1 Einleitung

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Das Thema der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Regulation zweier Apoptosesysteme, TRAIL und CD95/CD95Ligand, und deren mögliche Bedeutung für die Entstehung und Aufrechterhaltung von Autoimmunprozessen im Rahmen der Multiplen Sklerose (MS). Der Schwerpunkt liegt dabei auf der Rolle der löslichen Proteine sTRAIL und sCD95. Im Folgenden werden zunächst die verschiedenen Apoptosesysteme, das Krankheitsbild der MS und die Rolle von Apoptoseprozessen in der Pathogenese der MS erörtert.

1.1  Apoptose

1.1.1  Geschichte und Definition

Die Bezeichnung Apoptose kommt vom altgriechischen Wort αποπτόσισ, welches sich mit „Fallen der Blütenblätter von einer Blume“ oder „Fallen der Blätter von einem Baum im Herbst“ übersetzen lässt. Der Begriff wurde 1972 von John Kerr als morphologische Beschreibung für die Formation von „apoptotic bodies“ durch sterbende Zellen geprägt (Kerr et al., 1972). Das Phänomen selbst wurde 1842 erstmals von Carl Vogt beschrieben. Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods, gekennzeichnet durch eine festgelegte Abfolge von biochemischen und physikalischen Veränderungen, die nahezu alle Zellbestandteile betreffen: Zunächst schrumpft die Zelle und verliert den Kontakt zu anderen Zellen. Dann schwillt das Endoplasmatische Retikulum an, und Vesikel werden gebildet. Später fragmentieren DNAsen die Desoxyribonukleinsäure (DNA), und das Kernchromatin erscheint verdichtet. Letztlich zerfallen Zelle und Zellkern in verschiedene membranumschlossene „apoptotic bodies“ mit fragmentierten Zellorganellen. Unter physiologischen Umständen werden diese nun aufgrund von Zellmembranmodifikationen von Phagozyten erkannt und ohne die Induktion eines Entzündungsprozesses entfernt (Kerr et al., 1994). Hier liegt einer der Hauptunterschiede zum Prozess der Onkose bzw. Nekrose (siehe auch Tabelle 1), bei dem die Zelle in einer ungeordneten Art und Weise anschwillt und unter Zerstörung der Zellorganellen durch die Ruptur der Plasmamembran auslaufen kann, so dass Pathogene gegebenenfalls weiter verbreitet werden (Trump et al., 1997).

Tabelle 1 : Kardinale Kenzeichen von Nekrose und Apoptose (adaptiert nach Aktas, 2000)

Kennzeichen

Nekrose

Apoptose

Stimuli

  • Toxine
  • Schwere Hypoxie
  • Massiver Insult
  • ATP-Mangelzustände

  • Induktion über spezifische Todesrezeptor/-ligandensysteme
  • Entzug von Wachstumsfaktoren/ Bestrahlung
  • Physiologische und pathologische Zustände ohne ATP Mangel

Energieerfordernis

  • Keine

  • ATP-abhänig

Gewebereaktion

  • Entzündung

  • Keine Entzündung

Histologie

  • Zellschwellung
  • Platzen von Organellen
  • Tod konjunkter Gewebebezirke

  • Zellschrumpfung und Chromatinkondensation
  • Apoptotische Körperchen
  • Tod von einzelnen, isolierten Zellen

Plasmamembran

  • Lysiert

  • Intakt

DNA-Muster

  • Zufällige Fragmentgröße

  • Strickleiterähnliche Fragmentmuster
  • Regelmäßige Größenverteilung der Fragmente

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Die Apoptose ist ein essentieller Prozess für die Gewebshomöostase vor allem während der Embryonalentwicklung. Um geordnetes Wachstum und Entwicklung zu garantieren, ist eine Balance zwischen Zellproliferation und -differenzierung sowie programmiertem Zelluntergang notwendig (Melino, 2001).

Die Hypothese, dass einige Krankheiten durch zuviel (Morbus Parkinson, Alzheimer, Spinale Muskelatrophie, AIDS) oder zu wenig (Krebs, Autoimmunkrankheiten) Apoptose gekennzeichnet sind, hat das wissenschaftliches Interesse an Apoptose zusätzlich gesteigert (Strasser et al., 2000).

1.1.2 Rezeptor-vermittelte Apoptosesysteme

Es gibt zwei grundsätzlich verschiedene Mechanismen, die Apoptose induzieren können: den intrinsischen oder mitochondrialen Mechanismus und den extrinsischen Mechanismus. Für die Auslösung des intrinsischen Mechanismus spielen intrazelluläre Stressoren wie zytotoxische Agenzien oder oxidativer Stress eine wichtige Rolle. Der extrinsische Weg wird durch die Bindung von Liganden an membranständige Rezeptoren ausgelöst. Beide Signalkaskaden konvergieren auf der Ebene spezifischer Proteasen - der Caspasen, deren aktive Formen Zellorganellen und DNA spalten können (Strasser et al., 2000). Außerdem spielt die relative Expression von pro- oder anti-apoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie (B-cell lymphoma-2 Protein) eine zentrale Rolle bei der Induktion von Apoptose. Diese Proteine können in ihrer Dimer-Form durch Porenbildung in Mitochondrien Apoptose vermitteln (Borner, 2003).

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In dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf der Regulation der rezeptorvermittelten Apoptose durch lösliche Faktoren, also dem extrinsischen Mechanismus: Membranständige Rezeptoren werden durch extrazelluläre Liganden aktiviert. Viele dieser Rezeptoren gehören zur Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Familie (TNF-R-Familie) und sind Typ-I-transmembranöse Proteine, deren zysteinreiche extrazelluläre Domäne für Rezeptor-Liganden-Interaktionen und Komplexbildung aus mehreren Rezeptoren verantwortlich ist (Chan et al., 2000). Das intrazelluläre Ende der Rezeptoren enthält eine zytosolische „Todesdomäne“ (death domain, abgekürzt DD) aus ca. 80 Aminosäuren, die innerhalb von Sekunden Apoptose auslösen kann. Die DD rekrutiert die Caspasen (Zystein-Proteasen, die Proteine nach einem Aspartat-Rest schneiden) 8 und 10, welche dann ihrerseits den „Zelltod-induzierenden Signalkomplex“ (death inducing signaling complex, DISC) aktivieren. Am Ende der Signalkaskade steht die Aktivierung der oben beschriebenen Effektor-Caspasen (Strasser et al., 2000). Während der TNF-Signalweg bereits sehr intensiv studiert wurde, ist die Bedeutung des CD95- und des TRAIL-Signalwegs noch nicht ganz verstanden.

1.1.3 Das CD95-Rezeptor/CD95-Ligand-System

CD95 (auch Fas oder APO-1 genannt) und TNF-R-1 sind zwei typische und relativ früh entdeckte Vertreter der Apoptose-vermittelnden Todesrezeptoren. In der CD95- Signalkaskade kann Apoptose ausgelöst werden, indem der CD95-Ligand (CD95L) an CD95 bindet, welches daraufhin trimerisiert. Adapterproteine, hier das „Fas-assoziierte- Todesdomänen-Protein“ (Fas-associated death domain protein, FADD) binden dann durch elektrostatische Interaktionen an die zytosolische DD von CD95. FADD enthält eine Todeseffektordomäne (death effector domain, DED), an welche Pro-Caspase 8 binden kann. Dieser gebildete Komplex wird dann, wie bereits beschrieben, DISC genannt (Ashkenazi, 2002).

TNF-R-1 dagegen hat die besondere Fähigkeit, sowohl Proliferation bei Entzündungsreaktionen, als auch Apoptose auslösen zu können. Welches Signal vermittelt wird hängt davon ab, welche Moleküle in der Zelle für den Aufbau des DISC vorhanden sind. Die Rekrutierung von FADD führt zur Apoptose, während die Rekrutierung von RIP1 (receptor interacting protein 1) oder TRAF (tumor necrosis factor receptor-associated factor)zu anti-apoptotischen Effekten führt (Ashkenazi, 2002). Dies zeigt, dass die TNF-R-Familie über Signalkaskaden von einem breiten Wirkungsspektrum verfügt, angefangen von Apoptose bis hin zu Proliferation. Zusätzliche Komplexität entsteht durch Interaktionen der Liganden mit löslichen Rezeptoren (MacEwan, 2002).

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CD95 wird in verschiedenen Geweben exprimiert, vor allem aber im Thymus, der Leber und in den Nieren. CD95L dagegen wurde fast ausschließlich auf aktivierten T-Zellen und Natural-Killer-Zellen (NK-Zellen) gefunden (Suda et al., 1993). Das Typ-II-transmembranöse CD95L-Protein ist verantwortlich für drei verschiedene Prozesse, die Apoptose involvieren: die Elimination von (a) CD95 exprimierenden Targetzellen durch zytotoxische T-Zellen, (b) von Entzündungszellen in immunprivilegierten Geweben und von zytotoxischen T-Zellen durch Tumorzellen und (c) der CD95L exprimierenden T-Zelle selbst im Sinne einer autokrinen Schleife, bei der nach T-Zellaktivierung abgegebenes lösliches CD95L auf T-Zell-eigene CD95-Rezeptoren wirkt, oder als „Fratricide“ durch eine weitere T-Zelle. Dieser Prozess wird auch „aktivierungsinduzierter Zelltod“ genannt (activation-induced cell death, AICD). AICD betrifft reife proliferierende T-Zellen, beinhaltet in der Regel eine erneute Aktivierung der T-Zelle über den T-Zell-Rezeptor (Nagata, 1997), ist meist CD95-vermittelt und dient der Beendigung einer Immunantwort. Ko-stimulatorische Signale einer professionellen antigenpräsentierenden Zelle (APC), z.B. das Binden von B7 an den CD28-Rezeptor der T-Zelle, können diesen Prozess verhindern (Krueger et al., 2003). Der CD95-unabhänige AICD spielt darüber hinaus eine zentrale Rolle bei der negativen Selektion von Thymozyten im Thymus.

Wie bereits beschrieben, ist die CD95-vermittelte Apoptose abhängig von der Expression von membranständigem oder löslichem CD95L. Doch gibt es im weiteren Verlauf der Signalkaskade eine ganze Reihe zusätzlicher Regulationsmechanismen: So können die Proteine FLIPS und FLIPL (FADD-like IL-1β-converting enzyme inhibitory proteins) mit der DED von FADD assoziieren, bzw. kann FLIPL die Procaspase 8 deaktivieren und somit die Signalkaskade unterbrechen (Irmler et al., 1997). Außerdem kann eine lösliche Form des CD95-Rezeptors (sCD95) in der extrazellulären Flüssigkeit CD95L beziehungsweise Antikörper gegen CD95 binden, ohne dass ein Apoptosesignal weitergeleitet wird (Cheng et al., 1994;Pitti et al., 1998). Das Gen für den CD95-Rezeptor liegt auf Chromosom 10 und besteht aus neun Exonen. Der lösliche CD95-Rezeptor entsteht durch „alternative splicing“ der Exone drei, vier und sechs der regulären CD95-mRNA (Messenger-Ribonukleinsäure). Dabei entstehen mindestens fünf unterschiedliche Varianten (FasExo6Del, FasExo4Del, FasExo4,6Del, FasExo3,4Del, FasExo3,4,6Del), die um jeweils ein oder mehrere Exone verkürzt sind (Kovacs et al., 1997;Papoff et al., 1996). Zusätzlich kommt es bei FasExo3,4Del, FasExo3,4,6Del zur Verschiebung des Leserasters (frame shift). Keine der Varianten besitzt eine DD, wobei FasExo6Del im transmembranösen Bereich, alle anderen Varianten in der extrazytoplasmatischen Region abgeschnitten sind.

Kulturüberstände von Zellen, die mit einer dieser Varianten der mRNA oder abgeschnittener zytosolischen DNA transfiziert wurden, konnten die CD95L-vermittelte Apoptose blockieren (Cascino et al., 1995;Liu et al., 1995). Mäuse denen lösliches sCD95 injiziert wurde zeigten Autoimmunphänomene (Cheng et al., 1994;Pitti et al., 1998). Für die Blockade der CD95L-vermittelten Apoptose sind die ersten 49 Aminosäuren der N-terminalen Domäne der sCD95-Varianten verantwortlich. Diese binden an CD95L bzw. können wahrscheinlich auch Trimere mit funktionellen CD95-Rezeptoren bilden und somit eine Signaltransduktion verhindern, für die eine Trimer-Bildung aus drei vollständigen CD95-Rezeptoren nötig ist (Kovacs et al., 1997;Papoff et al., 1996).

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Eine dem sCD95 ähnliche Funktion hat der lösliche decoy receptor 3 (englisch für Köder-Rezeptor, abgekürzt DcR) (Pitti et al., 1998). Einige dieser Regulationsmechanismen werden von Tumorzellen genutzt, um einer Immunantwort zu entgehen. Auch bei Autoimmunkrankheiten könnten sie eine Rolle spielen (Cheng et al., 1994;Pitti et al., 1998).

1.1.4 Das TRAIL-Rezeptor/TRAIL-System

Obwohl CD95 der zuerst entdeckte und am besten charakterisierte Todesrezeptor (death receptor, DR) ist, gibt es viele andere Mitglieder der TNF-Rezeptor Familie mit weitreichender Aminosäuren-Sequenz-Homologie. So besitzen DR4, DR5, CAR1, p75 und der bereits beschriebene TNF-R1 auch eine DD. DR4 und 5 werden durch das Binden des TNF-verwandten apoptoseinduzierenden Liganden (TNF-related Apoptosis-Inducing Ligand, kurz TRAIL, auch als APO2-Ligand bezeichnet), einem Typ II-Membranprotein, aktiviert, woraufhin sie trimerisieren und Apoptose auslösen (Ashkenazi, 2002;Pitti et al., 1996). Die durch DR4 und DR5 ausgelöste Signalkaskade hat große Ähnlichkeiten mit der von CD95 ausgelösten Signalkaskade. So ist sowohl FADD als auch Caspase 8 ein essentieller Bestandteil des TRAIL-DISC (Bodmer et al., 2000). TRAIL bindet spezifisch an DR4 und DR5, aber zusätzlich auch an die beiden Köder-Rezeptoren DcR1 und DcR2, die keine (DcR1), oder nur eine unvollständige DD (DcR2) besitzen. Weiterhin existiert ein löslicher Rezeptor, Osteoprotegerin, der, wenn auch mit niedrigerer Affinität, an TRAIL binden und durch kompetitive Inhibition der TRAIL-TRAIL-Rezeptor Interaktion die Apoptose blockieren kann (Emery et al., 1998).

Obwohl diverse humane Gewebe TRAIL-Rezeptoren exprimieren, wurde zunächst von einer selektiven toxischen Wirkung von TRAIL auf transformierte bzw. Tumorzellen berichtet. Diese Selektivität wurde mit unterschiedlichen Expressionsprofilen der DcR mit anti-apoptotischer Wirkung in Zusammenhang gebracht, was Hoffnungen auf eine therapeutische Anwendung von TRAIL schürte (Ashkenazi et al., 1999). Experimentelle Überexpression der DcR hatte eine Apoptose-inhibierende Wirkung gezeigt (Pan et al., 1997;Sheridan et al., 1997). Studien mit spezifischen Antikörpern gegen die unterschiedlichen TRAIL-Rezeptoren konnten jedoch keine Korrelation zwischen TRAIL-Resistenz von Zelllinien und DcR-Expression herstellen (Walczak und Krammer, 2000). Neuere Studien haben die Hoffnung auf eine direkte klinische Anwendbarkeit weiter reduziert. So konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL in menschlichen Hepatozyten und Gehirnzellen Apoptose von erheblichem Ausmaß verursachen kann (Jo et al., 2000;Nitsch et al., 2000). Dennoch wurde in Tierversuchen gezeigt, dass die systemische TRAIL-Administration ohne schwerwiegende toxische Nebenwirkungen das Tumorwachstum stoppen kann. Verglichen mit CD95L und TNF, die im Tierversuch beide stark toxisch wirken, handelt es sich um ein sehr interessantes Ergebnis, welches allerdings die Interpretation der bisherigen Kenntnisse über das TRAIL-System nicht einfacher macht (Walczak und Krammer, 2000).

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Eine Lösung des komplexen Zusammenhangs könnte auf der Ebene von intrazellulären Proteinen oder Transkriptionsfaktoren zu suchen sein, die anti-apoptotische Gene regulieren. TRAIL induziert sowohl den Transkriptonsfaktor NF-κB als auch die Jun N-terminale Kinase (JNK), die an der Bildung des Transkriptionsfaktors AP-1 beteiligt ist (MacFarlane et al., 2000). Zudem ist die TRAIL-Sensitivität invers mit der Expressionsstärke des bereits oben erwähnten FLIP korreliert, es besteht jedoch kein Zusammenhang mit der Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-XL (Walczak et al., 2000).

TRAIL als Ligand kommt auf der Zelloberfläche aber auch in Körperflüssigkeiten vor. Für die Bildung der als lösliches TRAIL (sTRAIL) bezeichneten Form sind zwei Mechanismen beschrieben worden. Mariani und Krammer zeigten, dass sTRAIL durch Zystein-Proteasen aus membranständigem TRAIL auf der Zelloberfläche von humanen transformierten T- und B-Zellen entsteht (Mariani und Krammer, 1998). Martinez-Lorenzo et al. beschrieben die rasche Abgabe von TRAIL in präformierten Mikrovesikeln aus stimulierten Jurkat T-Lymphomzellen, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) und T-Zell-Blasten (Martinez Lorenzo et al., 1999).

1.2 Die Multiple Sklerose

1.2.1  Definition, Symptome und Diagnose der MS

Multiple Sklerose (MS), auch Encephalomyelitis disseminata genannt, ist eine chronische Erkrankung des Zentralen Nervensystems (ZNS) mit Beginn im jungen Erwachsenenalter. Morphologisch ist die MS durch perivaskuläre Entzündungsherde in der weißen Substanz gekennzeichnet, die zu Demyelinisierung und Axonschäden führen. Charakteristischerweise handelt es sich dabei um disseminiert auftretende Läsionen, d.h. sie sind an verschiedenen Stellen des Gehirns und zu verschiedenen Zeiten zu finden (Schmidt und Hoffmann, 2002).

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Da die Läsionen in diversen Teilen des ZNS auftreten, kommt es zu vielfältigen Beeinträchtigungen. Die folgenden Symptome treten bei über 10% der Neuerkrankten und über 50% der chronisch Kranken auf: Fatigue, Neuritis opticus, Internukleäre Ophtalmoplegie, Nystagmus, Vertigo, Gangstörungen, Sensibilitätsverlust, verstärkte Muskeleigenreflexe, Spastizität und Miktionstörungen.

Die Diagnose der MS erweist sich oftmals als schwierig, da einzelne Symptome und Tests nicht spezifisch genug sind, um als beweisend zu gelten. Zur Erleichterung der Diagnose wurden deshalb frühzeitig standardisierte Kriterien eingeführt (Poser et al., 1983). Aufgrund der zunehmenden Bedeutung bildgebender Verfahren in der Diagnostik wurden die Kriterien im Jahre 2001 vom „International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis“ überarbeitet (McDonald et al., 2001). Demnach müssen folgende Bedingungen erfüllt sein:

  1. Es muss ein objektiver Nachweis (neurologische Untersuchung) von mindestens zwei Schüben erbracht werden, definiert als eine Verschlechterung von MS-typischen Symptomen, die mindestens 24h anhalten.
  2. Die beiden Schübe müssen räumlich (Läsionen in unterschiedlichen Arealen des ZNS) und zeitlich (30 Tage) voneinander getrennt sein.
  3. Alle anderen Erklärungen für die Symptome und Schübe des Patienten müssen ausgeschlossen werden.

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Neben Anamnese und dem neurologischen Befund stützt sich die Diagnose auf folgende Untersuchungen:

1.2.2 Verlauf und Prognose der MS

Statistisch liegt das mittlere Alter zu Beginn der Erkrankung bei 30 Jahren, der Modalwert dagegen bei 23-24 Jahren. Ein Erkrankungsbeginn vor dem 15. oder nach dem 50. Lebensjahr ist selten (Vukusic und Confavreux, 2001). Man unterscheidet drei Haupttypen des MS-Krankheitsverlaufes (Abb. 1). Etwa 80-85% der Patienten haben zunächst einen (A) schubförmig remittierenden Verlauf (RRMS), der durch akute Schübe mit nachfolgender vollständiger oder partieller Genesung ohne Zustandsverschlechterung zwischen den Schüben gekennzeichnet ist. Nur 10-15% der Patienten leiden an (C) primär chronisch-progredienter MS (PPMS), die sich durch eine mehr oder weniger kontinuierliche Verschlechterung des Zustandes auszeichnet. Innerhalb von zehn Jahren nach Krankheitsbeginn entwickeln 50% der RRMS-Patienten

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Abbildung 1 : Verlaufsformen der MS

eine (B) sekundär chronisch-progrediente MS (SPMS) mit zunehmender Krankheitsverschlechterung auch zwischen den Schüben (Lublin und Reingold, 1996).

Die Frequenz der Schübe weist eine hohe Variabilität auf und liegt im Mittel bei 0.5 pro Patient und Jahr. Sie ist höher bei jüngeren Patienten und zu Krankheitsbeginn. Ebenso unterschiedlich ist der Zeitraum, nach dem es zu einer signifikanten dauerhaften körperlichen Behinderung kommt. Typischerweise ist das Laufen zehn Jahre nach Krankheitsbeginn deutlich eingeschränkt und die Lebenserwartung um 6-14 Jahre reduziert (Weinshenker und Ebers, 1987). Als prognostisch ungünstig gelten ein PPMS-Verlauf (Alter bei Krankheitsbeginn häufig > 40 Jahre), der frühe Beginn eines SPMS-Verlaufes, häufige Schübe mit inkompletter Remission, motorische, zerebelläre und die Sphinkter betreffende Störungen, sowie polyregionale Symptome. Patienten mit klinisch isolierten Symptomen (CIS), jedoch ohne definitive MS, entwickeln in 88% der Fälle eine klinisch gesicherte MS, wenn initial in T2-gewichteten Magnetresonanztomografie-Bildern (MRT) bereits Läsionen vorlagen (O'Riordan et al., 1998).

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Der Suizid stellt neben anderen Komplikationen der MS eine ernstzunehmende Todesursache bei MS-Kranken dar, wobei bisher nicht geklärt werden konnte, ob ein ursächlicher Zusammenhang zu den Hirnläsionen besteht (Ehrlich et al., 2003;Ehrlich et al., 2004).

Schwangerschaften haben einen positiven Effekt auf die klinische Symptomatik der MS und anderer T-Helferzell-vermittelter Autoimmunerkrankungen. Besonders im letzten Trimenon der Schwangerschaft ist die Rate der Krankheitsschübe signifikant erniedrigt, wogegen postpartum für ca. sechs Monate eine Zunahme der Krankheitsschübe im Vergleich zur Zeit vor der Schwangerschaft zu verzeichnen ist. Die genauen Ursachen für die protektive Wirkung von Schwangerschaften auf den Verlauf der MS sind nicht endgültig geklärt (Birk et al., 1990;Birk et al., 1988).

1.2.3 Epidemiologie und Ätiologie der MS

Die Prävalenz der MS in unterschiedlichen geographischen Regionen schwankt zwischen 1/100 000 und 100/100 000. Dabei ist die Verteilung komplex und nicht zufällig. Generell ist ein Anstieg der Krankheitsprävalenz mit den Breitengraden zu beobachten. So sind beispielsweise die nördlichen Vereinigten Staaten, Nord- und Zentraleuropa sowie Südaustralien Hochrisikogebiete (>30/100 000), wogegen Teile Afrikas, Asiens und Südamerikas durch ein niedriges Risiko gekennzeichnet sind (<5/100 000). Außerdem ist mehrfach beschrieben worden, dass Immigranten, die vor dem 14. Lebensjahr immigrieren, in der Regel eine ähnliche MS-Prävalenz wie die ortsansässige Bevölkerung entwickeln. Im Gegensatz dazu gibt es ethnische Gruppen, wie Schwarzafrikaner, Inuit oder Maori, die, unabhängig von Migrationsprozessen, eine sehr niedrige MS-Prävalenz aufweisen. MS kommt bei Frauen doppelt so häufig vor wie bei Männern, vom PPMS-Verlauf jedoch sind beide Geschlechter gleich häufig betroffen. Insgesamt scheinen sowohl Umwelt- als auch genetische Faktoren einen starken Einfluss auf die Prävalenz der MS zu haben (Pryse-Phillips und Costello, 2001).

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Weitere Hinweise für eine genetische Prädisposition der MS stammen aus Familien- und Zwillingsstudien. Eine kanadische Untersuchung zeigte, dass ungefähr 20% der MS-Patienten Verwandte ersten bis dritten Grades mit klinisch manifester MS haben. Das Risiko, im Laufe des Lebens an MS zu erkranken, betrug im allgemeinen nur 0,2%, war aber bei Verwandten ersten Grades von MS-Patienten auf 3-5% erhöht (Sommer et al., 1996). Zudem ist die Konkordanzrate in eineiigen Zwillingen mit 30% wesentlich höher als in zweieiigen (3-5%). Genetische Untersuchungen ergaben einen Zusammenhang zwischen den Haplotypen HLA-DR15 und HLA-DQ6 des humanen Leukozytenantigens Klasse II (HLA-II) mit einer MS-Prädisposition. Das Studium weiterer Kandidatengene einschließlich der Gene, die für den T-Zellrezeptor und INF-α kodieren, ließen bisher lediglich eine Assoziation mit dem CTLA-4-Gen (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) als wahrscheinlich erscheinen (Hillert und Masterman, 2001). CTLA-4 ist ein Rezeptor, der auf aktivierten T-Zellen exprimiert wird und nach Bindung an ein B7-Molekül die Proliferation der aktivierten T-Zelle inhibieren kann (Janeway et al., 1999).

Der Einfluss von Umweltfaktoren wird nicht nur durch die geographischen Unterschiede und die relativ niedrige Konkordanzrate bei eineiigen Zwillingen deutlich. Eine ganze Bandbreite von Umweltfaktoren, wie z.B. Toxine, Anästhetika oder Hepatitis-Impfungen wurden mit MS in Zusammenhang gebracht. Keine dieser Annahmen konnte bisher bestätigt werden, und ein Zusammenhang mit Hepatitis-Impfungen wurde widerlegt (Zipp et al., 1999). Besonderes Interesse gilt einer Assoziation mit Infektionen. Dabei wird diskutiert, ob pathogene Erreger MS auslösen oder sogar Gewebsschäden im Gehirn verursachen. So ist u.a. bekannt, dass der T-Lymphotrope Virus Typ 1 und der Masernvirus der MS ähnliche Myelopathien hervorrufen können. Diese These wird dadurch gestützt, dass im Serum von MS-Patienten erhöhte Antikörpertiter gegen Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Epstein-Barr-Virus, Masernvirus, Mumpsvirus, Influenzaviren, Rötelnvirus und Canine distemper Virus gefunden wurden. Es gelang jedoch nicht, eine Assoziation der MS mit einem dieser Erreger im Sinne der Henle-Koch Postulate nachzuweisen. Insbesondere der Pathogenitätsnachweis (Reproduktion der Symptome beim Versuchtier) war bisher nicht möglich (Kastrukoff und Rice, 1997).

1.2.4 Pathologie und Pathogenese der MS

Wie bereits beschrieben, ist die MS durch disseminierte, aber begrenzte Hirnläsionen mit Demyelinisierung und Axonschäden gekennzeichnet. Die Läsionen in der weißen Substanz von Gehirn und Rückenmark liegen zumeist in der Nähe der Liquorräume, wie z.B. angrenzend an die lateralen Ventrikel, periaquäduktal, im Corpus callosum, Nervus opticus oder Chiasma. Man unterscheidet akute, chronisch akute und chronisch stumme Läsionen, je nach zeitlichem Verlauf und Progredienz. Neuere Arbeiten von Lucchinetti et al. (Lucchinetti et al., 1998) verweisen auf substantielle Unterschiede bei Demyelinisierungsprozessen und Oligodendrozyten-Pathologie in MS-Plaques und unterscheiden vier verschiedene histopathologische MS-Typen. Dabei herrscht bei zwei Typen der Entzündungsprozess und bei den übrigen zwei Typen der Untergang von Oligodendrozyten vor.

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Die Bedeutung der direkten Axonschädigung wurde erst kürzlich erkannt. Sowohl mikroskopisch als auch durch Marker, die Axonschäden nachweisen, wie z.B. Amyloid und N-Azetylaspartat (NAA), konnte gezeigt werden, dass Axonschäden für die MS-Pathologie von essentieller Bedeutung sind. Die so genannte „Axon-Hypothese“ geht davon aus, dass Axonschäden für die anhaltenden neurologischen Defizite der MS verantwortlich sind. Mögliche Gründe für den Mechanismus der axonalen Schädigung werden zur Zeit erforscht und beinhalten: (a) eine direkte Schädigung durch Immunzellen, (b) Schädigung durch den Entzündungsprozess gegen Myelin, (c) Degeneration infolge des Verlusts der trophischen Unterstützung nach Demyelinisierung, oder aber (d) die primäre Degeneration mit sekundärer Entzündung (Trapp et al., 1999;Whitaker und Mitchell, 1996).

Bei Erklärungsmuster (d) handelt es sich um eine eher ungewöhnliche Hypothese. Denn üblicherweise wird die MS als primäre Autoimmunkrankheit angesehen, deren Angriffspunkte in erster Linie die Myelinscheiden und Oligodendrozyten des ZNS sind. Histopathologisch können in MS-Plaques Immunzellen, v.a. CD4+ T-Zellen, also T-Helferzellen (Th-Zellen) und ihre Produkte nachgewiesen werden. Für die These der MS als Autoimmunkrankheit sprechen außerdem: (1) die Assoziation der Erkrankung mit dem HLA-DR2-Gen des HLA-II-Komplexes, der für die Antigenpräsentation gegenüber T-Helferzellen verantwortlich ist (Compston und Sadovnick, 1992;Haines et al., 1998), (2) die erhöhte Rate an myelinspezifischen CD4+ Zellen, die im Blut von MS-Kranken zirkulieren (Zhang und Raus, 1994), (3) eine autochthone Antikörperproduktion im Liquor von MS-Patienten, ohne dass ein Erreger nachgewiesen werden kann, (4) die Induzierbarkeit eines MS-ähnlichen Krankheitsbildes bei Mäusen (experimentell-autoimmune Enzephalomyelitis, EAE) nach Transfer myelinspezifischer CD4+ Zellen oder aktiver Immunisierung mit Myelinproteinen (Martin und McFarland, 1995) und (5) die Besserung der MS-Symptomatik unter immunomodulatorischer Therapie (Zipp et al., 1997).

Die MS wird von einigen Forschern als T-Helferzell-1-vermittelte Autoimmunerkrankung angesehen. Th1-Zellen sind CD4+ Effektor-T-Zellen die vor allem pro-inflammatorische Zytokine wie IL-2, IL-12, IFN-γ und TNF-α sezernieren. IFN-γ und TNF-α stimulieren antigenpräsentierende Zellen und führen zur Hochregulation von HLA-II und Adhäsionsmolekülen in MS-Plaques. Die myelinspezifischen T-Zellen in der EAE und bei MS-Kranken sind vornehmlich vom Th1-Typ (Zipp, 2000). Th-Zellen vom Th2-Typ hingegen produzieren anti-inflammatorische Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10, die vor allem auf die humorale Immunantwort wirken und zugleich die Expression von Th1-Zytokinen herunterregulieren (Janeway et al., 1999).

1.2.5 Therapie der MS

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Traditionell werden in der Therapie der MS im akuten Schub vor allem Glukokortikoide eingesetzt. Orales oder intravenöses Methylprednisolon begrenzt perifokale Ödeme und wirkt immunosuppressiv. Der Wirkmechanismus besteht wahrscheinlich in der Stabilisierung der Blut-Hirn-Schranke, der Inhibition der Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine und sowohl der Inhibition als auch der Induktion von Apoptose (Gelati et al., 2002;Zipp et al., 2000).

In den letzten Jahren kamen bei der RRMS zusätzlich zur Akuttherapie verstärkt Immunomodulatoren als Langzeittherapeutika zum Einsatz. Dazu gehört vor allem subkutan oder intramuskulär gegebenes Interferon-β (IFN-β). Mehrere multizentrische, randomisierte, doppelblinde, plazebokontrollierte Studien konnten eine signifikante Verringerung der Frequenz der akuten Schübe und der Anzahl der im MRT sichtbaren Plaques, sowie eine verlangsamte Progredienz der körperlichen Behinderungen belegen (1995;2001). Neuere Daten zeigten, dass IFN-β auch schon bei Krankheitsbeginn wirksam ist (Jacobs et al., 2000). In mehreren Studien (CHAMPS, ETOMS) wurde daraufhin die Effektivität der IFN-β Therapie bei Erstmanifestation bzw. CIS bestätigt (Kieseier und Hartung, 2003). Auch Glatriamer Acetate (GA, auch als Copolymer-1 bezeichnet) erwies sich in einer multizentrischen, randomisierten, doppelblinden, plazebokontrollierten Studie als wirksam (Johnson et al., 1995;Johnson et al., 1998).

Die genauen Wirkmechanismen der Immunomodulatoren GA und IFN-β sind bis heute nicht vollständig geklärt. GA ist ein Zufalls-Polypeptid aus vier Aminosäuren, welches ursprünglich zur Auslösung von EAE in Versuchstieren vorgesehen war. Bei IFN-β handelt es sich um ein klassisches pleiotropes Zytokin, ursprünglich bekannt für seine antiviralen und –tumoralen Effekte. Einige Autoren betrachten die positive Wirkung von IFN-β bei MS vor allem als Folge eines Wechsels der Dominanz von CD4+-Zellen mit pro-inflammatorischem Th1-Profil zu CD4+-Zellen mit einem anti-inflammatorischen Th2-Profil, dem so genannten Th1/Th2-Shift (Yong et al., 1998). In der Pharmakotherapie wird zwischen IFN-β-1a (in den meisten Ländern zugelassen unter den Handelsnamen Avonex und Rebif) und IFN-β-1b (Betaferon/ Betaseron) unterschieden. Zwischen diesen gleichartig erscheinenden Substanzen existieren dennoch Unterschiede bezüglich der Pharmakokinetik und Applikation (Avonex einmal pro Woche intramuskulär, Rebif dreimal pro Woche subkutan, Betaferon täglich subkutan). Die Nebenwirkungsprofile der verschiedenen Interferone sind ähnlich und bestehen in grippeähnlichen Symptomen wie Fieber, Übelkeit und Erbrechen, Myalgien, Arthralgien, Depression, erhöhten Leberwerten und selten Leukopenie oder Anämie. Auch die Effektivität der unterschiedlichen Interferone ist vergleichbar und hängt u.a. von der Dosierung ab. Es bestehen jedoch Hinweise darauf, dass IFN-β-1a vor allem die anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 induziert und einen Th1/Th2-Shift fördert, wogegen eine IFN-β-1b Therapie mit niedrigeren Serumkonzentrationen des pro-inflammatorische Zytokins IFN-γ verbunden ist (Sega et al., 2004). In dieser Arbeit wurde ausschließlich IFN-β-1a verwendet.

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Weitere, weniger etablierte Therapeutika für die RRMS, für die positive Wirkungen angenommen werden, sind intravenöse Immunoglobuline (IVIG) (Sorensen et al., 2002) und Mitoxantron (Neuhaus et al., 2004). Die Therapie der primär bzw. sekundär chronisch-progredienten MS gestaltet sich als äußerst schwierig. Dabei kommen u.a. Substanzen wie IFN-β, Mitoxantron, Cyclophosphamid, Methotrexat, Nataliezumab, Azathioprin und Cyclosporin zur Anwendung (Hartung et al., 2002;Noseworthy, 2003).

1.3 Die Bedeutung der Apoptose in der Pathogenese der MS

Apoptose stellt einen Effektormechanismus dar, durch den immunkompetente Zellen virusinfizierte oder tumorös entartete Zellen eliminieren können. Zusätzlich spielt die Apoptose eine Rolle bei der Kontrolle des Immunsystems, da sie insbesondere durch den AICD zur spezifischen Begrenzung immunologischer Reaktionen beiträgt. Bereits aktivierte T-Zellen werden dabei nach erneuter Aktivierung über das CD95-Rezeptor/CD95-Ligand-System apoptotisch abgeschaltet (Lenardo et al., 1999).

Die folgende Hypothese über die MS-Pathogenese unterstützt das Autoimmun-Paradigma und hat derzeit die breiteste Akzeptanz: (1) Periphere T-Zellen, die spezifisch für basisches Myelinprotein (MBP) oder ein anderes Myelin-Protein sind, werden aktiviert. Für den genauen Mechanismus der Aktivierung bestehen bisher nur wenige Hypothesen: (a) Virale Proteine von Herpes simplex, Adeno- oder Epstein-Barr-Viren oder bakterielle Bestandteile stimulieren direkt myleinspezifische T-Zellen (Wucherpfennig und Strominger, 1995). (b) Gegen Fremdantigen gerichtete Antikörper oder T-Zellen reagieren im Sinne einer Kreuzreaktion mit körpereigenen Epitopen (molecular mimicry). (c) T-Zellen unterschiedlicher Spezifität werden durch ein einzelnes so genanntes „Superantigen“ aktiviert (Wucherpfennig, 2001). Letztendlich würden aktivierte autoreaktive Zellen aber apoptotisch eliminiert werden. Ein (d) Defekt in Apoptosesystemen könnte zum Überleben dieser Zellen bei MS-Patienten beitragen. (2) Die aktivierte T-Zelle migriert nun durch die Blut-Hirn-Schranke in das ZNS. Dieser Prozess wird durch eine Reihe von Molekülen wie Adhäsine, Selectine, Integrine und Matrix-Metalloproteasen vermittelt, die ebenfalls an der MS-Pathologie beteiligt sein könnten. (3) Im ZNS treffen die aktivierten myelinspezifischen T-Zellen auf ihr Antigen, welches, um von den CD4+ T-Zellen erkannt zu werden, auf einem HLA-II-Molekül von einer APC präsentiert werden muss (Wekerle, 1993). (4) Die aktivierten T-Lymphozyten sezernieren daraufhin Zytokine wie TNF-α/β und IFN-γ, die einen Entzündungsprozess initiieren, der zur Zerstörung der Myelinscheiden, Oligodendrozyten und Axone führt (Abb. 2). Der Untergang der Oligodendrozyten ist wahrscheinlich durch Apoptose verursacht (Markovic-Plese und McFarland, 2001).

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Abbildung 2 : Die Pathophysiologie der MS:

Aktivierte autoantigen-spezifische Th-Zellen, die nicht durch den AICD eliminiert wurden, migrieren durch die Blut-Hirn-Schranke. Im ZNS treffen die Th-Zellen auf ihr spezifisches Zielantigen, welches durch APC präsentiert wird. Daraufhin sezernieren sie pro-inflammatorische Zytokine und induzieren einen parenchymschädigenden Entzündungsprozess (adaptiert nach Waiczies, 2003).

Demnach könnte ein Zuwenig an Apoptose in der Peripherie im Zusammenspiel mit einem Zuviel an Apoptose im ZNS eine entscheidende Rolle für die Krankheitsentstehung der MS spielen: Einerseits führt eine eingeschränkte Apoptose zur pathologischen Persistenz aktivierter myelinspezifischer T-Zellen. Andererseits wird auf der Endstrecke der entzündlichen Reaktion Glia- und eventuell auch Nervenzellgewebe durch apoptotischen Zelluntergang geschädigt (Zipp, 2000).

Die zentrale pathogenetische Bedeutung autoreaktiver T-Zellen wird nicht zuletzt auch durch die Auslösung der Transfer-EAE in gesunden Versuchstieren durch die Übertragung aktivierter spezifischer T-Zellen, die Myelin oder Gliaproteine erkennen, belegt (Martin und McFarland, 1995). Dennoch stellt die bloße Existenz myelinspezifischer T-Zellen in einem Individuum noch keine Gefahr dar, solange diese nicht aktiviert sind. Obwohl man annimmt, dass schon während der Antigenprägung im Thymus jene T-Vorläuferzellen, die eine hohe Affinität zu körpereigenen Epitopen aufweisen, im Rahmen der negativen Selektion durch Apoptose eliminiert werden, sind myelinspezifische T-Zellen auch bei gesunden Probanden nachgewiesen worden (Fowlkes et al., 1988;Jenkinson et al., 1989). Solche T-Zellen könnten nun durch eine Aktivierung klonal proliferieren und sich zu Effektorzellen differenzieren. Die T-Zell-Antwort kann im Verlauf der MS erstaunlich stabil bleiben oder sich auf andere Epitope oder gar Proteine („epitope spreading“) ausdehnen (Goebels et al., 2000).

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Im gesunden Individuum wirken effektive Kontrollmechanismen der Aktivierung autoantigener T-Zellen entgegen: Eine Aktivierung voraktivierter T-Zellen führt zu einer apoptotischen Eliminierung durch den CD95- oder TNF-abhängigen AICD und ein Kontakt naiver T-Zellen mit nicht-professionellen APC zu Anergie (aktivierungsrefraktärer Zustand) (Janeway et al., 1999). Seit kurzem wird vermutet, dass neben dem AICD auch regulatorische CD4+CD25+-T-Zellen an der Selbsttoleranz des Immunsystems beteiligt sein könnten (Viglietta et al., 2004). Tierversuche hatten nämlich gezeigt, dass eine Depletion dieser Supressor-Zellen zur Auslösung von systemischen Autoimmunphänomen bei Mäusen führt (Sakaguchi, 2000).

1.3.1  Bedeutung des CD95 Signalweges

Die Bedeutung des CD95 Signalwegs für die spezifischen Begrenzung immunologischer Reaktionen wird durch zwei Knock-out Mausmodelle deutlich: lpr/lpr (lymphoproliferation) Mäuse haben keinen funktionierenden CD95-Rezeptor und dienen als ein Tiermodell für den systemischen Lupus erythematodeus (SLE); gld/gld (generalized lymphoproliferative disease) Mäuse besitzen kein CD95L und entwickeln eine generalisierte Lymphoproliferation. Außerdem entwickeln gld-Mäuse ein vergleichsweise schweres Krankheitsbild in der passiven Transfer-EAE (Sabelko-Downes et al., 1999). Beide Mausarten sind nicht in der Lage, mit Hilfe des CD95-Systems autoreaktive Lymphozyten zu eliminieren. Menschen mit einem ähnlichem Phänotyp, z.B. mit einem Canale-Smith Syndrom oder autoimmunem lymphoproliferativen Syndrom, haben ebenfalls Mutationen im CD95-Genabschnitt (Nagata, 1998;Rieux-Laucat et al., 1995).

Neuere Befunde sprechen für eine Fehlregulation des AICD bei MS-Patienten, die zum Überleben aktivierter autoreaktiver T-Zellen führt (Zang et al., 1999;Zipp et al., 1998). Als Ursache hierfür kommen die von Zipp et al. nachgewiesenen erhöhten Konzentrationen an sCD95 in Serum und Liquor von MS-Patienten in Betracht. sCD95 ist in der Lage an CD95L zu binden, und somit Apoptose zu verhindern (Zipp et al., 1998). Möglicherweise kann es so zu einer Verminderung des AICD kommen (Abb.3).

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Abbildung 3 : Modulation des AICD durch lösliches CD95

Interessanterweise korrelierten die sCD95-Serumkonzentrationen der im Verlauf beobachteten Patienten auch mit dem Grad der Behinderung, gemessen als „expanded disability status scale“, EDSS (Kurtzke, 1983). Zudem kam es unter Behandlung mit IFN-β-1b nach einem initialen Anstieg zu einer Reduktion der sCD95-Serumkonzentrationen und zur Besserung des Krankheitsverlaufes. Diese Effekte konnten bei Patienten, die neutralisierende Antikörper gegen IFN-β (NAB) entwickelten, nicht festgestellt werden (Zipp et al., 1998).

Auch die Expression von CD95L bei MS wurde gegenüber gesunden Kontrollpersonen als signifikant höher beschrieben (Huang et al., 2000). Im Gegensatz dazu besteht wahrscheinlich kein Zusammenhang zwischen MS und dem Ausmaß der Expression von CD95 auf peripheren Blutzellen und T-Zellen (Huang et al., 2000;Zipp et al., 1998).

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Das CD95-System ist nicht nur bedeutsam für die Homöostase des Immunsystems, sondern hat möglicherweise auch gewebeschädigende Wirkungen im Rahmen von Entzündungsreaktionen. Obwohl unklar ist, ob die Apoptose der vorherrschende Mechanismus für die Gewebsschädigung in der MS ist (Dowling et al., 1997), gibt es Hinweise für eine vermehrte Expression von CD95L auf Mikroglia, T-Zellen, Astrozyten und Oligodendrozyten in MS-Plaques (D'Souza et al., 1996;Dowling et al., 1997). Auch im normalen menschlichen ZNS ist funktionell aktives CD95L auf Neuronen und perivaskulär gelegenen Astrozyten nachweisbar und könnte einen wichtigen Mechanismus für das Immunprivileg des ZNS darstellen (Bechmann et al., 1999;Bechmann et al., 2002).

Der programmierte Zelltod hat nicht nur für die Initiation, sondern auch für die Modulierung und Beendigung von Entzündungsreaktionen eine Bedeutung. So ist bei der EAE in der Remissionsphase eine erhöhte intrazerebrale Apoptose von T-Zellen nachweisbar (Schmied et al., 1993).

1.3.2 Bedeutung des TRAIL Signalweges

Während TRAIL in der Lage ist, in vielen Tumorzellen Apoptose auszulösen, sind eine Reihe nicht-transformierter Zellen resistent gegen TRAIL (Walczak, 1999). Das Gleiche gilt für normale T-Zellen: Sie sind resistent gegen lösliches trimerisiertes TRAIL (Wendling et al., 2000). Tiermodellstudien für Autoimmunkrankheiten dagegen fanden Anhalt für eine Beteiligung des TRAIL-Systems an der Inhibition von Autoimmunkrankheiten (Hilliard et al., 2001;Song et al., 2000). Song et al. behandelten Mäuse mit experimentell induzierter Rheumatoider Arthritis (RA) mit rekombinantem löslichen DR5 (sDR5). sDR5 ist in der Lage, den Apoptose auslösenden Effekt von TRAIL in Tumorzellen zu blockieren. Im RA-Mausmodell wurde der Krankheitsverlauf durch die systemische Behandlung mit sDR5 gegenüber Kontrollgruppen signifikant exazerbiert. Dagegen konnte der Krankheitsverlauf durch intraartikuläre Injektion von mit dem TRAIL-Gen transfizierten Viren temporär gemildert werden. Ein Jahr später reproduzierten Hilliard et al. dieses Ergebnis im MS-Tiermodell, der EAE. Der Schweregrad der Krankheit und der ZNS-Entzündung war nach systemischer TRAIL-Blockade signifikant erhöht. Diese Ergebnisse implizieren, dass die systemische Blockade von TRAIL zur Steigerung von Autoimmunprozessen führen kann und TRAIL eine wichtige Rolle in der Homöostase des Immunsystems spielt.

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Interessanterweise konnte in Experimenten von Hilliard et al. kein Unterschied in der Apoptose-Aktivität im ZNS zwischen Kontroll- und behandelten Tieren festgestellt werden. Stattdessen ergaben sich Hinweise darauf, dass TRAIL regulatorisch auf den Zellzyklus wirkt, indem es die Progression von der G1-Phase zur S-Phase unterbindet (Song et al., 2000).

Studien in humanem Hirnbiopsiegewebe zeigten die Abwesenheit von TRAIL, aber die Expression von Apoptose-vermittelnden (DR4 und DR5) und Apoptose-inhibierenden TRAIL-Rezeptoren (DcR1 und DcR2) auf Oligodendrozyten und Neuronen (Dorr et al., 2002). Damit wäre eine Induktion von Apoptose in Neuronen durch eindringende, TRAIL-exprimierende T-Zellen z.B. im Rahmen eines Autoimmunprozesses denkbar. Nitsch et. al. (Nitsch et al., 2000) konnten in Experimenten mit humanen Hirnschnittkulturen die Wahrscheinlichkeit einer solchen Hypothese stützen. Obwohl TRAIL in Mäusen als nicht neurotoxisch charakterisiert wurde (Roth et al., 1999), konnte sTRAIL in relativ hoher Konzentration Apoptose in humanen Neuronen, Oligodendrozyten und Mikrogliazellen auslösen.

Ein weiteres Argument für eine mögliche Beteiligung des TRAIL-Systems an der MS-Pathogenese ergibt sich aus den Veröffentlichungen von Huang et al. Allerdings steht die von Huang et al. nachgewiesene signifikant erhöhte TRAIL-mRNA Expression in PBMC´s von MS-Patienten gegenüber Gesunden scheinbar im Widerspruch zu den oben beschrieben Experimenten von Song et al. und Hilliard et al. (Huang et al., 2000). Dennoch wäre eine Erhöhung der TRAIL-Expression als Gegenregulation des Körpers auf Autoimmunprozesse vorstellbar.

1.4 Fragestellung

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Das Ziel dieser Arbeit ist es, zu einem besseren Verständnis der Regulation und Bedeutung des (A) TRAIL-Rezeptor/TRAIL-Systems und (B) des CD95/CD95L-Systems für die Pathogenese der Multiplen Sklerose beizutragen.

Zusammenfassend lassen sich die Ziele dieser Arbeit folgendermaßen darstellen:

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(A)

(1) Welche Zellen sind in der Lage, TRAIL auf der Zelloberfläche zu exprimieren oder lösliches TRAIL zu sezernieren?

(2) Wie wird die Expression membranständigen und löslichen TRAILs reguliert? Welche Wirkung hat das in der Langzeitbehandlung der MS erfolgreich eingesetzte Therapeutikum IFN-β auf die TRAIL-Expression?

(3) Gibt es Unterschiede in der TRAIL-Expression zwischen MS-Kranken und gesunden Probanden?

(4) Gibt es neben der Apoptose noch andere Effektormechanismen von TRAIL?

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(B)

(5) Welche Zellen sind in der Lage, sCD95 zu sezernieren?

(6) Wie wird die Expression von sCD95 reguliert? Welche Wirkung hat das in der Langzeitbehandlung der MS erfolgreich eingesetzte Therapeutikum IFN-β auf die sCD95-Expression?

(7) Gibt es Unterschiede in der sCD95-Expression zwischen gesunden Probanden und MS-Kranken?

(8) Kann die verringerte Krankheitsaktivität der MS während der Schwangerschaft mit Veränderungen der Expression von sCD95 in Zusammenhang gebracht werden?

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Zu (1), (2) und (3): Unter der Annahme, dass die Expression von TRAIL-mRNA und somit TRAIL-Protein bei MS-Patienten gegenüber Gesunden tatsächlich erhöht ist (Huang et al., 2000), stellt sich die Frage, welche peripheren Immunzellen überhaupt dazu beitragen. Im Mittelpunkt der MS-Forschung steht traditionellerweise das T-Zellsystem (Zipp, 2000). Zu Beginn der hier beschriebenen Experimente gab es bereits Hinweise auf eine Oberflächenexpression von TRAIL auf T-Zellen (Martinez Lorenzo et al., 1998). Die Frage, ob T-Zellen oder andere Immunzellen sTRAIL mit möglicher systemischer Wirkung produzieren, hat große pathogenetische Relevanz. Daher wurden T-, B-Zellen und Makrophagen aus menschlichem Blut u.a. mittels magnetischer Zellsortierung (MACS) gewonnen, um sofort oder nach Zellkultur die sTRAIL-Produktion im ELISA und die Expression von membrangebundenem TRAIL mit einem Durchflusszytometer (FACS) zu analysieren.

Da die systemische Blockade von TRAIL im Tierversuch den Krankheitsverlauf von Autoimmunkrankheiten verschlimmert (Hilliard et al., 2001;Song et al., 2000), sollte zusätzlich überprüft werden, unter welchen Bedingungen die TRAIL-Expression zunimmt. Dazu wurden Immunzellen mit bekannten zellspezifischen Stimuli aktiviert. Weiterhin sollte die Hypothese überprüft werden, dass der immunomodulatorische Effekt von dem in der MS-Therapie erfolgreich eingesetzten IFN-β(Kieseier und Hartung, 2003) auch durch eine Interferenz mit dem TRAIL-System entsteht. Für diese Hypothese bestanden Hinweise aus den Experimenten von Kayagaki et al., die einen Einfluss von Typ-I-Interferonen auf TRAIL nachwiesen (Kayagaki et al., 1999). Deshalb wurden Leukozyten in parallelen Ansätzen mit IFN-β inkubiert. Die Funktionsfähigkeit des nachgewiesenen sTRAIL wurde in Apoptosenachweisen mit TRAIL-suszeptiblen Zellen getestet.

Durch die Kenntnis der Regulation und Expression von TRAIL lassen sich Hypothesen über dessen Wirkung im Rahmen der Pathogenese der MS aufstellen. Doch bestehen tatsächlich Unterschiede in der Expressionsstärke von löslichem oder membrangebundenem TRAIL zwischen MS-Patienten und gesunden Probanden, die zu einer Krankheitsentstehung beitragen? Um mögliche Aberrationen des TRAIL-Systems im MS-Krankheitsprozess zu erkennen, wurde die TRAIL-Expression von PBMC von MS-Patienten und Kontrollpersonen verglichen.

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Zu (4): Unter den sich verdichtenden Hinweisen, dass TRAIL keine Apoptose in menschlichen Immunzellen auslöst (Wendling et al., 2000), sollte hier der Frage nachgegangen werden, inwieweit TRAIL dennoch immunomodulatorisch wirken kann. Aus den Tierversuchen von Song et al. und Hilliard et al. ergaben sich Anhaltspunkte für eine mögliche hypoproliferative Wirkung von TRAIL (Hilliard et al., 2001;Song et al., 2000). Eine weitere hier zu untersuchende Hypothese war deshalb die Inhibition der Aktivierung und Proliferation von humanen T-Zellen durch TRAIL. Dazu wurde die Proliferation von stimulierten humanen T-Zelllinien nach Inkubation mit TRAIL bestimmt sowie die Zytokinkonzentrationen im Zellkulturüberstand von diesen Zellen analysiert.

Zu (5), (6) und (7): Die Oberflächenexpression von CD95 ist relativ gut erforscht (Huang et al., 2000;Zipp et al., 1998). Weniger klar war, durch welche Zellpopulationen sCD95 sezerniert wird. Da sCD95 im Serum von MS-Patienten erhöht ist und mit einer zunehmenden Behinderung der Patienten korreliert (Zipp et al., 1998), erschien es wichtig zu ergründen, welche Zellreihen für die erhöhten sCD95-Konzentrationen verantwortlich gemacht werden können. Natürlich trägt auch die Kenntnis der Regulation der sCD95-Sekretion in den verschieden Zellreihen zu einem besseren Verständnis des MS-Krankheitsgeschehens bei. Besonders interessant erschien hier wiederum die durch Zipp et al. gefundene Herabregulation der sCD95-Serumkonzentration nach IFN-β Therapie (Zipp et al., 1998). Deshalb wurden humane T-, B-Zellen und Makrophagen isoliert, zum Teil kultiviert und stimuliert bzw. IFN-β ausgesetzt, um dann sCD95 im Zellkulturüberstand mittels eines ELISA zu bestimmen.

Zusätzlich wurde geprüft, ob den erhöhten Serumkonzentrationen bei MS-Patienten Unterschiede in der Sekretion von sCD95 in vitro im Vergleich zu Gesunden zugrunde liegen.

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Zu (8): Wenn niedrige sCD95-Konzentrationen im Serum zu niedrigerer Krankheitsaktivität führen, stellt sich die Frage, ob der vielfach beobachtete benignere Verlauf der MS in der Schwangerschaft (Birk et al., 1990;Birk et al., 1988) ebenfalls mit reduzierten sCD95-Serumkonzentrationen assoziiert ist oder ob andere immunomodulatorische Effekte dafür in Betracht gezogen werden müssen. Um diese Frage zu beantworten, wurde sCD95 im Serum einer großen Gruppe MS-kranker Schwangeren vor, zu mehreren Zeitpunkten während, sowie nach der Schwangerschaft bestimmt. Die relativ heterogenen Daten wurden mit multivariaten statistischen Methoden ausgewertet.


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27.10.2006