Aus dem Institut für Neuroimmunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Die Bedeutung löslicher TNF-Familienmitglieder für die Multiple Sklerose

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Stefan Ehrlich
aus Halle/Saale

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. F. Zipp
2. Prof. Dr. med. N. Sommer
3. Prof. Dr. med. N. Goebels

Datum der Promotion: 29. Mai 2006

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Apoptose
    • 1.1.1  Geschichte und Definition
    • 1.1.2 Rezeptor-vermittelte Apoptosesysteme
    • 1.1.3 Das CD95-Rezeptor/CD95-Ligand-System
    • 1.1.4 Das TRAIL-Rezeptor/TRAIL-System
  • 1.2 Die Multiple Sklerose
    • 1.2.1  Definition, Symptome und Diagnose der MS
    • 1.2.2 Verlauf und Prognose der MS
    • 1.2.3 Epidemiologie und Ätiologie der MS
    • 1.2.4 Pathologie und Pathogenese der MS
    • 1.2.5 Therapie der MS
  • 1.3 Die Bedeutung der Apoptose in der Pathogenese der MS
    • 1.3.1  Bedeutung des CD95 Signalweges
    • 1.3.2 Bedeutung des TRAIL Signalweges
  • 1.4 Fragestellung
• 2 Materialien und Methoden
  • 2.1  Patientenkollektiv und gesunde Kontrollen – Gewinnung der Proben
  • 2.2 Zellisolation
    • 2.2.1  Separation peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC)
    • 2.2.2 Kryokonservierung peripherer mononukleärer Blutzellen
    • 2.2.3 Auftauen der kryokonservierten peripheren mononukleären Blutzellen
    • 2.2.4 Magnetische Zelltrennung (MACS)
  • 2.3 Zellkultur
    • 2.3.1  PBMC
    • 2.3.2 PBMC-Subgruppen
    • 2.3.3 Humane antigenspezifische T-Zelllinien
    • 2.3.4 Transformierte Zellen
  • 2.4 ELISA
    • 2.4.1  Allgemeines Prinzip
    • 2.4.2 Die Bestimmung von sTRAIL in Zellkulturüberständen
    • 2.4.3 Die Bestimmung von IFN-γ in Zellkulturüberständen
    • 2.4.4 Die Bestimmung von IL-4 in Zellkulturüberständen
    • 2.4.5 Die Bestimmung von sCD95 im Zellkulturüberstand oder Serum
  • 2.5 Durchflusszytometrie
    • 2.5.1  Allgemeine Prinzipien
    • 2.5.2 Voreinstellungen des Gerätes
    • 2.5.3 Färbung und Kontrollen
    • 2.5.4 Die Bestimmung der Reinheit der magnetisch separierten Zellen
    • 2.5.5 Die Bestimmung der TRAIL-Expression auf PBMC-Subgruppen
    • 2.5.6 Die Auswertung der erhobenen Daten
  • 2.6 Zelltodnachweise
    • 2.6.1  Prinzipien
    • 2.6.2 Trypanblaufärbung
    • 2.6.3 Propidiumiodidfärbung
    • 2.6.4 DNA-Fragmentierung nach Nicoletti
  • 2.7 Proliferationsnachweise
  • 2.8 Statistische Auswertung
  • 2.9 Verwendete Materialien
    • 2.9.1  Zellkulturmedien und Puffer
    • 2.9.2 Substanzen für die PBMC und T-Zellkultur
    • 2.9.3 Substanzen für Magnetische Zelltrennung (MACS)
    • 2.9.4 Substanzen für die Durchflusszytometrie
    • 2.9.5 Substanzen zum Nachweis von Zelltod
    • 2.9.6 Verwendete Geräte
    • 2.9.7 Verbrauchsmaterialien
    • 2.9.8 Verwendete Software
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Die Expression und Regulation von TRAIL
    • 3.1.1  Vorexperimente - Lösliches TRAIL im Zellkulturüberstand von stimulierten PBMC
    • 3.1.2 Regulation durch zellspezifische Stimuli
      • 3.1.2.1  Lösliches TRAIL
      • 3.1.2.2 Membranständiges TRAIL
    • 3.1.3 Regulation durch IFN-β
      • 3.1.3.1  Lösliches TRAIL
      • 3.1.3.2 Membranständiges TRAIL
    • 3.1.4 TRAIL-Sekretion, Zellproliferation und absolute Zellzahlen
    • 3.1.5 Die biologische Aktivität von sTRAIL aus Zellkulturüberständen
  • 3.2 Immunomodulatorische Wirkungen von TRAIL
    • 3.2.1  Expression von löslichem oder membranständigem TRAIL im Vergleich zwischen MS-Patienten und gesunden Probanden
    • 3.2.2 Der Effekt von TRAIL auf die Proliferation von antigenspezifischen T-Zelllinien
    • 3.2.3 Der Effekt von TRAIL auf die Sekretion von INF-γ und IL-4 durch antigenspezifische T-Zelllinien
  • 3.3 Die Expression und Regulation von löslichem CD95
    • 3.3.1  Die Etablierung der Messmethode
    • 3.3.2 Bestimmung von sCD95 im Überstand von PBMC
    • 3.3.3 Bestimmung von sCD95 im Überstand von aktivierten T-Zellen, B-Zellen und Monozyten
    • 3.3.4 Bestimmung von sCD95 im Überstand von T-Zelllinien
  • 3.4 Mögliche immunomodulatorische Wirkung von sCD95
    • 3.4.1  Expression von sCD95 im Vergleich zwischen MS-Patienten und gesunden Probanden
    • 3.4.2 Longitudinale Studie von sCD95-Serumkonzentrationen bei schwangeren MS-Patientinnen
• 4 Diskussion
  • 4.1  Expression, Regulation und mögliche Bedeutung von TRAIL
  • 4.2 Die Expression, Regulation und mögliche Bedeutung von sCD95
  • 4.3 Ausblick
• 5 Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Verzeichnis häufig benutzter Abkürzungen
• Danksagung
• Erklärung
• Publikationen

Tabellen

• Tabelle 1 : Kardinale Kenzeichen von Nekrose und Apoptose (adaptiert nach Aktas, 2000)
• Tabelle 2 : Stimulation der PBMC-Subgruppen
• Tabelle 3 : Anzahl an lebenden Zellen nach 0, 24 ,48 und 72h der verschiedenen PBMC-Subpopulationen von vier gesunden Probanden stimuliert mit unterschiedlichen Stimuli.
• Tabelle 4 : Getestete „Growth Curve“- Modelle mit sCD95-Serumkonzentrationen als abhängige Variable (Standard Error in Klammern, ns = nicht signifikant)

Bilder

• Abbildung 1 : Verlaufsformen der MS
• Abbildung 2 : Die Pathophysiologie der MS:
• Abbildung 3 : Modulation des AICD durch lösliches CD95
• Abbildung 4 : Lösliches TRAIL (sTRAIL) im ELISA – Hintergrund durch Zellkulturmedien.
• Abbildung 5 : sTRAIL im Überstand von PBMC nach 72h unter verschiedenen Stimuli
• Abbildung 6 : Kinetik der Konzentrationen von sTRAIL im Überstand von PBMC stimuliert mit zellspezifischen Stimuli.
• Abbildung 7 : Kinetik der Konzentration von sTRAIL im Zellkulturüberstand von magnetisch getrennten PBMC-Subgruppen nach Stimulation mit zellspezifischen Stimuli.
• Abbildung 8 : sTRAIL im Zellkulturüberstand von 4 antigenspezifischen T-Zelllinien nach 72h mit verschiedenen adäquaten (Antigen+APC+IL-2, PHA+IL-2) und nicht-adäquaten (SAC, LPS) Stimuli.
• Abbildung 9 : Expression von membranständigem TRAIL auf T-Zellen, B-Zellen und Monozyten nach Aktivierung mit zellspezifischen Stimuli.
• Abbildung 10 : sTRAIL im Überstand von PBMC nach Stimulation mit IFN-β im Verlauf.
• Abbildung 11 : sTRAIL im Überstand von PBMC-Subgruppen nach magnetischer Zellseparation und Stimulation mit IFN-β im Verlauf.
• Abbildung 12 : Expression von membranständigem TRAIL auf T-Zellen, B-Zellen oder Monozyten nach Stimulation mit IFN-β.
• Abbildung 13 : Nachweis der biologischen Aktivität von sTRAIL in Jurkat-Zellen mit einem DNA-Fragmentierungstest.
• Abbildung 14 : Vergleich der löslichen und membranständigen TRAIL-Expression zwischen PBMC von Gesunden (Kontrolle) und MS-Patienten .Die Signifikanz wurde mit dem Mann-Whitney Rangsummen-Test (*P<0,05) geprüft.
• Abbildung 15 : TRAIL (300ng/ml) inhibiert die Proliferation von humanen antigenspezifischen T-Zelllinien .
• Abbildung 16 : Verringerung der Zytokinproduktion durch TRAIL .
• Abbildung 17 : Lösliches CD95 im ELISA – Etablierung des Konzentrationsverfahrens
• Abbildung 18 : sCD95 im ELISA – Hintergrund durch Zellkulturmedien.
• Abbildung 19 : sCD95 im Überstand von PBMC nach 72h unter verschiedenen Stimuli
• Abbildung 20 : sCD95 im Überstand von PBMC im Verlauf
• Abbildung 21 : sCD95 im Überstand von PBMC nach Stimulation mit PHA+IL-2 und IFN-β nach 96h.
• Abbildung 22 : sCD95 im Überstand von isolierten T- , B-Zellen und Monozyten.
• Abbildung 23 : sCD95 in pg/ml im Überstand von drei antigenspezifischen T-Zelllinien.
• Abbildung 24 : sCD95 in pg/ml im Überstand von vier antigenspezifischen T-Zelllinien (TCL) stimuliert mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und Antigen (Ag) und Kontrollen (Mittelwerte±SEM).
• Abbildung 25 : Expression von sCD95 durch PBMC im Vergleich zwischen MS-Patienten und Gesunden nach 72h.
• Abbildung 26 : sCD95-Konzentrationen in pg/ml x 10 ^-1 im Verlauf bei einer Auswahl von MS-Patientinnen vor, während und nach der Schwangerschaft.
• Abbildung 27 : Übereinanderprojektion aller sCD95-Konzentrationen in pg/ml x 10 ^-1 im Verlauf bei MS-Patientinnen vor, während und nach der Schwangerschaft.