Eckhardt, Ulrich: Untersuchungen zur Eisenassimilation in Pflanzen
Untersuchungen zur Eisenassimilation in Pflanzen
Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde
"doctor rerum naturalium" (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der


Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin


von Ulrich Eckhardt

Präsident der Humboldt-Universität: Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Math.-Nat. Fakultät I: Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Gutachter:
Prof. Dr Thomas J. Buckhout
Prof. Dr. Wolfgang Lockau
Prof. Dr. Wolfgang Brüggemann

Datum der Promotion: 19. 12. 2000


2

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden Experimente zur pflanzlichen Eisenassimilation durchgeführt. Zwei cDNAs aus Tomatenwurzeln (LeIRT1 und LeIRT2, GenBank Acc-Nr. AF176579 und AF176580) wurden isoliert. Sie komplementierten Fe-aufnahmedefiziente Hefestämme in Bezug auf das Wachstum auf Fe-limitierendem Medium. Die durch die LeIRT-Proteine vermittelte Fe-Aufnahme wurde in Hefezellen charakterisiert. Sie war temperaturabhängig, sättigbar und Fe2+, nicht Fe3+ wurde transportiert. Kompetitions- und Komplementationsexperimente mit metall-aufnahmedefizienten Hefemutanten legten die Vermutung nahe, daß die beiden cDNAs für Kationentransporter codieren, die eine breite Substratspezifität für Übergangsmetalle aufweisen. Die Transkripte der LeIRT-Gene konnten fast ausschließlich in Wurzeln nachgewiesen werden, wobei LeIRT1 durch Fe-Mangel induziert war, während für LeIRT2 keine Regulation durch die Fe-Ernährung der Pflanzen erkennbar war. Die Genstruktur wurde aufgeklärt (GenBank Acc-Nr. AF246266).

Schwierigkeiten in der Analyse der Fe-Assimilation höherer Pflanzen machten es notwendig, einen neuen Modellorganismus zu suchen. Dabei wurde die einzellige Alge Chlamydomonas reinhardtii ausgewählt. Physiologische Studien zeigten, daß diese Alge ähnliche Fe-Mangelreaktionen wie die meisten höheren Pflanzen aufweist. Insbesondere die starke Induktion einer Fe3+-Chelatreduktase und die parallele Induktion der Fe-Transportkapazität unter Fe-Mangel waren deutlich. Mindestens zwei Fe-Transportsysteme wurden postuliert, von denen das höheraffine durch Cu-Ionen gehemmt wurde.

Schlagwörter:
Fe-Transport, Hefekomplementation, ZIP-Familie, Tomate, Chlamydomonas.

Abstract

In the present study, experiments were conducted to analyze the iron assimilation in plants. Two cDNAs from tomato roots (LeIRT1 and LeIRT2, GenBank Acc-Nr. AF176579 and AF176580) were isolated that complemented the growth defect of Fe uptake-deficient yeast mutants. The Fe uptake mediated by the LeIRT proteins was characterized in yeast. It was temperature-dependent, saturable and Fe2+ rather than Fe3+ was transported. Competition and complementation experiments with metal uptake-deficient yeast mutants suggested that both cDNAs code for cation transporters exhibiting broad substrate specificity for transition metals. The transcripts of both genes were predominantly detected in roots, LeIRT1 being induced by Fe deficiency whereas LeIRT2 was unaffected by the Fe status of the plants. The gene structure was determined (GenBank Acc-Nr. AF246266).

Problems in the analysis of Fe assimilation in higher plants made it necessary to establish a new model organism. The unicellular eucaryotic alga, Chlamydomonas reinhardtii, was chosen. Physiological studies indicated that this alga reacted to Fe deficiency similar to most higher plants. Particularly the strong induction of an Fe3+-chelate reductase paralleled by the induction of Fe transport capacitiy under Fe deficiency were evident. At least two Fe transporters were postulated, one of which was inhibited by Cu ions.

Keywords:
Fe transport, yeast complementation, ZIP family, tomato, Chlamydomonas.


Seiten: [2] [3] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur Eisenassimilation in Pflanzen
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen und Anglizismen
1 Einleitung
1.2Bedeutung des Eisens in der Pflanzenernährung
1.3Eisenassimilation in Pflanzen
1.3.1Ansäuerung der Rhizosphäre
1.3.2Eisenreduktion an der Plasmamembran von Wurzelzellen
1.3.2.1Induktion der Fe-Chelatreduktase unter Fe-Mangel
1.3.2.2Physiologische und biochemische Charakterisierung der Eisenchelat-Reduktasen
1.3.2.3Genetische Ansätze zur Identifizierung der Fe3+-Chelatreduktase
1.3.2.4Fe3+-Reduktasen und Pathogenabwehr
1.3.3Transport von Fe2+ in die Rhizodermis
1.3.4Eisenassimilation einzelliger Algen
1.4Eisenassimilation in Hefe
1.4.1Biochemische und genetische Charakterisierung der Eisenreduktasen in Hefe
1.4.2Molekulare Charakterisierung der Fe-Transporter in Hefe
1.5Ansätze zur molekularen Charakterisierung der Eisenassimilation in höheren Pflanzen
1.5.1Komplementation von Hefemutanten mit pflanzlichen cDNAs
1.5.2Differentielle Proteinmuster in Wurzeln
1.5.3Molekularbiologische Ansätze zur Identifizierung eisenmangel-induzierter Genprodukte
1.6Zielsetzung dieser Arbeit
2 Material und Methoden
2.1Material
2.1.1Pflanzen, Stämme und Vektoren
2.1.2Geräte
2.1.3Chemikalien und Reagenzien
2.1.4Radiochemikalien
2.1.5Synthetische Oligonucleotide
2.2Methoden
2.2.1Anzucht von Tomatenpflanzen
2.2.2Anzucht der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii
2.2.3Eisenchelat-Reduktasetest in Chlamydomonas reinhardtii
2.2.4Kupferreduktasetest in Chlamydomonas reinhardtii
2.2.5Messung der Eisenaufnahme in Chlamydomonas reinhardtii
2.2.6RNA-Isolation aus Pflanzen und Northern-Blot-Analyse
2.2.7DNA-Isolation aus Pflanzen und Southern Blot-Analyse
2.2.8PCR-Amplifikation von DNA mit spezifischen Primern
2.2.9RT-PCR
2.2.10Konstruktion von cDNA-Banken
2.2.11Sequenzanalyse doppelsträngiger DNA
2.2.12Computergestützte Analyse der DNA-Sequenzen
2.2.13Sonstige molekularbiologische Methoden
2.2.14Transformation von Saccharomyces cerevisiae
2.2.15Präparation von Plasmid- und genomischer DNA aus Saccharomyces cerevisiae
2.2.16Eisenchelat-Reduktasetest in Saccharomyces cerevisiae
2.2.17Messung der Eisenaufnahme in Saccharomyces cerevisiae
2.2.18Sonstige hefegenetische Methoden
3 Ergebnisse
3.1Konzept zur Isolierung von Fe-Transporter-cDNA-Klonen aus Tomaten
3.2Konstruktion neuer Hefe-Expressionsvektoren
3.3Konstruktion einer Fe-Transport-defizienten Hefemutante
3.3.1Deletion des FTR1-Gens im Hefestamm S288C
3.3.2Wachstum der putativen Deltaftr1-Mutanten auf eisenlimitiertem Medium
3.3.3Messung der Fe-Transports im Stamm AMY43
3.4Konstruktion einer Tomatenwurzel-cDNA-Bank
3.5Screening der Tomatenwurzel-cDNA-Bank mit der IRT1-cDNA aus Arabidopsis thaliana
3.6Isolierung putativer Fe-Transporter-cDNAs aus Tomatenwurzeln
3.6.1Sequenzanalyse der putativen Fe-Transporter-cDNAs aus Tomaten
3.6.2Ähnlichkeiten der LeIRT-Proteine mit bekannten Proteinen
3.7Charakterisierung der cDNA-Klone in Hefe
3.7.1Wachstum einer fet3/fet4-Hefemutante in Abhängigkeit der Tomaten-cDNAs
3.7.2Fe-Aufnahme einer fet3/fet4-Hefemutante in Abhängigkeit der Tomaten-cDNAs
3.7.3Valenz des transportierten Eisens
3.7.4Kinetische Parameter der LeIRT-Proteine
3.7.5Transportspezifität der LeIRT-Proteine
3.7.5.1Kompetition des Fe-Transports
3.7.5.2Wachstum von Mn-, Zn-, und Cu-Aufnahmemutanten in Abhängigkeit der Tomaten-cDNAs
3.8Expression der LeIRT-Gene auf RNA-Ebene
3.9Analyse der LeIRT-Gene
3.9.1Southern Blot-Analysen
3.9.2Intron/Exon-Struktur der LeIRT-Gene
3.9.3Inverse PCR-Versuche
3.9.4Direkte PCR-Versuche
3.9.5Transkriptionsstart der LeIRT-Gene
3.9.6Übersicht über die LeIRT-Gene
3.10Fe-Reduktaseaktivität der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii
3.10.1Pflanzenphysiologische Beobachtungen
3.10.2Etablierung eines Eisenchelat-Reduktasetests an Algen
3.10.3Induktion der Fe3+-Chelatreduktaseaktivität durch Eisenmangel
3.10.4Abhängigkeit der Induktion von der Eisenkonzentration im Anzuchtmedium
3.10.5Kinetik der Induktion der Fe3+-Chelat-Reduktaseaktivität
3.10.6Substratsättigung der Fe3+-Chelat-Reduktaseaktivität
3.10.7pH-Optimum der Fe3+-Chelat-Reduktase
3.10.8Einfluß von Inhibitoren auf die Fe3+-Chelatreduktase
3.10.9Rolle der Eisenchelat-Reduktase bei der Eisenaufnahme
3.11Fe-Transportaktivität der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii
3.11.1Induktion des Fe-Transports unter Eisenmangel
3.11.2Valenz des transportierten Eisens
3.11.3Inhibition der Fe-Aufnahme
3.12Interaktionen des Fe- und des Cu-Stoffwechsels in Chlamydomonas reinhardtii
4 Diskussion
4.1Molekulare Charakterisierung des Fe-Transportes in Tomaten
4.1.1.1Isolierung zweier putativer Fe-Transporter
4.1.1.2Physiologie des LeIRT-vermittelten Fe-Transports
4.1.1.3Sequenzanalyse der zwei cDNAs
4.1.1.4Expression der LeIRT-Gene
4.1.1.5Analyse der LeIRT-Gene
4.1.1.6Ausblick
4.2Physiologie der Fe-Assimilation in Chlamydomonas
4.2.1.1Fe3+-Chelatreduktase in C. reinhardtii
4.2.1.2Fe-Transport in C. reinhardtii
4.2.1.3Ausblick
Bibliographie Literatur
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Übersicht über einige eisenhaltige Enzyme in Pflanzen
Tabelle 2: Übersicht über die LeIRT-cDNAs und die daraus abgeleiteten Polypeptide. ORF-Analysen, Glycosylierungsstellen, Kyte/Doolittle-Hydropathie-Analysen, Berechnung des Mr und der Pi. wurden mit dem Programm BlueGene™ der Firma Magic Works erstellt. Weiterhin wurden das TopPred™- und das SignalP™-Programm verwendet.
Tabelle 3: Verwandschaft der aus den Tomaten-cDNAs abgeleiteten Polypeptide mit bekannten Proteinen.
Tabelle 4: Übersicht über die zur Isolation der genomischen DNA-Fragmente verwendeten Primer
Tabelle 5: Inhibitoren der Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii.
Die Zellen wurden fünf Minuten lang mit den angegebenen Reagenzien behandelt, bevor ihre Fe3+-Chelatreduktaseaktivität gemessen wurde. 100 % Aktivität entsprechen 18,4 ± 2,7 nmol Fe2+ (h . 106 Zellen)-1 .
Tabelle 6: Vergleich der Fe3+-Chelatreduktase mit den Fe-Transportraten in Chlamydomonas reinhardtii.
Tabelle 7: Einfluß verschiedener Reagenzien auf den Fe2+-Transport in Chlamydomonas reinhardtii.
Tabelle 8: Interaktionen der Fe3+- und der Cu2+-Reduktaseaktivität in Chlamydomonas reinhardtii: Die Algen wurden bis zur spät-exponentiellen Phase herangezogen, gewaschen und dann in TAP-Medium mit und ohne Fe oder Cu kultiviert. Nach zwei oder drei Tagen wurden die Fe3+- und die Cu2+-Reduktaseaktivitäten gemessen. Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei Experimenten sind gezeigt.
Tabelle 9: Übersicht über die Eigenschaften der Fe-Transporter aus Tomaten und Arabidopsis
Tabelle 10: Positionen der Introns in den putativen Fe-Transportergenen aus Tomate und Arabidopsis, bezogen auf ihre Aminosäuresequenz

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Schema des Ionentransportes über die Plasmamembran von Wurzelzellen höherer Pflanzen (nach Marschner 1986 ). Die durch die H+-ATPase erzeugte „protonenmotorische Kraft“, bestehend aus einem pH-Gradienten und einem Membranpotential über die Plasmamembran, treibt die Aufnahme verschiedener Ionen auch gegen einen Konzentrationsanstieg an. Der Ionentransport kann durch Uniporter entlang des Membranpotentials erfolgen, durch Symport mit Protonen (H+) energetisiert sein oder ungerichtet durch kurzzeitig geöffnete Ionenkanäle erfolgen.
Abb. 2: Habitus und Morphologie eisensuffizient und eisendefizient gewachsener Tomatenpflanzen. Zwei Wochen alte Pflanzen wurden sechs Tage lang in Hydrokultur mit oder ohne Eisen herangezogen. A: Sprosse (links: +Fe; rechts: -Fe); B: Blätter (links: +Fe; rechts: -Fe); C: Blattausschnitt (-Fe); D: Wurzelmorphologie (links: +Fe; rechts: -Fe).
Abb. 3: Modell der beiden Eisenaufnahmemechanismen höherer Pflanzen. PS = Phytosiderophor, PM = Plasmamembran. Erläuterungen im Text.
Abb. 4: Eisenchelatreduktaseaktivität eisengehungerter (links) und eisensuffizienter (rechts) Tomatenwurzeln: Zwei Wochen alte Pflanzen wurden sechs Tage lang in Hydrokultur mit und ohne Fe herangezogen. Ihre Wurzeln wurden abgeschnitten und in Agarose mit 250 µM Fe3+-Citrat und 750 µM BPDS eingebettet. Die rote Farbe rund um die Wurzeln zeigt Fe3+-Chelat-Reduktaseaktivität an. Auch die veränderte Wurzelmorphologie unter Fe-Mangel wird deutlich.
Abb. 5: Ausschnitt aus dem ClustalW-Vergleich einiger Polypeptide mit Homologie zur Eisenchelat-Reduktase Fre1p aus Hefe (vom Januar 1997). Einige funktionelle Sequenzbereiche wie die Häm- und die FAD-Bindungsstellen (unterstrichen) sind hochkonserviert. Die Gesamtsequenzen sind jedoch nur mäßig homolog.
Abb. 6: Modell der Eisenaufnahme in Saccharomyces cerevisiae (nach Eide 1998 ): Fe3+-Ionen werden von Eisenchelatreduktasen (Fre1p und Fre2p) außerhalb der Zelle zu Fe2+ reduziert und damit mobilisiert. Das gebildete Fe2+ wird durch den niedrigaffinen Transporter Fet4p transportiert, oder vom hochaffinen Oxidase-Permease-Komplex bestehend aus den Proteinen Fet3p und Ftr1p erkannt. Fet3p ist eine Oxidase, die das Fe2+ wieder zu Fe3+ oxidiert, während der Eisentransporter Ftr1p das gebildete Fe3+ in die Zelle transportiert. Fet3p benötigt Kupfer und Sauerstoff für seine Funktion, weshalb Cu-Defizienz oder Mutationen in den Kupfertransportergenen CTR1, ATX1 oder CCC2 zum Ausfall des hochaffinen Eisentransportes, und dadurch sekundär zu Fe-Mangelerscheinungen führen. Die Synthese aller beteiligten Proteine ist durch die Transkriptionsaktivatoren Aft1p und Mac1p reguliert, die den Eisen- und den Kupferzustand in der Zelle messen und in Mangelsituationen die Genexpression aktivieren. Außerdem werden Mn, Fe und andere Metalle durch Transporter der Nramp-Familie transportiert. Siderophorgebundenes Fe3+ kann durch das Sit1-Protein aufgenommen werden.
Abb. 7: Schematische Restriktionskarten der Hefe-Expressionsplasmide pUE1 und pUE2. Nur singuläre Schnittstellen sind aufgeführt. Die Karten sind nicht maßstabsgetreu. PGK-P: Phosphoglyceratkinase-Promotor, PGK-T: Phosphoglyceratkinase-Terminator, 2µm: Replikationsursprung des in S. cerevisiae natürlich vorkommenden 2µm-Plasmides, Amp: beta-Lactamasegen.
Abb. 8: A: Schema der Konstruktion einer „one step gene disruption“-Kassette zur Deletion des FTR1-Gens aus S. cerevisiae. B: Schema der Deletion des FTR1-Gens durch homologe Rekombination.
Abb. 9: Wachstum der mit einem Deltaftr1::LEU2-Deletionskonstrukt transformierten Hefekolonien, sowie ihres Elternstammes auf BPDS-haltigem YPD-Medium. A: Wildtypstämme S288C und DBY747. B: Leucin-prototrophe Transformanten AMY 42, AMY43 und AMY44 (mit Genehmigung von Andreas Mas Marques).
Abb. 10: Vergleich der Fe-Aufnahme der Hefestämme S288C und AMY43. Die Zellen wurden über Nacht auf Fe-limitierendem Medium herangezogen, gewaschen und zwei Stunden lang auf Eis gehalten. Die Zellen wurden bei 30°C mit 2 µM radioaktiv markiertem Fe2+ in Gegenwart von Ascorbat inkubiert. Nach 20 sec., 3, 6, 9 und 12 min wurden Aliquots der Zellsuspension in eiskalte Quenchlösung pipettiert, die Lösung wurde über Glasfaserfilter abgesaugt, die Zellen wurden mit Quenchlösung gewaschen und die auf den Filtern verbliebene Radioaktivität wurde gemessen. Kontrollwerte auf Eis wurden von den Meßwerten bei 30°C abgezogen (n = 2; mit Genehmigung von Andreas Mas Marques).
Abb. 11: Bestimmung der mittleren Insertgröße der Tomatenwurzel-cDNA-Bank. 24 Kolonien einer in vivo-Exzision der Bank wurden in Flüssigkultur herangezogen. Ihre Plasmid-DNA wurde mit MluI gespalten. Die Bande bei 4,1 kb entspricht der Vektor-DNA. Als Größenstandard wurde PstI-gespaltene Lambda-DNA verwendet. Die Größen der Markerbanden in kb sind links angezeichnet.
Abb. 12: cDNA- und daraus abgeleitete Peptidsequenz von LeIRT1. Die blauen Kästen repräsentieren putative TM-Domänen Der rote Kasten stellt das putative Signalpeptid dar. Der Histidin-Cluster ist blau und unterstrichen.
Abb. 13: cDNA- und daraus abgeleitete Peptidsequenz von LeIRT2.
Abb. 14: Kyte/Doolittle-Hydropathieanalyse der LeIRT-Proteine bei einer Fenstergröße von 13 Aminosäuren. Rote Balken symbolisieren putative Signalsequenzen, blaue Balken stellen putative Transmembrandomänen dar.
Abb. 15: ClustalW-Alignment der aus den cDNA-Sequenzen vorhergesagten LeIRT-Proteine mit verwandten Proteinen der ZIP-Familie aus Pflanzen und Hefe. Schwarze Bereiche symbolisieren identische Aminosäurereste, graue Bereiche sind konservative Substitutionen. Blaue Kästen bezeichnen TM-Domänen. Die ZIP-Signatursequenz ist durch einen gelben Balken markiert und die hochkonservierten Histidine sind rot gekennzeichnet (at, Arabidopsis thaliana; ps, Pisum sativum; tc, Thlaspi caerulescens; sc, Saccharomyces cerevisiae).
Abb. 16: Wachstum der Transformanten des Hefestammes DEY1453 auf YPD-Medium mit 55 µM BPDS (A) und auf demselben Medium mit 10 µM zusätzlichem Fe-EDTA (B). Die Hefen wurden ausgestrichen wie in (C) beschrieben.
Abb. 17: 59Fe-Transport des Hefestammes DEY1453 transformiert mit dem Expressionsplasmid pUE1 (Kreise) oder den LeIRT-cDNAs (Dreiecke und Quardate) in pUE1. Abgebildet sind die Meßwerte bei 30 °C (gefüllte Symbole) und Kontrollwerte auf Eis (leere Symbole). Die Daten zeigen Mittelwerte aus drei Experimenten mit ihren Standardabweichungen.
Abb. 18: Einfluß des Fe2+-spezifischen Chelators BPDS auf die LeIRT1-abhängige 59Fe-Aufnahme in Zellen des Hefestammes DEY1453. Zwei µM Fe2+-Ascorbat, Fe3+-HEDTA oder Fe3+-HEDTA und 10 µM BPDS wurden als Substrat angeboten (n = 2). Die Aufnahmeraten der mit dem leeren Kontrollplasmid pUE1 transformierten Zellen wurden abgezogen. Sie lagen unter 20 % der abgebildeten Transportraten.
Abb. 19: Substratsättigung des Fe2+-Transportes von mit den LeIRT-cDNAs (offene Dreiecke und Quadrate) oder dem leeren Expressionsplasmid pUE1 (offene Kreise) transformierten DEY1453-Hefezellen. Die gefüllten Symbole repräsentieren die LeIRT-abhängigen Transportraten (Raten der LeIRT-transformierten Zellen abzüglich der Kontrollen). Von allen Transportraten wurden die Kontrollraten auf Eis abgezogen. Um das Substrat vollständig zu reduzieren, war in allen Experimenten ein 100-facher Überschuß an Ascorbat vorhanden.
Abb. 20: Einfluß von 20 µM unterschiedlicher Metallionen auf den Fe-Transport transformierter Hefezellen des Stammes DEY1543. Die Substratlösung enthielt 2 µM Fe2+ in Gegenwart von Ascorbat. Die Metallionen wurden unmittelbar nach der Substratzugabe zu den Hefezellen pipettiert. Gezeigt sind die Transportraten gemessen bei 30°C abzüglich der Kontrollwerte auf Eis.
Abb. 21: Wachstum von drei metallaufnahme-defizienten Hefemutanten in Abhängigkeit der LeIRT-cDNAs:
Die Transformanten wurden ausplattiert wie in G gezeigt. Die Mn-Aufnahmemutante SLY8 (A) auf YPD mit 50 mM MES (pH 6,2) und 18 mM EGTA und (B) auf gleichem Medium mit 2 mM zusätzlichem MnSO4. Die Cu-Aufnahmemutante 64p (C) auf YPD mit 50 mM MES (pH 6,2) und 0,6 mM EDTA und (D) auf gleichem Medium mit 100 µM zusätzlichem CuSO4. Die Zn-Aufnahmemutante ZHY3 auf (E) YPD mit 50 mM MES (pH 6,2) und 0,7 mM EDTA und (F) auf gleichem Medium mit 150 µM zusätzlichem ZnSO4.
Abb. 22: Transkriptanalyse der LeIRT-Gene in Tomaten durch semiquantitative RT-PCR. Zwei Wochen alte Tomatenkeimlinge wurden sechs Tage lang in Hydrokultur mit und ohne Fe herangezogen und die RNA aus Wurzeln, Stengeln und Blättern wurde isoliert. Eine Pflanze wurde auf Fe-haltiger Nährlösung bis zur Blüte kultiviert bevor ihre Blüten-RNA isoliert wurde. 2 µg DNA-freie RNA aus den angegebenen Geweben wurden mit einem oligo(dT)-Primer revers transkribiert und anschließend wurden PCR-Reaktionen mit LeIRT1- oder LeIRT2-spezifischen sowie Actin-spezifischen Primern durchgeführt. Ein typisches Gel ist gezeigt (n=4).
Abb. 23: Southern-Blot-Analyse der LeIRT-Gene im Tomaten-Genom. (A) 30 µg genomische Tomaten-DNA wurden mit den genannten Enzymen gespalten, elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembran überführt. Die Filter wurden mit der 5‘-Sequenz (SalI-NcoI-Fragment) der LeIRT2-cDNA hybridisiert. (B): Analyse der 9 kb-Bande des BglII-Verdaus: 30 µg genomische DNA wurden mit BglII und den angegebenen Enzymen gespalten und wie in (A) hybridisiert.
Abb. 24: Intron/Exon-Grenzen der LeIRT-Gene. Die blau-gedruckten Sequenzen gehören zu Introns.
Abb. 25: Primer extension-Reaktionen zur Ermittlung des Transkriptionsstarts der LeIRT-Gene: Die Oligonucleotide IRT15r und IRT25r wurden mit 32P endmarkiert und in reverse Transkriptionsreaktionen mit Wurzel-RNA Fe-defizienter Tomaten eingesetzt (mittlere Spuren). Die gleichen Primer wurden für Sequenzreaktionen genomischer Klone von LeIRT1 (links) and LeIRT2 (rechts), verwendet. Putative Transkriptionsstartpunkte sind durch Kästen markiert.
Abb. 26: Karte der LeIRT-Gene: Exonsequenzen sind gelb, Introns blau dargestellt. Die Transkriptions(TK)-Startpunkte wurden durch Primer Extension gefunden, die Translations(TL)-Startpunkte sind die Startcodons der langen offenen Leserahmen. Einige Restriktionsschnittstellen sind aufgeführt. Die Pfeile geben die Leserichtung an.
Abb. 27: Induktion der Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii unter Eisenmangel. Die Zellen wurden auf TAP-Medium mit oder ohne Fe herangezogen. Nach vier Tagen wurde die Fe3+-Reduktaseaktivität gemessen.
Abb. 28: Abhängigkeit der Eisenchelat-Reduktionsaktivität von der Eisenkonzentration im Anzuchtmedium: Algen wurden zwei Tage lang mit den angegebenen Eisenkonzentrationen kultiviert. Die Reduktaseaktivität wurde nach 46 und 48 h gemessen (n = 2).
Abb. 29: Kinetik der Induktion der Eisenchelatreduktase unter Eisenmangel in Chlamydomonas reinhardtii: Die Algen wurden in TAP-Medium herangezogen, geerntet und in TAP-Medium mit und ohne Fe überführt. Die Reduktaseaktivität wurde alle 1,5 - 2 Stunden gemessen. Nach 24 Stunden wurde die eisengehungerte Kultur geteilt und eine Hälfte mit 10 µM FeCl3 rückgefüttert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes (von drei) sind angegeben.
Abb. 30: Die Fe3+-Chelat-Reduktaseaktivität von eisengehungerten und eisensuffizient gewachsenen Chlamydomonas reinhardtii-Zellen wurde bei Substratkonzentrationen von 4 bis 300 µM Fe-HEDTA gemessen. Mittelwerte von vier unabhängigen Messungen sind dargestellt. Die eingefügte Abbildung zeigt die doppelt-reziproke (Lineweaver-Burk)-Darstellung der Experimente mit den Fe-gehungerten Zellen. Der daraus ermittelte apparente Km-Wert beträgt 31,5 (± 2,3) µM FeHEDTA.
Abb. 31: Einfluß des pH-Wertes auf die Fe3+-Chelatreduktase in Chlamydomonas reinhardtii. Die Zellen wurden einen Tag lang ohne Fe herangezogen, bevor ihre Fe3+-Chelatreduktaseaktivität gemessen wurde (n = 2). Die Testpuffer enthielten 10 mM MES (pH 5 und 5,5), 10 mM HEPES (pH 6 und 6,35) oder 10 mM Tris (pH 6,5 - 8).
Abb. 32: Einfluß des Fe2+-spezifischen Chelators BPDS auf das Wachstum und die Fe3+-Chelatreduktaseaktivität eisengehungerter und eisensuffizienter Chlamydomonas reinhardtii-Zellen. Die Algen wurden zwei Tage lang mit und ohne Fe sowie mit und ohne Zusatz von 50 µM BPDS kultiviert. Ihre Fe3+-Chelatreduktaseaktivität wurde nach 17 und 27 Stunden gemessen. Die Mittelwerte von zwei Messungen sind gezeigt.
Abb. 33: Aufnahme radioaktiv markierten Eisens in Chlamydomonas reinhardtii. Exponentiell wachsende Algen wurden für 40 Stunden in TAP-Medium mit und ohne Eisen herangezogen, bevor die Aufnahme von 1 µM 59Fe-HEDTA gemessen wurde. Die Kontrollwerte auf Eis sind abgezogen. Mittelwerte und Standardabweichungen von drei Experimenten sind gezeigt.
Abb. 34: Einfluß divalenter Metallionen auf den Fe-Transport in Chlamydomonas reinhardtii. Eisengehungerte Zellen wurden zu Fe-Transportmessungen herangezogen. Dabei wurde 1 µM radioaktives Fe2+ in Gegenwart von Ascorbat als Substrat eingesetzt, und 100 µM der angegebenen Metallsalze wurden unmittelbar nach Substratzugabe zu den Zellen pipettiert (n = 3).
Abb. 35: Einfluß von Kupfer auf den Fe2+-Transport in eisengehungerte Chlamydomonas reinhardtii-Zellen. 1 µM radioaktiv markiertes Fe2+ wurde als Substrat angeboten und die angegebenen Kupferkonzentrationen wurden unmittelbar nach der Substratzugabe zu den Zellen pipettiert (n = 3).
Abb. 36: Einfluß der Fe- und der Cu-Ernährung auf den Fe-Transport von Chlamydomonas reinhardtii.
Abb. 37: Effekt von 20 µM CuSO4 auf die Sättigung des Fe2+-Transportes in Chlamydomonas reinhardtii. Die Algen wurden zwei Tage lang ohne Fe herangezogen, bevor ihre Fe-Transportaktivität gemessen wurde. Als Substrat wurde radioaktiv markiertes FeCl2 in Konzentrationen zwischen 0,3 und 200 µM in Gegenwart eines 16,7-fachen Überschusses an Ascorbat eingesetzt. Eine CuSO4-Lösung (+ Cu, Quadrate) oder Uptake-Puffer (- Cu, Kreise) wurde unmittelbar nach der Substratzugabe zu den Zellen pipettiert. Gezeigt sind Mittelwerte aus drei Experimenten. Ähnliche Effekte wurden auch bei 10 und 50 µM CuSO4 beobachtet.
Abb. 38: Modell der aus den Sequenzdaten abgeleiteten Membrantopologie der LeIRT-Proteine. Die blauen Säulen repräsentieren Transmembrandomänen. Die cytosolische, histidinreiche Domäne ist hellblau hervorgehoben. Rote Pfeilspitzen symbolisieren putative N-Glycosylierungsstellen. Die ZIP-Signatur-Sequenz ist in gelb angegeben und die hochkonservierten Histidinreste sind rot eingezeichnet.
Abb. 39: Karte der LeIRT-Gene. Die sequenzierten Bereiche sind blau markiert. Die ungefähren Positionen der Restriktionsschnittstellen sind Ergebnis der Southern-Blot-Analysen. Der grau gezeichnete Bereich des LeIRT2-Gens symbolisiert die Hybridisierungssonde der in Abb. 23 gezeigten Autoradiogramme.
Abb. 40: Phylogenetische Analyse einiger Mitglieder der ZIP-Genfamilie. ZIP-Proteine aus Säugern, Insekten, Hefen, Nematoden und Pflanzen wurden in der Datenbank gefunden. Sie wurden mit Hilfe des ClustalW-Programmes angeordnet, größere Lücken wurden aus dem Alignment entfernt und die phylogenetische Analyse wurde mit Hilfe der Phylip Programmgruppe durchgeführt. Nur die Sequenzen aus Pflanzen und Hefen sind berücksichtigt. Bei unbekannter Funktion der Proteine ist die Abkürzung der Spezies und die Accession-Nummer angegeben (at = Arabidopsis thaliana; ps = Pisum sativum; sp = Schizosaccharomyces pombe).
Abb. 41: Vergleich der Fe-Assimilation höherer Pflanzen mit dem hochaffinen Mechanismus in Hefe. Das durch die Fe3+-Chelatreduktasen bereitgestellte Fe2+ wird entweder direkt transportiert (höhere Pflanzen, „Strategie I“) oder durch das Fet3-Protein zu Fe3+ re-oxidiert und dann transportiert (Hefe).
Abb. 42: Modell der Fe-Assimilation in der Alge Chlamydomonas reinhardtii. Unter Fe-Mangel wird eine Fe3+-Chelatreduktase induziert, die das zum Transport benötigte Fe2+ bereitstellt. Dieses wird über mindestens zwei unterschiedliche Transportsysteme in die Zellen transportiert. Das hochaffine Transportsystem ist durch Kupferionen inhibierbar.

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Fri Oct 4 9:58:45 2002