4 Diskussion

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Trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten ist die Ätiopathogenese der chronisch-entzündlichen ZNS-Erkrankung Multiple Sklerose noch immer nicht genau bekannt. In der Mehrheit der Studien finden sich Hinweise darauf, dass Autoimmunphänomene in einem engen Zusammenhang mit der Auslösung und der Aufrechterhaltung des Krankheitsgeschehens stehen. Demnach kommt es wahrscheinlich infolge eines Versagens inhibierender Regulationsmechanismen zur Persistenz von aktivierten myelinspezifischen CD4+-T-Zellen. Diese durchwandern die Blut-Hirnschranke und werden durch die Präsentation von Myelin-Antigenen auf APC reaktiviert. Nach der Reaktivierung setzen sie entzündungsinduzierende und gewebsdestruierende Mediatoren im Hirnparenchym frei, die zur Zerstörung von glialen und axonalen Strukturen führen (Trapp et al., 1998).

Zwar haben sich die Therapiemöglichkeiten für die MS durch die Einführung von IFN-β wesentlich verbessert, doch wird die Lebensqualität der meisten Patienten langfristig durch fortschreitende körperliche Behinderungen beeinträchtigt. Deshalb sind diagnostische Parameter, die Rückschlüsse auf den individuellen Verlauf der Erkrankung gestatten, sowie effektivere Therapeutika dringend erforderlich. Grundvoraussetzung dafür ist ein empirisch belegbares Konzept der Pathogenese der MS.

Apoptosemechanismen tragen bei der MS wahrscheinlich direkt zum Untergang der Oligodendrozyten im ZNS bei und haben somit eine Bedeutung als Effektormechanismus. Darüber hinaus spielt ein Mangel an Apoptose für das Überleben aktivierter autoreaktiver Immunzellen im peripheren Blut eine Rolle (Krammer, 1999;Zang et al., 1999). Da autoreaktive T-Zellen sowohl bei MS-Kranken, als auch bei Gesunden vorkommen, kann man annehmen, dass T-Zellen bei MS-Kranken durch eine höhere Resistenz gegenüber apoptotischen Stimuli gekennzeichnet sind, oder dass die Apoptosesysteme in ihrer Funktion beeinträchtigt sind (Ciusani et al., 1998;Macchi et al., 1999;Zipp et al., 1998). So konnte gezeigt werden, dass die Expression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-XL in PBMC von MS-Patienten gesteigert ist und mit einer erhöhten Resistenz dieser Zellen gegen AICD einhergeht (Waiczies et al., 2002). Unterstützt wird die Annahme einer erhöhte Apoptose-Resistenz durch die signifikant höhere Frequenz an ZNS-spezifischen CD4+- und CD8+-T-Zellen bei MS-Patienten (Crawford et al., 2004;Zhang und Raus, 1994). Als weitere Belege gelten lymphoproliferative und autoimmune Syndrome in CD95-Gen (lpr) bzw. CD95L-Gen-defizienten (gld) Mausmutanten (Nagata und Suda, 1995) sowie die Exazerbation eines MS-ähnlichen Krankheitsbildes im Tiermodell (EAE) durch eine systemische TRAIL-Blockade (Hilliard et al., 2001). Außerdem deuten erhöhte Protein- bzw. mRNA-Konzentrationen von sCD95 und sTRAIL bei MS-Patienten auf eine Schlüsselrolle dieser Apoptosesysteme auch beim Menschen hin (Huang et al., 2000;Zipp et al., 1998).

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Vorraussetzung für das Verständnis der oben genannten Phänomene sind nicht zuletzt konkrete Daten über die Expression und Regulation von sCD95 und TRAIL. Auf die Fragen nach diesen Expressions- und Regulationsmechanismen, versucht die vorliegende Arbeit Antworten zu geben.

4.1  Expression, Regulation und mögliche Bedeutung von TRAIL

Lösliches TRAIL (sTRAIL) wurde mit einem hochspezifischen sandwich-ELISA bestimmt, und membranständiges TRAIL auf Zelloberflächen mit einem Vierfarben-Durchflusszytometer analysiert. Durch den Einsatz zellspezifischer Stimuli (spezifisch für T-, B-Zellen oder Makrophagen) konnte gezeigt werden, dass T-Zellen in der Lage sind, große Mengen sTRAIL zu sezernieren, wenn sie mit PHA+IL-2 stimuliert werden. Die membranständige TRAIL-Expression war hingegen unverändert verglichen mit den nicht stimulierten Kontrollzellen. Im Gegensatz dazu konnte durch eine Stimulation von aufgereinigten B-Zellen mit αCD40+IL-4 weder eine sTRAIL-Sekretion noch eine TRAIL-Oberflächenexpression induziert werden. Für die LPS-Stimulation von Monozyten konnte ein moderater Kurzzeiteffekt auf die Sekretion von sTRAIL, nicht aber auf die Oberflächenexpression von TRAIL, festgestellt werden. Andererseits ergaben die Experimente, dass IFN-β nur bei Monozyten zu einer signifikanten dosisabhängigen Steigerung der sTRAIL-Sekretion führt, obwohl IFN-β alle Leukozytensubgruppen beeinflussen kann, da sowohl T-, B-Zellen, als auch Monozyten IFNAR 1 und 2 Rezeptoren exprimieren (Oritani et al., 2001). IFN-β stellte zudem das einzige hier eingesetzte Agens dar, welches eine klare Erhöhung der TRAIL-Oberflächenexpression auf Monozyten und in geringerem Ausmaß auf B-Zellen bewirkte.

Verschiedene Autoren vermuten, dass T-Zellen in der Lage sind, sTRAIL zu sezernieren (Martinez Lorenzo et al., 1998;Song et al., 2000). In der vorliegenden Studie wurde die Sekretion von sTRAIL durch T-Zellen direkt quantifiziert. Es konnte ein langsamer Anstieg von sTRAIL in Kulturüberständen nach Stimulation von PBMC oder gereinigten T-Zellen mit PHA+IL-2 oder αCD3+αC28 und IL-2 gezeigt werden. Die ausbleibende sTRAIL-Sekretion bei Stimulation nur mit PHA ohne IL-2 könnte darauf hinweisen, dass der IL-2 Signalweg wichtig für eine TRAIL-Induktion ist. Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung mit den Resultaten von Snell et al., die zeigten, dass IL-2 die Menge an TRAIL-mRNA in PBMC erhöht (Snell et al., 1997). Auch Monleon et al. berichteten, dass CD59 cross-linking, welches ein Signal für die IL-2-Synthese gibt, zur Hochregulation des TRAIL-Proteins in überaktivierten humanen T-Zellen führt (Monleon et al., 2000). Da IL-2 einer der potentesten Wachstumsfaktoren für T-Zellen ist (Smith et al., 1979), liegt die Vermutung zunächst nahe, dass die Hochregulation von sTRAIL in Anwesenheit von IL-2 lediglich die erhöhten Zellzahlen in der Zellkultur reflektiert, nicht aber einen direkten Effekt von IL-2 auf die sTRAIL-Sekretion. Diese Vermutung konnte jedoch nicht bestätigt werden, da die überproportionale sTRAIL-Sekretion nicht mit der Zellzahl korrelierte. Obwohl die T-Zellaktivierung mit PHA und IL-2 zu einer nachweisbaren Proliferation dieser Zellen nach einem Intervall von mehr als 72h führte, war die absolute Anzahl lebender T-Zellen in den Kulturen bis zum Zeitpunkt von 72h gegenüber der Ausgangsmenge sogar leicht reduziert. Gründe dafür könnten in der Toxizität der Stimuli und Kulturbedingungen liegen. Erst nach einem Zeitraum von 96h nahm die absolute Zellzahl in den stimulierten Ansätzen allmählich zu.

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T-Zellen gehören zu den effektivsten zytotoxischen Effektorzellen des Immunsystems. Sie eliminieren Zielzellen durch Perforin, CD95L, TNF oder Granzyme (Podack, 1995). Trotzdem zeigten diese Zellen in den hier beschriebenen Experimenten in vitro keine Erhöhung der membranständigen TRAIL-Expression durch die Aktivierung mit PHA+IL-2, was in Übereinstimmung mit den Forschungsergebnissen von Kayagaki et al. (Kayagaki et al., 1999) steht und vermuten lässt, dass die Sekretion von sTRAIL und die TRAIL-Oberflächenexpression unterschiedlich reguliert werden. Im Gegensatz dazu ist eine TRAIL-Hochregulation auf der Zelloberfläche nach Inkubation von aktivierten antigen-spezifischen T-Zelllinien (Wendling et al., 2000) oder frisch isolierten T-Zellen mit αCD3+αC28 in Kombination mit IFN-β möglich (Kayagaki et al., 1999).

B-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der humorale Immunantwort. Die Aktivierung, Reifung und Differenzierung von B-Zellen wird u.a. durch das Zytokin IL-4 und durch ko-stimulatorische Moleküle wie CD40 reguliert (Jeppson et al., 1998). Deshalb wurden funktionell aktive anti-CD40-Antikörper und IL-4 verwendet, um gereinigte B-Zellen zu stimulieren. Aktivierte B-Zellen begannen nach 72h in Kultur zu proliferieren, produzierten aber weder sTRAIL noch membranständiges TRAIL in nachweisbaren Konzentrationen. Laut Fanger et al. führt auch die Stimulation von dendritischen Zellen (DC) mit CD40L nicht zur Expression von TRAIL (Fanger et al., 1999;Vidalain et al., 2001). Im Gegensatz zu T-Zellen exprimieren auch frisch isolierte ex vivo B-Zellen überhaupt kein TRAIL auf ihrer Zelloberfläche. Dieser Unterschied zwischen T- und B-Zellen wurde zusätzlich durch eine real-time-PCR (Polymerasekettenreaktion) verifiziert (Daten nicht gezeigt), und bestätigt die von Zhao et al. postulierte Abwesenheit von TRAIL-mRNA in ruhenden humanen B-Zellen (Zhao et al., 1999). Im Mausmodell dagegen ist eine TRAIL-Expression auf der Oberfläche von transformierten und B220+-B-Zellen beschrieben worden, was auf mögliche Speziesunterschiede im B-Zell-System hinweist (Mariani und Krammer, 1998).

Bei der dritten Leukozytensubgruppe, auf die in dieser Studie ein Schwerpunkt gelegt wurde, handelt es sich um CD14+ Monozyten. Monozyten sezernierten nach Stimulation mit LPS in den ersten 24h kleine Mengen sTRAIL. Dieser Effekt wurde nur in isolierten Monozyten, nicht aber in PBMC beobachtet, was an der geringen Konzentration der Monozyten in PBMC-Proben (7,5-20%) liegen könnte. Da vielfach beschrieben wurde, dass Monozyten nach LPS-Aktivierung nicht in der Lage sind zu proliferieren (Langstein et al., 2000), erscheint es unwahrscheinlich, dass die gemessene sTRAIL-Sekretion durch eine erhöhte Monozytenanzahl in Kultur hervorgerufen wurde. Auch in anderen Studien wurde eine sTRAIL-Expression nach Stimulation mit LPS bestätigt (Halaas et al., 2000).

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Wie auch schon bei T-Zellen konnte bei Monozyten direkt ex vivo eine TRAIL-Oberflächenexpression gemessen werden, was ebenfalls in Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen steht (Halaas et al., 2000). Trotzdem führte die LPS-Stimulation von Monozyten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nicht zu einer verstärkten TRAIL-Oberflächenexpression. Die TRAIL-Oberflächenexpression nahm sowohl auf unstimulierten Monozyten zu, als auch auf solchen, die mit LPS stimuliert worden waren. Der Grund dafür war wahrscheinlich eine allgemeine Monozytenaktivierung durch die Kulturbedingungen, v.a. die Adhäsion an die Zellkulturplatten (Young et al., 2000). Die Ursache für widersprüchliche Daten zur LPS-induzierten TRAIL-Oberflächenexpression könnte in unterschiedlich konzentrierten LPS-Lösungen zu suchen sein (Griffith et al., 1999;Halaas et al., 2000). Halaas et al. beschrieben eine Erhöhung der bereits bestehenden TRAIL-Oberflächenexpression, nachdem Monozyten mit einer sehr hohen Konzentration an LPS (100ng/ml) stimuliert worden waren, wobei große interindividuelle Unterschiede bestanden (n=5). Bei Makrophagen wurde dieser Effekt nicht beobachtet, und auch bei dendritischen Zellen konnte LPS (5ng/ml) TRAIL nicht hochregulieren (Fanger et al., 1999).

Anders als die eingesetzten spezifischen Stimuli, die auf eine einzelne Leukozytensubgruppe zielen, beeinflusst das pleiotrop wirksame IFN-β alle Subpopulationen (Oritani et al., 2001;Stark et al., 1998). IFN-β ist eines der effektivsten Medikamente in der Langzeittherapie der RRMS. Dabei ist der Wirkungsmechanismus dieses Zytokins bisher ungeklärt. Die kontroversen Ergebnisse vieler Studien verweisen darauf, dass IFN-β den AICD verstärkt (Kaser et al., 1999), nicht direkt Apoptose auslösen kann (Zipp et al., 2000) oder sogar einen protektiven Effekt auf T-Zellen hat (Pilling et al., 1999). In der vorliegenden Studie sollte überprüft werden, ob die immunomodulatorischen und hypoproliferativen Effekte von IFN-β über eine Induktion von TRAIL vermittelt werden. In Experimenten mit PBMC war bereits eine dosisabhängige sTRAIL-Produktion nach Inkubation mit IFN-β nachgewiesen worden. Auch Transkriptionsanalysen anderer Autoren belegen eine Induktion von TRAIL durch IFN-β (Gong und Almasan, 2000). Die hier durchgeführten Analysen zeigten, dass trotz des pleiotropen Charakters von IFN-β (Oritani et al., 2001) ausschließlich Monozyten mit einer Sekretion von sTRAIL reagierten. Die durch IFN-β hervorgerufene sTRAIL-Sekretion war stark ausgeprägt, dosisabhängig und begann bereits in den ersten 24h nach Stimulation. Schon eine IFN-β-Konzentration, vergleichbar der Konzentration im Serum von MS-Patienten (68-86 IU/ml), die mit intramuskulärem IFN-β behandelten werden (Khan und Dhib-Jalbut, 1998), führte zu einem starken Anstieg von sTRAIL in den Zellkulturüberständen. Dieses Resultat steht in Übereinstimmung mit Ergebnissen einer weiterführenden Studie, die in vivo eine Induktion von sTRAIL bei MS-Patienten belegte, die mit IFN-β behandelt wurden (Wandinger et al., 2003). Mit einem DNA-Fragmentationtest nach Nicoletti (s.o.) konnte die biologische Wirksamkeit des abgegebenen sTRAIL nachgewiesen werden: Zellkulturüberstände von mit IFN-β behandelten Monozyten lösten Apoptose in suszeptiblen Jurkat-Zellen aus. Warum nur Monozyten nach IFN-β-Behandlung sTRAIL abgeben, nicht aber die anderen untersuchten Leukozytensubgruppen, sollte Gegenstand weiterführender Studien sein.

Die Inkubation mit IFN-β erhöhte nach den ersten 24h auch die Oberflächenexpression von TRAIL auf Monozyten. Griffith et al. beschrieben ähnliche Ergebnisse nach Stimulation von Monozyten mit IFN-α oder durch virale Infektion (Griffith et al., 1999). IFN-α und -β sind Typ-I-Interferone. Sie teilen eine ähnliche Sequenzhomologie, ähnliche Funktionen und die gleichen Oberflächenrezeptoren. Virale Infektionen von Zellen führen zu einer erhöhten Produktion von Interferonen und über diesen Mechanismus wahrscheinlich auch zur Hochregulation der TRAIL-Expression (Vidalain et al., 2001). Die IFN-β-induzierte TRAIL-Oberflächenexpression auf B-Zellen war zwar vergleichsweise gering, aber dennoch signifikant. Die Möglichkeit einer TRAIL-Expression auf der Oberfläche von nicht-transformierten B-Zellen ist in dieser Studie somit erstmalig nachgewiesen worden. In Übereinstimmung mit den Forschungsergebnissen von Kayagaki et al. (Kayagaki et al., 1999) konnte IFN-β alleine keine Erhöhung der membranständigen TRAIL-Expression auf T-Zellen induzieren.

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Insgesamt weisen die präsentierten Daten auf ein komplexes Regulationsmuster von löslichem und oberflächengebundenem TRAIL hin. Beide Formen werden am stärksten durch IFN-β induziert. Andere Autoren beschreiben einen „cross-talk”, ein Interagieren von TRAIL und IFN-β, da beide Proteine ähnliche subzelluläre Signalkaskaden benutzen. Zudem ergaben Gen-Expressionsanalysen, dass nicht nur TRAIL durch IFN-β induziert wird, sondern, umgekehrt, IFN-β auch durch TRAIL (Kumar-Sinha et al., 2002). Hinsichtlich dieser Resultate könnte der immunomodulatorische Einfluss von IFN-β auf den Verlauf der MS durchaus auch durch den synergistischen Effekt dieser beiden Zytokine auf Entzündungsreaktionen erklärt werden.

Die logische Schlussfolgerung aus diesen Überlegungen wäre, dass die von Huang et al. (Huang et al., 2000) festgestellte erhöhte TRAIL-mRNA-Konzentration in peripheren Blutzellen von MS-Patienten eine adäquate Reaktion des Organismus zur Begrenzung der Entzündungsreaktion darstellt. Diese auf der mRNA-Ebene gezeigten Unterschiede, die Huang et al. selbst auf der Protein-Ebene nicht verifizieren konnte, ließen sich auch in dieser Arbeit nicht bestätigen. Bei der Expression von Oberflächen- und sTRAIL konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen MS-Patienten und gesunden Probanden festgestellt werden. Mögliche Gründe dafür sind:

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Letztlich konnte die bereits erwähnte Studie von Wandinger et al. die von Huang et al. propagierten Unterschiede nicht reproduzieren, sondern zeigte ein umgekehrtes Verhältnis: 23 RRMS-Patienten (eine Subgruppe der untersuchten Kohorte, für die Serumproben vor Beginn der IFN-β Therapie vorlagen) zeigten signifikant niedrigere sTRAIL-Serumkonzentrationen als 24 gesunde Probanden gleichen Alters und Geschlechts (matched sample). Dabei muss auch erwähnt werden, dass 19 der insgesamt 47 Patienten in der Studie von Huang et al. primär oder sekundär chronisch-progrediente MS aufwiesen und neun weitere RRMS-Patienten zum Studienzeitpunkt einen akuten Krankheitsschub durchliefen oder gerade gehabt hatten. Somit ist insgesamt von einem Patientenkollektiv mit wesentlich aktiverem Krankheitsgeschehen als in der vorliegenden Arbeit auszugehen.

Zudem wäre denkbar, dass Polymorphismen im TRAIL-Gen bei einem Vergleich der Expressionsstärke mitbeachtet werden müssen. In einer weiterführenden genetischen Studie (Weber et al., 2004) konnten in der Promotorregion des für TRAIL kodierenden Gens vier einfache Nukleotidpolymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNP) identifiziert werden. Trotzdem gab es zwischen diesen Genotypen keine Unterschiede in der Expression von mRNA und löslichem oder membranständige TRAIL-Protein (Daten nicht gezeigt).

Unabhängig von möglichen Unterschieden in der TRAIL-Expression zwischen Gesunden und MS-Kranken kann als erwiesen gelten, dass die Expression von TRAIL durch IFN-β sowohl in vitro als auch in vivo drastisch gesteigert wird. Darauf deuten auch jüngste Ergebnisse aus der Längsschnittstudie von Wandinger et al. über IFN-β-behandelte MS-Patienten hin (Wandinger et al., 2003). Patienten, die klinisch auf eine IFN-β-Therapie ansprechen, so genannte „Responder“, zeigten frühzeitig anhaltend hohe Expressionslevel an TRAIL-mRNA und sTRAIL-Protein. Diese waren signifikant höher als bei unbehandelten Patienten oder gesunden Kontrollpersonen. Bei den so genannten „Non-Respondern“ blieb ein solcher Anstieg aus. Das Auftreten von IFN-β-neutralisierenden Antikörpern (NAB) dagegen führte zu einem späteren signifikanten Absinken der TRAIL-Expression. Somit kann TRAIL zumindest als ein Marker für das Ansprechen von Patienten auf eine IFN-β-Therapie betrachtet werden.

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Ungeklärt bleibt die Frage, warum die Blockade von TRAIL im systemischen Kreislauf von Nagetieren zu einer rapiden Verschlechterung von EAE und kollageninduzierter Arthritis führen (Hilliard et al., 2001;Song et al., 2000). Wie einleitend beschrieben, war TRAIL zunächst als apoptoseinduzierender Mediator bekannt geworden (Walczak, 1999). Schnell stellte sich heraus, dass viele nicht-transformierte Zellen, u.a. auch humane antigenspezifische T-Zellen, nicht suszeptibel gegenüber TRAIL sind (Ashkenazi et al., 1999); (Wendling et al., 2000). Auch in den Experimenten von Hilliard et al. und Song et al. war das Ausmaß an Apoptose von Entzündungszellen nicht verändert. Stattdessen gaben die Tierexperimente Hinweise darauf, dass TRAIL die T-Zell-Aktivierung und Proliferation inhibiert und somit eine Krankheitsexazerbation verhindert (Hilliard et al., 2001;Song et al., 2000). Darüber hinaus wurde ein supprimierender Effekt von TRAIL auf die Erythropoese beschrieben (Zamai et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass multimerisiertes TRAIL auch in humanen T-Zellen zu einer Inhibition der Aktivierung und Proliferation führt, und zugleich die Funktion von T-Effektorzellen einschränkt. Dazu wurde in An- und Abwesenheit von TRAIL eine Stimulation der T-Zellen mit αCD3 und αCD28 vorgenommen, welche eine Stimulation mit professionellen APC simuliert. Eine der Hauptfunktionen von CD4+ T- Effektorzellen besteht in der Sekretion von Zytokinen, wobei Th1-Zellen vor allem pro-inflammatorische Zytokine, Th2-Zellen hingegen anti-inflammatorische Zytokine produzieren (Janeway et al., 1999). TRAIL inhibierte die Aktivierung beider CD4+ T-Zell-Phänotypen, wie die verringerte Produktion von INF-γ und IL-4 nach TRAIL-Applikation in vitro belegt. Dieses Ergebnis widerspricht einer weit verbreiteten Hypothese, die besagt, dass die MS eine vornehmlich Th1-vermittelte Krankheit ist, und dass IFN-β das Verhältnis der beiden CD4+ T-Zell-Subtypen zugunsten der ehr immunomodulatorisch wirkenden Th2-Zellen verschiebt (Yong et al., 1998). Gestützt wird die Hypothese des sogenannten Th1/Th2-Shifts u.a. dadurch, dass die IFN-β-Therapie zu einer Inhibition der IL-12 Sekretion führt (Wang et al., 2000). IL-12 ist ein Zytokin, welches u.a. die Differenzierung von CD4+ T-Zellen in Th1-Zellen forciert. (Janeway et al., 1999). Die hier vorgestellten Ergebnisse folgen nicht dieser Th1-Th2 Dichotomie, da TRAIL zu einer Reduktion der Proliferationsrate und der Zytokinproduktion für beide T-Zell-Phänotypen führte. Auch die Ergebnisse anderer Studien bekräftigen die Zweifel an einem strikten Th1/Th2-Shift als alleinige therapeutische Wirkung von IFN-β(Wandinger et al., 2001).

Der Grad der dosisabhängigen Inhibition der T-Zelllinien-Proliferation zeigte eine große Varianz und betrug nur in einem Drittel der Fälle 40% oder mehr. Dabei wurden keine systematischen signifikanten Unterschiede zwischen T-Zelllinien von MS-Patienten und Gesunden oder zwischen Linien verschiedener Antigenspezifität (TT versus MBP) beobachtet (Lunemann et al., 2002). Die inhibierende Wirkung von TRAIL ließ sich auch in lediglich mit αCD3+αCD28 stimulierten T-Zellen nachweisen und war somit unabhängig von professionellen APC. Deswegen ist eine direkte Beeinflussung der T-Zellen durch TRAIL als wahrscheinlich anzusehen. Die genauere Erforschung des Signalwegs war Gegenstand weiterführender Studien (Lunemann et al., 2002). Diese zeigten, dass die TRAIL-vermittelte Hypoproliferation mit einer Herabregulation der CDK4 (Cyclin-dependent Kinase 4) verbunden ist. CDK4 reguliert das Voranschreiten des Zellzyklus von der G1 (Gap1) zur Synthesephase und könnte eine Rolle bei der Entstehung von T-Zell-Toleranz, z.B. der Anergie, spielen (Balomenos und Martinez, 2000). Im vorliegenden Fall wurde gezeigt, dass die Inkubation von T-Zellen mit TRAIL zur Inhibition des speicherabhängigen Kalziumeinstroms führt. Dieser stellt eine Grundvoraussetzung für die Lymphozytenaktivierung einschließlich der Zytokinproduktion und Zellproliferation dar (Qian und Weiss, 1997). Eine Inhibition des Kalziumstroms, die auch als Wirkung von TNF und CD95 beschrieben wurde, kann die T-Zellaktivierung supprimieren (Lewis und Cahalan, 1995). Mit Hilfe dieser Ergebnisse läst sich die schon lange bekannte hypoproliferative Wirkung von IFN-β(Oritani et al., 2001) wesentlich besser erklären: IFN-β induziert TRAIL, welches durch die Inhibition des Kalziumeinstroms zur Hypoproliferation beiträgt.

Die vorliegenden Daten aus dieser und weiterführenden Studien legen nahe, dass TRAIL die Aktivierung von humanen T-Zellen herabreguliert und dabei weder Apoptose noch Anergie auslöst. Diese potentiell anti-inflammatorische Wirkung könnte von großer Bedeutung für das Finden neuer therapeutischer Strategien auf dem Gebiet der Autoimmunerkrankungen sein.

4.2 Die Expression, Regulation und mögliche Bedeutung von sCD95

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Das CD95-Rezeptor/CD95-Ligand-Apoptosesystem wurde bereits in den frühen neunziger Jahren entdeckt (Itoh et al., 1991;Trauth et al., 1989). Somit lagen bereits zu Beginn dieser Studie Daten über die Expression und Regulation von membranständigem CD95 und CD95L vor: CD95 wird von verschiedenen Zellen exprimiert, vor allem aber von Thymozyten und T-Zellen, und durch IFN-γ sowie TNF bzw. Lymphozytenaktivierung hochreguliert (Klas et al., 1993;Nagata und Golstein, 1995). Von ruhenden B-Zellen wird CD95 erst nach Aktivierung durch CD40L oder Endotoxine exprimiert (Wang et al., 1996;Watanabe et al., 1995). Die CD95L-Expression ist begrenzt auf T-Zellen, NK-Zellen und Zellen in immunprivilegierten Geweben wie Auge und Hoden (Li-Weber und Krammer, 2003).

Gegenstand dieser Studie waren die Expression und Regulation von sCD95 aufgrund seiner besonderen apoptoseinhibierenden Rolle und der möglicherweise damit verbundenen verminderten Elimination aktivierter autoreaktiver T-Zellen in der MS-Pathogenese. Dazu wurde sCD95 mit einem sandwich-ELISA in den Zellkulturüberständen von PBMC und isolierten T-, B-Zellen und Monozyten quantifiziert. Allerdings waren die von den Zellen sezernierten sCD95-Konzentrationen unter der Nachweisgrenze des ELISA, so dass eine Azetonfällungs-Methode zur Konzentration der Zellkulturüberstände etabliert werden musste. Daraufhin wurden verschiedene Agenzien auf ihre Fähigkeit untersucht, die Produktion von sCD95 in PBMC zu induzieren. Zunächst konnte sCD95 nur in den mit T-Zell-Stimuli versetzten Ansätzen (PHA, PHA+IL-2 und αCD3+αC28) nachgewiesen werden. Die Stimulation mit PHA in Abwesenheit von IL-2 führte zu einem verzögerten Anstieg der sCD95-Konzentration in den Zellkulturüberständen, was die Bedeutung von IL-2 bei der Aktivierung, Differenzierung und Proliferation von T-Zellen widerspiegelt (Janeway et al., 1999). Erst eine Verlaufsbeobachtung über sieben Tage zeigte, dass auch das Endotoxin SAC eine sCD95-Sekretion bei PBMC bewirkt. SAC ist ein hitzeinaktiviertes Staphylokokkus aureus Bakterienantigen, also ein Endotoxin und potenter Induktor von B-Zell-Proliferation (Li et al., 1997),

Die parallel geführten Proliferationstests belegten die Wirksamkeit der eingesetzten Stimuli, aber die sCD95-Produktion war nicht mit einer Erhöhung der absoluten Zellzahl in der Kultur korreliert. Beim Einsatz von T-Zell-Stimuli kam es erst nach 96h zu einem Anstieg der absoluten Zellzahl.

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Über eine Sekretion von sCD95 durch PBMC war schon in früheren Arbeiten berichtet worden (Kovacs et al., 1997;Papoff et al., 1996); zu Leukozyten-Subpopulationen lagen bislang lediglich Daten aus Experimenten mit T- und B-Tumorzelllinien vor (Knipping et al., 1995). Die hier durchgeführten Experimente mit isolierten T-, B-Zellen und Monozyten bestätigten die Vorexperimente und ergaben, dass aktivierte T-Zellen sCD95 abgeben können. Im Gegensatz dazu war im Überstand von ruhenden oder mit SAC stimulierten B-Zellen bzw. ruhenden oder mit LPS stimulierten Makrophagen kein sCD95 nachweisbar. Das Ergebnis der SAC-Stimulation aus den Experimenten mit getrennten Zellpopulationen widerspricht den Vorexperimenten mit PBMC. Dort hatte SAC nach einem Intervall von 120h zur erhöhten sCD95-Konzentrationen in den Zellkulturüberständen geführt. Die Diskrepanz der vorliegenden Ergebnisse könnte damit erklärt werden, dass SAC durch „Toll-like-Rezeptoren“ Monozyten auf eine ähnliche Weise wie LPS aktivieren kann (Rabehi et al., 2001). Somit wäre denkbar, dass Monozyten durch Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine mit einiger Latenz T-Zellen aktivieren, die dann sCD95 abgeben. Weiterhin müssen proapoptotische Effekte von SAC auf reine B-Zell-Kulturen in Erwägung gezogen werden (Li et al., 1997). Deshalb bleibt offen, durch welche Zellpopulation und Mechanismen SAC tatsächlich sCD95-Konzentrationen in Zellkulturen erhöht, und ob normale humane B-Zellen in der Lage sind, sCD95 abzugeben. Forschung aus dem Bereich des systemischen Lupus erythematodus (SLE) zeigt, dass bei SLE-Patienten die sCD95-Serumkonzentration mit der Aktivität von B-Zellen, nicht aber T-Zellen korreliert (Bijl et al., 1998). Zusätzliche Experimente sind nötig, die Techniken wie intrazelluläre Durchflusszytometrie oder ELISPOT, weitere Stimuli sowie eine größere Anzahl an Probanden einschließen, um diese Frage endgültig zu beantworten.

Die Ergebnisse dieser und anderer Studien ergaben keine Hinweise auf einen Einfluss von IFN-β auf die Expression von CD95 bzw. sCD95. Im Überstand von Zellkulturen, die mit hohen IFN-β-Konzentrationen versetzt waren, konnte unabhängig von der Inkubationszeit kein sCD95 nachgewiesen werden. Außerdem war in Kulturüberständen von Zellen, die sowohl mit PHA+IL-2 als auch IFN-β inkubiert waren, tendenziell eher weniger sCD95 nachweisbar als in ausschließlich mit PHA+IL-2 stimulierten Zellkulturen. Wie oben bereits beschrieben hatte IFN-β einen antiproliferativen Effekt auf PBMC, was in Übereinstimmung mit vielen anderen Studien steht (Pette et al., 1997;Weber et al., 1999). Dabei ist zu betonen, dass IFN-β nicht zu einer Zunahme an Apoptose von T-Zellen führt (Zipp et al., 2000). Auch zusätzliche ex vivo Studien konnten keine eindeutig verstärkte Expression von CD95-mRNA bei IFN-β-behandelten MS-Patienten nachweisen (Gniadek et al., 2003), obwohl es unter IFN-β-Therapie bei MS-Patienten zu anfänglich steigenden und erst später abfallenden sCD95-Serumkonzentrationen kommt (Rep et al., 1999;Zipp et al., 1998).

Die Vermutung, dass isolierte und mit T-Zell-Stimuli aktivierte T-Zellen sCD95 abgeben, konnte mit antigenspezifischen T-Zelllinien verifiziert werden. Sowohl die Stimulation mit αCD3+αCD28 als auch mit bestrahlten APC und Antigen führte zur sCD95-Sekretion. Weder in den Zellkulturüberständen von T-Zellen+APC ohne Antigen noch von bestrahlten APC+Antigen ohne T-Zellen konnte sCD95 nachgewiesen werden. Daraus lässt sich schließen, dass die gemessenen sCD95-Konzentrationen tatsächlich von T-Zellen stammen und die Aktivierung Voraussetzung dafür ist. Da T-Zellen den größten Anteil an Lymphozyten (ca. 60%) ausmachen, ist somit auch wahrscheinlich, dass sie die Quelle für erhöhte sCD95-Spiegel bei MS-Patienten sind (Zipp et al., 1998). Die erhöhten sCD95-Serumkonzentrationen bei MS-Patienten sind nicht nur mit dem Fortschreiten der Krankheit assoziiert, sondern das Serum von RRMS-Patienten mit hohen sCD95-Spiegeln konnte auch in vitro CD95L-vermittelte Apoptose in suszeptiblen Glioma-Zelllinien verhindern (Zipp et al., 1998).

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Eine mögliche Ursache für die erhöhten sCD95-Serumkonzentrationen bei MS-Patienten könnte eine generelle Dysregulation der T-Zellen mit vermehrter sCD95-Sekretion sein. Diese Hypothese konnte hier nicht bestätigt werden. Es gab keine signifikanten Unterschiede der absoluten oder auf die Zellzahl bezogenen sCD95-Konzentrationen in Zellkulturüberständen von PBMC von Gesunden oder MS-Patienten. Dafür können mehrere Ursachen in Betracht gezogen werden (siehe auch oben):

Abgesehen von den experimentellen Bedingungen müssen folgende Überlegungen berücksichtigt werden: (1) Es ist denkbar, dass die Erhöhung der sCD95-Serumkonzentrationen durch die verstärkte Aktivierung von T-Zellen verursacht wird, die sich in den Entzündungsherden der MS-Kranken, nicht aber im peripheren Blut befinden. (2) Inoue et al. (Inoue et al., 1997) berichteten, dass sich die erhöhten Konzentrationen von sCD95 nur in Serum und Liquor von Patienten mit aktiver MS nachweisen lassen, d.h. sofern neurologische Symptome in den letzten sechs Monaten neu aufgetreten sind. Es bestehe aber kein Unterschied zwischen inaktiver MS, gesunden Kontrollen und Patienten mit anderen neurologischen Krankheiten. Zwei andere Studien kamen zu ähnlichen Ergebnissen (Sakai et al., 1999) und fanden erhöhte sCD95-Konzentrationen im Liquor von Patienten mit chronisch-progredienter MS gegenüber Patienten mit RRMS (Boylan et al., 2001;Ciusani et al., 1998). (3) Erhöhte sCD95-Konzentrationen wurden auch im Serum von Patienten mit anderen entzündlichen oder konsumierenden Erkrankungen gefunden, u.a. bei anderen inflammatorischen ZNS-Erkrankungen (Ciusani et al., 1998), bei SLE (Bijl et al., 1998), Rheumatoider Arthritis (Cheng et al., 1994), HIV (Jiang et al., 1997), bei Karzinomen (Kimura et al., 1999) und Leukämien (Liu et al., 2002). Zumindest für den SLE ist ebenfalls eine Assoziation der sCD95-Produktion mit der Krankheitsaktivität beschrieben (Bijl et al., 1998). Im Falle von maligner Erkrankungen gilt es nahezu als erwiesen, dass die Sekretion von sCD95 durch Tumorzellen dem Schutz vor Tumorelimination durch ein intaktes Immunsystem dient (Liu et al., 2002).

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Zusätzliche in-vitro-Studien mit PBMC von Patienten mit aktiver MS, MS in Remission und anderen Infektionskrankheiten, sowie die sCD95-Bestimmung im Liquor von Patienten mit aktiver und passiver MS wären nötig, um diese Frage vollends zu klären. Intrazelluläre Färbung und anschließende Durchflusszytometrie könnten die ELISA-Ergebnisse sinnvoll ergänzen.

Trotz der im Detail unterschiedlichen Teilergebnisse ist insgesamt davon auszugehen, dass erhöhte systemische sCD95-Serumkonzentrationen mit einer Verschlimmerung des inflammatorischen Krankheitsgeschehens einhergehen. Demnach müssten erniedrigte sCD95-Serumkonzentrationen einen positiven Effekt auf den Krankheitsverlauf haben. Im Falle der MS ist eine Erniedrigung der Schubrate während der Schwangerschaft mit postpartaler Krankheitsexazerbation lange bekannt (Birk et al., 1990;Birk et al., 1988). Daraus ergab sich die folgende Frage: Ist die verminderte Krankheitsaktivität während der Schwangerschaft auch mit erniedrigten sCD95-Serumkonzentrationen und somit einer verbesserten Elimination autoreaktiver T-Zellen verbunden? Die im Rahmen dieser Studie durchgeführte Längsschnittuntersuchung von schwangeren MS-Patientinnen konnte weder vor, während noch nach der Schwangerschaft systematischen Veränderungen von sCD95-Serumkonzentrationen feststellen. Obwohl ein Fehler zweiter Art (die Wahrscheinlichkeit, die Nullhypothese anzunehmen, obwohl diese falsch ist) durch zu wenige oder unstrukturierte Messpunkte nicht auszuschließen ist, deutet die Bestätigung des Ergebnisses auch unter Verwendung statistischer Methoden wie Growth Curve Modeling (Singer und Willett, 2003) auf die Richtigkeit der Nullhypothese hin. Die Nullhypothese besagt, dass keine systematischen Unterschiede existieren. Trotzdem muss in Betracht gezogen werden, dass ein Teil der Patientinnen der Studie immunomodulatorische Medikamente erhalten hatte, die zu Veränderungen der sCD95-Serumkonzentration führen können.

Anderen Studien zufolge liegt dem protektiven Effekt der Schwangerschaft v.a. ein Wechsel des zellulären Immunsystems von Th1 zu Th2 zugrunde, ähnlich dem Th1/Th2-Shift unter IFN-β-Therapie. Ein solcher Immunshift findet in der Schwangerschaft wahrscheinlich zum Schutz des Föten vor Abstoßung statt, und die Besserung Th1-vermittelter Autoimmunkrankheiten wie MS wäre somit ein Nebeneffekt (Dudley et al., 1993;Hill et al., 1995). Ursache dieses Immunshifts sind wahrscheinlich erhöhte Östrogenspiegel während der Schwangerschaft. Pilotversuche mit Östriol als Therapeutikum für MS-Patientinnen zeigten bereits erste Erfolge (Sicotte et al., 2002;Soldan et al., 2003). Eine andere Studie ergab, dass 2-Methoxyestradiol, ein endogener Östrogenmetabolit, Apoptose durch Hochregulation von CD95 in Endothelzellen hervorrufen könnte (Yue et al., 1997).

4.3 Ausblick

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Die Ergebnisse dieser und anderer Studien zeigen, dass TRAIL von aktivierten T-Zellen und von Monozyten unter der Wirkung von IFN-β verstärkt exprimiert wird. TRAIL wirkt hemmend auf die Proliferation und Aktivierung von humanen T-Zellen, löst dabei jedoch weder Apoptose noch Anergie aus. Diese immunomodulatorische Wirkung von TRAIL ist bedeutsam für das Verständnis der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten und deren Therapie. Während die Hochregulation von sTRAIL mit einer Besserung der MS-Symptomatik verbunden ist, gehen erhöhte sCD95-Serumkonzentrationen eher mit einer Verschlechterung einher. Der Grund dafür ist möglicherweise eine Blockade der CD95-vermittelten Apoptose autoreaktiver T-Zellen.

In den durchgeführten Experimenten wurde sCD95 ausschließlich von stimulierten T-Zellen sezerniert. IFN-β führte nicht zu einer Zunahme der sCD95-Expression in vitro. Weder im Vergleich zwischen MS-Kranken und Gesunden in vitro noch in der Untersuchung des Verlaufs der Schwangerschaft bei MS-Patientinnen in vivo fanden sich jedoch Veränderungen der sCD95-Sekretion.


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27.10.2006