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2  Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

Verwendet wurden 48 weibliche C57/BL6 Mäuse, die von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen worden waren. Das Alter der Mäuse betrug zu Beginn des Experiments 10 Wochen.

2.2 Versuchsaufbau und –bedingungen

2.2.1 Allgemeine Tierhaltungsbedingungen

Alle Mäuse waren für die gesamte Dauer des Experiments im selben Raum untergebracht und bekamen Wasser und Nahrung ad libitum. Der Raum war abgedunkelt, die Hellphase mit künstlicher Beleuchtung währte von 6-18 Uhr, die Dunkelphase von 18-6 Uhr. Die Tierkäfige wurden wöchentlich mit Haushaltsreiniger und klarem Wasser gesäubert und der Streu ausgetauscht.

2.2.2 Experimentelles Design

Zu Beginn des Experiments (Tag 1) wurden die Mäuse zufällig einer der verschiedenen Haltungsbedingungen zugeteilt: je 16 wurden den drei experimentellen Bedingungen (siehe 2.3.3 ff.) ausgesetzt. 8 Mäuse jeder Gruppe lebten 40 Tage unter den jeweiligen Bedingungen und wurden am 41.Tag getötet, 8 Mäuse wurden nach 68 tägiger Exposition am 69. Tag perfundiert. Alle Mäuse erhielten BrdU einmal täglich von Tag 31 bis Tag 40.


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2.2.3  Bedingungen einer reizreichen Lebensumwelt (ENR)

Alle 16 ENR Mäuse wurden in einem relativ geräumigen, eigens angefertigten Tierkäfig mit einer Grundfläche von 80 cm x 80 cm (Werkstatt des MDC, Hr. Kagelmaker, MDC) gemeinsam gehalten (Kempermann, Kuhn, and Gage, 1997). Kunststoffröhren wurden nach gründlicher Reinigung zu einem Tunnelsystem in drei Dimensionen zusammengefügt und zum Verbleib im Tierkäfig plaziert. Die räumliche Konfiguration des Systems wurde 2-3 mal wöchentlich durch Umstecken der Kunststoffröhren nach deren Säuberung variiert. Metallbestandteile eines gewöhnlichen Tierkafigs bzw. eines Laufradkäfigs wurden so in den ENR-Tierkäfig eingebracht, das die Mäuse sie zum Klettern verwenden konnten. Handelsübliche Papierhandtücher, die die Tiere zum Nestbau benutzten, wurden 2-3 mal wöchentlich in den ENR-Käfig gelegt und die alten entfernt. Die Mäuse reagierten auf die Umgestaltung im allgemeinen für eine kurze Zeitdauer mit einer deutlichen Steigerung ihrer explorativen Aktivität, während sie sich in der Zwischenzeit der Hellphasen vor allem in Nestern und im Tunnelsystem aufhielten. Die Pflege und Ernährung der ENR Mäuse unterschied sich nicht von der der anderen Gruppen.

2.2.4 Standardlaborbedingungen (CTR)

Die 16 CTR Mäuse waren jeweils zu viert in Standardtierkäfigen, die nur Streu und den üblichen Träger für Futter und Wasser enthielten, untergebracht. Die Gruppenzusammensetzung wurde konstant gehalten, es fand kein Austauch zwischen den vier CTR-Tierkäfigen statt.

2.2.5 Bedingungen körperlicher Aktivität (RUN)

RUN-Mäuse lebten von Tag 1 bis Tag 30 unter den gleichen Bedingungen wie CTR-Mäuse. Am Tag 31 wurden die RUN-Tierkäfige mit je einem Laufrad ausgestattet, die bis zur Tötung der Mäuse (Tag 41 bzw. 69) dort belassen wurden. RUN-Mäuse hatten während dieser Zeit unbegrenzten Zugang zum Laufrad, von dem sie heftig, vor allem während der Dunkelphase, Gebrauch machten.


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Abb. 1: Bedingungen einer reizreichen Lebensumgebung (Enriched Environment, ENR)

Abb. 2: Bedingungen einer reizreichen Lebensumgebung (Enriched Environment, ENR)


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Abb. 3: Standardlaborbedingungen (Kontrollbedingungen, CTR)

Abb. 4: Bedingungen körperlicher Aktivität (RUN)


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2.2.6  BrdU

2.2.6.1 Allgemeines

2-Bromo-5-desoxyuridin (=BrdU, Sigma, Deisenhofen), ein Analogon des Thymidin, wird während der S-Phase des Zellzyklus in die zelluläre DNA integriert. BrdU kann mit Antikörpern immunhistochemisch im Zellkern nachgewiesen werden. Da BrdU eine kurze Bioverfügbarkeit hat, kann retrospektiv die Aussage gemacht werden, daß sich eine Zelle, die BrdU enthält, zu dem Zeitpunkt als BrdU exogen appliziert worden war, geteilt haben muß (Kuhn et al., 1996; Nowakowski et al., 1989).

2.2.6.2 Dosierung

Zur Untersuchung adulter Neurogenese im Gyrus dentatus hippocampi wurden zunächst Dosen von 50µg BrdU/g Körpergewicht, 7-12 mal an aufeinanderfolgenden Tagen injiziert, verwendet. Cameron und McKay schlugen 2001 vor, dass diese Dosis zu niedrig sei, um alle sich teilenden Zellen im erwachsenen Gyrus dentatus der Ratte zu markieren, und man dieses Phänomen mit der niedrigen Dosierung folglich quantitativ unterschätze (Cameron and McKay, 2001). Nach einer einmaligen Injektion von 250 µg BrdU/g KG konnten sie ohne toxische Effekte zu beobachten mehr hippokampale, BrdU positive Zellen finden, als nach mehrfacher Injektion von 50 µg/g KG.

Um die günstigere Dosierung unter unseren Bedingungen zu finden, wurde dem Experiment eine Dosisstudie vorgeschaltet.

Dabei wurde die Anzahl BrdU positiver Zellen in der Granulär- (GZ) und der Subgranulärzone (SGZ) des rechten Hippokampus von 30 C57/BL6 Mäusen untersucht. Je 6 Mäuse erhielten entweder 50 µg BrdU/g KG 1 oder 5 mal oder 250µg BrdU/g KG 1 oder 5 mal. Die Hälfte jeder Gruppe wurde ein Tag nach der (letzten) BrdU-Injektion , die andere Hälfte 4 Wochen nach der (letzten) BrdU-Injektion getötet. Um mögliche Interferenzen von RUN mit der Dosisabhängigkeit der Anzahl BrdU positiver Zellen zu erkennen, wurden Hoch- und Niedrigdosis (einmalige Applikation) bei RUN Mäusen verglichen. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen, dass nach mehrfacher Gabe der Niedrigdosis (50 µg BrdU/g KG) sowohl 1 Tag als auch 4 Wochen nach der (letzten) BrdU-[Seite 24↓]Injektion deutlich mehr (Unterschiede signifikant) BrdU positive Zellen in der GZ und SGZ detektierbar sind als nach einmaliger Gabe der Hochdosis (250 µg BrdU/g KG).

Tab. 1: Anzahl BrdU+ Zellen in der GZ und SGZ des eines Hippokampus 1 Tag nach der (letzten) BrdU-Injektion.

Gruppe

1 Injektion

5 Injektionen

RUN, 1 Injektion

Hochdosis

(250µg/g KG)

804

1290

906

1896

1554

2706

972

1068

1242

Niedrigdosis

(250µg/g KG)

1008

1452

--

3384

3246

2880

1302

1260

--

Tab. 2: Anzahl BrdU+ Zellen in der GZ und SGZ eines Hippokampus 28 Tage nach der (letzten) BrdU-Injektion.

Gruppe

1 Injektion

5 Injektionen

Hochdosis

(250µg/g KG)

336

210

66

492

630

534

Niedrigdosis

(250µg/g KG)

204

192

144

624

732

684

Deswegen entschieden wir uns für die Verwendung des Protokolls der multiplen Injektionen der niedrigen Dosis, mit dem man offensichtlich unter unseren Bedingungen effizienter proliferierende Zellen detektieren kann. Zwar reduzieren die mehrfachen täglichen BrdU-Injektionen die zeitliche Auflösung und erschweren die Beurteilbarkeit der Entwicklung BrdU+ Zellen, da man immer BrdU+ Zellen verschiedenen Alters untersucht. Doch erschien es für die Beurteilung insbesondere kortikaler Zellproliferation unerlässlich, ein Injektionsprotkoll zu verwenden, dass möglichst viele BrdU+ Zellen zur Darstellung bringt, da verlässliche Aussagen über kortikale Zellproliferation und –neubildung aufgrund einer zu geringen Anzahl BrdU+ kortikaler Zellen sonst möglicherweise nicht zu machen gewesen wären.


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2.2.6.3  Applikation

BrdU wurde bei -20°C gelagert und am Morgen der Injektion frisch in 0,9% NaCl Lösung gelöst (Konzentration: 20 mg BrdU/ml). Jede Maus wurde gewogen und dann das Injektionsvolumen errechnet. Die BrdU-Lösung wurde konstant gegen 10 Uhr morgens in die Peritonealhöhle der Mäuse injiziert. Die korrekte Plazierung der Kanülenspitze wurde durch Aspiration vor dem Spritzen geprüft.

2.3 Gewebepräparation

2.3.1 Narkose

Die Mäuse wurden durch Perfusion in tiefer Narkose nach einer intraperitoneal applizierten Überdosis des Injektionsnarkotikums Ketamin getötet.

2.3.2 Perfusion

Zur Beseitigung des in zentralnervösen Gefäßen befindlichen Blutes (stört bei der Fluoreszenzmikroskopie) und Fixation des Gewebes wurde der große Kreislauf der Mäuse mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in kaltem 0,1M Phosphatpuffer gespült.

Dazu wurden die Mäuse zunächst sternotomiert und der linke Ventrikel des Herzens mit einer Kanüle punktiert. Über ein angehängtes Infusionsbesteck wurden mit Hilfe einer Pumpe zunächst physiologische Kochsalzlösung und dann 100ml der Paraformaldehydlösung durch den Kreislauf gespült.

2.3.3 Extraktion des Gehirns

Im Anschluß an die Perfusion wurden die Mäuse dekapitiert. Der Schädelknochen wurde durchschnitten und das komplette Gehirn aus der Schädelhöhle gehoben.


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2.3.4  Postfixation, Sucrose

Die Gehirne wurden bei 4°C für 24 Std. in 4% Paraformaldehyd in 0,1M Phosphatpuffer fixiert. Anschließend wurden die Hirne in eine 30% Sucrose-Lösung überführt, um dem Gewebe osmotisch Wasser zu entziehen und eine weitgehende Zerstörung der Zellen beim Einfrieren zu verhindern (Inkubation für 72 Std. bei 4°C).

2.3.5 Anfertigung von Schnittserien der Gehirne

Durch einen medianen Sagittalschnitt wurden zunächst die rechte und linke Großhirnhemisphäre getrennt. Auf einem mit Trockeneis gekühlten Kupferblock wurden an einem Schlittenmikrotom (Leica) von der rechten Hemisphäre eine horizontale, von der linken eine koronare Schnittserie erstellt. Die Schnittdicke betrug 40µm.

2.3.6 Lagerung der Hirnschnitte

Die Schnitte wurden bis zur Weiterverwendung bei -20°C in einer Kälteschutzlösung mit 25% Glycerin und 25% Ethylenglykol in Phosphat- puffer (v/v) gelagert.

2.4 Immunhistochemie

2.4.1 Vorbehandlung

Zunächst wurden die Schnitte für zweimal 5 Minuten in TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gewaschen. Die immunhistochemische Detektion von BrdU erfordert eine Vorbehandlung, durch die die DNA denaturiert und eine Bindung zwischen anti-BrdU-Antikörpern und in die DNA integriertem BrdU ermöglicht wird. Dies kann durch dreißigminütige Inkubation des Gewebes bei 37°C in 2N HCl erreicht werden. Es folgten zwei Waschschritte, erst ein zehnminütiger in 0,1M Boratpuffer (pH 8,5, Raumtemperatur), dann ein sechzigminütiger in TBS, das etwa alle 5 Minuten ausgetauscht wurde.

2.4.2 Immunhistochemie

Um eine Bindung zwischen Antikörpern und intrazellulär lokalisierten Antigenen zu ermöglichen, müssen trennende lipophile Membranen zerstört werden, wozu Detergenzien wie Triton X-100 Verwendung finden.


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Um unspezifische Antikörperbindungen abzusättigen und damit den unspezifischen Hintergrund einer immunhistochemischen Färbung zu reduzieren, kann das Gewebe mit Serum der Spezies, aus der der Sekundärantikörper gewonnen wurde, hier vom Esel, vorbehandelt werden. Aus diesen Gründen ging der Antikörperinkubation eine 30minütige Inkubation des Gewebes in TBS-plus (bestehend aus 96 vol% TBS, 1 vol% Triton X-100 10% und 3 vol% Eselserum) voraus.

Zur Antigendetektion wurden spezifische Antikörper gegen die weiter unten (2.4.3) beschriebenen Antigene (Primärantikörper) verwendet. Die Antikörper wurden in TBS-plus verdünnt und das Gewebe wurde in dieser Lösung bei 4°C für 48 Std. unter ständigem Schütteln inkubiert.

Um eine Visualisierung der Antigen-Primärantikörper-Komplexe zu ermöglichen, wurden diese mit Antikörpern, die an verschiedene Fluoreszenzmoleküle gekoppelt sind und das Fc-Fragment der Primärantikörper erkennen, markiert. Durch diesen Schritt erfolgt außerdem eine Potenzierung der Anzahl der Antikörper, die direkt oder indirekt in Verbindung mit dem Antigen stehen (im Gegensatz zur Verwendung markierter Primärantikörper) und damit eine Verstärkung des Signals.

Nach der Auswaschung nicht spezifisch gebundener Primärantikörper mit TBS (2-mal 15 Minuten) und der Absättigung unspezischer Bindungsplätze mit TBS-plus (30 Minuten Inkubation), wurde das Gewebe in Sekundärantikörper-TBS-plus-Lösung überführt. Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur für 4 Stunden. Nicht spezifisch gebundene Sekundärantikörper wurden mit TBS ausgewaschen (8-mal 5 Minuten). Das Gewebe wurde in 0,1M Phosphatpuffer überführt, auf beschichtete Objektträger aufgezogen und luftgetrocknet. Um ein frühzeitiges Ausbleichen der Fluoreszenzmoleküle zu verhindern wurden die Schnitte auf dem Objektträger mit PVA-DABCO (10% Polyvinlyalkohol und 25% Glycerin in TBS mit 2,5% Diazabicyclo-Oktan) überschichtet, abschließend mit einem Deckglas versehen.

2.4.3 Antikörper

Alle Antikörper wurden in TBS-plus verdünnt verwendet.


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2.4.3.1  Primärantikörper

Zur spezifischen Bindung von BrdU wurde ein monoklonaler Antikörper aus der Ratte in einer Verdünnung von 1:500 verwendet (Harlan Seralab, Leicestershire, England).

NeuN (Neuronal Nuclei) ist ein neuronales Protein in nukleärer Lokalisation und gilt als spezifischer Marker reifer Nervenzellen (Mullen et al., 1992). Es wurde ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen NeuN (Chemicon, Hofheim, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:100 benutzt.

S100ß, ein Calcium-bindendes Protein mit trophischen Eigenschaften, gilt als Marker für einen astrozytären Phänotyp (Ghandour et al., 1981). Es wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen S100ß der Firma Swant (Bellinzona, Schweiz) verwendet.

Der polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen Iba1 - ein mikrogliales Calcium-bindendes Adapterprotein (Ito et al., 1998) - wurde uns großzügigerweise von Dr. Y. Imai und Dr. S. Kohsaka (beide National Institute of Neuroscience, Tokyo, Japan) zur Verfügung gestellt. Er wurde in einer Verdünnung von 1:70 verwendet.

CNP ist eine Phosphodiesterase und gilt als Marker für einen oligodendroglialen Phänotyp (Sheedlo and Sprinkle, 1983). Es wurde ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen CNP in einer Verdünnung von 1:50 verwendet (Abcam, Cambridge, England).

Gegen NG2 wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper (Chemicon, Hofheim, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:250 verwendet. NG2 ist ein transmembranös lokalisiertes Proteoglykan und wird von glialen Zellen exprimiert, die in der Lage sind, Oligodendrozyten hervorzubringen (Nishiyama, 2001; Dawson et al., 2000; Stallcup, 1981).


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2.4.3.2  Sekundärantikörper

Die alle in einer Verdünnung von 1:250 verwendeten Sekundärantikörper wurden von Jackson Laboratories (Vertrieb: Dianova, Hamburg) bezogen. Benutzt wurden Antikörper aus dem Esel, die entweder gegen das Fc-Fragment von Antikörpern aus der Ratte, der Maus oder dem Kaninchen gerichtet und entweder mit FITC, Rhodamine-X oder CY-5 konjugiert sind.

2.5 Quantifizierung BrdU+ Zellen

Die Quantifizierung der BrdU positiven Zellen erfolgte an einer koronaren Schnittserie der linken Hemisphäre, die die gesamte fronto-okzipitale Ausdehnung der Hemisphäre umfasste. Das Gewebe war immunhistochemisch gegen BrdU und NeuN behandelt worden. Die Quantifizierung erfolgte an einem Leica DM-RXE Mikroskop, das mit dem halbautomatischen stereologischen Analysesystem Stereoinvestigator (MicroBrightfield, Magdeburg) ausgerüstet war.

Der Cortex wurde nach histoarchitektonischen Merkmalen in verschiedene Regionen unterteilt. Es wurden der frontale, cinguläre motorische, somatosensorische, insuläre und visuelle Cortex ausgewertet. Die genannten kortikalen Regionen wurden zur Datenerhebung weiter in bestimmte Schichten gegliedert.

Es wurden frontale Cortexgebiete, die den frontalen Assoziationscortex und den orbitalen Cortex umfassten, zum „frontalen Cortex“ zusammengefasst. Als subkortikaler Orientierungspunkt bei der Abgrenzung des frontalen Cortex nach okzipital hin diente die Körnerzellschicht des Bulbus olfactorius.

Der cinguläre Cortex wurde nach lateral hin vom motorischen Cortex durch eine Linie, die von der Mantelkante bis zum Cingulum reichte, abgegrenzt.

Der motorische Cortex unterschied sich vom lateral benachbart liegenden somatosensorischen Cortex durch die fehlende, prominente innere Körnerzellschicht (Schicht IV). Unter Verwendung desselben Kriteriums (prominente Schicht IV) konnte der somatosensorische Cortex nach lateral vom insulären Cortex differenzierte werden.

Der insuläre Cortex konnte nach lateral hin wiederum vom piriformen Cortex unterschieden werden. Als Abgrenzungskriterium diente dabei die prominente äußere Körnerzellschicht (Schicht II) des piriformen Cortex.


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Der visuelle Cortex konnte nach medial wie nach lateral durch seine besonders ausgeprägte innere Körnerzellschicht (Schicht IV) abgegrenzt werden. Zur okzipitalen Abgrenzung des somatosensorischen vom visuellen Cortex dienten einerseits subkortikale Orientierungspunkte, andererseits die Orientierung am Übergang cingulärer Cortex (rostral) in den retrosplenialen Cortex (okzipital).

Innerhalb der genannten Regionen wurden verschiedene Schicht unterschieden.

Bei kräftiger Ausprägung der inneren Körnerzellschicht (Schicht IV) konnten die Schichten II-VI gut in Schicht II/III, Schicht IV und Schichten V+VI differenziert werden (so wurde mit dem visuellen und somatosensorischen Cortex verfahren). In allen anderen erwähnten kortikalen Regionen wurden nur die Schicht I und die zusammengefassten Schichten II-VI getrennt betrachtet.

Als Hilfsmittel diente der Atlas des Gehirns der C57Bl/6-Maus der Mouse Brain Library (Rosen, Williams et al., 2000).

Die Anzahl BrdU positiver Zellen in den kortikalen Regionen und Schichten wurde durch Auszählen von 40 µm dicken Schnitten, die 240µm voneinander entfernt waren, bestimmt. Um die Zellzahl der kompletten Struktur zu erhalten, wurden diese Ergebnisse mit sechs multipliziert.

Das gleiche Vorgehen wurde auch auf den Gyrus dentatus des Hippokampus angewandt. Dabei sollte geprüft werden, ob die bekannten Effekte von ENR und RUN auf adulte hippokampale Zellproliferation und –überleben unter unseren Bedingungen replizierbar waren (interne Kontrolle der Wirkung von RUN und ENR auf das Gehirn).

Das Volumen der kortikalen Schichten und Regionen wurde aus den an den Schnitten gemessenen flächenhaften Ausdehnungen der einzelnen Regionen nach dem Cavalieri Prinzip mit Hilfe der StereoInvestigator-Software errechnet.

Angegeben wurde die Anzahl BrdU positiver Zellen in genannten kortikalen Strukturen sowie in allen ausgewerteten kortikalen Teilen zusammen, außerdem die Volumina der Strukturen und, aus beiden Werten errechnet, die Dichte BrdU positiver Zellen.


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Abb. 5: Koronarer Schnitt durch das Gehirn einer C57/BL6-Maus. Türkis umrandet: Frontaler Cortex (Schicht I und Schichten II-VI).

Abb. 6:Koronarer Schnitt durch das Gehirn einer C57/BL6-Maus. Gelb: cingulärer Cortex (Schicht I, Schichten II-VI), rot: motorischer Cortex (Schicht I und Schichten II-VI), schwarz: somatosensorischer Cortex (Schicht I, Schichten II/III, Schicht IV, Schichten V+VI), violett: insulärer Cortex (Schicht I, Schichten II-VI).


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Abb. 7: Koronarer Schnitt durch das Gehirn einer C57/BL6-Maus. Grün umrandet: Visueller Cortex (Schicht I und Schichten II/III, Schicht IV, Schichten V+VI).

2.6 Phänotypisierung BrdU+ Zellen

Um die Phänotypen BrdU+ Zellen zu bestimmen, wurden Gewebeschnitte verwendet, die immunhistochemisch gegen BrdU und verschiedene andere Antigene (vgl. Kapitel 2.4.3), deren spezifische Expression durch bestimmte Zelltypen bekannt ist, behandelt worden waren. Durch Bestimmung der Kolokalisation von BrdU-Immunreaktivität und Immunreaktivität gegen andere Antigene konnte der Immunphänotyp BrdU+ Zellen determiniert werde. Dies ist in der Regel mit konventioneller Mikroskopie nicht möglich, da die fokussierte Ebene zu dick ist, um eine Zuordnung optischer Signale zu einer Zelle zu erlauben. Abhilfe schafft hier die konfokale Mikroskopie, mit der eine Untersuchung optischer Schnitte bis zu einer Dicke von nur einem µm möglich ist. Die konfokale Mikroskopie wurde an einem spektralen Leica TCS-SP2 durchgeführt.

Aufgrund der Integration von BrdU in die DNA ist die BrdU-Immunreaktivität nukleär lokalisiert. Um eine mögliche, durch Phagozytose bedingte lysosomale Lokalisation von BrdU in Mikrogliazellen auszuschließen, wurde die [Seite 33↓]Kolokalisation von BrdU mit dem nukleären Marker TO-PRO-3 (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) gezeigt (siehe Abb.8). Die Feststellung der Kolokalisation von BrdU mit anderen Antigenen ist bei ebenfalls nukleärer Lokalisation (dies trifft für NeuN, S100ß und Iba1 zu) einfacher. Bei nicht nukleärer Lokalisation des Antigens (CNP, NG2) ist die Feststellung einer Kolokalisation mit nukleärer BrdU-Immunreaktivität aufwendiger.

2.6.1 Quantitative Phänotypisierung

Zur Phänotypisierung BrdU positiver Zellen wurden koronare Schnittserien der linken Hemisphäre verwendet, deren Schnitte 40 µm dick und 480µm voneinander entfernt waren und die gesamte fronto-okzipitale Ausdehnung der Hemisphäre umfassten. Eine erste Schnittserie wurde immunhistochemisch gegen BrdU, NeuN und S100ß, eine zweite gegen BrdU, NeuN und Iba1, eine dritte gegen BrdU, S100ß und CNP und eine vierte gegen BrdU, NeuN und NG2 behandelt. In die quantitative Phänotypisierung wurden nur die kortikalen Regionen und Schichten eingeschlossen, die signifikante Unterschiede zwischen ENR, RUN und CTR auf Ebene der Anzahl oder Dichte BrdU positiver Zellen hatten erkennen lassen. Fünfzig zufällig ausgewählte und über die gesamte Struktur verteilte, BrdU positive Zellen pro kortikaler Region bzw. Schicht wurden mittels konfokaler Mikroskopie auf Kolokalisation mit anderen immunhistochemischen Markern (NeuN, S100ß, CNP, Iba1, NG2) untersucht. Der Anteil doppelt positiver (z.B. BrdU und S100ß) an allen BrdU positiven Zellen pro Struktur wurde angegeben. Durch Multiplikation mit der absoluten Zahl der BrdU positiven Zellen pro Struktur wurde die absolute Zahl BrdU positiver Zellen mit einem bestimmten Phänotyp erhalten.

2.6.2 Qualitative Phänotypisierung

Zur Beantwortung der Frage, ob im Cortex neugebildete, BrdU-positive Nervenzellen zu finden sind, wurden auch die nicht in die oben beschriebene quantitative Phänotypisierung eingeschlossenen kortikalen Strukturen qualitativ durch ein Screening über den gesamten Cortex hinweg miterfasst. Dabei wurden tausende zufällig ausgewählte und über den gesamten Cortex verteilter, BrdU positive Zellen in den Gehirnen sowohl von ENR-, CTR-, als [Seite 34↓]auch RUN-Mäusen auf Kolokalisation mit NeuN untersucht. Das gleiche Verfahren wurde in geringerem Umfang (mehrere hundert Zellen) für S100ß, Iba1, CNP und NG2 durchgeführt.

2.7 Statistik

Die Statistische Auswertung wurde mit SPSS Version 11.0 und mit Statview 4.5.1. für Macintosh durchgeführt. Für alle Vergleiche wurde ANOVA und, wo nach dem Ergebniss der ANOVA zulässig, Fisher Posthoc-Tests verwendet.

2.8 Methodenkritik

2.8.1 Präparations- und Abgrenzungsprobleme

Die Abgrenzung frontaler Cortexgebiete rostral vom motorischen Cortex okzipital auf der Basis histoarchitektonischer Merkmale war problematisch. Daher dienten in diesem Fall vor allem subkortikale Strukturen (Körnerzellschicht des Bulbus olfactorius) der Orientierung. Bei nicht exakt koronarer Schnittführung kann es mit diesem Verfahren allerdings zu Fehlbeurteilungen kommen. Diese fallen wegen des ohnehin relativ geringen Volumens des frontalen Cortex vergleichsweise stark ins Gewicht. Wohl darauf ist die relativ starke Schwankung des Volumens des frontalen Cortex (siehe Kapitel 3.2.1.1.1, 3.2.2.1.1, 3.2.2.2.1) zurückzuführen.

Ähnliche Schwierigkeiten traten bei der Abgrenzung des visuellen Cortex nach rostral hin auf. Hier half ebenfalls die Orientierung an subkortikalen Strukturen (Körnerzellschicht des Gyrus dentatus). Wegen des Schnittverfahrens blieb der visuelle Cortex nicht komplett erhalten, so dass die am weitesten okzipital gelegenen Gebiete nicht mit in die Auswertung eingingen. Der Anteil am gesamten visuellen Cortex war jedoch gering.

Aufgrund des relativ geringen Volumens des insulären Cortex fielen Inkonsistenzen bei dessen Abgrenzung von benachbarten kortikalen Bereichen hier auch vergleichsweise stark ins Gewicht, was an einer relativ hohen Variabilität des Volumens erkennbar ist.


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2.8.2  BrdU als Proliferationsmarker

BrdU-Immunreaktivität zeigt stattgefundene DNA-Synthese an. DNA-Synthese findet nicht nur in der S-Phase vor einer Zellteilung statt, sondern auch im Rahmen normaler DNA-Umsatzprozesse (DNA-Reparatur). Auch degenerierende Zellen können abortive DNA-Synthese ohne Zellteilung zeigen. Wie an Hepatozyten gezeigt wurde, kann DNA-Synthese auch Ausdruck einer Anpassung an einen höheren metabolischen Bedarf sein (Rakic, 2002).

Deswegen ist der Einwand erhoben worden, daß der Nachweis von BrdU-Immunreaktivität nicht ausreichend valide sei, stattgefundene Zellteilung nachzuweisen.

Es ist allerdings mit einer ganzen Reihe anderer Nachweismethoden von Zellteilung (Mitosefiguren, retrovirale Markierungen, immunhistochemischer Nachweis zellzykusassoziierter Proteine) in der SVZ und im Hippokampus demonstriert worden, daß BrdU+ Zellen auch andere Zeichen ablaufender oder stattgefundener Zellteilung zeigen. Weiterhin war keine Kolokalisation von BrdU- und TUNEL-Immunreaktivität (Nachweis apoptoseassoziieter Caspasen) zu finden. Auch konnte gezeigt werden, daß Bestrahlung von Zellen, die die Induktion von DNA-Reparatur zur Folge hat, unter Verfügbarkeit von BrdU nicht zu einer Zunahme der Anzahl BrdU-inkorporierender Zellen führt.

Es existieren also starke Hinweise darauf, daß zumindest die Masse der BrdU+ Zellen BrdU zellteilungsassoziiert und nicht etwa im Rahmen von DNA-Reparatur oder abortiver DNA-Synthese bei Degeneration aquiriert, und somit BrdU ein geeigneter Marker zur Untersuchung von Zellproliferation ist (Cooper-Kuhn and Kuhn, 2002).

2.8.3 Phänotypisierung

Die Phänotypisierung BrdU+ Zellen setzt voraus, dass die Kolokalisation der BrdU-Immunreaktivität mit der Immunreaktivität auf andere Antigene exakt festzustellen ist. Dies ist durch die Verwendung von Z-Schnittserien bei der konfokalen Mikroskopie, d.h. die Untersuchung der Kolokalisation von BrdU mit einem anderen Antigen auf vielen verschiedenen Ebenen durch eine Zelle, gut möglich.


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Allerdings waren die Fluoreszenzfärbungen gegen verschiedene Antigene von recht unterschiedlicher Qualität. So war der Kontrast zwischen spezifischer Färbung und unspezifischer Hintergrundfärbung bei Verwendung der Antikörper gegen Iba1, NeuN, S100ß sicherlich höher (und damit die Auswertung einfacher) als bei Verwendung der Antikörper gegen CNP und NG2.


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11.02.2005