Aus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin
und
aus der Abteilung für Parodontologie und Synoptische Zahnmedizin
Zentrum für Zahnmedizin der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae dentariae
(Dr. med. dent.)

Prevalence analysis of putative periodontal pathogens
in patients with aggressive periodontitis and healthy elderly.
A molecular study

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von Zahnärztin Lilian Edesi-Neuss

aus Tallinn, Estland

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. Dr. U. B. Göbel
2. Prof. Dr. Dr. J.-P. Bernimoulin
3. Prof. Dr. G. Krekeler

Datum der Promotion:21.11.05

Exzerpt

Marginale Parodontitis, die multikausale Erkrankung des Parodonts ist in erster Linie eine Infektionskrankheit, modifiziert durch Wirtsfaktoren und äußere Einflüße. Die als pathogene Mischflora bezeichnete Kombination kommensaler Mikroorganismen, die opportunistische Infektionen und damit Immunreaktionen auslösen können, spielt die primäre Rolle in der Ätiopathogenese der Parodontitis. In der Aufstellung des Studienziels wurden einzelne, vermutlich pathogene Bakterienarten (Tannerella forsythensis, Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium spp., Prevotella intermedia, Eikenella corrodens, Veillonella parvula und Capnocytophaga ochracea) auf Grund der Evidenz von früheren Studien ausgewählt, die eventuell als "Markerkeime" in der aggressiven Form der Parodontitis betrachtet werden können. Dazu wurde eine Kontrollgruppe (die Senioren) untersucht, die eine gesunde parodontale Flora besitzen. Die angewandte Nachweismethode basiert auf eubakterieller PCR-Amplifikation von 16S rDNA und darauffolgender dot-blot Hybridisierung mit spezifischen Oligonukleotidsonden. Die entsprechenden Sonden wurden hergestellt und evaluiert. Die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen einzelner Sonden folgte unter Einsatz von Positiv- und Negativkontrollen - PCR-Produkte von 42 gezüchteten Ziel- bzw. phylogenetisch nahliegenden Baktetrienstämmen. Für die epidemiologische Untersuchung wurde subgingivale Plaque von vier Parodontaltaschen und einer Kontrollstelle von 45 Patienten mit aggressiver Parodontitis, sowie an fünf Stellen von 21 Senioren entnommen. Die Prävalenz der einzelnen Bakterienarten wurde mit Hilfe des Chi-quadrat-Tests verglichen. Die Ergebnisse dieser Studie bewiesen die erfolgreiche Einsetzbarkeit der hergestellten Oligonukleotidsonden. Es konnte gezeigt werden, daß alle untersuchten Bakterien in beiden Gruppen vorkommen. Obgleich eine hohe interindividuelle Variabilität der Kolonisationsmuster zu beobachten war, konnten T. forsythensis, P. gingivalis und F. nucleatum sehr häufig in den Parodontaltaschen nachgewiesen werden. Obwohl diese Arten auch an den gesunden Stellen der parodontal Erkrankten sowie der Senioren festzustellen waren, blieb die Häufigkeit dieser Besiedlung signifikant seltener.

A. actinomycetemcomitans konnte nur bei einzelnen Patienten mit aggressiver Parodontitis festgestellt werden. Die Ergebnisse für P. intermedia und E. corrodens ließen keine eindeutige Assoziation sowohl mit der aggressiven Parodontitis als auch mit dem gesunden Parodontalzustand zu. Bei Senioren wurde C. ochracea besonders häufig nachgewiesen. Zusammenfassend kann man die vermutlichen Parodontalpathogene wie T. forsythensis, P. gingivalis, F. nucleatum und C. rectus als Leitkeime aggressiver Parodontitis ansehen. Bezüglich der polymikrobiellen Natur der Parodontitis würde eine umfassende Untersuchung der oralen Mikroflora und deren Zusammenspiel mit den Wirtsfaktoren zur Aufklärung der Ätiopathogenese der Parodontitis eher beitragen als der Nachweis einzelner Arten.

Schlagwörter:

Eigene Schlagworte: Parodontalpathogene, aggressive Parodontitis, Oligonukleotidsonden, Dot-blot Hybridisierung, PCR-Amplifikation

Abstract

A multifactorial risk pattern of periodontitis has been recognized, where in addition to host and environmental factors a pathogenic microbiota plays a primary role. At present no definite answer can be given to the question of whether the expression of either aggressive etiological agents (implying infection with a virulent microbiota), or a high level of individual susceptibility to periodontal disease, or a specific combination of both is the conductive factor in the etiopathogenesis of aggressive periodontitis. The purpose of the current research was to analyze the prevalence of periodontitis-associated microorganisms in patients with aggressive periodontitis and periodontally healthy elders by using molecular-biologic detection methods like eubacterial PCR-amplification of 16S rDNA in combination with dot-blot hybridization. The oligonucleotide probes for the detection of Tannerella forsythensis, Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium spp., Prevotella intermedia, Eikenella corrodens, Veillonella parvula and Capnocytophaga ochracea were designed and evaluated. The PCR products of 42 cultivated target and closely related bacteria were obtained for the optimization of hybridization conditions. For the epidemiological study subgingival plaque was sampled from four pockets and one healthy site of 45 aggressive periodontitis patients as well as from five sites of 21 elderly. The differences in the prevalence of bacterial species was analyzed by chi-square test. The results of the study confirmed the reliability of the oligonucleotide probes in a specific and sensitive detection of the respective oral species. The data of the epidemiological study revealed frequent colonization by T. forsythensis, P. gingivalis, F. nucleatum and C. rectus in patients with aggressive periodontitis, however individual variations were obvious. These microorganisms could be predominantly identified in periodontal pockets, but were significantly less common in the healthy sites of the periodontitis patients and in the elderly subjects. A. actinomycetemcomitans could be detected in only a few patients, reducing its suspected importance in the etiopathogenesis of aggressive periodontitis. No direct association for P. intermedia and E. corrodens with aggressive periodontitis or periodontal health could be seen. C. ochracea was highly prevalent in the well-maintained elderly, being rarely found in the diseased group. The putative pathogens T. forsythensis, P. gingivalis, F. nucleatum and C. rectus can be conclusively suggested as the key-bacteria in patients with aggressive periodontitis. However, considering that periodontitis is a polymicrobial infection, the screening of the microbial population, rather than the isolation of single members of the subgingival flora, should give a more comprehensive perspective in etiopathogenetic research of periodontitis.

Keywords:

Keywords: periodontal pathogens, 16S rRNA, oligonucleotide probes, dot-blot hybridization, aggressive periodontitis, PCR-amplification

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20.09.2006