppe mit IRT1 aus Arabidopsis ( Abb. 40 ). Diese Gruppe umfaßt neben Polypeptiden unbekannter Funktion vorwiegend Fe-Transporter. Sie ist klar von den Zn-Transportern


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abgetrennt. Weitere phylogenetische Gruppen stellen die ZIP-Proteine aus Hefe sowie putative plastidäre Metalltransporter dar ( Abb. 40 ). Aufgrund dieser Analyse kann vermutet werden, daß die physiologische Funktion der LeIRT-Proteine im Fe- und weniger im Zn-Transport besteht. Die Klassifizierung der Metalltransporter anhand ihrer phylogenetischen Verwandtschaft in Zn- und Fe-Transporter kann jedoch nur ein Anhaltspunkt für weitere experimentelle Charakterisierungen sein. In dieser Hinsicht muß besonders die transkriptionelle Regulation im Bezug auf die Zn-, die Cu-, und die Mn-Ernährung untersucht werden.

Abb. 40: Phylogenetische Analyse einiger Mitglieder der ZIP-Genfamilie. ZIP-Proteine aus Säugern, Insekten, Hefen, Nematoden und Pflanzen wurden in der Datenbank gefunden. Sie wurden mit Hilfe des ClustalW-Programmes angeordnet, größere Lücken wurden aus dem Alignment entfernt und die phylogenetische Analyse wurde mit Hilfe der Phylip Programmgruppe durchgeführt. Nur die Sequenzen aus Pflanzen und Hefen sind berücksichtigt. Bei unbekannter Funktion der Proteine ist die Abkürzung der Spezies und die Accession-Nummer angegeben (at = Arabidopsis thaliana; ps = Pisum sativum; sp = Schizosaccharomyces pombe).

In der Fe-Ernährung von Hefe wurde ein hoch- und ein niedrigaffines Aufnahmesysten beschrieben, die sich in ihrem Transportmechanismus grundlegend unterscheiden ( Eide 1998 ). Es kann nicht ausgeschlossen werden, daß in höheren Pflanzen ebenfalls ein Fe-Transportsystem existiert, das noch nicht identifiziert ist. Die Kenntnisse zur Fe-Assimilation in Pflanzen gründen


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sich ausnahmslos auf die funktionelle Expression in Hefe. Ein komplexes Mehrkomponentensystem aus Pflanzen kann jedoch nicht durch Hefekomplementation identifiziert werden. Auch ist die Rolle der Nramp-Proteine im Metalltransport höherer Pflanzen nicht geklärt. In Zebrafischen und Säugern wurde kürzlich der Fe-Transporter „Ferroportin“ beschrieben, der wahrscheinlich den Export von Fe aus den Darmepithelzellen vermittelt ( Donovan et al. 2000 ). Mehrere ferroportinähnliche Sequenzen wurden im Genom von Arabidopsis thaliana gefunden. Ihre Bedeutung ist bisher völlig unklar. Weiterhin wurde in Säugern das Fet3p-homologe Protein „Hephaestin“ beschrieben. Es ist wie Ceruloplasmin und Fet3p eine kupferhaltige Ferroxidase und katalysiert die Oxidation von Fe2+ durch Sauerstoff ( Vulpe et al. 1999 ). Ein Mechanismus ähnlich der Fe-Assimilation in Hefe ist daher in Säugern möglich und kann auch für höhere Pflanzen nicht ausgeschlossen werden, obwohl Einzelheiten des Fe-Imports und -Exports in Einzellern und mehrzelligen Organismen unterschiedlich geregelt erscheinen ( Nelson 1999 ).

Um der Frage nachzugehen, welche Aufgabe die LeIRT-Proteine in der Pflanzenernährung haben, ist es sinnvoll, ihre Expression mit Hilfe der Antisense-Technik gezielt zu verringern. Entsprechende Konstrukte wurden mit den LeIRT-cDNAs erstellt und in Agrobakterium eingebracht. Transgene Tomaten konnten jedoch im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit nicht regeneriert werden (Daten nicht gezeigt).

4.1.1.6 Ausblick

Fe-Defizienz ist ein gravierendes Problem in der Landwirtschaft, da nicht die Menge an Fe, sondern vor allem seine Verfügbarkeit für das Pflanzenwachstum limitierend ist ( Vose 1982 , Marschner 1986 ). In Sojabohnen wurde gezeigt, daß Linien mit hoher Fe3+-Chelatreduktase besonders Fe-effizient sind ( Römheld 1987 ). Die Isolierung des FRO2-Gens ( Robinson et al. 1999 ) und der IRT1-cDNA aus Arabidopsis thaliana ( Eide et al. 1996 ) ebneten den Weg für die Isolation homologer Gene aus Ertragspflanzen. Obwohl die FRO2-cDNA den Fe3+-Reduktase-defizienten Phänotyp von fre1-Hefemutanten nicht komplementieren konnte (eigene unveröffentlichte Daten), wurde von einem FRO2-Homolog aus Erbsen berichtet, das hierzu in der Lage war (Waters, Blevins und Eide: Poster, 10th International Symposium on Iron Nutrition and Interactions in Plants. Houston TX, 14. - 19 Mai 2000).

Die unmittelbare Aussicht, Fe-regulierte Promotoren aus Tomaten zu identifizieren, eröffnet die Möglichkeit, transgene Pflanzen mit gesteigerter oder verminderter Fe-Assimilation zu generieren. In der nahen Vergangenheit wurden Phytoferritin-Gene aus Sojabohnen in Reis und Tabak überexprimiert. Dabei wurde gezeigt, daß diese Pflanzen zum einen mehr Fe in ihren Blättern speichern ( Goto et al. 1999 ) und zum anderen toleranter gegenüber oxidativem Stress sind ( van Wuytswinkel et al. 1999 ). Es wurde vermutet, daß durch die Überexpression des Speicherproteins Phytoferritin große Mengen Fe aus dem Cytosol abgezogen werden und für die Katalyse der Fenton-Reaktionen und der damit verbundenen Toxizität nicht mehr zur Verfügung stehen. Diese Pflanzen sind offensichtlich an reaktivem, cytosolischem Eisen verarmt. Es ist zu erwarten, daß diese Pflanzen in Kalkböden oder an Fe-Mangelstandorten große


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Wachstumsprobleme haben. Die Überexpression der Fe-Transporter sollte den entgegengesetzten Effekt haben: es könnten Pflanzen generiert werden, die gerade auf Fe-limitierten Standorten besser wachsen können. Die Verwendung Fe-regulierter Promotoren könnte hier eine Feinregulation bewirken, die dazu führt, die Fe-Versorgung entsprechend des Fe-Bedarfes zu steigern, ohne daß größere toxische Wirkungen zu erwarten sind. Denkbar wäre auch die Expression von Siderophor-Transportsystemen in Pflanzen, die es ermöglichen, bakterielle oder Pilz-Siderophoren zu nutzen. Dazu könnte das kürzlich identifizierte SIT1-Gen aus Hefe ( Lesuisse et al. 1998 ) verwendet werden.

Die mögliche Identifizierung der LeIRT-Promotoren kann zur Isolierung eisenmangelspezifischer Transkriptionsfaktoren herangezogen werden. Die in dieser Arbeit konstruierte cDNA-Bank ist induzierbar und könnte für einen entsprechenden „South-Western-Screen“ benutzt werden. In Hefe wurde die sogenannte „iron box“ identifiziert, eine Sequenz, die im Promotorbereich fast aller Fe-Assimilationsgene gefunden wurde und die die Fe-Mangel-spezifische Transkription vermittelt ( Eide 1998 ). Obwohl zu erwarten ist, daß in höheren Pflanzen noch weitere Faktoren wie Phytohormone oder ein phloemmobiles Signalmolekül ( Grusak 1995 , Grusak und Pezeshgi 1996 ) eine Rolle in der transkriptionellen Fe-Mangelantwort spielen, ist eine ähnliche Regulation im Falle der LeIRT-Gene denkbar.

4.2 Physiologie der Fe-Assimilation in Chlamydomonas

Die zu Anfang dieser Arbeit bekannten molekularen Ansätze zur Charakterisierung der Fe-Assimilation höherer Pflanzen, insbesondere die Mißerfolge differentieller Screening-Methoden sowie der Komplementation von fre-Hefemutanten, machten es notwendig, das Forschungsgebiet um einem neuen Organismus zu erweitern. Dabei bot sich die einzellige, eukaryotische Alge Chlamydomonas reinhardtii an, weil sie einfach zu kultivieren, molekularbiologisch und genetisch ausgezeichnet zugänglich und bereits weit charakterisiert ist. Obwohl in Chlamydomonas keine autonom replizierenden Plasmide bekannt sind, läßt sich diese Alge transformieren, wobei die eingebrachte DNA an willkürlichen Stellen ins Kern- oder Chloroplastengenom der Alge integriert. Dies ist eine einfache und effektive Art der Mutagenese ( Tam und Lefebvre 1993 ). Insbesondere zellbiologische und photosynthetische Fragestellungen wurden in Chlamydomonas bearbeitet ( Rochaix 1995 ). Seit zwei Jahren gibt es ein Genomprojekt für Chlamydomonas reinhardtii. Im Gegensatz zu den meisten höheren Pflanzen hat Chlamydomonas ein sehr GC-reiches Kerngenom (>65%). Dies hängt mit einem strengen Codongebrauch zusammen, der fast immer an der dritten Position ein G oder C positioniert (

http://biol1.bio.nagoya-u.ac.jp:8000/codon.html

). Es ist daher zum einen nahezu unmöglich, Chlamydomonas-Gene durch heterologes Screening mit Sequenzen höherer Pflanzen zu isolieren und Chlamydomonas-Gene heterolog zu exprimieren. Zum anderen bietet der strenge Codongebrauch die Gelegenheit reverser Genetik. Die aus der Isolation und Sequenzierung von Proteinen resultierenden Peptidsequenzen lassen nur wenige Möglichkeiten für das Design von Oligonucleotiden offen, so daß PCR-Reaktionen sehr schnell zum Erfolg führen können ( Rochaix 1995 ).

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Die Fe-Assimilation ist für Algen generell ein größeres Problem als für ortsgebundene Landpflanzen. In einer wässrigen Umgebung kann das Eisen, egal ob es als chelatisiertes oder freies Ion vorliegt, frei diffundieren, während im Boden die Diffusion vergleichsweise eingeschränkt ist. Daher muß die zur Fe-Assimilation verwandte Anstrengung größer sein als bei den Landpflanzen. Tatsächlich ist Fe in einigen Bereichen der Ozeane der limitierende Faktor für das Wachstum von Phytoplankton und damit für die gesamte marine Biomasseproduktion ( Martin und Fitzwater 1988 ; Behrenfeld und Kolber 1999 ).

Verschiedene Mechanismen der Fe-Assimilation wurden in Algen gefunden: In Scenedesmus incrassulata wurde die Sekretion von Siderophoren nachgewiesen ( Benderliev und Ivanova 1994 ), eine Reaktion, die der von Mikroorganismen und Gräsern ähnelt (Strategie II, Bienfait 1988 ). In der halophilen Alge Dunaliella salina wurde ein Transferrin-ähnliches Protein gefunden, das den Fe-Transport vermittelt und dessen Expression durch die Salzkonzentration der Umgebung reguliert wird ( Fisher et al. 1998 ). Ein Transferrin-abhängiger Mechanismus ist aus Säugern bekannt. Bei ihnen erfolgt die Beladung von Transferrin im Blutserum oxidativ durch die Wirkung von Ceruloplasmin. Dieses kupferhaltige Serumprotein katalysiert die Oxidation von Fe2+ durch Sauerstoff. Das dabei entstehende Fe3+ wird an Transferrin gebunden und zusammen mit ihm über den Transferrinrezeptor durch rezeptorvermittelte Endozytose in die Zellen aufgenommen. Neuere Arbeiten berichten von Ceruloplasmin-abhängiger, aber Transferrin-unabhängiger Fe3+-Aufnahme in menschliche Zellen ( Attieh et al. 1999 ). Ähnliche Vorgänge wurden in Hefe beschrieben: Hier wird das durch die Fe3+-Reduktasen entstandene Fe2+ durch das Fet3-Protein re-oxidiert, bevor es durch das Ftr1-Protein als Fe3+ ins Innere der Zellen transportiert wird ( Eide 1998 ). In Chlorella vulgaris wurde die Assimilation angebotener Fe3+-Siderophoren als reduktiv beschrieben ( Alnutt und Bonner 1987a , Alnutt und Bonner 1987b ). Eisenchelat-Reduktase wurde auch in Chlorella pyrenoidosa nachgewiesen, obwohl keine Substratsättigung gefunden wurde ( Moog und Brüggemann 1994 ). Zusammengenommen scheinen Algen über die gesamte Bandbreite der bekannten Fe-Assimilationsreaktionen zu verfügen.

4.2.1.1 Fe3+-Chelatreduktase in C. reinhardtii

In dieser Studie wurde Chlamydomonas reinhardtii als neuer Modellorganismus zur Untersuchung der Fe-Assimilation etabliert. Es wurde gezeigt, daß Chlamydomonas-Zellen unter Fe-Mangel eine Fe3+-Chelatreduktase über 15-fach induzieren. Diese Induktion ist höher als die in höheren Pflanzen gemessene ( Moog und Brüggemann 1994 ). Außerdem stellen Chlamydomonas-Zellen eine annähernd homogene Population dar, während in den Wurzeln höherer Pflanzen nur wenige Zellen tatsächlich die Fe3+-Chelatreduktase exprimieren ( Abb. 4 ). Parallel zur Induktion der Fe3+-Chelatreduktase wird Fe-Transportaktivität induziert. Diese beiden Enzymaktivitäten deuten darauf hin, daß Chlamydomonas, ebenso wie die meisten höheren Pflanzen, in einer „Strategie I“-Reaktion Fe3+-Chelate zunächst reduzieren muß, um anschließend Fe2+ transportieren zu können ( Chaney et al. 1972 , Römheld 1987 , Bienfait 1988 ).

Die Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii wurde in dieser ( Eckhardt und Buckhout 1998 )


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und in einer zeitgleich erschienen Studie ( Lynnes et al. 1998 ) erstmals physiologisch charakterisiert. Langanhaltender, gravierender Fe-Mangel führte zum Ausbleichen der Zellen. Dieses Phänomen wurde von Lynnes et al. 1998 quantifiziert.

Die Aktivität der Fe3+-Chelatreduktase war abhängig von der Fe-Konzentration des Wachstumsmediums. Unterhalb von etwa 4 µM Fe im Medium war diese Aktivität nach zwei Tagen stark induziert. Daraus läßt sich der Fe-Bedarf der Algen abschätzen, der offensichtlich bei Konzentrationen um die vier µM gedeckt ist. Dies liegt im Bereich der für höhere Pfanzen empirisch bestimmten Nährlösungskonzentrationen ( Epstein 1972 ).

Die Kinetik der Induktion wurde untersucht: Nach etwa 4 - 6 Stunden Fe-defizientem Wachstums wurde eine deutliche Steigerung der Fe3+-Chelatreduktaseaktivität meßbar, nach etwa 20 - 24 Stunden war sie maximal induziert und sank beim Erreichen der spät-exponentiellen Wachstumsphase wieder ab. Die Induktionskinetik der Fe3+-Chelatreduktase deutet auf die Neusynthese des Enzyms unter Fe-Mangel hin. Dafür sprechen auch Inhibitionsversuche der Induktion der Fe3+-Chelatreduktase durch Cycloheximid, einem Hemmstoff der Proteinbiosynthese, obwohl Kontrollexperimente fehlten (A. Herbik, pers. Mitt.).

Hefezellen sind in der Lage, Fe- und Cu-Mangel direkt durch die spezifischen Transkriptionsaktivatoren, Aft1p und Mac1p, zu messen. Diese Proteine binden Fe- oder Cu-Ionen und sind in diesem Zustand inaktiv. Unter Mangelbedingungen oder in sogenannten „up“-Mutanten, sind die entsprechenden Bindungsstellen unbesetzt und die Proteine aktivieren die Transkription der Fe- und Cu-Assimilationsgene ( Eide 1998 ). In Hefe konnte keine Signaltransduktion der Fe-Mangelantwort durch Proteinphosphorylierung oder ähnliche Mechanismen beobachtet werden. In Chlamydomonas durchgeführte Inhibitionsversuche der Fe3+-Chelatreduktase mit Proteinkinase- und -phosphataseinhibitoren konnten keinen Aufschluß über die Signaltransduktion des Fe-Mangels geben (Daten nicht gezeigt). Daher schlage ich eine ähnliche Regulation wie in Hefe auch für Chlamydomonas vor. Signaltransduktionen über längere Strecken, wie sie für höhere Pflanzen postuliert wurden ( Grusak und Pezeshgi 1996 ), können für einzellige Organismen mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. In höheren Pflanzen sind die Orte des größten Fe-Bedarfes (Blätter, Blüten, Samenanlagen) von denen der Fe-Assimilation (Wurzeln) räumlich getrennt. Die Beteiligung von Phytohormonen wie Auxin und Ethylen an der Fe-Mangelantwort, sowie eines Signalmolekül, das im Phloem transportiert wird ( Grusak 1995 , Grusak und Pezeshgi 1996 ), wurden postuliert aber bisher nicht auf molekularer Ebene nachgewiesen. In Bezug auf die Wahrnehmung und die Reizübertragung des Fe-Mangels ist es wahrscheinlich, daß Chlamydomonas als einzellige Alge sich von höheren Pflanzen unterscheidet und eine Regulation ähnlich wie in Hefe zeigt.

Die Fe3+-Chelatreduktase ist energieabhängig, da sie durch FCCP und Valinomycin signifikant gehemmt wurde und ein Chloroplasten-ATPase-defizienter Stamm unter Fe-defizienten Bedingungen keine Induktion der Reduktaseaktivität zeigte ( Eckhardt und Buckhout 1998 ). Ihr pH-Optimum lag im neutralen Bereich zwischen pH 6,5 und 7,0. Lynnes et al. 1998 konnten, im Gegensatz zu den hier dargestellten Untersuchungen, keine pH-Abhängigkeit der Fe3+-Chelatreduktase und der Ferricyanidreduktase in Chlamydomonas feststellen. Dies muß an den von Lynnes et al. 1998


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verwendeten Untersuchungsmethoden liegen, die von mir nicht reproduziert werden konnten. Insbesondere war es in unserem Labor, trotz eines hochwertigen Diode Array-Spektrophotometers (Beckman) nicht möglich, die Absorption des Fe2+-BPDS Komplexes ohne vorheriges Abtrennen der Zellen zu messen, was Lynnes et al. 1998 konnten. In meinen Untersuchungen lag die durch die Zellen verursachte Lichtstreuung mehr als zehnfach über der Absorption des Fe2+-BPDS-Komplexes, so daß das Rausch/Signal-Verhältnis für sinnvolle Messungen viel zu groß war (nicht gezeigt).

Die Fe3+-Chelatreduktase war sättigbar mit einem apparenten Km-Wert von etwa 30 µM, was, angesichts der geringen Fe-Konzentrationen, mit denen die Algen in ihrer natürlichen Umgebung konfrontiert sind, erstaunlich hoch ist. Bei der Bewertung dieser Km-Werte muß bedacht werden, daß die Messungen an ganzen Zellen durchgeführt wurden, und daß möglicherweise in Chlamydomonas mehrere Plasmamembran-Redoxsysteme existieren. In den Wurzeln höherer Pflanzen wurden apparente Km-Werte für Fe3+-EDTA zwischen 28 und 230 µM und in isolierten Plasmamembranen zwischen 21 und 230 µM gemessen ( Moog und Brüggemann 1994 ). Die in Chlamydomonas gemessenen Km-Werte bewegen sich demnach in Konzentrationsbereichen ähnlich derer höherer Pflanzen. Die hohen Werte könnten auf die synthetischen Chelatoren zurückzuführen sein, die zwar die Messung erleichtern, aber nicht das natürliche Substrat der Fe3+-Chelatreduktasen darstellen und möglicherweise mit geringerer Affinität reduziert werden.

In höheren Pflanzen wurde die Existenz zweier Plasmamembran-Redoxsysteme beschrieben: das konstitutive „Standard-System“ und das Fe-Mangel-induzierte „Turbo-System“ (als Überblick: Lüthje et al. 1997 ). Das Standard-System wurde meistens unter Verwendung von Elektronenakzeptoren mit extrem niedrigen Reduktionspotentialen, wie Hexacyanoferrat(III) oder Hexabromoiridat(IV) gemessen. Es ist offensichtlich, daß die Redox-Systeme, die Fe3+-Chelate reduzierten, entsprechend der Reduktionspotentiale der Substrate, auch Hexacyanoferrat(III) reduzieren konnten ( Moog und Brüggemann 1994 , Lynnes et al. 1998 , sowie eigene, unveröff. Daten). Der umgekehrte Fall wurde von Lynnes et al. 1998 postuliert, aber nicht nachgewiesen. Fe-gehungerte Chlamydomonas reinhardtii-Zellen reduzierten zunächst das gesamte Hexacyanoferrat(III), bevor gleichzeitig angebotene Fe3+-Chelate reduziert wurden ( Lynnes et al. 1998 ). Die Autoren schlossen aus diesen Ergebnissen, daß Hexacyanoferrat(III) ein geeignetes Substrat für die Messung der eisenmangelinduzierten Fe3+-Chelatreduktase sei. Dieser Schluß ist meines Erachtens nach keineswegs zwingend. Die Ergebnisse zeigen vielmehr, daß die Fe3+-Chelatreduktase recht unspezifische Substratpräferenzen hat und daß die am leichtesten reduzierbaren Substrate zuerst reduziert werden.

In Algen, die unter Fe-suffizienten Wachstumsbedingungen herangezogen waren, konnten keine Sättigungskinetiken der Fe3+-Chelatreduktase bis hin zu 300 µM Fe3+-HEDTA gemessen werden. Die geringe und nicht sättigbare Fe3+-Chelatreduktaseaktivität Fe-suffizient gewachsener Algen könnte auf die Aktivität des Standard-Systems zurückzuführen sein ( Lüthje et al. 1997 ). Zusätzlich zu der linearen Komponente war immer auch eine geringe sättigbare Komponente zu bemerken, die möglicherweise basale Level der Eisenmangel-induzierten Turbo-Reduktase repräsentiert. Dies würde die Vermutung bekräftigen, daß die Induktion der Fe3+-Chelatreduktase


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auf die Neusynthese des Proteins zurückzuführen ist.

In vitro-Translationsversuche mit isolierter RNA aus Chlamydomonas-Zellen, die Fe- und Cu-defizient angezogen wurden, identifizierten drei Fe-, aber nicht Cu-Mangel-induzierte Translationsprodukte mit molekularen Massen zwischen 30 und 40 kDa ( Hill et al. 1996 ). Vergleiche der Peptidmuster Fe-gehungerter und Fe-suffizient gewachsener Chlamydomonas-Zellen identifizierten ein etwa 150 kDa großes Membranprotein, das Sequenzähnlichkeiten zu der kupferhaltigen Ferroxidase Hephaestin und zu Fet3p aus Hefe aufweist (A. Herbik, pers. Mitt.). Diese Proteine haben ebenfalls Ähnlichkeit zu Ceruloplasmin, welches in Säugern zur oxidativen Beladung von Transferrin, sowie zum Fe3+-Transport in humane Zellen benötigt wird (als Überblick: Nelson 1999 ).

Abb. 41: Vergleich der Fe-Assimilation höherer Pflanzen mit dem hochaffinen Mechanismus in Hefe. Das durch die Fe3+-Chelatreduktasen bereitgestellte Fe2+ wird entweder direkt transportiert (höhere Pflanzen, „Strategie I“) oder durch das Fet3-Protein zu Fe3+ re-oxidiert und dann transportiert (Hefe).

Diese Daten gaben Anlaß zu der Spekulation, daß der Fe-Transport in Chlamydomonas reinhardtii ähnlich zu dem in Hefe erfolgt. Der Einfluß von Cu-Mangel konnte diese Hypothese nicht unterstützen, obwohl hierzu weitere Untersuchungen notwendig sind. Moderater Cu-Mangel über drei bis vier Tage war weder in der Lage, die Fe3+-Chelatreduktase, noch den Fe2+-Transport signifikant zu beeinflussen ( Tabelle 8 , Abb. 36 ). Die Reduktase wurde in reproduzierbaren Versuchen gering induziert (10-15%), während der Fe2+-Transport sehr geringfügig durch Cu-Mangel inhibiert wurde. Diese Unterschiede waren zwar reproduzierbar, aber statistisch nicht signifikant ( Eckhardt und Buckhout 1998 ). Ähnliche Daten wurden.

Die Induktion einer trans-plasmamembranären Reduktase durch Cu-Defizienz wurde auch im Labor von Sabeeha Merchant (S. Merchant, Los Angeles, CA, pers. Mitt.) gemessen und als Cu2+-Reduktase beschrieben ( Hill et al. 1996 ). Es wurde postuliert, daß Cu2+, analog zu Fe3+, zunächst reduziert werden muß, bevor Cu+ in die Zelle transportiert werden kann ( Hassett und Kosman 1995 ). Diese Annahme stützt sich auf die Beobachtung, daß die Fe3+-Chelatreduktasen aus Hefe Fre1p und Fre2p ebenfalls Cu2+-Reduktaseaktivität zeigten ( Georgatsou und Alexandraki 1994 ) und daß in Erbsenwurzeln eine Cu2+-Reduktase durch Fe-Defizienz und eine Fe3+-


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Chelatreduktase durch Cu-Defizienz induziert werden konnte ( Welch et al. 1993 ). Das ebenso einfache wie geniale Experiment, das von Chaney et al. 1972 für die Fe-Aufnahme entwickelt worden ist, nämlich das Abfangen der Fe2+-Ionen durch den Fe2+-spezifischen Chelator BPDS bei angebotenen Fe3+-Chelaten, und die anschließende Messung der Fe-Gehalte in den Sprossen, könnte analog auch mit Cu2+ und dem Cu+-spezifischen Chelator BCDS durchgeführt werden. Solche Versuche sind jedoch nie publiziert worden. Stattdessen stützen sich die Autoren auf indirekte Evidenzien wie die Inhibition der Fe3+-Reduktase in Hefe durch Platinsalze und einer verbleibenden Restaktivität von unter 5%, die einer vermeintlichen Cu2+-Reduktase zugeschrieben wurde ( Hassett und Kosman 1995 ). Es ist biologisch sinnvoll, Fe3+-Verbindungen zu reduzieren, da die Löslichkeit von Fe2+ erheblich höher ist und außerdem Fe3+-Chelate in der Regel durch die Reduktion gespalten werden. Die Löslichkeit von Cu+ ist jedoch wesentlich geringer als die von Cu2+, so daß die Reduktion von Cu2+ zur Kupferassimilation wenig Sinn macht. Eine mögliche Erklärung für die Reduktion von Cu2+ wäre der Schutz vor Cu-Toxizität durch den Ausschluß von Cu. Dies würde allerdings der Induktion der Fe3+- und der Cu2+-Reduktase unter Cu-Mangel widersprechen. Die plausibelste Erklärung für dieses Dilemma ist die Beteiligung von Cu am Fe-Transport, wodurch die geringe aber reproduzierbare Steigerung der Fe3+-Chelatreduktase erklärt werden könnte. Gleichzeitig muß für die Fe3+-Chelatreduktase eine geringe Substratspezifität angenommen werden, was angesichts der unterschiedlichen Fe3+-Verbindungen im natürlichen Lebensraum von Chlamydomonas reinhardtii sinnvoll ist ( Moog und Brüggemann 1994 ). Die Eigenschaften der Cu2+-Reduktase in Tomatenwurzeln wurden von Holden et al. 1995 untersucht. Obwohl sie in denselben Reinigungsfraktionen wie die Fe3+-Chelatreduktase angereichert wurde, unterschieden sich die beiden Enzymaktivitäten in Bezug auf die Detergens-Latenz, die Substratspezifität und die Elektronendonor-Präferenz.

4.2.1.2 Fe-Transport in C. reinhardtii

Ebenso wie die Fe3+-Chelatreduktaseaktivität war der Fe-Transport in Chlamydomonas eisenmangelinduziert. Nur in eisengehungerten Zellen wurden signifikante Fe-Aufnahmeraten gemessen. In Kontrollmessungen auf Eis wurde der Anteil unspezifischer Bindung geschätzt. Er lag unter 10 % der bei 30 °C gemessenen enzymatischen Fe-Transportraten.

Ähnlich wie in Tomaten wurden in Chlamydomonas erhöhte Fe-Transportraten gemessen, wenn Fe2+ und nicht Fe3+ als Substrat angeboten wurde. Dieser Effekt war jedoch geringer ausgeprägt als bei den in Hefe exprimierten Tomatenproteinen. Dies ist vermutlich auf die hohe Fe3+-Chelatreduktaseaktivität zurückzuführen. Die Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas war etwa hundert- bis tausendfach höher als die Fe-Transportraten ( Tabelle 6 ). Bei der Fe-Assimilation in Chlamydomonas scheint daher der Transport und nicht die Fe3+-Reduktion den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt darzustellen. Diese Aktivität steht im Widerspruch zu den Beobachtungen in Erbsen ( Grusak et al. 1990 ), verwundert jedoch nicht, wenn die freie Diffusion des reduzierten Eisens bedacht wird. Es erscheint biologisch sinnvoll, erheblich größere Mengen Fe3+ zu reduzieren als für die Mineralernährung notwendig sind, da in wässriger Umgebung ein Großteil des Fe2+ die Zellen gar nicht erreicht, sondern sofort wegdiffundiert. Um die tatsächlichen Anteile


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des Transportes von Fe2+ und Fe3+ auseinanderzuhalten, ist es notwendig, Fe3+-Chelatreduktase-defiziente oder Fe-Transport-defiziente Mutanten zu verwenden.

Der Fe-Transport in Chlamydomonas erwies sich als energieabhängig: in Inhibitionsversuchen konnte der Fe-Transport durch 20 µM FCCP fast vollständig unterbunden werden. Dies legt eine Beteiligung des Membranpotentials am Fe-Transport nahe. Die Transportraten weisen auf eine Akkumulation des Eisens aus der umgebenden Lösung hin. Unter Vernachlässigung der Zellkompartimentierung und bei Annahme eines Zellvolumens von etwa 50 fl ( Harris 1988 ) und einer Fe-Transportrate von 20 pmol / h . 106 Zellen ( Abb. 33 ) werden nach 30 Minuten 200 µM Fe in den Zellen akkumuliert. Dies ist 100-fach höher als die angebotenen 2 µM des Substrates. Diese Akkumulation liegt im Rahmen des durch das Membranpotential möglichen und muß nicht durch H+-Symport energetisiert sein. Evidenzien für einen Protonen-Symport konnten aufgrund der gemessenen Daten nicht gefunden werden.

Der Fe2+-Transport in eisengehungerte Chlamydomonas reinhardtii-Zellen konnte durch einen 100-fachen Überschuß an Kupferionen inhibiert werden. Diese Inhibition war abhängig von der Cu-Konzentration ( Abb. 35 ). Dies führte zu der Frage, ob Fe und Cu denselben Transportweg benutzen. Es wurde daher untersucht, ob Cu-Mangel zur Induktion des Fe-Transportes führt. Dies war nicht der Fall ( Abb. 36 ). In Transportversuchen, die zeigen sollten, ob die Inhibition des Fe2+-Transportes durch Cu kompetitiv ist, wurde bei konstanter Cu-Konzentration die Fe2+-Konzentration variiert. Dabei wurde deutlich, daß sich die Inhibition des Fe-Transportes durch Cu auf niedrige Fe-Konzentrationen beschränkt. Bei Fe2+-Konzentrationen oberhalb von etwa 2 µM verlor Cu seinen inhibitorischen Effekt und wirkte sogar stimulierend auf die Fe2+-Aufnahme ( Abb. 37 ). Dieser Effekt kann durch die Existenz mehrerer Fe-Transportsysteme erklärt werden, obwohl allosterische Effekte nicht ausgeschlossen werden können. Der hochaffine Fe2+-Transporter scheint dabei durch Cu inhibierbar zu sein, während der niedrigaffine Transporter durch die Anwesenheit von Cu-Ionen stimuliert wurde.

In nahezu allen untersuchten Organismen existieren hoch- und niedrigaffine Transportsysteme für Übergangsmetall-Ionen ( Nelson 1999 ). Die Regulation dieser Transportsysteme erlaubt eine Feinabstimmung der Aufnahme dieser potentiell toxischen Ionen. In Hefe wurde gezeigt, daß in Mutanten, die im hochaffinen Fe-Transportsystem defizient sind, der niedrigaffine Transportweg verstärkt ausgeprägt ist ( Dix et al. 1994 ). Dabei sind transkriptionelle und post-translationale Mechanismen beteiligt (D. Eide, Columbia, MO; pers. Mitt.). Eine ähnliche Regulation schlage ich für den Fe-Transport in Chlamydomonas vor. Bei Ausfall oder Inhibition des hochaffinen Aufnahmesystems wird über einen nicht identifizierten Mechanismus der niedrigaffine Transportmechanismus induziert. Um diese Hypothese zu untersuchen, ist die Verwendung von Fe-Transport-Mutanten notwendig. Abb. 42 stellt ein vorläufiges Modell der Fe-Assimilation in Chlamydomonas reinhardtii dar, das aus den hier vorgelegten Daten erstellt werden konnte.


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Abb. 42: Modell der Fe-Assimilation in der Alge Chlamydomonas reinhardtii. Unter Fe-Mangel wird eine Fe3+-Chelatreduktase induziert, die das zum Transport benötigte Fe2+ bereitstellt. Dieses wird über mindestens zwei unterschiedliche Transportsysteme in die Zellen transportiert. Das hochaffine Transportsystem ist durch Kupferionen inhibierbar.

4.2.1.3 Ausblick

Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, stellt Chlamydomonas reinhardtii einen ausgezeichneten Modellorganismus für die Analyse der Fe-Assimilationsreaktionen in Pflanzen dar ( Eckhardt und Buckhout 1998 ). Tiefere Einblicke in die Fe-Assimilation dieser Alge werden jedoch erst mit der Verfügbarkeit entsprechender Mutanten gelingen. Insbesondere die quantitative Bewertung der Fe3+-Reduktion im Vergleich zum Fe-Transport wird nur durch Fe3+-Reduktasemutanten gelingen. Zur Selektion von Fe-Transportmutanten wurde in Hefe das Antibiotikum Streptonigrin erfolgreich angewandt ( Askwith et al. 1994 ).

Die Transformation des Kerngenoms von Chlamydomonas stellt eine ausgezeichnete Möglichkeit der Mutagenese dar ( Tam und Lefebvre 1993 ). Die Untersuchung von etwa 20.000 transformierten Kolonien ist notwendig, um einen bestimmten Phänotyp zu identifizieren (P. Lefebvre, St. Louis, pers. Mitt.). Durch Rückkreuzung der Transformanten mit Wildtypzellen umgekehrten Kreuzungstyps kann leicht verifiziert werden, ob die Transformanten nur eine Kopie des Plasmides enthalten. Wenn dies der Fall ist, kann durch „plasmid rescue“ das Plasmid und die Integrationsstelle schnell isoliert werden. Mit der bekannten Sequenz der Integrationsstelle kann das entsprechende Gen leicht aus einer Genbank isoliert werden. Eine geordnete BAC-Bank, die


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das Genom von Chlamydomonas reinhardtii über dreifach repräsentiert, ist als einzelner Membranfilter kommerziell erhältlich (

http://www.genomesystems.com/cgi-bin/prod-search?K=Chlamydomonas

). Die Hybridisierung dieses Filters mit der Sequenz der Integrationsstelle erlaubt die Identifizierung des genomischen Fragmentes in einem einzigen Experiment. Die hybridisierenden BAC-Klone können dann angefordert werden. Nach Fragmentierung in überschaubare Stücke und Subklonierung kann das Gen durch erneute Hybridisierung gefunden werden.

In Vorversuchen wurde nach einem Testsystem gesucht, um die Fe3+-Chelatreduktaseaktivität vieler Kolonien einzeln qualitativ zu messen. Dabei wurden Sprühtests, Überschichtungstests und Filtertests nach dem Beispiel von Dancis et al. 1990 verwendet (nicht gezeigt). Am besten schien der Filtertest geeignet zu sein. Die Algenkolonien wurden mit Hilfe eines Replikastempels geordnet auf Fe-limitierte Agarplatten überführt. Nach etwa einer Woche Wachstum wurden sie auf Nylonmembranen gezogen und die Nylonfilter wurden nacheinander auf Filterpapier mit Testpuffer (20 mM MES, 2 mM K-Acetat, 2 mM Na3-Citrat, pH 6,8) und Substratlösung (200 µM Fe-HEDTA und 600 µM BPDS in Testpuffer) im Dunkeln inkubiert. Die entstandene Rotfärbung wurde deutlich, nachdem die Zellen unter Leitungswasser vorsichtig abgespült worden waren. Diese Methode funktionierte nicht bei einer zellwand-defizienten Mutante, da sich die Zellen dieses Stammes nicht abspülen ließen (nicht gezeigt). Obwohl Details dieser Methode noch verbesserungswürdig sind, zeigen diese ersten Vorversuche, daß es möglich ist, durch Filtertests die Fe3+-Chelatreduktaseaktivität vieler Kolonien qualitativ zu analysieren. Die Verfügbarkeit von Mutanten hatte bereits in Hefe zum Durchbruch in der Analyse der Fe-Assimilation geführt ( Dancis et al. 1990 ).


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