3 Ergebnisse

↓65

3.1  Die Expression und Regulation von TRAIL

3.1.1  Vorexperimente - Lösliches TRAIL im Zellkulturüberstand von stimulierten PBMC

Lösliches TRAIL (sTRAIL) wurde im Serum von 20 gesunden Probanden mit einem käuflich erhältlichen TRAIL-ELISA bestimmt. Die mittlere sTRAIL-Serumkonzentration betrug 1351,8±203,7pg/ml (Mittelwert±SEM = Standard Error of the Mean).

↓66

Um die Herkunft von sTRAIL in humanem Serum zu bestimmen, wurden frisch isolierte humane PBMC kultiviert. Als Kulturmedium diente FCS-Medium, da ein Vorexperiment ergeben hatte, dass AB-Medium bereits sTRAIL enthält (Abb. 4).

Abbildung 4 : Lösliches TRAIL (sTRAIL) im ELISA – Hintergrund durch Zellkulturmedien.

FCS-Medium oder AB-Medium wurden in drei unterschiedlichen ELISA-Ansätzen entsprechend dem Standardprotokoll jeweils als Doppelwert gemessen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert mit SEM (Standard Error of the Mean) dargestellt.

.

↓67

Die frisch isolierten PBMC wurden nun mit verschiedenen Agenzien versetzt, die T-Zellen, B-Zellen oder Monozyten stimulieren. Dabei dienten 1μg/ml PHA + 20U/ml IL-2, 1μg/ml PHA oder anti-CD3-AK (αCD3) + anti-CD28-AK (αCD28) + 20U/ml IL-2 als T-Zell-Stimuli (Greaves et al., 1974); 1μg/ml anti-CD40-AK (αCD40) + 2,5ng/ml IL-4 oder 0,01% SAC als B-Zell-Aktivierung (Jeppson et al., 1998;Li et al., 1997) und 50ng/ml LPS (Langstein et al., 2000) als Monozyten-Stimulus (siehe Material und Methoden für genaue Bedingungen). Im Vergleich dazu wurden 10 – 1000 IU/ml IFN-β-1a als unspezifischer Stimulus verwendet. IFN-β kann auf alle drei Zelltypen wirken, da die entsprechenden Rezeptoren ubiquitär exprimiert werden (Oritani et al., 2001).

Die Inkubation erfolgte im Brutschrank (37°C, 5% CO2-Gehalt) in getrennten Ansätzen für die Proteinbestimmung, die Bestimmung der Zellzahl und der Stimulationsindizes. Nach 72h wurden die Proben zentrifugiert, die Überstände abgetrennt und die Menge an sTRAIL in einem sandwich-ELISA nachgewiesen. Unter Berücksichtigung der Nachweisgrenze (Detektionslimit, in den Grafiken abgekürzt als DL) des ELISA-Kits und unter Berücksichtigung des Standardfehlers konnte gezeigt werden (Abb. 5), dass sTRAIL vor allem nach Stimulation mit spezifischen T-Zell-Stimuli und nach der Stimulation mit SAC oder IFN-β von den PBMC sezerniert wird (Wilcoxon Test gegenüber Leerwert jeweils p<0,05).

Dabei war zu beobachten, dass die T-Zell-Stimuli PHA und αCD3+αCD28 unbedingt einer Kombination mit IL-2 bedurften, um eine sTRAIL-Sekretion zu induzieren. Stimulation mit PHA allein zeigte keinen Effekt. Die Wirkung von IFN-β war dosisabhängig (Kendall´s W Test: p<0,05). Eine Konzentration von 10 IU/ml IFN-β induzierte eine kaum messbare Sekretion. Eine Konzentration von 100 IU/ml hatte einen mittelstarken Effekt, vergleichbar dem T-Zell-Stimulus PHA+IL-2 (Wilcoxon Test: p>0,01), und eine Konzentration von 1000 IU/ml IFN-β bewirkte eine sehr starke Sekretion von sTRAIL innerhalb von 72h (Abb. 5). Parallel zu den oben beschriebenen Protein-Bestimmungen wurden Proliferationsdaten und Zellzahlen erhoben. Die Proliferation wurde gemessen, indem nach 80h [3H]Thymidin für weitere 16h zu den

↓68

Abbildung 5 : sTRAIL im Überstand von PBMC nach 72h unter verschiedenen Stimuli

A) Lösliches TRAIL in den Zellkulturüberständen in pg/ml nach 72h. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM von PBMC-Kulturen von jeweils 6-8 gesunden Probanden. Die ELISA-Nachweisgrenze ist mit DL (Detektionslimit) angegeben.
B) Stimulationsindex bestimmt mit [3H]Thymidin. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM von PBMC-Kulturen derselben 6-8 gesunden Probanden.
C) Anzahl an lebenden Zellen in den Zellkulturen nach 72h. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM in Zellzahl/ml von PBMC-Kulturen derselben 6-8 gesunden Probanden.

Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die Stimulationsindizes zeigten deutlich, dass DNA 80-96h nach Beginn der Stimulation mit T-Zell-Stimuli und SAC repliziert wurde (SI 40-190 und 20). Unabhängig davon wurde die Anzahl lebender PBMC nach 72h mit der Trypanblaumethode bestimmt. Weder der Vergleich der Zellzahlen in den Kulturen (Zellzahl N/ml) zu Anfang und nach 72h, noch der Vergleich der Kontrollen mit den stimulierten Kulturen zeigte signifikante Unterschiede (ANOVA und Tukey-Kramer Multiple Comparisons Tests: p>0,1).

3.1.2 Regulation durch zellspezifische Stimuli

3.1.2.1  Lösliches TRAIL

Der Effekt von zellspezifischen Stimuli auf die Sekretion von sTRAIL durch PBMC

↓69

Die Kinetik der sTRAIL-Sekretion mit zellspezifischen Stimuli, gemessen als TRAIL-Konzentration im Überstand von PBMC-Kulturen über drei Tage, bestätigte die oben beschriebenen Ergebnisse (Abb. 6). Frisch isolierte PBMC von sechs gesunden Probanden wurden in An- und Abwesenheit von PHA+IL-2, αCD40+IL-4, oder LPS kultiviert. sTRAIL wurde im Medium (Zeitpunkt 0h) und in den Überständen (Zeitpunkte 24, 48 und 72h) mit dem sandwich-ELISA bestimmt.Nur die Stimulation mit T-Zell-Stimuli (PHA+IL-2) führte zu einem langsamen und nach 72h signifikanten Anstieg der sTRAIL-Konzentration, wogegen αCD40+IL-4 als B-Zell- und LPS als Monozyten-Stimulus keinen Effekt zeigten.

Abbildung 6 : Kinetik der Konzentrationen von sTRAIL im Überstand von PBMC stimuliert mit zellspezifischen Stimuli.

Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM von 6 gesunden Probanden. Die Signifikanz wurde mit dem Wilcoxon Test (*P<0,05) geprüft.

Der Effekt von zellspezifischen Stimuli auf die Sekretion von sTRAIL durch isolierte T-Zellen, B-Zellen und Monozyten

↓70

Die oben beschriebenen Ergebnisse sollten nun mit isolierten reinen Leukozyten-Subpopulationen verifiziert werden. Dazu wurden frisch isolierte PBMC von vier gesunden Probanden durch magnetische Zellsortierung (MACS) mit Antikörpern gegen das jeweilige spezifische CD-Gruppenantigen in T-Zellen (CD3+ Zellen), B-Zellen (CD19+ Zellen) und Monozyten (CD14+ Zellen) aufgetrennt. Die Reinheit wurde mittels Durchflusszytometrie geprüft und betrug für alle Subpopulationen >96%.Die Subpopulationen wurden unter den gleichen Bedingungen wie die PBMC kultiviert und stimuliert, d.h. gereinigte T-Zellen wurden mit PHA+IL-2, B-Zellen mit αCD40+IL-4 und Monozyten mit LPS versetzt. sTRAIL wurde mit dem sandwich-ELISA-Kit im Medium (Zeitpunkt 0h) und den Überständen (Zeitpunkte 24, 48, und 72h)bestimmt. In Übereinstimmung mit den Vorexperimenten führte die Stimulation von reinen T-Zellen mit PHA+IL-2 zu einem langsamen Anstieg der Konzentration an sTRAIL in den Zellkulturüberständen (Abb. 7). Genauso konnte in den mit αCD40+IL-4 stimulierten B-Zell-Kulturen an keinem der Zeitpunkte (0, 24, 48 und 72h) sTRAIL nachgewiesen werden. Abbildung 7 zeigt auch, dass in den mit LPS stimulierten Monozyten-Kulturen nicht signifikante Mengen an sTRAIL an den ersten beiden Tagen nachgewiesen wurden, die aber nach 72h nicht mehr messbar waren.

Abbildung 7 : Kinetik der Konzentration von sTRAIL im Zellkulturüberstand von magnetisch getrennten PBMC-Subgruppen nach Stimulation mit zellspezifischen Stimuli.

Die Mittelwerte±SEM von T-, B-Zellen und Monozyten von 4 gesunden Probanden nach 0, 24,48 und 72h sind dargestellt.

↓71

Bestimmung von sTRAIL im Überstand von T-Zelllinien

Die Fähigkeit stimulierter T-Zellen, sTRAIL zu sezernieren, konnte auch mit antigenspezifischen T-Zelllinien bestätigt werden (Abb. 8). Mit Hilfe eines „split-well-Verfahren“ wurden MBP-spezifische T-Zelllinien von vier gesunden Probanden gewonnenen (siehe Material und Methoden für Details), die nach dem gleichen Muster wie die magnetisch separierten T-Zellen mit PHA+IL-2 stimuliert wurden. In einem zusätzlichen Ansatz wurde eine antigenspezifische Stimulation mit 20pg/ml MBP+IL-2 und bestrahlten antigenpräsentierende Zellen (APC) vorgenommen. Dazu wurden 2,5x105 T-Zellen mit 7,5x105 bestrahlten (3000 rad) autologen PBMC als APC versetzt. Nach 72h wurde sTRAIL mit einem ELISA-Kit gemessen. Zusätzlich wurde nach 80h für weitere 16h die Proliferation als Stimulationsindex (SI) mit [3H]Thymidin bestimmt. Es zeigte sich in beiden Fällen eine hohe sTRAIL-Sekretion und Zellproliferation nach 72h bzw. 80h (Der Wilcoxon Test im Vergleich zu den nicht stimulierten Ansätzen ergab: p<0,05). Wenn nur APC ohne Antigen zur Kultur gegeben wurden, fand keine sTRAIL-Sekretion statt. Die in den T-Zell-Kulturüberständen gemessenen sTRAIL-Konzentrationen entsprachen ungefähr den im menschlichen Serum gemessenen sTRAIL-Konzentrationen. Als Kontrolle dienten zusätzlich zum Leerwert auch Überstände von T-Zell-Kulturen, die mit den nicht-adäquaten Stimuli SAC und LPS kultiviert worden waren. Diese Stimuli induzierten weder Zellproliferation noch die Sekretion von sTRAIL.

Abbildung 8 : sTRAIL im Zellkulturüberstand von 4 antigenspezifischen T-Zelllinien nach 72h mit verschiedenen adäquaten (Antigen+APC+IL-2, PHA+IL-2) und nicht-adäquaten (SAC, LPS) Stimuli.

A) Konzentration von sTRAIL in pg/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM von jeweils 4 MBP-spezifischen T-Zelllinien gesunder Probanden
B)
B) Stimulationsindex (SI) bestimmt mit der [3H]Thymidin-Methode.

3.1.2.2 Membranständiges TRAIL

↓72

Der Effekt von zellspezifischen Stimuli auf die Expression von membranständigem TRAIL auf T-Zellen, B-Zellen und Monozyten

Interessant erschien die Frage, ob membranständiges TRAIL genauso reguliert wird wie sTRAIL. Deshalb wurde membranständiges TRAIL auf T-Zellen, B-Zellen und Monozyten bestimmt. Die PBMC wurden dazu nicht magnetisch getrennt, sondern im Drei-Farben-Durchflusszytometer anhand ihrer Marker differenziert: Frisch isolierte PBMC von sechs verschiedenen gesunden Probanden wurden unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, kultiviert und stimuliert.Membranständiges TRAIL wurde auf frisch isolierten (0h) oder kultivierten PBMC (24, 48 oder 72h) im Durchflusszytometer identifiziert, wobei die Zellen gleichzeitig anhand der spezifischen CD-Antigene einer Leukozytensubpopulation zugeordnet wurden (anti-CD3-AK für T-Zellen, anti-CD19-AK für B-Zellen und anti-CD14-AK für Monozyten). Tote Zellen wurden durch Propidiumiodidanreicherung erkannt und aus der Analyse ausgeschlossen. Von jeder Leukozytensubgruppe wurden 5000 lebende (Propidiumiodid-negative) Zellen untersucht. Abbildung 9A und 9B zeigen eine Hintergrundexpression von membranständigem TRAIL auf T-Zellen, welche im Verlauf langsam weiter anstieg. Die Expression zum Zeitpunkt 0h und zu allen weiteren Zeitpunkten war die gleiche in den unstimulierten Kontrollen und den mit PHA+IL-2 versetzten Proben (Abb. 9, Wilcoxon Teste: p>0,1). Auf der Oberfläche von B-Zellen konnte TRAIL weder ex vivo noch in Kultur oder unter Stimulation mit αCD40+IL-4 nachgewiesen werden. Ähnlich den T-Zellen zeigten Monozyten bereits ex vivo eine TRAIL-Expression auf der Zelloberfläche. Diese stieg im Verlauf weiter an, doch auch hier wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollen und den mit LPS stimulierten Ansätzen zu keinem der Messzeitpunkte gefunden (Wilcoxon Teste: p>0,01). Somit konnte die Expression von membranständigem TRAIL auf keiner der untersuchten Leukozytengruppen mit den hier getesteten zellspezifischen Stimuli verstärkt werden.

Abbildung 9 : Expression von membranständigem TRAIL auf T-Zellen, B-Zellen und Monozyten nach Aktivierung mit zellspezifischen Stimuli.

A) Membranständige TRAIL-Expression des stimulierten Ansatzes (gefülltes Histogramm) ist gegen die korrespondierende Isotypenfärbung (leeres Histogramm) aufgezeichnet. Jedes Histogramm zeigt die TRAIL-Expression einer stimulierten Leukozyten-Subgruppe zu einem der vier Zeitpunkte.
B) Membranständige TRAIL-Expression im Vergleich zwischen stimulierten und unstimulierten Zellproben in arbitrary units (au). Arbitrary units wurden aus den Histogrammstatistiken berechnet und als mittlere Fluoreszenzstärke der TRAIL-Färbung minus der Isotypenfärbung definiert. Die Punkte und Linien repräsentieren den Mittelwert und SEM von 6 verschiedenen Probanden.

3.1.3 Regulation durch IFN-β

3.1.3.1  Lösliches TRAIL

↓73

Der Effekt von IFN-β auf die Sekretion von sTRAIL durch isolierte T-Zellen, B-Zellen und Monozyten

Schon die Vorexperimente hatten gezeigt, dass PBMC auch nach Stimulation mit IFN-β sTRAIL sezernieren. Eine Kinetik über drei Tage mit IFN-β-Konzentrationen von 10-1000 IU (Abb. 10), bestätigte die Fähigkeit von IFN-β, eine starke sTRAIL-Sekretion zu induzieren: Frisch isolierte PBMC von sechs gesunden Probanden wurden in An- und Abwesenheit von 10, 100 oder 1000 IU IFN-β-1a kultiviert. sTRAIL wurde zu den verschiedenen Zeitpunkten im Medium (Zeitpunkt 0h) oder den Zellkulturüberständen (Zeitpunkte 24, 48 und 72h) mit dem TRAIL-sandwich-ELISA bestimmt. Die Sekretion von sTRAIL war dosisabhängig, erfolgte bei Stimulation mit der höchsten Konzentration von 1000 IU schon in den ersten 24h in großen Mengen und erreichte sehr hohe Konzentrationen.

Abbildung 10 : sTRAIL im Überstand von PBMC nach Stimulation mit IFN-β im Verlauf.

Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM von 6 gesunden Probanden. Die Signifikanz wurde jeweils mit dem Wilcoxon Test (*P<0,05) geprüft.

↓74

Um die Zellpopulation zu bestimmen, in der sich durch IFN-β-Stimulation eine sTRAIL-Sekretion induzieren lässt, wurden die PBMC von vier gesunden Probandenerneut magnetisch in T- (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) separiert und getrennt kultiviert. Die Zellen wurden mit 10, 100 oder 1000 IU IFN-β-1a stimuliert oder als Kontrollen belassen. Medium (Zeitpunkt 0h) oder Überstände (Zeitpunkte 24, 48, und 72h) wurden aus jeweils verschiedenen Ansätzen zu diesen Zeitpunkten abgenommen, und sTRAIL wurde mit dem sandwich-ELISA bestimmt.Unerwarteterweise zeigten nur Monozyten eine sTRAIL-Sekretion nach Stimulation mit IFN-β. Deren Kinetik war vergleichbar mit dem PBMC-Ansatz, aber die sTRAIL-Spitzenkonzentrationen waren wesentlich höher (Abb. 11). In den Überständen von isolierten T- und B-Zellen, die mit IFN-β stimuliert worden waren, konnte kein sTRAIL nachgewiesen werden.

Abbildung 11 : sTRAIL im Überstand von PBMC-Subgruppen nach magnetischer Zellseparation und Stimulation mit IFN-β im Verlauf.

Die Mittelwerte± SEM von 4 gesunden Probanden sind dargestellt.

3.1.3.2 Membranständiges TRAIL

Der Effekt von IFN-β auf die Expression von membranständigem TRAIL auf T-, B-Zellen und Monozyten

↓75

Geht die Sekretion von sTRAIL nach Stimulation mit IFN-β mit einer Hochregulation von membranständigem TRAIL auf Monozyten einher? Um diese Frage zu beantworten wurde erneut eine durchflusszytometrische Analyse mit Dreifachfärbung durchgeführt. Dazu wurden frisch isolierte PBMC von sechs verschiedenen gesunden Probanden in An- und Abwesenheit von 100 IU IFN-β-1a kultiviert. Membranständiges TRAIL wurde auf je 5000 frisch isolierten (0h) oder kultivierten PBMC (24, 48 und 72h) einer Leukozytensubpopulation untersucht. Die Leukozytensubpopulationen wurden anhand ihrer spezifischen Subgruppenmarker (anti-CD3-AK für T-Zellen, anti-CD19-AK für B-Zellen und anti-CD14-AK für Monozyten) identifiziert und tote Zellen wurden durch Propidiumiodidanreicherung erkannt.

Abbildung 12 : Expression von membranständigem TRAIL auf T-Zellen, B-Zellen oder Monozyten nach Stimulation mit IFN-β.

A) Membranständige TRAIL-Expression des mit INF-ß stimulierten Ansatzes (gefülltes Histogramm) ist gegen die korrespondierende Isotypenfärbung (leeres Histogramm) aufgezeichnet. Jedes Histogramm zeigt die TRAIL-Expression einer stimulierten Leukozyten-Subgruppe zu einem der vier Zeitpunkte.
B) Membranständige TRAIL-Expression im Vergleich zwischen stimulierten und unstimulierten Zellproben in arbitrary units (au). Arbitrary units wurden aus den Histogrammstatistiken berechnet und als mittlere Fluoreszenzestärke der TRAIL-Färbung minus der Isotypenfärbung definiert. Die Punkte und Linien repräsentieren den Mittelwert und SEM von 6 verschiedenen Probanden (*P<0.05, Wilcoxon Test).

3.1.4 TRAIL-Sekretion, Zellproliferation und absolute Zellzahlen

Die eingesetzten zellspezifischen Stimuli PHA+IL-2 und αCD40+IL-4 regen T-Zellen bzw. B-Zellen zur Proliferation an (Greaves et al., 1974;Jeppson et al., 1998). Diese kann in der Regel erst nach mehr als 72h durch [3H]Thymidin-Inkorporation bei der DNA-Replikation nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu sind Monozyten nach Stimulation mit LPS nicht zur Proliferation fähig (Langstein et al., 2000). Um eine erfolgreiche Stimulation von T- und B-Zellen zu dokumentieren, wurden Stimulations-Indizes (SI = Quotient der gemessenen Radioaktivität des stimulierten Ansatzes zur Aktivität des unstimulierten Ansatz) als Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten errechnet. Dazu wurden magnetisch getrennte T- und B-Zellen der vier selben gesunden Probanden genutzt. Die Proliferationsnachweise wurden parallel zu den Zellkulturen zur Proteinbestimmung durchgeführt. Ein SI >3,0 wurde als Proliferation betrachtet.

↓76

Gleichzeitig sollte gezeigt werden, dass die im ELISA gemessenen erhöhten sTRAIL-Konzentrationen in den Überständen von T-Zellen wirklich auf deren erhöhte sTRAIL-Sekretion zurückzuführen war. Analog sollte gesichert werden, dass sTRAIL in den Überständen von stimulierten B-Zellen nicht nur deswegen nicht nachweisbar war, weil die absolute B-Zellzahl stark erniedrigt war. Deshalb wurde zusätzlich die Anzahl der in Kultur befindlichen lebenden Zellen zu jedem der vier Zeitpunkte der ELISA-Messungen (0, 24, 48, 72h) bestimmt. Dafür wurden magnetisch gereinigte T- und B-Zellen derselben vier gesunden Probanden eingesetzt. Die Auszählung erfolgte blind mit der Trypanblaumethode in Neubauer-Hämatozytometern für jeden Spender, jede Zellgruppe und jeden eingesetzten Stimulus im Doppelwert.

Tabelle 3 zeigt Zellzahlen und SI von stimulierten und unstimulierten T- und B-Zellen. Es stellte sich heraus, dass die Anzahl lebender Zellen in den stimulierten Kulturen nach 24h bzw. 48h geringer und nach 72h sogar signifikant geringer war (ANOVA, Tukey-Kramer Multiple Comparisons Test: p<0,05) als die anfängliche Zellzahl. Vom Trend her war sie auch geringer als die Zellzahl in den Kontrollen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen T- und B-Zellen oder zellspezifischen Stimuli (PHA, IL-2, PHA+IL-2, αCD40+IL-4) und IFN-β (ANOVA: p>0,05). Erst zu späteren Zeitpunkten (s.u.) ergaben sich signifikant höhere Zellzahlen in den mit zellspezifischen Stimuli aktivierten B- und T-Zell-Kulturen. Die Funktionalität der zellspezifischen Stimuli konnte durch einen SI größer als drei und die typische Form aktivierter Zellen unter dem Lichtmikroskop nachgewiesen werden. IFN-β regte die Zellen nicht zur Proliferation an.

Tabelle 3 : Anzahl an lebenden Zellen nach 0, 24 ,48 und 72h der verschiedenen PBMC-Subpopulationen von vier gesunden Probanden stimuliert mit unterschiedlichen Stimuli.

MittelwerteSEM sind hier angegeben als Millionen Zellen pro ml. Zusätzlich ist die Proliferation derselben Zellen nach 72 als Stimulationsindex angegeben.

3.1.5 Die biologische Aktivität von sTRAIL aus Zellkulturüberständen

↓77

Die bisher präsentierten Ergebnisse belegen, dass CD3+ and CD14+ Zellen in der Lage sind, sTRAIL zu produzieren. In einem weiteren Schritt sollte nun gezeigt werden, dass das in den Überständen nachgewiesene sTRAIL auch biologisch aktiv ist, d.h. Apoptose in suszeptiblen Zellen induzieren kann. Dazu wurden magnetisch gereinigte T-Zellen in An- und Abwesenheit von PHA+IL-2 sowie separierte Monozyten in An- und Abwesenheit von 10, 100 oder 1000 IU IFN-β für 48h und 72h kultiviert. Anschließend wurde geprüft, ob die gewonnenen Zellkulturüberstände Apoptose induzieren. Dazu diente ein DNA-Fragmentierungsnachweis im Durchflusszytometer nach Nicoletti (Nicoletti et al., 1991). 2x105 Jurkat-T-Lymphomzellen wurden in den verschiedenen gesammelten Zellkulturüberständen für 24h kultiviert. Anschließend wurden die Zellen in einer hypotonen fluorochromen Lösung (Propidiumiodid 50 μg/ml in 0,1% Natriumzitrat und 0,1% Triton X-100) suspendiert. Nach drei Stunden wurde die DNA-Fragmentierung im Durchflusszytometer durch Messung der hypodiploiden DNA-Spitzen gemessen. Als Positivkontrolle diente CD95L (APO-1 1μg/ml mit Protein A

Abbildung 13 : Nachweis der biologischen Aktivität von sTRAIL in Jurkat-Zellen mit einem DNA-Fragmentierungstest.

Dargestellt sind Mittelwerte±SEM der DNA-Fragmentierung in %.(*P<0.05, Wilcoxon Test).

10ng/ml), der Apoptose in Jurkat-Zellen auslöst (Trauth et al., 1989). Überstände von nicht stimulierten T-Zellen und Monozyten wurden als Negativkontrolle genutzt.

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Abb. 13A zeigt, dass Überstände von Monozyten, die mit 100 IU oder 1000 IU IFN-ß stimuliert wurden, Apoptose in Jurkat-Zellen auslösten. Der Anteil an apoptotischen Jurkat-Zellen nach Behandlung mit Zellkulturüberständen aus stimulierten T-Zell-Kulturen war sehr gering und nach 48h nur auf einem Niveau von p<0,1 signifikant (Abb. 13B). Dies stimmt mit den wesentlich geringeren Konzentrationen von sTRAIL in den Überständen von stimulierten T-Zellen überein. Während Monozyten bis zu 2,0ng/ml sTRAIL in die Kulturüberstände abgaben, waren es in den T-Zell-Kulturen nur 0,3ng/ml.

3.2 Immunomodulatorische Wirkungen von TRAIL

3.2.1  Expression von löslichem oder membranständigem TRAIL im Vergleich zwischen MS-Patienten und gesunden Probanden

Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es Hypothesen, die eine Mitwirkung des TRAIL-Systems in der Pathogenese der Multiplen Sklerose nahe legen. Deshalb wurden mögliche Unterschiede in der Expression von löslichem und membranständigem TRAIL in PBMC von Gesunden und MS-Kranken geprüft. Kryokonservierte PBMC von jeweils zehn gesunden Probanden und neun Patienten mit klinisch manifester aber nicht immunomodulatorisch behandelter RRMS wurden in FCS-Medium kultiviert und mit PHA+IL-2 oder 1000 IU IFN-β stimuliert. Nach 72h wurden die Überstände abgetrennt, zentrifugiert, und die Menge an sTRAIL wurde mit dem TRAIL-sandwich-ELISA bestimmt (Abb. 14A). Parallel dazu wurden PBMC von denselben Probanden für die BestimmungderOberflächenexpression von membranständigem TRAIL unter den gleichen Bedingungen für 48h kultiviert. Es wurden 104 Zellen pro Probe im Durchflusszytometer analysiert, wobei tote Zellen durch Propidiumiodidanreicherung erkannt und von der Analyse ausgeschlossen wurden (Abbildung 14B). Die Proliferation der PBMC wurde in einem dritten parallelen Ansatz für jeden Spender durch Zugabe von [3H]Thymidin nach 80h und die Messung der Radioaktivität nach 86h nachgewiesen.

In Übereinstimmung mit den Vorexperimenten führte die Stimulation der PBMC mit IFN-β zu einer starken und mit PHA+IL-2 zu einer moderaten Sekretion von sTRAIL, wobei jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen gesunden Probanden und MS-Patienten nachweisbar waren (Mann-Whitney Rangsummen-Teste: p>0,5). Allerdings ergab sich ein Trend für eine höhere sTRAIL Sekretion bei der IFN-β-Stimulation von PBMC der gesunden Probanden (Mann-Whitney Rangsummen-Test: p=0,09). Hinsichtlich der TRAIL-Oberflächenexpression existierten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, unabhängig von der Art des Stimulus (Mann-Whitney Rangsummen-Teste: p>0,1). Die Funktionalität der Stimuli und der kryokonservierten PBMC konnte mit Proliferationstesten nachgewiesen werden, welche wiederum keine signifikanten Unterschiede zwischen der Proliferation der PBMC von gesunden Probanden und MS-Patienten zeigten (Proliferationsindex 79±34 vs. 109±39, Paired Sample T-Test: p>0,1).

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Abbildung 14 : Vergleich der löslichen und membranständigen TRAIL-Expression zwischen PBMC von Gesunden (Kontrolle) und MS-Patienten .Die Signifikanz wurde mit dem Mann-Whitney Rangsummen-Test (*P<0,05) geprüft.

A) sTRAIL in pg/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM
B) Die mittlere Expression von membranständigem TRAIL der stimulierten und unstimulierten Ansätze ist mit SEM in arbitrary units (au) dargestellt. Arbitrary units wurden aus den Histogrammstatistiken berechnet und als mittlere Fluoreszenzintensität der TRAIL-Färbung minus mittlere Fluoreszenzintensität der Isotypenfärbung definiert.

3.2.2 Der Effekt von TRAIL auf die Proliferation von antigenspezifischen T-Zelllinien

TRAIL könnte neben seiner Funktion als apoptoseinduzierender Mediator auch weitere immunomodulatorische Wirkungen, z.B. durch ein Eingreifen in den Zellzyklus, besitzen. Deshalb wurde hier die Wirkung von TRAIL auf die Zellaktivierung untersucht. Dazu wurden sechs antigenspezifische T-Zelllinien mit αCD3+αCD28 stimuliert und in An- und Abwesenheit von 300ng/ml humanen rekombinanten TRAIL in Verbindung mit einem Verstärker-Antikörper für die Multimerisation kultiviert. Die Proliferation wurde nach 72h durch die Inkubation mit [3H]Thymidin über 16h jeweils als Dreifachwert gemessen. Abbildung 15 zeigt, dass die Proliferation der mit TRAIL behandelten stimulierten T-Zelllinien signifikant geringer war als die Proliferation in den nicht mit TRAIL behandelten T-Zelllinien (Paired Sample T-Test: p<0,05).

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Abbildung 15 : TRAIL (300ng/ml) inhibiert die Proliferation von humanen antigenspezifischen T-Zelllinien .

Die Proliferation von 6 T-Zelllinien ist als Mittelwert±SEM der counts per minute (cpm) dargestellt. Die Signifikanz wurde mit dem Paired Sample T-Test (*P<0,05) geprüft.

3.2.3 Der Effekt von TRAIL auf die Sekretion von INF-γ und IL-4 durch antigenspezifische T-Zelllinien

Neben der Wirkung von TRAIL auf die Proliferation von T-Zellen ist auch eine Wirkung auf die T-Zell-Effektorfunktionen vorstellbar. Deshalb wurde die Sekretion von typischen Th1- und Th2-Zytokinen nach Inkubation mit TRAIL untersucht. Für die Bestimmung von INF-γ wurden T-Zellen von sechs Th1/Th0 antigenspezifischen T-Zelllinien und für die Bestimmung von IL-4 T-Zellen von fünf Th2/Th0T-Zelllinien mit αCD3+αC28 für 48h in FSC Medium und in An- und Abwesenheit von 300ng/ml TRAIL kultiviert. Anschließend wurden die für den jeweiligen T-Zell-Phänotyp typischen Zytokine, INF-γ für Th1-Zellen und IL-4 für Th2-Zellen (Janeway et al., 1999), in den Zellkulturüberständen mit ELISAs bestimmt. Zum Vergleich wurde

Abbildung 16 : Verringerung der Zytokinproduktion durch TRAIL .

A) IFN-γ Produktion in sechs Th1/Th0 T-Zelllinien
B) IL-4 Produktion in 5 Th2/Th0 T-Zelllinien.

Die Ergebnisse sind in Prozent±SEM im Vergleich zu Stimulation mit αCD3+αCD28 allein angegeben. Die mittleren Zytokinkonzentrationen und cpm Werte waren 626,7pg/ml und 12734 cpm (αCD3+αCD28 Stimulation allein) und 357,2 pg/ml und 8149 cpm (300ng/ml TRAIL) für IFN-γ; und 69,48 pg/ml und 15672 cpm (αCD3+αCD28 Stimulation allein) und 43,2 pg/ml und 9794 cpm (300ng/ml TRAIL) für IL-4.

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parallel die Zellproliferation mittels Inkorporation von [3H]Thymidin nach 72h gemessen.

Abbildung 16 zeigt, dass TRAIL die IFN-γ Produktion in stimulierten Th1/Th0 T-Zelllinien (Wilcoxon Test: p<0,01) und IL-4 Produktion in stimulierten Th2/Th0 T-Zelllinien (Wilcoxon Test: p<0,05) signifikant verringerte.

3.3 Die Expression und Regulation von löslichem CD95

3.3.1  Die Etablierung der Messmethode

CD95-Oberflächen-Antigen wurde auf diversen menschlichen Zelllinien nachgewiesen (Leithauser et al., 1993). Mit Hilfe von Western blotting kann CD95 in Proteinform auch im Zelllysat nachgewiesen werden. Schwieriger ist es, die nicht membranständige, also lösliche Form von CD95 (sCD95) zu bestimmen. Mit einem käuflich erhältlichen ELISA-Kit ist es möglich, sCD95 im menschlichen Serum zu bestimmen. Trotzdem misslang es bisher, sCD95 in Zellkulturüberständen zu messen. Dies kann entweder daran liegen, dass die entsprechenden Zellen nicht in der Lage sind, sCD95 zu produzieren, oder daran, dass die Konzentrationen an freiem sCD95 in den Zellkulturüberständen unter der Nachweisgrenze des ELISA liegen (30pg/ml). Da mehrere Studien gezeigt hatten, dass bei der Aktivierung von Leukozyten durch „alternative splicing“ mRNA-Formen entstehen, deren Translation zur Entstehung von sCD95 führen würde (Cascino et al., 1995;Liu et al., 1995), lag es nahe, eine zu geringe Konzentration des Moleküls in den Überständen zu vermuten. Deshalb wurden zwei verschiedene Methoden, die Überstände zu konzentrieren, getestet: die Azetonfällung und die Vakuumkonzentration. Dazu wurden PBMC von fünf verschiedenen Probanden mit PHA+IL-2 stimuliert oder als Kontrolle unstimuliert belassen. Nach 72h wurden die Überstände abgenommen und zweimal zentrifugiert. Eine relativ lange Inkubationszeit von 72h wurde gewählt, um späte Effekte einer Leukozytenaktivierung mit zu erfassen. Ein Teil der Überstände wurde anschließend mittels Azetonfällung bzw. Vakuumkonzentration (siehe Material und Methoden) im Verhältnis 10:1 aufkonzentriert. Anschließend wurden sCD95 in den originalen und aufkonzentrierten Überständen mit einem sandwich-ELISA gemessen. Abbildung 17 zeigt, dass sowohl mit der Azetonfällungs- als auch mit der Vakuumkonzentrationsmethode sCD95 in den Zellkulturüberständen nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz dazu konnte in den unbehandelten Überständen kein sCD95 detektiert werden. Um die Azetonfällungs- und Vakuumkonzentrationsmethode zu vergleichen, wurden dieselben Zellkulturüberstände der fünf Spender eingesetzt. Es konnte kein Unterschied in der Güte der Konzentrationsprozesse festgestellt werden (Abb. 17B, Wilcoxon Test: p>0,05). Weil die Azetonfällungsmethode einfacher ist, wurde diese fortan als Standardmethode eingesetzt.

↓82

Abbildung 17 : Lösliches CD95 im ELISA – Etablierung des Konzentrationsverfahrens

A) Lösliches CD95 (sCD95) in originalen Zellkulturüberständen (graue Säulen) und nach Acetonfällung (schwarze Säulen) von stimulierten und unstimulierten PBMC. Die Nachweisgrenze des ELISA liegt bei 30pg/ml. Die hier aufgetragenen Zellkulturüberstände wurden 10:1 konzentriert, weshalb der angegeben Wert mit 10 -1 multipliziert werden muss, um die tatsächliche sCD95 Konzentration in den Zellkulturüberständen zu erhalten. Die Ergebnisse sind als Mittelwert±SEM dargestellt.
B) sCD95 derselben Zellkulturüberstände nach Aufkonzentration durch Azetonfällung (schwarze Säulen) oder durch eine Vakuumtrocknung (graue Säulen). Die Ergebnisse sind als Mittelwert±SEM dargestellt.

sCD95 wurde in humanem Serum nachgewiesen (Zipp et al., 1998;Zipp et al., 1998). Deshalb wurde geprüft, ob der Einsatz bestimmter Zellkulturmedien die Messung von sCD95 beeinflusst. Dazu wurde humanes AB-Medium und FCS-Medium mit der Azetonfällungsmethode aufkonzentriert, in drei unterschiedlichen ELISA-Ansätzen als Doppelwert aufgetragen und gemäß dem Standardprotokoll gemessen. Wie in Abbildung 18 gezeigt, enthält AB-Medium geringe Mengen sCD95. Für alle weiteren Experimente wurde deshalb FCS-Medium als Zellkulturmedium eingesetzt.

Abbildung 18 : sCD95 im ELISA – Hintergrund durch Zellkulturmedien.

Die Ergebnisse sind als Mittelwert±SEM dargestellt. Da die Proben im Verhältnis von 1: 10 aufkonzentriert wurden, erfolgt die Konzentrationsangabe in pg/ml x 10 -1 .

3.3.2 Bestimmung von sCD95 im Überstand von PBMC

↓83

Bereits die oben beschriebenen Vorexperimente zeigten, dass stimulierte PBMC sCD95 sezernieren können. Mit den folgenden Experimenten sollte nun systematisch geprüft werden, welche Stimuli PBMC zur Sekretion von sCD95 anregen. Frisch isolierte PBMC von sechs gesunden Probanden wurden in einer Konzentration von 1x106/ml in FCS-Medium suspendiert und je nach Ansatz unstimuliert belassen (Kontrollen) oder mit den folgenden Agenzien stimuliert: 1μg/ml PHA +20U/ml rekombinantes humanes IL-2, 1μg/ml PHA oder αCD3+αCD28 +20U/ml IL-2 als T-Zell-Stimulation, 20pg/ml MBP oder 10µg/ml TT oder 5µg BP als Antigenstimulation (siehe Material und Methoden für genaue Bedingungen); 0,01% SAC als B-Zell-Aktivierung; 50ng/ml LPS als Monozyten-Stimulus oder 100-1000 IU IFN-β-1a als zellunspezifischer Stimulus. Die Inkubation erfolgte im Brutschrank (37°C, 5% CO2–Gehalt) in getrennten Ansätzen für die Proteinbestimmung, für die Bestimmung der Zellzahlen sowie der Stimulationsindizes. Nach 72h wurden die Zellkulturplatten zentrifugiert, die Überstände abgetrennt und aufkonzentriert und dann im CD95-ELISA-Kit gemessen. Die Anzahl lebender Zellen wurde nach der Trypanblaumethode mit Hilfe von Neubauer-Hämatozytometern bestimmt. Zusätzlich wurde die Proliferation durch Zugabe von 0,5µCi/Ansatz [3H]Thymidin nach 80h und weiteren 16h Inkubationszeit im Szintillationszähler gemessen. Alle Proliferationsmessungen wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt.

Abbildung 19 zeigt, dass nach 72h sCD95 ausschließlich in den mit T-Zell-Stimuli aktivierten PBMC nachgewiesen werden konnte. Stimulation mit Antigen allein führte zu keiner sCD95-Sekretion und die Stimulation mit PHA ohne die Zugabe von IL-2 zu einer sehr geringen, nicht sicher nachweisbaren sCD95-Sekretion. Der effizienteste Stimulus war eine Vorbereitung der Zellkulturplatten mit αCD3+αCD28 in Verbindung mit IL-2.

Alle T-Zell-Stimuli, außer den Antigenen, und SAC führten zu einer markanten Zellproliferation, gemessen nach 96h. Nach 72h lagen die absoluten Zellzahlen jedoch noch im Bereich der eingesetzten Zellmengen (1x106/ml) oder darunter.

↓84

Die Zeit, die zwischen Transkription, Translation und Sekretion von Proteinen vergehen kann, ist variabel. Um weder einen sehr späten noch einen sehr frühen Sekretionszeitpunkt zu verpassen, wurde eine Verlaufsuntersuchung der sCD95-
Abbildung 19 : sCD95 im Überstand von PBMC nach 72h unter verschiedenen Stimuli

A) sCD95 in Zellkulturüberständen. Die Nachweisgrenze des ELISA liegt bei 30 pg/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM.
B) Proliferation als Stimulationsindex (SI).

C) Anzahl lebender Zellen in Kultur nach 72h. Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM.

Sekretion durchgeführt. Frisch isolierte PBMC von fünf gesunden Probanden wurden

mit PHA, SAC bzw. ohne Stimulus (Kontrolle) kultiviert. Medium (zum Zeitpunkt 0h) oder Überstände wurden zu den verschiedenen Zeitpunkten (nach 5h, 1-7d) abgenommen, aufkonzentriert und im CD95-ELISA gemessen. Parallel wurde die Proliferation mittels [3H]Thymidin und die Anzahl lebender Zellen mit Trypanblau bestimmt.

↓85

Abbildung 20 zeigt, dass mit PHA (ohne IL-2) stimulierte PBMC erst nach vier Tagen eine deutliche sCD95-Sekretion zeigten, die im Verlauf weiter anstieg. Der Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin und demnach die DNA-Replikation in PHA-stimulierten PBMC erreichte seine höchsten Werte schon nach 72+12h, fiel dann wieder ab, blieb aber bis zum siebten Tag erhöht. Die Anzahl lebender Zellen in Kultur stieg nach dem vierten Tag an und verdoppelte sich bis zum sechsten Tag.

Nach vier Tagen in Kultur war auch in den mit SAC stimulierten PBMC-Proben sCD95 in geringer Konzentration nachweisbar. Diese stieg weiter an, blieb aber weit unter den mit PHA erzielten Werten. Die Proliferation von PBMC nach Stimulation mit SAC war wesentlich geringer ausgeprägt, und die Zellzahlen stiegen nicht an, sondern blieben relativ konstant bei etwa 1x106/ml.

Abbildung 20 : sCD95 im Überstand von PBMC im Verlauf

A) sCD95 in pg/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM von 5 gesunden Probanden. Die Signifikanz wurde mit dem Wilcoxon Test (*P<0,05) geprüft.
B) Anzahl lebender Zellen, bestimmt mit der Trypanblaumethode ( Mittelwerte±SEM).

C) Proliferation in counts per minute (Mittelwert±SEM).

↓86

In einem weiteren Experiment wurde erneut die Wirkung von IFN-β auf die sCD95-Sekretion evaluiert. Dazu wurden PBMC von vier gesunden Probanden jeweils ohne Stimulus, in Anwesenheit von 100 oder 1000 IU IFN-β, in Anwesenheit von PHA+IL-2 und von 100 oder 1000 IU IFN-β oder in Anwesenheit von PHA+IL-2 allein kultiviert. Um sehr späte Effekte mit zu erfassen, wurden die Überstände erst nach 96h abgenommen. In den Ansätzen ohne Stimulus oder mit IFN-β ohne PHA+IL-2 konnte kein sCD95 gemessen werden. Im Gegensatz dazu wurde erwartungsgemäß in den mit PHA+IL-2 stimulierten Zellkulturen eine sCD95-Sekretion nachgewiesen. In den mit und PHA+IL-2 und IFN-β stimulierten Ansätzen wurden im Vergleich dazu geringere sCD95-Konzentrationen gefunden (Abb. 21). Dies steht in Übereinstimmung mit der außerordentlich starken Aktivierung der PBMC durch PHA+IL-2, was sich in hohen

Abbildung 21 : sCD95 im Überstand von PBMC nach Stimulation mit PHA+IL-2 und IFN-β nach 96h.

A) sCD95 in pg/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM von 4 gesunden Probanden.
B) Proliferation in counts per minute ([3H]Thymidin, Mittelwert±SEM ).

Werten im Proliferationstest niederschlägt, während die Proliferation in den zusätzlich mit IFN-β behandelten Proben signifikant vermindert ist (ANOVA und Tukey-Kramer Multiple Comparisons Tests: P<0,05). Diese Inhibition der Proliferation durch IFN-β war dosisabhängig.

3.3.3 Bestimmung von sCD95 im Überstand von aktivierten T-Zellen, B-Zellen und Monozyten

↓87

Die durchgeführten Experimente mit PBMC gaben Hinweise darauf, dass T- und B-Zellen sCD95 sezernieren. Deshalb sollten nun getrennte Zellpopulationen untersucht werden. Mit der MACS-Technik wurden T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) in PBMC-Proben mit Antikörpern gegen CD-Gruppenantigene markiert und magnetisch separiert. Die Reinheit der Subpopulationen lag über 96%. Anschließend wurden T-Zellen mit PHA+IL-2, B-Zellen mit SAC und Monozyten mit LPS stimuliert. Für die T-Zell-Kulturen standen Zellen von sechs verschiedenen gesunden Probanden zur Verfügung, für die B-Zell- und Monozyten-Kulturen von drei gesunden Probanden. Nach 120h wurden Überstände abgenommen, aufkonzentriert und mit dem CD95-sandwich-ELISA analysiert. Dieser lange Zeitraum wurde gewählt, da eine Stimulation von PBMC mit SAC in den Vorexperimenten ergeben hatte, dass sCD95 erst nach fünf Tagen messbar ist. Abbildung 22 zeigt, dass nur gereinigte T-Zellen unter PHA+IL-2 Stimulation sCD95 sezernierten. Weder unstimulierte noch mit SAC stimulierte B-Zellen sezernierten sCD95, ebenso wenig wie Monozyten ohne und mit LPS-Stimulation. In parallelen Ansätzen wurde die Proliferation mit [3H]Thymidin bestimmt. Der mittlere SI für T-Zellen war 326±145 und für B-Zellen 49±37. Damit konnte die Funktionalität der eingesetzten Zellen und Stimuli nachgewiesen werden.

Abbildung 22 : sCD95 im Überstand von isolierten T- , B-Zellen und Monozyten.

Dargestellt sind die Mittelwerte±SEM in pg/ml von 6 bzw. 3 gesunden Probanden nach einer Inkubationszeit von 120h. Die Signifikanz wurde mit dem Wilcoxon Test (*p<0,05) geprüft.

3.3.4 Bestimmung von sCD95 im Überstand von T-Zelllinien

Die Fähigkeit von T-Zellen, nach PHA-Stimulation sCD95 abzugeben, sollte mit humanen antigenspezifischen T-Zelllinien bestätigt werden. Antigenspezifische T-Zelllinien wurden mittels eines modifizierten „split-well-Verfahrens“ etabliert. Anschließend wurden die T-Zellen von MBP-spezifischen T-Zelllinien von drei gesunden Probanden in Anwesenheit von adäquaten (PHA+IL-2, αCD3+αC28 + IL-2), inadäquaten (SAC, LPS) oder ohne Stimuli (Kontrolle) kultiviert. Die inadäquaten Stimuli wurden eingesetzt, um deren unspezifischen Einfluss auf T-Zellen zu testen und somit auszuschließen, dass die in PBMC beobachtete Induktion von sCD95 durch SAC eine direkte Wirkung des Stimulus auf T-Zellen als Ursache hat. Nach 72h wurden die Überstände abgenommen, aufkonzentriert und mit dem CD95-ELISA analysiert. Parallel dazu wurden Proliferationstests durchgeführt.Abbildung 23 zeigt, dass die Ergebnisse aus den vorhergehenden Experimenten hier bestätigt werden konnten. Stimulation mit T-Zell-spezifischen Stimuli (PHA+IL-2 und αCD3+αC28 + IL-2) führte zur Sekretion von sCD95 und zur Proliferation von antigenspezifischen T-Zellen. Die inadäquaten Stimuli führten im Vergleich zum Leerwert (Kontrolle) zu keiner Erhöhung von sCD95-Sekretion oder Zellproliferation. Eine Kinetik gab Anhalt dafür, dass auch im Falle von T-Zelllinien höhere Konzentrationen von sCD95 erst nach 72h nachweisbar sind (Abb. 23C).

↓88

Abbildung 23 : sCD95 in pg/ml im Überstand von drei antigenspezifischen T-Zelllinien.

Die antigenspezifischen T-Zelllinien wurden mittels eines „split-well-Verfahrens“ etabliert und mit oder ohne (Kontrollen) Stimulus kultiviert. Dargestellt sind die Mittelwerte SEM (A). Parallel dazu wurden Proliferationstests mit [3H]Thymidin durchgeführt (B). Im Falle einer TT- spezifischen Linie fanden sCD95-Bestimmungen zu einem weiteren Zeitpunkt statt (C).

In einem weiteren Experiment sollte gezeigt werden, ob auch eine Stimulation mit Antigen zur Sekretion von sCD95 führen kann. Dazu wurden jeweils 0,25x106 T-Zellen von vier MBP-spezifischen T-Zelllinien (TCL) mit 0,75x106 bestrahlten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und 20pg/ml MBP-Antigen (Ag) und 20U/ml IL-2 inkubiert. Als Kontrolle dienten zum einen T-Zellen, die nur mit APC und IL-2 versetzt waren, und zum anderen T-Zellen, die nur mit Antigen inkubiert wurden. Nach 48h wurden die Überstände abgenommen, aufkonzentriert und mit dem CD95-ELISA analysiert. Abbildung 24 zeigt, dass auch mit APC und Antigen stimulierte T-Zellen sCD95 produzierten. Bestrahlte autologe APC und Antigen alleine dagegen gaben kein sCD95 ab (ELISA-Nachweisgrenze bei 30pg/ml). Ebenso konnte eine mögliche Interaktion der antigenspezifischen T-Zellen mit APC ohne Antigen und eine daraus resultierende sCD95-Expression ausgeschlossen werden (Kontrolle TCL+APC).

Abbildung 24 : sCD95 in pg/ml im Überstand von vier antigenspezifischen T-Zelllinien (TCL) stimuliert mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und Antigen (Ag) und Kontrollen (Mittelwerte±SEM).

3.4 Mögliche immunomodulatorische Wirkung von sCD95

3.4.1  Expression von sCD95 im Vergleich zwischen MS-Patienten und gesunden Probanden

↓89

Mehrere Studien, u.a. über sCD95-Serumkonzentrationen von MS-Kranken, stellen einen Zusammenhang zwischen dem CD95-Apoptosesystem und einer möglichen Immundysregulation bei der MS her (Zipp et al., 1999). Deshalb sollte die sCD95-Sekretion von PBMC bei MS-Kranken und Gesunden unter konstanten Bedingungen verglichen werden. PBMC von 12 gesunden Probanden und 12 Patienten mit gesicherter, aber bisher unbehandelter RRMS wurden in An- und Abwesenheit von PHA+IL-2 kultiviert. Nach 72h wurden die Überstände abgenommen, aufkonzentriert und im CD95-ELISA gemessen. Gleichzeitig wurde die Anzahl lebender Zellen nach 72h mit der Trypanblaufärbung bestimmt. Erwartungsgemäß reagierten sowohl die PBMC von MS-Kranken als auch die von Gesunden mit einer sCD95-Absonderung nach der Stimulation. Die in Abbildung 25 etwas geringeren sCD95-Konzentrationen in den Zellkulturüberständen der MS-Kranken sind jedoch statistisch nicht signifikant niedriger als die der gesunden Probanden (Mann-Whitney Rangsummen-Teste: p>0,1). Auch wenn man die sCD95-Konzentrationen jedes Ansatzes auf die Zellzahl desselben Ansatzes bezieht, sind keine signifikanten Unterschiede zwischen MS-Kranken und Gesunden feststellbar (Abbildung 25B).

Abbildung 25 : Expression von sCD95 durch PBMC im Vergleich zwischen MS-Patienten und Gesunden nach 72h.

A) sCD95 in pg/ml. Dargestellt sind die Mediane und die F-Spannen als Boxplot.
B) sCD95-Produktion bezogen auf die Zellzahl nach 72h.

3.4.2 Longitudinale Studie von sCD95-Serumkonzentrationen bei schwangeren MS-Patientinnen

Serumproben von 69 Patientinnen mit klinisch definierter MS wurden bei geplanter Schwangerschaft vor, während der Schwangerschaft und bis zu sechs Monate postpartal bei Routineuntersuchungen gewonnen. Folgende mittlere sCD95-Serumkonzentrationen wurden gemessen: vor der Schwangerschaft 561,0±197,5pg/ml (Mittelwert±Standard Error of the Mean); im ersten Trimenon 583,1±71,5; im zweiten Trimenon 555,4±52,1; im dritten Trimenon 689,3±49,3; in den ersten drei Monaten nach der Geburt 585,2±53,3; und nach mehr als 3 Monaten nach der Geburt 621,8±94,5.

↓90

Die erhobenen longitudinalen Daten über sCD95-Serumkonzentrationen bei Schwangeren bzw. post- oder präpartalen Frauen sind unstrukturiert, d.h. bei jedem Individuum zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Schwangerschaft abgenommen, und unbalanciert, d. h. nicht jedes Individuum hat die gleiche Anzahl von Messpunkten (ungefähr 4±1 pro Patient). In der präpartalen und spät-postpartalen Phase existieren nur wenige Messwerte. Für derartige nicht-unabhängige Daten sind repeated measurement ANOVA-Methoden nicht geeignet, da das Zuordnen von Zeitpunkten zu Zeiträumen zum Verlust von statistischer Power und Exaktheit führt. Deshalb wurde stattdessen die Growth Curve Modelling-Methode nach den Richtlinien von Singer and Willet (Singer und Willett, 2003) angewandt. Dazu diente die SPSS 11.0 “Mixed Model Procedure” mit einer “first order autoregressive repeated covariance matrix”, “full maximum likelihood estimation”, und “type III sum of squares”. Die „first order autoregressive covariance matrix“ ist üblich bei der Analyse longitudinaler Daten und erlaubt die Autokorrelation von Fehlern. Als einheitliche exakte Zeitvariable dienten Wochen zentriert am tatsächlichen Geburtstermin (also z.B. bei Geburt in der 39. Schwangerschaftswoche (SSW) entspräche ein Entnahmezeitpunkt in der fünften SSW einer Zeitvariablen WOCHE = -34).

Zunächst wurden Verläufe der sCD95-Konzentrationen von einer repräsentativen Gruppe einzelner Individuen beurteilt. Diese Verläufe (eine Auswahl davon ist in Abb. 26 abgebildet) waren äußerst heterogen.

Abbildung 26 : sCD95-Konzentrationen in pg/ml x 10 -1 im Verlauf bei einer Auswahl von MS-Patientinnen vor, während und nach der Schwangerschaft.

↓91

Eine Projektion der Verläufe der Serumkonzentrationen aller Individuen in ein Liniendiagramm lässt ebenso keinen eindeutigen Trend erkennen (Abb. 27). Um den Verlauf der gemessenen sCD95-Serumkonzentrationen zu modellieren, wurden verschiedene Growth Curve Modelle gegeneinander getestet. Die verschiedenen hypothetischen Modelle wurden anhand theoretischer Überlegungen aufgestellt. Kernpunkt war hierbei die vielfach nachgewiesene Tatsache, dass die Krankheitsaktivität der MS während der Schwangerschaft nachlässt, und dass sCD95

Abbildung 27 : Übereinanderprojektion aller sCD95-Konzentrationen in pg/ml x 10 -1 im Verlauf bei MS-Patientinnen vor, während und nach der Schwangerschaft.

als Apoptose-inhibierendes Protein dabei eine Rolle spielen könnte. Als Kontrollmodell (M0) diente ein lineares “unconditional growth model” des Formates:

↓92

Yij=π0i1iWOCHEijij

(“within person” or “level 1” Modell)

π0i =Y000i

(“between person” or “level 2” Modell)

π1i =Y101i

(“between person” or “level 2” Modell)

Yij:

sCD95-Serumkonzentration der Person i zum Zeitpunkt j

π0i :

sCD95-Serumkonzentration der Person i zum Zeitpunkt null

π1i :

Änderung der sCD95-Serumkonzentration der Person i pro Zeitraum

εij:

zufälliger Messfehler der Daten zu Person i zum Zeitpunkt j

Y:

“level 2“ Intercepts

ζ:

“level 2“ Residuen (Varianz/Kovarianz- Parameter)

Modell M1 dagegen war quadratisch:

↓93

Yij=π0i1iWOCHEij2iWOCHE2 ijij

π0i =Y000i

π1i =Y101i

↓94

π2i =Y202i

wogegen Model M2 eine diskontinuierlicher Steigung der Geraden durch einen zusätzlichen „level 1“ Term für SSW (der vor und nach der Schwangerschaft =0 ist) erlaubt.

Yij=π0i1iWOCHEij2iSSWijij

↓95

π0i =Y000i

π1i =Y101i

π2i =Y202i

↓96

Die Ergebnisse der Modellierung (dargestellt in Tabelle 4) zeigten keine signifikanten Unterschiede in den „goodness of fit“-Statistiken zwischen Modell M1 und M0 bzw. M2 und M0. Auch erreichte keiner der eingesetzten Prädiktoren ein akzeptables Signifikanzniveau.

Tabelle 4 : Getestete „Growth Curve“- Modelle mit sCD95-Serumkonzentrationen als abhängige Variable (Standard Error in Klammern, ns = nicht signifikant)

Parameter (Fixed Effects)

M0

M1

M2

Intercept

612,40

(25,07***)

608,55

(27,45***)

488,72

(97,99***)

Woche

0,61

(1,14ns)

0,54

(1,16ns)

0,99

(1,15ns)

Woche*Woche

0,01

(0,02ns)

SSW

2,51

(1,54ns)

Gesamtmodell

- 2 Log Likelihood

2171,11

2170,99

2168,49

Akaike's Information Criterion (AIC)

2177,11

2178,99

2176,49

Schwarz's Bayesian Criterion (BIC)

2186,18

2191,09

2188,59

Differenz zu Kontroll Modell, D df=1

- 2 Log Likelihood

0,12ns

2,62ns

Da keine geeigneten zusätzlichen Daten wie z.B. der EDSS Score bei Schwangerschaftsbeginn oder über Therapiemethoden vorlagen, war es nicht möglich „level 2“ oder „between person“ Prädiktoren zu erproben. Diese könnten gegebenenfalls die inter-individuelle Variation der Kurvenverläufe erklären.


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27.10.2006