[Seite 71↓]

4  Diskussion

4.1 Adult kortikal proliferierende Zellen

4.1.1 Adulte kortikale Gliogenese

Im erwachsenen Cortex der Maus neugebildete Zellen waren vor allem Gliazellen, allen voran S100ß exprimierende gliale Zellen.

Astrozyten

Die Expression von S100ß deutet auf einen astrozytären Phänotyp hin. Frühere, autoradiographische Untersuchungen, die lichtmikroskopisch durchgeführt wurden, wiesen bereits auf adulte kortikale Astrozytogenese im Nagerhirn hin (Kraus-Ruppert et al., 1973; Noetzel and Rox, 1964). Allerdings war die lichtmikroskopische Differenzierung der Neuroglia mit Unsicherheiten verbunden. Elektronenmikroskopische, autoradiographische Bestätigung adulter Astrozytogenese im visuellen Cortex der Ratte folgte (Kaplan and Hinds, 1980).

Was wird aus den neugebildeten kortikalen Astrozyten? Wie oben ausgeführt, schien die Anzahl S100ß+/BrdU+ Zellen tendenziell in den quantitativ phänotypisierten kortikalen Bereichen über 4 Wochen eher abzunehmen, wenn auch nicht signifikant.

In kortikalen Bereichen, deren BrdU+ Zellen nicht quantitativ phänotypisiert worden waren, die aber prima vista einen relativ hohen Anteil an S100ß+/BrdU+ Zellen hatten, konnte eine deutliche Abnahme der Anzahl BrdU+ Zellen über 4 Wochen beobachtet werden (z.B. visueller Cortex V+VI). Es ist anzunehmen, dass diese Abnahme der Anzahl BrdU+ Zellen im Zeitverlauf durch eine Abnahme der Anzahl S100ß+/BrdU+ Zellen zumindest mitbedingt war. Es spricht also manches dafür, dass nicht alle kortikalen S100ß+/BrdU+ Zellen persistierten.

Aus Studien am Rattenhirn ist bekannt, dass die Gesamtzahl der kortikalen Astrozyten über 27 Monate nach der Geburt relativ konstant bleibt (Vaughan and Peters, 1974; Ling and Leblond, 1973). Ähnliche Verhältnisse im cerebralen Cortex der Maus vorausgesetzt, ließe auf einen kontinuierlichen [Seite 72↓]astrozytären Zellverlust, der durch Neubildung von Astrozyten kompensiert wird, schließen. Tatsächlich deutete die erwähnte tendenzielle Abnahme der S100ß+/BrdU+ Zellen über 4 Wochen auf einen astrozytären Zellverlust hin, der zusammen mit der kontinuierlichen Neubildung von Astrozyten (durch Zellteilung, wie hier nachgewiesen, und/oder möglicherweise auch durch Differenzierung präformierter Vorläufer) zur Kompensation der astrozytären Gesamtzahl führen könnte.

Oligodendrozyten

Nicht quantifiziert wurde in dieser Studie die Anzahl der BrdU+ kortikalen Oligodendrozyten. Es wurden jedoch Schnittserien des cerebralen Cortex immunhistochemisch gegen den oligodendroglialen Marker CNP behandelt und qualitativ untersucht. Relativ wenige der kortikalen BrdU+ Zellen exprimierten CNP.

Dies steht scheinbar im Widerspruch zu einigen anderen Studien. Hommes und Leblond benutzten eine Silberfärbung nach Hortega, um ³H-Thymidin-markierte Oligodendrozyten zu identifizieren. Sie vermuteten einen großen Anteil an Oligodendrozyten unter den neugebildeten kortikalen Zellen (Hommes and Leblond, 1967). Kaplan und Hinds charakterisierten ³H-Thymidin-inkorporierende Zellen im visuellen Rattencortex elektronenmikroskopisch. Einige der markierten kortikalen Zellen schienen Oligodendrozyten zu sein (Kaplan and Hinds, 1980).

In diesen Untersuchungen wurden wohl zum Teil andere Zellpopulationen als in dieser Arbeit untersucht. Problematisch erscheint auch der Vergleich einer Phänotypisierung auf morphologischer Basis mit einer immunhistochemischen Phänotypisierung. Die Verwendung konfokaler Mikroskopie zur Phänotypisierung in dieser Arbeit bot natürlich ein höheres Maß an Sicherheit bei der Feststellung einer Kolokalisation verschiedener immunhistochemischer Marker als konventionelle mikroskopische Verfahren.

Aus dem Labor von James E. Goldman stammende Befunde wurden als Hinweise auf hauptsächlich stattfindende adulte kortikale Oligodendrozytogenese gewertet (Gensert and Goldman, 2001; Levison, Young, and Goldman, 1999). Allerdings unterschied sich das experimentelle Vorgehen grundsätzlich von dem hier beschriebenen. Es wurde eine in vivo mit [Seite 73↓]BrdU markierte Zellpopulation extrahiert und in vitro immunphänotypisch charakterisiert (Gensert and Goldman, 2001). Die von den hier beschriebenen Ergebnissen abweichenden Befunde könnten die Folge einer Selektion nur bestimmter BrdU+ Zellen oder eines anderen Verhaltens dieser Zellen in vitro sein. Levison et al. markierten sich in der perinatalen SVZ der Ratte teilende Zellen mit einem retroviralen Vektor und verfolgten das Verhalten der in den Cortex einwandernden markierten Zellen mittels in-vivo-Immunphänotypisierung (Levison and Goldman, 1999). Sie beschrieben eine Expansion oligodendroglialer und als prä-oligodendroglial gewerteter NG2+ Klone, während die Anzahl markierter Astrozyten im Zeitverlauf abnahm. Aus dieser Studie abgeleitete Aussagen können sich natürlich nur auf die perinatal in den Cortex einwandernden Zellpopulationen beziehen.

Die in der Literatur beschriebene Expansion der kortikalen oligodendroglialen Gesamtpopulation (Ling and Leblond, 1973) mit zunehmendem Lebensalter (Ratte) dürfte in Zusammenschau mit der hier beschriebenen (Maus) eher geringfügigen adulten kortikalen Oligodendrozytogenese am besten durch ein geringes Maß an Zellverlust bei langsamer Zellneubildung oder oligodendrogliale Neubildung aus präformierten kortikalen Vorläufern ohne Zellteilung zu erklären sein.

Mikroglia

Iba1+/BrdU+ Zellen zeigten die Morphologie ramifizierter Mikroglia und waren oft in Gruppen gelagert. Die Iba1+/BrdU+ Zellen (BrdU+ Mikroglia) fanden sich besonders häufig in Schicht I des cerebralen Cortex und stellten hier insbesondere bei RUN einen großen Anteil an allen BrdU+ Zellen. Geringer war der Anteil der Iba1+/BrdU+ Zellen (insbesondere unter CTR) an allen BrdU+ Zellen in tieferen kortikalen Schichten. Die nukleäre Lokalisation von BrdU bei Iba1+/BrdU+ Zellen wurde durch die Kolokalisation mit dem Kernmarker TO-PRO-3 bestätigt.

Hommes und Leblond beobachteten unter den von ihnen verwendeten Bedingungen sogar einen Anteil der Mikroglia von 31% an allen sich teilenden kortikalen Zelle der Ratte (Hommes and Leblond, 1967).

Unklar blieb, ob die neugebildeten Mikrogliazellen Abkömmlinge sich lokal teilender Vorläufer oder einwandernder Zellen hämatopoetischer Herkunft [Seite 74↓]waren. Sowohl eine lokale Proliferation (Eliason et al., 2002; Glenn et al., 1992; Lawson et al., 1992; Alliot et al., 1991) als auch eine Einwanderung aus dem Blut (Priller et al., 2001; Eglitis, 1997; Hickey et al., 1992; Lawson et al., 1992) wären denkbar. Die Beobachtung, dass kortikale Iba1+/BrdU+ Zellen sowohl 1 Tag als auch 4 Wochen nach BrdU häufig in Gruppen gelagert waren, sprach eher für lokale Zellteilung. Hommes und Leblond untersuchten sich teilende kortikale Zellen in stündlichem Abstand 1-12 Stunden nach Applikation des Proliferationsmarkers ³H-Thymidin (Hommes and Leblond, 1967). Aus Untersuchungen von Konigsmark und Sidman (Konigsmark and Sidman, 1963) war bekannt, dass erst 11- 12 Stunden nach der Gabe von ³H-Thymidin markierte Leukozyten im peripheren Blut auftauchen. Hommes und Leblond werteten den fehlenden Anstieg der markierten Mikroglia 12 Stunden nach ³H-Thymidin-Applikation und das Vorhandensein markierter Mikroglia in der Zeit davor als Hinweis auf lokale Neubildung von Mikroglia. Lawson et al. schätzten, dass lokale Proliferation und monozytäre Einwanderung aus dem Blut zu etwa gleichen Teilen zur Neubildung von Mikroglia im Gehirn beitragen (Lawson et al., 1992).

Der mikrogliale Zellumsatz im erwachsenen cerebralen Cortex stellt sich wie folgt dar: die Gesamtzahl kortikaler Mikroglia bleibt zumindest bei der Ratte über das Lebensalter von einem ¾ Monat bis zu fünf Monate weitgehend konstant (Ling and Leblond, 1973). Es werden durch Zellproliferation laufend neue Mikrogliazellen hinzugefügt (vgl. Kapitel 3, (Lawson et al., 1992)). Nach Schätzungen von Lawson et al. tragen die in-situ Proliferation und die Einwanderung von Monozyten aus dem Blut zu etwa gleichen Teilen zum steady-state bei. Es wäre daher zu erwarten, dass Mikroglia entsprechend kontinuierlich untergeht.


[Seite 75↓]

Gliale Vorläuferzellen

Ein beachtlicher Anteil der BrdU+ kortikalen Zellen exprimierte NG2. Dieser Befund ist in guter Übereinstimmung zu in der Literatur beschriebenen Daten. So fanden Jiang et al. bei über 50% der PCNA+ (Proliferating cell nuclear antigen+) Makroglia im Neocortex Koexpression von NG2 (Jiang et al., 1998). Reynolds und Hardy beschrieben die Koexpression von NG2 bei 74% aller kortikalen BrdU+ Zellen (Reynolds and Hardy, 1997). Die Überprüfung der Kolokalisation von NG2 und S100ß in BrdU+ kortikalen Zellen war leider nicht möglich, da beide Primärantikörper in der gleichen Spezies hergestellt worden waren. Eine Überlappung der NG2+/BrdU+ und der S100ß+/BrdU+ Zellpopulation, also die Existenz NG2+/S100ß+/BrdU+ kortikaler Zellen, wäre aber zu erwarten, da beide Zellpopulationen weit über 50% der gesamten BrdU+ Zellen ausmachen.

S100ß gilt gemeinhin als Marker eines astroglialen Phänotyps, während NG2 in Zusammenhang mit glialen, v.a. oligodendroglialen, Vorläufern gebracht wurde (Nishiyama, 2001; Levine et al., 2001; Dawson et al., 2000). Welche Zellpopulation in vivo durch die Expression von NG2 und S100ß gekennzeichnet sein könnte, ist nicht ganz klar. In der Literatur sind bipotente gliale Vorläuferzellen (O-2A-Vorläufer) beschrieben, die in vitro Oligodendrozyten und Typ-2-Astrozyten hervorbringen können sowie NG2 exprimieren (Lee et al., 2000; Ffrench-Constant and Raff, 1986). Erwähnt werden auch protoplasmatische Astrozyten, die in vivo NG2+ aber S100ß- sind (Levine and Card, 1987). Möglicherweise könnte es sich bei den NG2+S100ß+BrdU+ Zellen um ein in-vivo-Korrelat der O-2A-Vorläuferzellen handeln. Daraus würde folgen, dass zumindest ein Teil der kortikalen S100ß+/BrdU+ Zellen nicht etwa neugebildetetn reifen Astrozyten, sondern vielmehr unreifen glialen Vorläuferzellen, die in vitro verschiedene Gliazelltypen hervorbringen können, entsprechen würde. Es konnte gezeigt werden, dass NG2+ Zellen in vivo nur Oligodendrozyten hervorbringen.

Daß 4 Wochen nach den BrdU Injektionen immer noch ein sehr hoher Anteil der BrdU+ Zellen NG2+ ist, könnte bedeuten, daß kortikale NG2+/BrdU+ Vorläuferzellen nur sehr langsam oder überhaupt nicht differenzieren, oder daß NG2 auch von differenzierten Zellen exprimiert wird. Levison et al. (Levison et al., 1999) beschrieben die adulte Expansion kortikaler NG2+ Klone, die [Seite 76↓]nicht oligodendroglial differenzierten, sondern unreif blieben. In Zusammenschau mit dem Befund, dass sich im cerebralen Cortex nur wenige CNP+/BrdU+ Zellen finden ließen, deutet das Vorhandensein großer Mengen BrdU+ oligodendroglialer Vorläufer darauf hin, dass diese Zellen im cerebralen Cortex nur langsam oder teilweise gar nicht differenzieren.

Woher kommen adulte BrdU+ kortikale Zellen?

Lewis (Lewis, 1968) und Paterson (Paterson, 1983) deuteten die adulte subventrikuläre Zone (SVZ) als Reservoir für neugebildete Glia für das erwachsene Nagerhirn. Morshead und van der Kooy (Morshead and van der Kooy, 1992) behaupteten jedoch, daß in der SVZ adult neugebildete Zellen in der Regel sterben und nicht dem Zellumsatz im Cortex dienen. Levison et al. (Levison et al., 1999; Levison et al., 1993) zeigten, daß zwar Abkömmlinge von proliferierenden Zellen der SVZ perinatal in den Cortex auswandern, Migration im erwachsenen Hirn jedoch stärker begrenzt ist. Deswegen wurde vorgeschlagen, dass Zellneubildung im adulten Cortex eine Funktion lokaler kortikaler Zellteilung ist (Levison et al., 1999).

Zwei Stunden nach BrdU untersuchte Cortices (Daten nicht gezeigt) zeigten weit über den Cortex verteilte BrdU+ Zellen, die sehr häufig in Zweiergruppen gelagert waren, was für lokale kortikale Zellteilung spricht. Außerdem erbrachte der Vergleich der 1-Tag- und 4-Wochen-nach-BrdU-Werte keinen Hinweis auf intrazerebrale Migration BrdU+ Zellen.

Zusammenfassung

Sowohl makro- als auch mikrogliale Zellen scheinen im erwachsenen cerebralen Cortex der Maus einem ständigen Umsatz zu unterliegen. In dieser Arbeit wurde die Zellneubildung untersucht. Es konnte in Übereinstimmung mit vorausgegangenen Arbeiten gezeigt werden, dass es Zellen aller 3 klassischen Gliatypen (Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia) im adulten cerebralen Cortex gibt, die Immunreaktivität auf BrdU zeigen. Außerdem exprimierte eine große Zahl BrdU+ Zellen NG2. Dabei handelte es sich nach heute gängigen Vorstellungen um unreife Gliazellen. Wie sie sich genau in gliale Abstammungslinien einreihen lassen, ist nicht abschließend geklärt. In Zusammenschau mit in der Literatur beschriebenen Befunden ergibt sich [Seite 77↓]daraus das Bild einer ständigen Regeneration bzw. Ergänzung glialer Zellpopulationen im erwachsenen Cortex.

4.1.2 Adulte kortikale Neurogenese

Die Frage nach adult vorkommender kortikaler Neurogenese hat tiefgreifende Bedeutung für das Verständnis zellulärer Mechanismen höherer kognitiver Funktionen und wird hier deswegen ausführlich diskutiert.

Unter den hier beschriebenen Bedingungen konnte die Existenz adulter kortikaler Neurogenese nicht beobachtet werden. Eine fragwürdige Ausnahme waren schwach BrdU- und NeuN-immunreaktive Zellen, die sehr selten im frontalen Cortex gesehen wurden.

In dieser Studie wurden Neurone anhand der Expression von NeuN, einem in reifen Nervenzellen exprimierten Protein (Mullen et al., 1992), identifiziert. Hier wurde untersucht, ob es sich teilende kortikale Zellen oder sich teilende Zellen, die in den Cortex einwandern, gibt, die kurz- oder mittelfristig (innerhalb von 38 Tagen) NeuN exprimieren. Von tausenden analysierter BrdU+ Zellen über den gesamten cerebralen Cortex verteilt, zeigte keine BrdU+ Zellen eine zweifelsfreie Immunreaktivität auf NeuN. Daraus kann jedoch noch nicht zwingend geschlossen werden, dass es keine adulte kortikale Neubildung neuronaler Zellen gab. Schließlich ist nicht bekannt, wie sensitiv der immunhistochemische Nachweis von NeuN für die Detektion von Nervenzellen ist. Er gehört zur Zeit aber zu den verbreitetsten und weithin akzeptiertesten immunhistochemischen Nachweismethoden reifer neuronaler Zellen. Da NeuN erst spät im Differenzierungsverlauf exprimiert wird und wir keinen immunhistochemischen Marker unreifer Neurone verwendeten, wären unreife neuronale neugebildete Zellen im Cortex in dieser Studie nicht erkannt worden. Weil aber Gewebe auch zu einem späten Zeitpunkt nach den BrdU-Injektionen (38 Tage nach der ersten BrdU-Injektion) untersucht wurde, kann davon ausgegangen werden, dass potentiell proliferierende neuronale Vorläufer im Cortex Zeit zur Differenzierung gehabt hätten (sofern sie ausdifferenzierten) und dann über den immunhistochemischen Nachweis von NeuN detektierbar gewesen sein müssten.


[Seite 78↓]

Arseijevic et al. isolierten Zellen aus dem frontalen und temporalen menschlichen Cortex, die in vitro in der Lage waren, sich selbst zu vermehren und Astrozyten, Oligodendrozyten sowie neuronale Zellen hervorzubringen (Arsenijevic et al., 2001). Allerdings fanden sich unter den neuronalen Abkömmlingen keine Zellen, die NeuN exprimierten, sondern ausschließlich Zellen, die Immunreaktivität auf die unreifen neuronalen Marker ß-tubulin-III und MAP-2 (microtubule-associated protein-2) sowie NCAM (neural cell adhesion molecule) zeigten. Wie sich diese Zellen in vivo verhalten, wurde nicht untersucht. Möglicherweise sind sie in vivo nicht teilungsaktiv. Würden die von Arseijevic beschriebenen in vitro unreif neuronal differenzierenden Vorläufer in vivo teilen und auch nicht vollständig ausreifen, wären sie in dieser Studie nicht entdeckt worden.

In gewissem Widerspruch stehen die hier dargestellten Ergebnisse zu Berichten aus der Arbeitsgruppe um Elisabeth Gould. Gould et al. untersuchten kortikale Zellproliferation und –differenzierung bei Primaten (Makaken) und berichteten von kortikaler Neurogenese, die sich in großem Umfang in Assoziationscortices fand (Gould et al., 2001; Gould et al., 1999b). Für den Sulcus principalis bezifferten Gould et al. den Anteil der NeuN+/BrdU+ Zellen an allen BrdU+ Zellen beispielsweise mit 38 - 52% (Gould et al., 1999b). Ebenfalls berichtet wurde über kortikale Neurogenese bei Ratten (Gould et al., 2001), wenn hierzu auch keine Daten angegeben wurden. Die Möglichkeit, dass ein derart hohes Maß an kortikaler Neurogeneses in der hier dargestelleten Arbeit übersehen wurde, ist angesichts der großen Zahl analysierter BrdU+ Zellen nicht gegeben.

Gould et al. wiesen darauf hin, dass die kortikal neugebildeten Neurone transienter Natur seien und schon nach einigen Wochen überwiegend verschwunden wären (Gould et al., 2001). Jedenfalls müßten die hier gewählten Beobachtungszeitpunkte (1 Tag und 4 Wochen nach der letzten BrdU-Injektion) nach der von Gould et al. beschriebenen Kinetik kortikaler Neurogenese adäquat gewesen sein, adulte kortikale Neurogenese zu entdecken.

Erfahrungsgemäß war die Untersuchung BrdU+ Zellen auf Kolokalisation mit NeuN prima vista nicht immer einfach und zweifelsfrei möglich. So fanden sich relativ häufig NeuN+ Zellen mit scheinbar BrdU-immunreaktiven Kernen. [Seite 79↓]Die Anfertigung optischer Schnitte senkrecht zur z-Achse mittels konfokaler Mikroskopie zeigte dann aber oftmals, dass die BrdU-immunreaktiven Kerne zu benachbarten glialen Zellen (sogenannten Satellitenzellen) und nicht den Neuronen gehörten. Es wäre jedenfalls vorstellbar, dass man bei der Phänotypisierung BrdU+ Zellen eine falsch positive Kolokalisation mit NeuN feststellen könnte.

Die hier dargestellten Befunde befinden sich in guter Übereinstimmung mit anderen Studien, die ebenfalls über nicht beobachtete adulte kortikale Neurogenese sowohl bei Primaten als auch bei Nagern berichteten (Rakic, 2002; Kornack and Rakic, 2001; Magavi et al., 2000; Rakic, 1985).

4.2 Veränderungen kortikaler Zellneubildung unter freiwilliger körperlicher Aktivität

Es konnte gezeigt werden, dass RUN (1) kortikale Zellproliferation global betrachtet nicht beeinflusst, (2) hippokampale Neurogenese steigert und (3) die Anzahl BrdU+ Mikroglia in bestimmten kortikalen Gebieten (im cingulären Cortex Schicht I, im motorischen Cortex Schicht I, im visuellen Cortex Schicht I-III) gegenüber CTR erhöht, während (4) die Anzahl anderer BrdU+ Zelltypen nicht beeinflusst wurde. RUN hatte also einen zelltyp- und lokalisationsspezifischen Effekt auf kortikale Zellproliferation.

Die Lokalisationsspezifität der kortikalen Wirkung von RUN konnte aber nur bezogen auf die Gesamtzahl BrdU+ Zellen Gültigkeit erlangen. Die Wirkung auf BrdU+ Mikroglia kann nur in den phänotypisierten kortikalen Bereichen (cingulärer Cortex I, motorischer Cortex I, visueller Cortex II/III) beurteilt werden. Ob RUN auch zu einer Zunahme der Zahl BrdU+ Mikrogliazellen in anderen kortikalen Abschnitten führte, konnte mit den hier zur Verfügung stehenden Daten nicht beantwortet werden. Da der Vergleich der Anzahl BrdU+ Zellen zwischen RUN und CTR in den anderen kortikalen Abschnitten jedoch keinen signifikanten Unterschied erbrachte, müsste die mögliche Zunahme BrdU+ Mikroglia in diesen Bereichen mit einer Abnahme anderer Phänotyp(en) der BrdU+ Zellen einhergehen.

Die relative Zunahme BrdU+ Mikroglia unter RUN konnte schon 1 Tag nach der letzten BrdU- Injektion gezeigt werden, was darauf hindeutet, dass es sich [Seite 80↓]hierbei um eine relativ prompte, zumindest innerhalb von 11 Tagen induzierbare Veränderung handelte.

Morphologie Iba1+/BrdU+ Zellen

Iba1+/BrdU+ Zellen hatten sowohl bei RUN als auch bei CTR die Morphologie ruhender, ramifizierter Mikroglia. Morphologisch war kein Unterschied zwischen den Iba1+/BrdU+ Zellen in Tieren der RUN- und der CTR-Gruppe feststellbar. Dies zeigt an, dass die Mikrogliazellen bei beiden Experimentalgruppen offenbar nicht aktiviert waren bzw. sich bezüglich des Aktivierungsgrades nicht unterschieden.

Entwicklung Iba1+/BrdU+ Zellen

Gegenüber dem frühen Untersuchungszeitpunkt konnte 4 Wochen nach BrdU eine Zunahme BrdU+ Mikroglia sowohl bei RUN als auch bei CTR gezeigt werden. Die Iba1+/BrdU+ Zellen 4 Wochen nach BrdU unterschieden sich morphologisch nicht von denen 1 Tag nach BrdU

Herkunft Iba1+/BrdU+ Zellen

In der Literatur ist sowohl die Proliferationsfähigkeit hirnständiger Mikroglia (Eliason et al., 2002; Glenn et al., 1992; Lawson et al., 1992; Alliot et al., 1991), als auch eine ständige Einwanderung von Zellen hämatopoetischer Herkunft, die im ZNS mikroglial differenzieren (Priller et al., 2001; Eglitis and Mezey, 1997; Hickey et al., 1992; Lawson et al., 1992), beschrieben. Demzufolge könnte die Zunahme der Anzahl BrdU+ Mikroglia über 4 Wochen entweder durch eine anhaltende Proliferation markierter Mikroglia im Verlauf, eine fortgesetzte Einwanderung hämatopoetischer mikroglialer Vorläufer oder eine Kombination aus beidem begründet sein. Theoretisch möglich wäre auch eine Veränderung der Anzahl BrdU+ Mikroglia im Verlauf durch intrazerebrale Migration. Diese Deutung ist aufgrund der Datenlage allerdings eher unwahrscheinlich. Durch in Vorbereitung befindliche Experimente soll geklärt werden, welcher Anteil der BrdU+ Mikroglia auf aus dem Blut einwandernde Zellen und welcher auf lokal kortikal proliferierende Zellen zurückzuführen ist. Von Interesse ist dabei die Frage, ob die Zunahme neugebildeter Mikroglia unter RUN auf Einwanderung, lokale Proliferation [Seite 81↓]oder eine Kombination aus beidem zurückzuführen ist. In diesem Zusammenhang deuten die bekannte Monozytose unter körperlicher Belastung (Shephard and Shek, 1994; Pedersen, 1991; Tvede et al., 1989) und die Beeinflussung von Adhäsionsfunktionen durch körperliche Aktivität (Miles et al., 1998), die bei der Verteilung von Leukozyten zwischen Blut und Geweben eine Rolle spielen, auf mögliche zugrunde liegende Mechanismen einer verstärkten Einwanderung von Zellen hämatopoetischer Herkunft in periphere Gewebe unter körperlicher Belastung hin. Die Hypothese, dass der verstärkten kortikalen Mikrgliazellneubildung eine verstärkte Einwanderung von Zellen hämatopoetischer Abstammung zugrunde liegt, wird gestützt durch den Befund, dass körperliche Aktivität zu einer verstärkten Einwanderung von Monozyten in periphere entzündete Gewebe führte (Woods and Davis, 1994).

Mikrogliale Funktionen

Zur mikroglialen Funktion liegen zur Zeit vor allem Befunde vor, die die Bedeutung der Mikrogliazelle bei pathologischen Prozessen im ZNS, wie Inflammation, Ischämie, Trauma, Degeneration etc. hervorheben (Nakajima and Kohsaka, 2001; Gonzalez-Scarano and Baltuch, 1999; Gehrmann, 1996; Kreutzberg, 1996; Gehrmann et al., 1995; Kreutzberg, 1995; Davis et al., 1994; Gehrmann and Kreutzberg, 1994; Thomas, 1992; Graeber and Streit, 1990; Perry and Gordon, 1988).

Mikroglia stellt dabei einen zentralen Bestandteil und die erste Linie des Abwehrsystems innerhalb des ZNS dar und ist an wesentlichen regenerativen, aber auch destruktiven Funktionen beteiligt. Im nicht pathologisch veränderten Gehirn liegen mikrogliale Zellen in einer ruhenden Form vor, über deren funktionelle Bedeutung sehr wenig bekannt ist. Im Zuge eines adäquaten Reizes, wie beispielsweise einer zentralnervösen Infektion, kommt es zur mikroglialen Aktivierung. Diese Aktivierung umfasst verschiedene Komponenten, die auch abgestuft ausgelöst werden können. Dazu gehören mikrogliale Proliferation, Expression verschiedener Aktivierungsmarker (z.B. Komplementrezeptoren, MHC-II-Komplex) und schließlich die phagozytische Transformation.

Weitgehend unklar ist, welche Funktionen Mikroglia unter physiologischen Bedingungen in ihrer Ruheform wahrnimmt (oder ob die Ruheform keine [Seite 82↓]weitere Rolle spielt). Immerhin wissen wir, dass Mikroglia via Sekretion neurotropher Faktoren Einfluß auf die Funktion neuronaler Zellen nehmen kann (Fields and Stevens-Graham, 2002; Elkabes et al., 1996). Die Beeinflussbarkeit mikroglialer Zellneubildung im Cortex durch eine vollkommen physiologische Tätigkeit wie körperliche Aktivität, könnte vermuten lassen, dass dieser Zelltyp unter physiologischen Bedingungen möglicherweise eine größere Rolle spielt, als bisher angenommen wurde.

Welche Bedeutung hat die gesteigerte kortikale Neubildung von Mikroglia unter körperlicher Aktivität?

Hypothese 1: Die Zunahme mikroglialer kortikaler Neubildung mediiert kognitive Veränderungen unter gesteigerter körperlicher Aktivität.

Vielfach beschrieben sind die leistungssteigernden Effekte von körperlicher Aktivität auf bestimmte kognitive Funktionen (Cotman and Engesser-Cesar, 2002; Taylor et al., 1985). Wie erwähnt üben Mikrogliazellen via Sekretion neurotropher Faktoren supportive Funktionen aus (Fields and Stevens-Graham, 2002; Elkabes et al., 1996). Dies wäre ein möglicher Mechanismus, wie Mikroglia Einfluß auf die Funktion neuronaler Netzwerke nehmen könnte.

Auf der Suche nach substantiellen Korrelaten der auf Verhaltensebene nachgewiesenen Effekten von körperlicher Aktivität (Beeinflussung kognitiver Funktionen), könnte der hier beschriebene Effekt von RUN auf neue kortikale Mikrogliazellen zumindest ein Teilaspekt der die kognitive Leistungssteigerung mediierenden Mechanismen sein. Gegenwärtige Vorstellungen der substantiellen Grundlage von Verhaltensplastizität (zum Beispiel Lernen) beziehen sich vor allem auf synaptische Mechanismen. Die Entdeckung hippokampaler Neurogenese (Altman and Das, 1965b) und ihre Beeinflußbarkeit durch Zustände (reizreiche Umgebung und körperliche Aktivität) (van Praag et al., 1999; Kempermann et al., 1997), die starken Einfluß auf kognitive Funktionen zu nehmen vermögen, legten den Verdacht nahe, dass Prozesse adulter Zellneubildung als Kandidaten der funktionellen Plastizität zugrunde liegenden Mechanismen in Frage kommen. Tatsächlich gibt es einige Befunde, die eine Beteiligung hippokampaler Neurogenese bei Lernen und Gedächtnisbildung vorschlagen (Shors et al., 2001; Gould et al., [Seite 83↓]1999). Inwiefern kortikale Zellneubildungsvorgänge Bedeutung für die funktionelle Plastizität des Nervensystems haben, ist gegenwärtig schwer zu sagen und experimentell auch schwerer zu adressieren. Während in dieser Studie unter ENR eine geringere Beeinträchtigung zellulärer kortikaler Neogenese gesehen wurde, fallen die Veränderungen der mikroglialen kortikalen Zellneubildung unter RUN quantitativ stärker ins Gewicht.

Hypothese 2: Die verstärkte kortikale Mikrogliazellneubildung unter RUN ist Teil allgemeiner Veränderung der immunologischen Funktionslage unter gesteigerter körperlicher Aktivität.

Es ist gut belegt, dass körperliche Aktivität in Abhängigkeit von ihrem Ausmaß und dem individuellen Trainingsstand zum Teil ausgeprägten Einfluß auf das Immunsystem hat. Während moderater körperlicher Aktivität ein abwehrstärkender Effekt nachgesagt wird, hat ausgedehnte und/oder intensive physische Belastung Immunsupression zur Folge, so kommt es beispielsweise zu einer Erhöhung des Risikos an einem Infekt des oberen Respirationstraktes zu erkranken (Nieman, 2001). Epidemiologische Studien weisen auf eine Assoziation von gesteigerter körperlicher Aktivität und einer niedrigeren Prävalenz und Mortalität von verschiedenen bösartigen Tumoren hin (Hardman, 2001; McTiernan et al., 1998; Woods and Davis, 1994). Der zugrunde liegende Mechanismus ist jedoch unklar.

Jedenfalls beeinflusst körperliche Aktivität eine ganze Reihe messbarer immunologischer Parameter: so kommt es zur Alteration von Zytokinspiegeln (Espersen et al., 1990) und zu zellulären Veränderung im peripheren Blut. Oft beschrieben wird eine Leukozytose, die besonders durch einen Anstieg der Monozyten und neutrophilen Granulozyten bedingt ist (Shephard and Shek, 1994). Die Effekte auf die zellulären Komponenten des spezifischen Immunsystems im peripheren Blut hängen vom Ausmaß der körperlichen Belastung ab (Shephard and Shek, 1994). Sie variieren in der Literatur etwas, übereinstimmend wird jedoch eine Alteration von verschiedenen Lymphozytenpopulationen und der Immunglobulinspiegel berichtet (Boyum et al., 1996; Shephard and Shek, 1994; Pedersen, 1991; Espersen et al., 1990; Tvede et al., 1989). Im Zusammenhang mit dieser Studie besonders interessant sind Befunde, die einen verstärkten Influx von Monozyten unter körperlicher [Seite 84↓]Aktivität in entzündliches Gewebe beschreiben (Woods and Davis, 1994). Außerdem führt körperliche Aktivität zu einer Beeinträchtigung bestimmter Schritte des phagozytischen Prozesses (Ortega, 1994). Körperliche Aktivität hat Wirkungen auf leukozytäre Adhäsionsmoleküle (Gabriel and Kindermann, 1998; Gabriel et al., 1994) und könnte auf diese Weise Einfluß auf die Verteilung von Leukozyten im Organismus nehmen.

Als vermittelnde Mechanismen der immunologischen Effekte körperlicher Aktivität wurden neuroendokrine Veränderungen, vor allem eine Aktivierung des sympathischen Nervensystems, der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse und eine verstärkte Freisetzung von Neuropeptiden (z.B. endogener Opioide) diskutiert (Jonsdottir, 2000; Benschop et al., 1996; Weicker and Werle, 1991). Die Beeinflussung von Zytokin-Netzwerken durch körperliche Aktivität (Moldoveanu et al., 2001) könnte ebenso verschiedenste Effekte auf zelluläre Komponenten des Immunsystems vermitteln.

Zusammengefaßt geht körperliche Aktivität mit einer komplexen Wirkung auf verschiedene Komponenten des Immunsystems einher. In diesem Zusammenhang könnte es im Rahmen generalisierter leukozytärer Umverteilungsprozesse unter körperlicher Aktivität nicht nur zu einer verstärkten Einwanderung neugebildeter Monozyten in den cerebralen Cortex, sondern zusätzlich zu Effekten auf die Verteilungsverhältnisse im histiozytären System anderer Gewebe kommen.

Mögliche therapeutische Implikationen der verstärkten mikroglialen kortikalen Neubildung durch körperliche Aktivität

Die Blut-Hirn-Schranke stellt eine effiziente Barriere zwischen dem ZNS und dem Blut bzw. peripheren Geweben dar. Therapeutische Manipulationen (z.B. pharmakologische) am ZNS werden oft dadurch erschwert, daß verschiedene Substanzen über diese Barierre gebracht werden müssen.

Zellen, die in der Lage sind, über die intakte Blut-Hirn-Schranke ins ZNS einzuwandern (z.B. Monozyten), könnten als Transporteure therapeutischen Materials (z.B. bestimmter Gene) über die Blut-Hirn-Schranke verwendet werden.

Wenn körperliche Aktivität tatsächlich zu einer vermehrten Einwanderung hämatopoetischer Zellen über die intakte Blut-Hirn-Schranke führt, ließe sie [Seite 85↓]sich zur Verstärkung des zellulären Transportes therapeutischen Materials über die Blut-Hirn-Schranke einsetzen.

Weiterhin ist es von medizinischem Interesse die substantiellen Grundlagen der cerebral leistungssteigernden Effekte körperlicher Aktivität (Cotman and Engesser-Cesar, 2002; Taylor et al., 1985) zu erforschen, um mögliche Ansätze für therapeutische Manipulationen zu erhalten. Vielleicht stellt der hier beschriebene Effekt körperlicher Aktivität auf mikrogliale kortikale Neogenese zumindestens eine Komponente der die kognitive Leistungssteigerung vermittelnden substantiellen Grundlagen dar.

4.3 Veränderungen kortikaler Zellneubildung unter den Bedingungen reizreicher Lebensumgebung

Die im Ergebnisteil dargestellten Befunde sprechen dafür, dass RUN und ENR adulte kortikale Zellneubildung differentiell regulieren. Die beobachteten Effekte von ENR auf kortikale Zellproliferation und Zellneubildungen waren offensichtlich quantitativ deutlich geringer ausgeprägt und anders geartet als die von RUN. Während die regional beobachteten Effekte von RUN auf kortikale Zellneubildung auf eine Zunahme neugebildeter Mikroglia zurückzuführen waren und andere Zellpopulationen nicht beeinflusst wurden, beeinflusste ENR diese Zellpopulation überhaupt nicht. Umgekehrt schien ENR in gewissem, eher begrenztem Maße Einfluß auf kortikale Astrozytogenese zu haben, was bei RUN nicht der Fall war. Da diese Veränderungen jedoch nur in Schicht I des motorischen Cortex das Signifikanzniveau erreichten und in den anderen phänotypisierten kortikalen Bereichen kein signifikanter Unterschied zwischen ENR und CTR (was die Anzahl S100ß+/BrdU+ Zellen anbelangt) zu finden war, muss die Interpretation, inwiefern ENR kortikale Astrozytogenese steigern kann, weiter untersucht werden. Allerdings unterstützt die Gleichrichtung der Daten in verschiedenen kortikalen Bereichen diese Deutung.

Die meisten der in der Literatur beschriebenen Effekte einer reizreichen Umgebung auf den cerebralen Cortex (siehe Kapitel 1.3) traten nicht überall im Cortex in gleicher Weise auf, sondern zeigten bezüglich ihres Ausprägungsgrades eine regionale Spezifität.


[Seite 86↓]

So beschrieben Bennett et al. eine Zunahme des kortikalen Gewichtes und der kortikalen Cholinesteraseaktivität unter einer reizreichen Umgebung, die regional unterschiedlich stark ausgeprägt waren: Die stärksten Effekte zeigten sich im visuellen Cortex, die geringfügigsten im somatosensorischen Cortex (Bennett et al., 1964).

Eine reizreiche Umgebung führte zu Dickenzunahmen des erwachsenen Cortex der Ratte, die regional unterschiedlich starker Ausprägung waren: generell waren die Veränderungen unter einer reizreichen Umgebung in medialen und okzipitalen Cortexgebieten stärker ausgeprägt als lateral und frontal. Minimale Effekte fanden sich im motorischen und somatosensorischen Cortex (Walsh, 1981). Diamond et al. zeigten, dass die Zunahme der kortikalen Dicke im visuellen Cortex, vor allem auf Veränderungen von Schicht II/III zurückzuführen waren (Diamond et al., 1964).

Es gab auch Hinweise darauf, dass die absolute Gliazellzahl in kortikalen Bereichen bei Tieren, die in einer reizreichen Umgebung gehalten wurden, von Kontrolltieren abwichen (Diamond et al., 1964). Jedenfalls sind Befunde, die auf dem Vergleich von Zelldichten beruhen, kritisch zu sehen, ist doch völlig unklar, welche Variable zur Veränderung eines Zelldichtewertes führt. Diamond et al. berichtete über eine Zunahme der Dichte vor allem von Oligodendrozyten im okzipitalen Cortex unter einen reizreichen Umgebung (Diamond et al., 1966). Ähnliche Veränderungen konnten auch Szeligo et al. beobachten (Szeligo and Leblond, 1977).

Die Gruppe um William Greenough studierte verschiedene Aspekte von durch eine reizreiche Umgebung induzierten Veränderungen im visuellen Cortex. Ein großer Teil dieser Studien befasste sich mit astrozytären Veränderungen durch eine reizreiche Umgebung im visuellen Cortex. Vereinfachend kann man diese astrozytäre Reaktion nach Sirevaag et al. in zwei Phasen einteilen: Initial kam es zur astrozytären Hypertrophie (Wachstum von Zellkörper und Fortsätzen). Zwischen dem Tag 30 und 67 der Einwirkung einer reizreichen Umgebung setzte eine astrozytäre Hyperplasie ein. Eine astrozytäre Proliferation wurde allerdings nicht direkt nachgewiesen, sondern die astrozytäre Gesamtzellzahl bestimmt und ein Effekt auf die astrozytäre Proliferation postuliert (Sirevaag and Greenough, 1991). Das eine reizreiche Lebensumgebung tatsächlich [Seite 87↓]Wirkungen auf astrozytäre kortikale Zellneubildung hat, konnte in dieser Arbeit unter anderem im visuellen Cortex gezeigt werden.

Die von Sirevaag et al. beschriebenen astrozytären Veränderungen im visuellen Cortex gingen den neuronalen Veränderungen teilweise voraus. Nach 30 Tagen reizreicher Umgebung kam zur Hypertrophie der Dendriten (Greenough and Volkmar, 1973), zu einer Zunahme der Synapsenanzahl pro Neuron (Turner and Greenough, 1985) und einer Veränderung der synaptischen Kontaktfläche im visuellen Cortex (Sirevaag and Greenough, 1985). Die Kapillarzahl pro Neuron stieg an (Black et al., 1987).

Diese durch eine reizreiche Umgebung im visuellen Cortex auslösbaren Veränderungen konnten im motorischen, somatosensorischen und auditorischen Cortex nicht gezeigt werden (Beaulieu and Colonnier, 1989a; Beaulieu and Colonnier, 1989b).

Die in der Literatur beschriebene regionale Spezifität der kortikalen Veränderungen, die durch eine reizreiche Umgebung auslösbar waren, deckte sich teilweise gut mit den hier dargestellten Befunden. So konnte auch hier der deutlichste und konsistenteste Effekt von ENR auf kortikale Zellneubildung im visuellen Cortex gesehen werden. Schicht II/III des visuellen Cortex, dessen Sensitivität auf eine reizreiche Umwelt vorbeschrieben war (Walsh, 1981; Szeligo and Leblond, 1977; Diamond et al., 1964), zeigte auch in dieser Arbeit relativ markante Veränderungen. Allerdings waren offenbar verschiedenste kortikale Bereiche in die Reaktion auf ENR involviert. So zeigten der frontale, motorische, cinguläre und somatosensorische Cortex (wenn auch meist nicht signifikante) Unterschiede bezüglich der Anzahl der BrdU+ Zellen zwischen ENR und CTR. Jedenfalls ergab sich bezüglich kortikaler Zellneubildung nicht der Eindruck einer einfachen regionalen Spezifität auf ENR in dem Sinne, dass Veränderungen ausschließlich in bestimmten kortikalen Regionen zu beobachten gewesen wären. Vielmehr schien es einen gleichgerichteten Unterschied zwischen ENR und CTR in verschiedenen kortikalen Regionen zu geben, der dann im regionalen Ausprägungsgrad etwas variierte.

Astrozytäre Funktionen

Astrozyten übernehmen vielfältige Funktionen im Gehirn (Kandel, 2000): Sie sind an der Abgrenzung des Parenchyms gegenüber Oberflächen und Gefäßen [Seite 88↓]beteiligt, regulieren die extrazellulären ionalen Verhältnisse (Newman et al., 1984; Kuffler, 1967), sezernieren Wachstumsfaktoren, modulieren Synapto- genese (Meshul et al., 1987) etc.

Neuerdings wurde die Vermutung formuliert, dass Astrozyten Vorläuferzelleigenschaften hätten (Doetsch et al., 1999). Grundlage dieser Hypothese war die Beobachtung, dass proliferierende Vorläuferzellen in der SVZ, die letzlich im Bulbus olfactorius integrierende Interneurone hervorbrachten, vorübergehend GFAP (klassischerweise als Marker für reife Astrozyten angesehen) exprimierten. Außerdem übernahmen hippokampale Astrozyten offenbar regulatorische Funktionen bei adulter hippokampaler Neurogenese (Song et al., 2002). Damit häufen sich Befunde, die darauf hindeuten, dass Astrozyten im erwachsenen Gehirn Funktionen ausüben, die weit über die nur supportiven Aufgaben hinausgehen, die man ihnen klassischerweise zugedacht hatte.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde beobachtet, dass viele der BrdU+ kortikalen Zellen S100ß und/oder NG2 exprimierten. S100ß wird allgemein als Marker eines astrozytären Phänotyps, NG2 als Antigen, was von unreifen Gliazellen exprimiert wird, angesehen. Es existieren zwar in-vitro-Daten, die eine Koexpression von NG2 und S100ß bei O-2A-Vorläufern beschreiben (Lee, 2000). Über eine Zellpopulation, die in vivo durch Expression dieser beiden Antigene charakterisiert wird, ist jedoch bisher nicht berichtet worden. Wie oben ausgeführt wurde, ist aber davon auszugehen, dass zumindest ein Teil der kortikalen S100ß+/BrdU+ Zellen in dieser Studie NG2 koexprimierte. Möglicherweise handelte es sich bei dieser Zellpopulation um ein in-vivo-Korrelat der O-2A-Vorläufer.

Die klassischerweise als spezifisch astrozytär angesehenen Marker S100ß und – oben erwähnt – GFAP würden folglich von gänzlich verschiedenen Zellpopulationen exprimiert werden: im Cortex (unter anderem) von einer NG2+/S100ß+ Zellpopulation mit unbekannter Funktion, in der SVZ von einer Stammzellpopulation und im Hippokampus von einer Zellpopulation, die Neurogenese regulieren kann. Es stellt sich die Frage, ob die klassischen Astrozytenmarker nicht auch von anderen Zellpopulationen exprimiert werden. Anders formuliert, könnte man fragen, ob der Astrozyt ausreichend präzise [Seite 89↓]definiert ist, oder ob sich nicht eher Zellen verschiedener Eigenschaften hinter diesem Begriff verbergen.

Möglicherweise könnte eine Beeinflussung kortikaler Astrozytogenese durch ENR eine Rolle bei adaptiven Prozessen des ZNS unter variablen Umgebungsbedingungen spielen. So waren bereits, wie oben ausgeführt, astrozytäre Veränderungen im visuellen Cortex unter einer reizreichen Lebensumgebung mit synaptischen Adaptationsprozessen in Verbindung gebracht worden (Jones et al., 1996; Jones and Greenough, 1996; Sirevaag and Greenough, 1991). In diesem Zusammenhang ist auch interessant, dass visuelle Deprivation zu parallelen Effekten auf Astrozyten und Synapsen im visuellen Cortex, die möglicherweise zusammenhingen, führte (Gabbott et al., 1986). ange bekannt ist auch eine astrozytäre Reaktion auf verschiedene Schadensereignisse innerhalb des ZNS, die sogenannte Gliose. Auch hier ist die funktionelle Bedeutung der astrozytären Reaktion nicht völlig geklärt. Immerhin konnte gezeigt werden, dass die Verpflanzung von Astrozyten in das geschädigte Gehirn, die funktionelle Rehabilitation zu fördern vermag (Kesslak et al., 1986).

Insgesamt läßt sich erkennen, daß die Vorläuferzellen der kortikalen Makroglia offensichtlich weniger empfindlich auf Umweltbedingungen bzw. physiologische Aktivierungszustände, wie in diesem Experiment verwendet, reagieren, als die der Mikroglia.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
11.02.2005