2 Materialien und Methoden

2.1  Patientenkollektiv und gesunde Kontrollen – Gewinnung der Proben

↓26

In dieser Studie wurden humane Leukozyten von MS-Patienten und gesunden Kontrollindividuen (im Text auch als „gesunde Probanden“, „gesunde Kontrollen“ oder „Gesunde“ bezeichnet) kaukasischer Abstammung im Alter von 18-55 Jahren verwendet. Einschlusskriterien für Patienten waren klinisch manifeste MS (McDonald et al., 2001), ein schubförmig remittierender (RRMS) Krankheitsverlauf mit mindestens zwei Schüben in den letzten zwei Jahren sowie eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie. Einschlusskriterium für gesunde Kontrollindividuen war die Abwesenheit von MS und anderer neurologischer Erkrankungen sowie eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie.

Immunosuppressive oder -modulierende Behandlung in den letzten sechs Monaten vor Blutentnahme sowie Anzeichen von infektiösen, malignen, metabolischen oder anderen systemischen Erkrankungen führten zum Ausschluss des Spenders aus der Studie. Blut wurde mit Lithium-Heparin-Monovetten abgenommen und innerhalb von zwölf Stunden weiter verarbeitet.

↓27

Für die Analyse von sCD95-Konzentrationen im Serum von schwangeren MS-Patientinnen galten die gleichen Bedingungen, allerdings wurde hier eine immunosuppressive oder -modulatorische Therapie innerhalb der letzten sechs Monaten nicht als Ausschlusskriterium definiert. Serum wurde mit Hilfe von Serumröhrchen gewonnen, zentrifugiert, in Eppendorfgefäße überführt und bei –80°C bis zur Proteinbestimmung gelagert.

2.2 Zellisolation

2.2.1  Separation peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC)

Prinzipien

Die Methode basiert auf der unterschiedlichen Dichte verschiedener Zellen. Es werden Dichtegradienten verwendet, um mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC), die eine niedrige Dichte haben, von Erythrozyten und Granulozyten, die eine hohe Dichte haben, zu trennen. Gleichzeitig werden lebende Zellen (niedrige Dichte) von toten Zellen (hohe Dichte) getrennt.

↓28

Prozedur

In 50ml-Röhrchen wurden Dichtegradienten hergestellt, indem 15ml Ficoll-Lösung (Lymphoprep) mit 25ml Blut überschichtet wurden. Die anschließende Gradientenzentrifugation erfolgte bei 700g bei Raumtemperatur (RT) über 40min ohne Bremse. Dabei formten PBMC und Thrombozyten einen Ring an der Gradientenzwischenschicht, während Erythrozyten und Granulozyten ein Pellet am Boden des Röhrchens bildeten.

Der Lymphozytenring wurde mit einer sterilen Pasteurpipette in ein neues 50ml Röhrchen überführt und erneut bei 500g und RT über 20min zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde abgenommen und das Zellpellet in 20ml PBS resuspendiert und erneut bei 500g und RT über 15min zentrifugiert. Das entstandene Zellpellet wurde in 10ml Waschmedium aufgelöst, die Zellen wurden in einem Neubauer-Hämatozytometer gezählt (s.u.) und weiter verarbeitet.

2.2.2 Kryokonservierung peripherer mononukleärer Blutzellen

↓29

Zellen wurden bei -80°C eingefroren, um später Experimente mit PBMC von verschiedenen unbehandelten MS-Kranken in Remission zum gleichen Zeitpunkt durchführen zu können.

Durchführung

Die Zellsuspension wurde in ein steriles 50ml Röhrchen überführt und in Neubauer- Hämatozytometern gezählt. T-Zellen wurden in einer Konzentration von 3x106/ml und PBMC in einer Konzentration von 107/ml in 0,5ml Einfriermedium aufgenommen. Anschließend wurden 0,5ml einer 20%igen eiskalten Dimethylsulfoxid-(DMSO)-Lösung hinzugegeben, um die zellschädigende Bildung intrazellulärer Eiskristalle beim Einfriervorgang zu verhindern. Die Suspension wurde in auf Eis gelagerte Kryoröhrchen überführt, welche dann zum langsamen Abkühlen der Zellen für weitere zwei Stunden in einer Styroporbox bei -20°C gelagert wurden. Danach wurden die Kryoröhrchen in den Stickstofftank überführt und bei -80°C aufbewahrt.

↓30

Die sachgemäße Durchführung der Kryokonservierung wurde kontrolliert, indem bei jedem Auftauprozess die Proliferationsfähigkeit der Zellen im [3H]Thymidintest nachgewiesen (s.u.) wurde.

2.2.3 Auftauen der kryokonservierten peripheren mononukleären Blutzellen

Das Auftauen von Zellen musste zügig erfolgen, damit gebildete Eiskristalle rasch auftauten und das zellschädigende DMSO möglichst schnell verdünnt wurde. Zum Auftauen wurde speziell angefertigtes Auftaumedium verwendet (s.u.).

Durchführung

↓31

Ein Kryoröhrchen mit der eingefrorenen Zellsuspension wurde aus dem Stickstofftank genommen und sofort in einen mit 37°C warmem Wasser gefüllten Behälter gegeben. Dort wurde es solange geschwenkt, bis sich ein nur noch linsengroßes Eiskristall in der Suspension befand. Anschließend wurde das Kryoröhrchen sofort auf Eis gestellt und unter sterilen Bedingungen mit einer Eppendorfpipette in ein steriles Falcon-Röhrchen mit 10ml Auftaumedium überführt. Die Zellen wurden bei 800g und RT über 10min abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit Waschmedium gelöst und gezählt. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/ml in FCS-Medium suspendiert (Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-Medium 1640, ergänzt mit 100U/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin und 10% Fetalem Kälber Serum, nachfolgend als „FCS-Medium“ bezeichnet).

2.2.4 Magnetische Zelltrennung (MACS)

Prinzipien

Magnetische Zelltrennung (magnetic cell sorting, MACS) wird verwendet, um spezifische Zellpopulationen zu isolieren. Dafür werden spezifische monoklonale Antikörper (AK), an die kleine magnetische Partikel (20-100nm im Durchmesser, sogenannte Microbeads) gekoppelt sind, genutzt. Die Zellen werden mit dem gewünschten gekoppelten Antikörper inkubiert und dann gewaschen, um den Überschuss an nicht gebundenen Antikörpern zu entfernen. Anschließend wird die hochkonzentrierte Zellsuspension durch eine Säule geleitet, die ferromagnetische Matrix enthält und sich in einem Magnetfeld befindet. Die mittels der gekoppelten Antikörper magnetisch markierten Zellen verbleiben in der Säule, während die unmarkierten Zellen die Säule mit der Flüssigkeit verlassen. Nach Entfernung des Magnetfelds, kann man die markierten Zellen aus der Säule spülen.

↓32

Die MACS-Technik kann zur positiven und negativen Selektion von spezifischen Zellpopulationen verwendet werden.

Isolation von T-, B-Zellen und Monozyten

Für alle Schritte wurden 50ml Falcon-Röhrchen verwendet und alle Zentrifugationsvorgänge wurden bei 500g und 8°C für 10min ausgeführt. Frisch isolierte PBMC wurden in eiskaltem MACS-Trennpuffer, bestehend aus PBS, 2mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), und 5% FCS gelöst. Die Zellsuspension wurde durch Filter (Milipore) geleitet, um Zellverklumpungen und tote Zellen abzutrennen. Ein Teil der PBMC wurde nun auf Eis für Kontrollexperimente wie Proliferationsanalysen und FACS aufbewahrt. Der andere Teil, maximal 5x107 PBMC, wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit Trennpuffer und 20μl Microbeads pro 107 Zellen in einem Endvolumen von 100μl pro 107 PBMC suspendiert. Für den ersten Schritt wurden anti-CD14-AK-gekoppelte Microbeads (für Monozyten) benutzt. Die Zell-Microbead-Suspension wurde für 15min bei 8°C inkubiert und anschließend mit 10ml Trennpuffer aufgefüllt und zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 500μl Trennpuffer gelöst. Mit ferromagnetischer Matrix gefüllte Säulen der Größe MS wurden im Magnetfeld platziert und einmal mit Trennpuffer gespült. Die Säulen dieser Größe können mit maximal 2x108 Zellen beladen werden, aber nur 107 Zellen zurückhalten. Anschließend wurden die markierten Zellen in Suspension appliziert, und das Eluat und die Flüssigkeit der nachfolgenden drei Spülvorgänge mit Trennpuffer wurden als negative, d.h. keine Microbeads enthaltende, Fraktion in einem Röhrchen aufgefangen. Nun wurde die Säule aus dem Magnetfeld entfernt und die positive Fraktion wurde mit 1ml Trennpuffer unter Druck mit einem Pfropfen herausgespült. Die so erhaltene positive Fraktion wurde mittels FACS-Technik auf ihre Reinheit geprüft und dann für weitere Experimente oder Zellkulturen verwendet.

↓33

Die negative Fraktion wurde mit Trennpuffer zweimal gewaschen und dann für eine erneute magnetische Trennung mit zunächst anti-CD19-AK-gekoppelten Microbeads (für B-Zellen) und in einem dritten Schritt mit anti-CD3 Microbeads (für T-Zellen) verwendet.

2.3 Zellkultur

2.3.1  PBMC

Frisch isolierte oder kryokonservierte PBMC wurden generell in einer Konzentration von 1x106/ml in FCS-Medium suspendiert und in 48-well oder 96-well Mikrotiterplatten alliquotiert. Je nach Ansatz wurden die Zellen nicht stimuliert (Kontrolle) oder mit einer der folgenden Agenzien aktiviert:

↓34

Die Inkubation erfolgte im Brutschrank (37°C, 5% CO2–Gehalt). Für einige Experimente wurden Mikrotiterplatten mit 10µg/ml anti-CD3-AK (αCD3) und anti-CD28-AK (αCD28) über Nacht bei 4°C beschichtet und anschließend dreimal mit PBS gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen. CD3 ist ein mit dem T-Zellrezeptor assoziiertes Protein und CD28 ist der Rezeptor für das ko-stimulatorische Signal (B7.1 und B7.2). Wenn der T-Zell-Rezeptor/CD3-Komplex durch einen Peptid-HLA-II-Komplex bzw. einen entsprechenden anti-CD3-AK aktiviert wird und zusätzlich CD28 durch B7 oder durch den hier benutzten CD28-Antikörper gebunden wird, führt dies zur Verstärkung der IL-2-Synthese, zur T-Zell-Proliferation und zur Entwicklung von T-Effektorzellen aus naiven T-Zellen (Janeway et al., 1999). Die Stimulation mit αCD3+αCD28 simuliert also eine Stimulation mit professionellen APC.

2.3.2 PBMC-Subgruppen

Die mittels MACS-Technik isolierten PBMC-Subgruppen wurden unter den gleichen Bedingungen wie die ungetrennten PBMC kultiviert. Die unterschiedlichen Subgruppen wurden mit jeweils einem der folgenden Stimuli aktiviert (Tabelle 2):

Tabelle 2 : Stimulation der PBMC-Subgruppen

Stimulus

T-Zellen (CD3 + )

B-Zellen (CD19 + )

Monozyten (CD14 + )

Spezifisch

1μg/ml PHA+20U/ml IL-2

2,5ng/ml IL4 und 1μg/ml anti-CD40-AK

50ng/ml LPS

oder 0,01% SAC

Unspezifisch

10–1000IU IFN-β-1a

10–1000 IU IFN-β-1a

10–1000IU IFN-β-1a

2.3.3 Humane antigenspezifische T-Zelllinien

↓35

In dieser Studie wurden humane antigenspezifische CD4+-Lymphozytenlinien von MS-Patienten sowie von gesunden Kontrollindividuen verwendet. Die T-Zellen waren spezifisch gegen MBP, TT oder gegen BP.

Split-well-Technik:

Die antigenspezifischen T-Zelllinien wurden mittels eines modifizierten „split-well-Verfahrens“ etabliert (Zipp et al., 1997). Dazu wurden 2x105 PBMC von gesunden Probanden mit einem Antigen (20pg/ml MBP oder 10µg/ml TT oder 5µg BP) in 200µl Kulturmedium in einer 96-well Mikrotiterplatte inkubiert. Nach sieben Tagen wurden 10U/ml rekombinantes humanes IL-2 als T-Zellstimulus zugeführt. Nach weiteren fünf bis sieben Tagen wurden jeweils 100µl Zellsuspension entnommen und auf je zwei Vertiefungen einer neuen Mikrotiterplatte verteilt (split-well). Anschließend wurden in An- und Abwesenheit von Antigen 1x105 autologe bestrahlte (3000 rad) PBMC zur Antigenpräsentation hinzugegeben. Zum Nachweis der Antigenspezifität wurde der Stimulationsindex (s.u.) als Maß für die Antigenspezifität errechnet. T-Zellpopulationen, die nach Antigenzugabe einen Stimulationsindex >3 aufwiesen, waren spezifisch für das jeweilige Antigen und wurden weiter kultiviert.

↓36

Die Th-Differenzierung der T-Zelllinien wurde anhand des Quotienten an IFN-γ und IL-4-Produktion bestimmt. Überwiegende IFN-γ-Färbung bei intrazellulärer Durchflusszytometrie (Zipp et al., 1998) kennzeichnete eine Th1-Zelllinie; überwiegende IL-4 Färbung eine Th2-Linie und Doppelfärbung eine so genannte Th0-Linie (Lunemann et al., 2002).

Aktivierung der antigenspezifischen T-Zellen

Um eine Abhängigkeit der TRAIL- bzw. sCD95-Expression vom Funktionszustand der T-Zellen zu untersuchen, wurden Experimente mit aktivierten und nicht aktivierten T-Zellen einander gegenübergestellt. Dazu wurden zunächst 48-well-Zellkulturplatten mit αCD3+αCD28 (10µg/ml in PBS) über Nacht bei 4°C beschichtet und anschließend mit PBS gewaschen. Zur Aktivierung wurden die T-Zellen ebenfalls gewaschen und in einer Konzentration von 1x106 Zellen/ml in FCS-Medium aufgenommen. Pro beschichtetes well wurden 1x106 Zellen ausgesät. Nach 24h Inkubation ließ sich ein morphologischer Unterschied zwischen aktivierten und ruhenden T-Zellen feststellen.

↓37

Zusätzlich wurden T-Zellen auch mit Antigen und antigenpräsentierenden Zellen aktiviert. Dazu wurden 0,75x106 autologe bestrahlte (3000rad) PBMC zur Antigenpräsentation (APC) zusammen mit dem Antigen und 20U rekombinantem humanem IL-2 zu 0,25x106 antigenspezifischen T-Zellen gegeben. Als Alternative diente die Stimulation mit 1μg/ml PHA + 20U/ml IL-2.

2.3.4 Transformierte Zellen

Jurkat-Zellen sind Zellen eines humanen akuten lymphatischen T-Zell-Lymphoms (TIB-152, ATCC, Manassas, USA). Sie dienten in einigen Experimenten als Kontroll- oder Targetzellen. Die Kultur erfolgte in FCS-Medium.

2.4 ELISA

2.4.1  Allgemeines Prinzip

Die Bestimmung von sTRAIL und sCD95 sowie der Mediatoren IFN-γ und Interleukin-4 erfolgte mittels „sandwich“ Enzym-linked-immunoassay (ELISA).

↓38

Die Mikrotiterplatten der käuflich erworbenen ELISAs sind mit einem monoklonalen Antikörper gegen die zu untersuchende Substanz beschichtet (erster Antikörper). Zuerst wurden die Standardproben und die zu untersuchenden Proben in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert und reagierten mit dem ersten Antikörper. Nach Abschluss der Reaktion wurden überschüssige Bestandteile der Proben durch Waschschritte entfernt. Nach Zugabe von Meerrettichperoxidase-markierten polyklonalen Antikörpern (zweiter Antikörper) konnte sich in einer anschließenden Inkubation ein Sandwich-Komplex aus dem ersten Antikörper, der zu untersuchenden Substanz in der Probe und dem enzymmarkierten zweiten Antikörper bilden. Überschüssiger enzymmarkierter Antikörper wurde durch Waschen entfernt. Mit Zugabe der chromogenen Lösung (Tetramethylbenzidin) begann die Bildung eines farbigen Endproduktes, wobei die Farbintensität proportional der Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe oder in den Standardproben war. Diese Reaktion wurde durch Zugabe einer Säurelösung beendet. Anschließend wurde die Absorption des farbigen Endproduktes bei 450 nm gemessen und ausgewertet.

Durch das Mitführen von Standardproben bekannter Konzentration wurde eine Referenzgerade erstellt, mit der die Konzentration der Proben berechnet werden konnte. Der Leerwert, die Standardproben und die Proben wurden jeweils als Doppelwert gemessen.

2.4.2 Die Bestimmung von sTRAIL in Zellkulturüberständen

Die Bestimmung von humanem sTRAIL in Zellkulturüberständen und Serum erfolgte mittels eines ELISA (Soluble TRAIL/APO2L ELISA-Kit) von DIACLONE, Besancon, Frankreich.

↓39

Dazu wurden die Zellkulturplatten bei 500g für 10min zentrifugiert und jeweils 0,15ml der Überstände in Rundbodenplatten überführt und bei 700g für 10min erneut zentrifugiert. Nun wurden 100μl aus den Rundbodenplatten auf die vorbeschichteten Platten des TRAIL-ELISA überführt. Alle weiteren Schritte wurden nach der Durchführungsvorschrift des Herstellers vollzogen. Die Messung der Extinktion erfolgte bei 450nm innerhalb von 30min mit einer Referenzwellenlänge von 620nm. Die Sensitivität dieses Testsystems liegt laut Hersteller bei 64pg/ml. Die Ergebnisse der Experimente dieser Studie gaben Hinweise, dass erst Werte über 90pg/ml als verlässlich zu betrachten sind.

2.4.3 Die Bestimmung von IFN-γ in Zellkulturüberständen

Die Bestimmung von humanem IFN-γ in Zellkulturüberständen erfolgte mittels des „Human Interferon Gamma ELISA-Kits“ der PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, USA. Die Zellkulturplatten wurden bei 500g für 10min zentrifugiert und jeweils 0,15ml der Überstände in Rundbodenplatten überführt und bei 700g für 10min erneut zentrifugiert. Nun wurden 100μl auf die vorbeschichteten Mikrotiterplatten des ELISA-Kits überführt. Alle weiteren Schritte wurden nach der Durchführungsvorschrift des Herstellers vollzogen. Die Sensitivität dieses Testsystems liegt laut Hersteller bei 10 – 500pg/ml. Der ELISA ist spezifisch für IFN-γ und hat keine Kreuzreaktionen mit IFN-α oder IFN-β.

2.4.4 Die Bestimmung von IL-4 in Zellkulturüberständen

Die Bestimmung von humanen IL-4 in Zellkulturüberständen erfolgte mittels des ELISAs Quantikine® der R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Deutschland. Die Überstände wurden nach dem gleichen Verfahren, wie oben beschrieben, gewonnen und es wurde 50µl Überstand pro Probe auf die Mikrotiterplatte gegeben. Die Durchführung erfolgte laut Herstellerangaben. Die Nachweisgrenze dieses Testsystems liegt laut Hersteller bei 10,0pg/ml.

2.4.5 Die Bestimmung von sCD95 im Zellkulturüberstand oder Serum

↓40

Konzentration der Zellkulturüberstände

Da die Konzentration von sCD95 in Zellkulturüberständen unter der Nachweisgrenze des ELISA-Kits lag, mussten die Zellkulturüberstände konzentriert werden. Zwei Verfahren wurden dazu getestet.

(a) Vakuumkonzentration

↓41

Kleine Flüssigkeitsmengen (bis zu 4ml) aus Proben mit nichtflüchtigen Substanzen in wässriger Lösung können mit einem Vakuumkonzentrator volumenreduziert werden. Mit einer Pumpe, die annährend ein Vakuum erzeugte, wurden die Proben in einer temperierbaren Vakuumzentrifuge vom Lösungsmittel befreit. 24h vor der Durchführung des ELISA wurden die Pellets im Lösungspuffer des ELISA durch Vortexen gelöst. Die klaren Lösungen wurden auf die Mikrotiterplatte des ELISA aufgetragen.

(b) Azetonfällung

Proteine lassen sich mit Hilfe von Azeton aus einer Lösung fällen. Hierzu wurden die Überstände mit einer Eppendorf-Pipette, zentrifugiert und in ein neues 15ml Falcon-Röhrchen überführt. Anschließend wurden die Überstände mit der fünffachen Volumenmenge an Azeton, welches zuvor auf -20°C abgekühlt wurde, gemischt. Diese Suspension wurde für 15min bei -20°C inkubiert und anschließend bei 1500g für 15min zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Pellets über Nacht getrocknet. 24h vor der Durchführung des ELISA wurden die Pellets im Lösungspuffer des ELISA-Kits durch Vortexen gelöst. Die klaren Lösungen wurden auf die Mikrotiterplatte des ELISA aufgetragen.

↓42

Die Azetonfällung war, bei gleichen Ergebnissen, die einfachere Methode und wurde deswegen in den weiteren Experimenten angewandt (siehe Ergebnisse).

CD95 ELISA

Die Bestimmung von humanem sCD95 in Zellkulturüberständen und im Serum erfolgte mittels des sAPO-1/Fas ELISA, der zweiten Generation der Bender Medsystems Diagnostics GmbH, Wien, Österreich. Dieser ELISA erkennt alle bekannten CD95-Varianten. Die Zellkulturplatten (48-well Zellkulturplatten) wurden bei 500g für 10min abzentrifugiert und je 1ml der Überstände wurde in 1ml-Eppendorfgefäße überführt und bei 700g für 10min erneut zentrifugiert. Danach wurden die Zellkulturüberstände durch Azetonfällung konzentriert (1:10). Die Serumproben wurden nicht weiter behandelt. Der ELISA wurde gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt.

↓43

Die Sensitivität dieses Testsystems liegt laut Hersteller bei 20pg/ml. Das Testen von Leerwerten und internen Referenzwerten ergab jedoch, dass der ELISA erst ab einer sCD95-Konzentration von über 30pg/ml zuverlässig misst.

2.5 Durchflusszytometrie

2.5.1  Allgemeine Prinzipien

Die Durchflusszytometrie dient der Erfassung intra- oder extrazellulärer Proteine bzw. physikalischer und chemischer Eigenschaften von Zellen, welche sich in Suspension befinden und durch eine Messregion fließen. Sie ermöglicht es, quantitative multiparametrische Bestimmungen der Merkmale mehrerer Tausend Zellen pro Sekunde durchzuführen (Eckhardt, 1991). Das hier verwendete FACSCalibur® Durchflusszytometer saugt die Zellsuspension während der Messung an und führt sie in einem kontinuierlichen und nahezu laminaren Strom der Durchflusskammer zu. Diese enthält einen 480nm Argon-Laser und einen 630nm Diodenlaser. Die Analyse erfolgt nach dem Prinzip der angeregten Emission: tritt eine mit Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnete Zelle in den Laserstrahl ein, so werden diese Farbstoffe angeregt und strahlen ein Emissionsspektrum mit einem charakteristischem Maximum aus:

↓44

Zusätzlich analysiert das Durchflusszytometer physikalische Eigenschaften der Zellen anhand des von ihnen gestreuten Lichts. Je nach Anordnung der Streulichtdetektoren unterscheidet man zwischen nach vorne gestreutem Licht (Forward Scatter, FSC) und seitlich gestreutem Licht (Sideward Scatter, SSC):

In der Auswertung wird der Logarithmus der Fluoreszenz- und Streulichtimpulse berechnet und mit der Software CELLQuestTM graphisch dargestellt.

2.5.2 Voreinstellungen des Gerätes

↓45

Die Fluoreszenzeinstellungen des Geräts wurden regelmäßig mit „Calibrite-Beads“ der Firma Becton Dickinson kalibriert. Einen Störfaktor stellen Zelltrümmer (Debris) dar. Diese aus Erythrozyten- und Leukozytenfragmenten sowie Thrombozyten oder Immunkomplexen bestehenden Mikropartikel führen zu fehlerhaften Messergebnissen. Durch die Einstellung der Schwelle für FSC auf etwa zehn kann die Einbeziehung von Debris in die Auswertung verhindert werden (Ault und Mitchell, 1992).

2.5.3 Färbung und Kontrollen

↓46-47

Die Durchführung der Durchflusszytometrie umfasst folgende Schritte:

· Ernten der Zellen

· Blockieren unspezifischer Bindungen mit humanem IgG-AK

· Färben der Zellen (ein- oder mehrstufiges Verfahren)

· Einstellen des Durchflusszytometers

· Messen der Proben

· Auswertung der Messungen

Um die Zellen mit den oben angeführten Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren, wurden spezifische monoklonale Antikörper gegen Oberflächen- oder intrazelluläre Antigene verwendet, die fest an die Zellen binden. Die PBMC-Subpopulationen wurden mit folgenden Antikörpern differenziert, die mit Fluoreszenzfarbstoff markiert waren:

↓48

Diese Antikörper waren direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Für die Analyse der TRAIL-Expression auf der Oberfläche der Zellen wurden ungekoppelte Primärantikörper gegen TRAIL verwendet. Danach wurde mit einem gekoppelten Zweitantikörper inkubiert, der an den ersten bindet und das Signal visualisiert und amplifiziert.

Durch die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlichen Emissionsspektren kann man unterschiedliche Antigene gleichzeitig markieren und somit mehrere Teilpopulationen hinsichtlich ihrer Merkmale unterscheiden.

↓49

Zu jeder vollständigen Messreihe gehören geeignete Kontrollen:

Fluoreszenzfarbstoffe, die nicht an Antikörper gekoppelt sind, wie das hier verwendete Propidiumiodid, können auch zur Markierung toter Zellen verwendet werden (s.u.).

2.5.4 Die Bestimmung der Reinheit der magnetisch separierten Zellen

↓50

Der Erfolg und die Reinheit der Leukozytenauftrennung in T-, B-Zellen und Monozyten mit der MACS-Technik wurde durchflusszytometrisch kontrolliert. Bei der Vorbereitung der durchflusszytometrischen Messung wurden alle folgenden Schritte auf Eis oder bei 8°C durchgeführt. Alle Zentrifugationsvorgänge erfolgten bei 500g und 8°C für 10min. Ein Waschschritt bestand immer aus der Suspension der Zellen in FACS-Puffer und einer anschließenden Zentrifugation. Der Überstand wurde dekantiert.

In jedes FACS-Röhrchen wurden 2x105 Zellen gegeben und mit 1ml FACS-Puffer zweimal gewaschen. Die Zellpellets wurden nun mit 25µl FACS-Puffer als Kontrolle oder einer Lösung aus 2µl spezifischem Antikörper oder einem Isotypenantikörper und 23µl FACS-Puffer mit einer Multikanalpipette suspendiert und 30min im Dunkeln inkubiert. Folgende Antikörper bzw. Antikörperkombinationen wurden verwendet:

  1. Keine (Hintergrund)
  2. Isotyp anti-IgG1 PE und Isotyp anti-IgG1 FITC
  3. Isotyp IgG2b PE und Isotyp anti-IgG1 FITC
  4. Anti-CD3 PE (Marker für T-Zellen)
  5. Anti-CD19 PE (Marker für B-Zellen)
  6. Anti-CD14 PE (Marker für Monozyten)
  7. Anti-CD45 FITC (Marker für Leukozyten)
  8. Anti-CD3 PE und anti-CD45 FITC
  9. Anti-CD19 PE und anti-CD45FITC
  10. Anti-CD14 PE und anti-CD45 FITC

↓51

Danach wurden die Röhrchen direkt mit 1ml FACS-Puffer aufgefüllt, zentrifugiert und dekantiert. Das Pellet wurde in 300µl FACS-Puffer aufgelöst und die Suspension am Durchflusszytometer FACScalibur® gemessen und mit CELLQuestTM Software ausgewertet. Je nach Zellpopulation wurde in einer der Einzelfärbungen (3-5) und der äquivalenten Doppelfärbung (7-9) ein stark positives Signal und in den übrigen Einzelfärbungen (3-5) ein Signal gleich oder kleiner dem entsprechenden Isotyp (1-2) erwartet.

Um durch Erythrozytenverunreinigungen keine Ergebnisverfälschung zu erhalten, wurden nur die CD45-positiven-Zellen (Leukozyten) betrachtet. Die Werte wurden als „arbitrary units“ (au) dargestellt. Diese wurden aus der mittleren spezifischen Intensität des Fluoreszenzsignals der Färbung abzüglich der mittleren Intensität der Isotypenfärbung errechnet.

2.5.5 Die Bestimmung der TRAIL-Expression auf PBMC-Subgruppen

Für die Bestimmung der TRAIL-Expression auf den verschiedenen PBMC-Subgruppen wurde eine Dreifachfärbung verwendet. Ein ungekoppelter anti-TRAIL-AK und ein fluoreszenzmarkierter Zweitantikörper wurden mit einem direkt fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen ein Subgruppen-Oberflächenantigen sowie mit einer Propidiumiodidfärbung zum Ausschluss toter Zellen kombiniert. Das Färbeprotokoll war das folgende:

↓52

Die einzelnen Schritte wurden auf Eis oder bei 8°C durchgeführt. Alle Zentrifugationsvorgänge wurden bei 500g und 8°C für 10min ausgeführt. Ein Waschschritt bestand immer aus der Suspension der Zellen in 1ml FACS-Puffer und einer anschließenden Zentrifugation. Der Überstand wurde dekantiert.

Die Zellen wurden geerntet, einmal mit PBS gewaschen und für 10min mit humanem IgG inkubiert um unspezifisches Binden weiterer Antikörper zu verhindern. In jedes FACS-Röhrchen wurden 2x105 Zellen gegeben und nach einem Waschschritt mit 25µl FACS-Puffer als Kontrolle oder spezifischem Maus-anti-TRAIL-AK in einer Konzentration von 10μg/ml oder einem Maus-IgG1-Isotypenantikörper der gleichen Konzentration für 15min bei 4°C inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt wurde mit einem FITC-markierten Ziege-anti-Maus-Zweitantikörper in einer Konzentration von 10μg/ml für 30min bei 8°C im Dunkeln inkubiert. Es folgten zwei Waschschritte und anschließend die schon oben beschriebene Färbung der Subgruppenantigene mit PE markierten anti-CD3, anti-CD19 oder anti-CD14-AK bzw. deren Isotypen (allerdings ohne die korrespondierende anti-CD45-Färbung). Kurz vor der Analyse mit dem Durchflusszytometer wurde 1μg/ml Propidiumiodid zum Ausschluss toter Zellen als dritter Fluoreszenzfarbstoff zugegeben und die Probe gevortext.

2.5.6 Die Auswertung der erhobenen Daten

Die erhobenen Daten wurden mit Hilfe des Programms CELLQuestTM zunächst in einem Histogramm oder Dotplot dargestellt. Die gewünschte Population CD45+ (also Leukozyten) oder PI negativ und CD3+, CD19+ oder CD14+ wurde als „Region“ definiert. Eine Region ist eine Population von Zellen, die in Bezug auf ein Kriterium oder zwei Kriterien gewisse Eigenschaften erfüllen und auf dem Bildschirm als Bereich in Form einer Fläche (Dotplot) oder Strecke (Histogramm) dargestellt werden können. Diese Region wurde daraufhin in einem neuen Histogramm dargestellt und auf die übrige gewünschte Eigenschaft hin analysiert (Subgruppe, bzw. TRAIL-Expression). Dazu diente entweder der Mittelwert der spezifischen Färbung oder es wurden Marker gesetzt. Ein Marker kann in einem Histogramm willkürlich gesetzt werden und definiert einen unteren und oberen Grenzwert als Einschlusskriterium.

2.6 Zelltodnachweise

2.6.1  Prinzipien

↓53

Ob eine Zelle vital ist oder nicht (apoptotische Zellen, nekrotische Zellen, Debris) kann mit Farbstoff-Ausschlusstests nachgewiesen werden. Diese Tests basieren auf dem Prinzip, dass bestimmte Farbstoffe wie Trypanblau oder Propidiumiodid (PI) intakte Zellmembranen lebender Zellen nicht passieren können. Im Gegensatz dazu dringen diese Farbstoffe in tote Zellen ein und markieren diese.

2.6.2 Trypanblaufärbung

20μl einer Zellsuspension wurden 1:1 mit Trypanblau gemischt. Ein Tropfen dieser Lösung wurde auf ein Neubauer-Hämatozytometer appliziert. Tote Zellen färbten sich blau, wogegen lebende Zellen keinen Farbstoff aufnahmen. Die ungefärbten Zellen wurden unter einem binokularen Mikroskop gezählt.

Die Gesamtzahl lebender Zellen wurde folgendermaßen errechnet:

↓54

Gesamtzahl lebender Zellen = n x df x vol. x 104

Diese Prozedur wurde pro Zellsuspension zweimal durchgeführt, und es wurden zwei unabhängige Ansätze ausgezählt. Abschließend wurde der Mittelwert der errechneten Zellzahlen gebildet.

2.6.3 Propidiumiodidfärbung

↓55

Eine Propidiumiodid (PI)-Färbung wurde benutzt, um im FACS zwischen toten und lebenden Zellen zu unterscheiden. PI besitzt die Fähigkeit, mit doppelsträngiger Desoxyribonukleinsäure (DNA) zu interkalieren und bei Anregung durch UV-Licht zu fluoreszieren. Diese Fluoreszenz ist proportional dem Nukleinsäuregehalt der Zelle. Wie auch andere Farbstoffe kann PI keine intakten Zellmembranen passieren und färbt deshalb nur die DNA toter Zellen an.

PI wurde 1min vor der FACS-Analyse in einer Endkonzentration von 1μg/ml zu der Zellsuspension gegeben. Zellen die im FACS eine positive PI-Fluoreszenz zeigten, wurden ausselektiert und nicht in die Datenauswertung mit einbezogen (s.o.).

2.6.4 DNA-Fragmentierung nach Nicoletti

Diese Methode ist eine Erweiterung der PI-Färbung. Durch die Färbung der DNA mit Propidiumiodid nach Nicoletti et al. (Nicoletti et al., 1991) lassen sich die einzelnen Zellzyklusphasen, bzw. die subG1-Populationen (apoptotische Zellen) identifizieren. Apoptotische Zellen, die sich in der subG1-Phase befinden, unterscheiden sich in ihrem DNA-Gehalt deutlich von den übrigen Zellzyklusphasen, da während der Apoptose DNAsen DNA in Untereinheiten fragmentieren. Durch den Zusatz einer Lösung, die hypotone Detergenzien enthält, kommt es zum Herausdiffundieren der niedermolekularen DNA-Fragmente aus dem Zellkern in das Zytoplasma und durch die porös gewordene Zytoplasmamembran in den umgebenden Puffer. Somit kann man im Durchflusszytometer Zellen mit einem insgesamt erniedrigten DNA-Gehalt (hypodiploid) nachweisen (Loo und Rillema, 1998).

↓56

Zur Messung wurden die Zellen mit einer hyptonen Lösung mit 50μg/ml Propidiumiodid, 0,1% Natriumzitrat und 0,1% Triton X-100 für drei Stunden bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Der Anteil an Zellen mit fragmentierter DNA, definiert als hypodiploide Ereignisse in %, wurde mit dem Durchflusszytometer bestimmt und mit der CELLQuestTM Software ausgewertet.

2.7 Proliferationsnachweise

Die Bestimmung der DNA-Syntheseleistung anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin in die DNA stellt eine standardisierte Methode zur Quantifizierung der Zellproliferation dar. Bei der Zugabe einer definierten Menge [3H]Thymidin in das Kulturmedium einer konstanten Anzahl von Zellen pro Ansatz erhält man ein Maß für die Zellen, die sich in der S-Phase des Zellzyklus befinden, da an dieser Stelle der Einbau des markierten Basenanalogons in die DNA erfolgt.

Dazu wurden Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/ml in FCS-Medium resuspendiert und in einer Flachbodenmikrotiterplatte ausplattiert. Die Zellen wurden parallel zu den Ansätzen für ELISA oder FACS-Analyse unterschiedlich stimuliert oder als Kontrolle belassen und im Brutschrank (37°C, 5% CO2–Gehalt) inkubiert. Wenn nicht anders angegeben, wurde nach 80h in jede der Vertiefungen 0,5 µCi [3H]Thymidin zugegeben. Stimulierte T- und B-Zellen proliferierten und nahmen dabei das radioaktiv markierte Thymidin auf. Nach 16 h Inkubation wurde die Mikrotiterplatte eingefroren, um den [3H]Thymidin-Einbau zu stoppen und die Zellen zu lysieren. Mit Hilfe eines Zellerntegerätes (Cell Harvester) wurde der Inhalt der Mikrotiterplatte auf Filtermatten gesaugt. Nach Trocknen der Filter in einem Mikrowellengerät (160W, ca. 5min) wurde eine Feststoffszintillatorplatte auf diese Filter aufgeschmolzen. Schließlich konnten die abgekühlten Filter in einen Folienbeutel eingeschweißt und die Menge des [3H]Thymidins im Szintillationszähler gemessen werden. Alle Messungen wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt. Der Stimulationsindex (SI) wurde als Quotient aus den radioaktiven Signalen pro Minute (cpm) von den stimulierten Zellkulturen und den Zellkulturkontrollen berechnet. Ein Stimulationsindex >3 wurde als positiv angesehen.

2.8 Statistische Auswertung

↓57

In der überwiegenden Zahl wurden Balkendiagramme zur Darstellung der Ergebnisse gewählt. Die Fehlerbalken über den Datenbalken beschreiben den Standardfehler des Mittelwertes („standarderror of the mean“, SEM).

Signifikanzprüfungen wurden mit dem Mann-Whitney Rangsummen-Test oder dem Wilcoxon Test durchgeführt. Der Mann-Whitney Rangsummen-Test ist ein nicht-parametrischer statistischer Test und beschreibt die Wahrscheinlichkeit, mit der ein zwischen zwei unabhänigen Gruppen beobachteter Unterschied auf Zufall beruht. Eine Normalverteilung in den Gruppen ist dabei nicht erforderlich.

Der Wilcoxon Test ist ein nicht-parametrischer statistischer Test und beschreibt die Wahrscheinlichkeit, mit der ein in einer Gruppe beobachteter Unterschied auf Zufall beruht. Eine Normalverteilung ist dabei ebenfalls nicht erforderlich. Dieser Test wurde bevorzugt zum Vergleich von Proteinexpressionen nach unterschiedlicher Stimulation von Zellen derselben Spender benutzt. Zum Vergleich von mehr als zwei Gruppen diente der Kendall´s W Test.

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Für die Proliferation von Zellen bzw. die Anzahl lebender Zellen in Kultur wurde hingegen eine Normalverteilung angenommen, so dass Student T Tests und ANOVA-Methoden zur statistischen Prüfung eingesetzt wurden. Soweit nicht anders angegeben wurden alle statistischen Hypothesen zweiseitig („two-tailed“) formuliert.

p“ gibt dabei die Wahrscheinlichkeit an, mit der die Nullhypothese zu Unrecht verworfen wird. Üblicherweise gilt ein Unterschied als statistisch signifikant, d.h. mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht auf Zufall beruhend, wenn p Werte < 0,05 annimmt. Signifikante Unterschiede wurden in den Abbildungen mit „*“ gekennzeichnet.

Für Signifikanzprüfungen und das unten beschriebene „growth curve modeling“ wurde die Software SPSS 11.0 verwendet.

2.9 Verwendete Materialien

2.9.1  Zellkulturmedien und Puffer

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AB-Medium

RPMI 1640 (Gibco-BRL, Karlsruhe) ad 100U/ml Penicillin (Gibco-BRL, Karlsruhe), 100µg/ml Streptomycin (Gibco-BRL, Karlsruhe), 5% gepooltes humanes AB-Serum

FCS-Medium

RPMI ad 2nM L-Glutamin (Gibco-BRL, Karlsruhe), 100U/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin, 10% gepooltes fetales Kalbsserum (fetal calf serum, FCS)

Waschmedium

RPMI ad 2nM L-Glutamin, 100U/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin, 5% gepooltes FCS

Serumfreies Medium

AIM V (Gibco-BRL, Karlsruhe)

Phosphatpuffer

PBS (Gibco-BRL, Karlsruhe)

2.9.2 Substanzen für die PBMC und T-Zellkultur

Antigene

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Weitere Substanzen

2.9.3 Substanzen für Magnetische Zelltrennung (MACS)

Trennpuffer

↓61

Microbeads

2.9.4 Substanzen für die Durchflusszytometrie

↓62

FACS-Puffer

↓63

Primärantikörper

Sekundärantikörper

↓64

2.9.5 Substanzen zum Nachweis von Zelltod

2.9.6 Verwendete Geräte

2.9.7 Verbrauchsmaterialien

↓65

2.9.8 Verwendete Software


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27.10.2006