Patricia Eifart: Visualisierung und Charakterisierung der S-Protein vermittelten Fusion von Coronaviren
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Visualisierung und Charakterisierung der S-Protein vermittelten Fusion von Coronaviren

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biophysik

Eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin Patricia Eifart

geb. am 17.01.1979 in Greifswald, Deutschland

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Christian Limberg

Gutachter:
1. Prof. Dr. A. Herrmann
2. Prof. Dr. Th. Pomorski
3. PD Dr. M. Veit

Tag der mündlichen Prüfung: 14.12.2007

Zusammenfassung

Visualisierung und Charakterisierung der S-Protein vermittelten Fusion von Coronaviren

117 Seiten, 39 Abbildungen und 21 Tabellen, Patricia Eifart, 2007, Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, Dissertation

Die Infektion von Zellen durch das Coronavirus MHV-A59 setzt die Freisetzung des viralen Genoms nach Fusion mit der zellulären Targetmembran voraus. Die Fusionsreaktion wird vom viralen S-Protein vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Eintrittsweg von MHV-A59 in Mauszellen mit zwei unabhängige experimentellen Ansätzen untersucht. Die Infektivität konnte durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren der Clathrin-abhängigen Endozytose signifikant gehemmt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass der Eintritt von MHV-A59 in Mauszellen über die Clathrin-abhängige Endozytose erfolgt und die anschließende Fusion der viralen und zellulären Membran in einem intrazellulären Kompartiment mit niedrigem pH-Wert stattfindet. Durch Inhibitoren endosomaler Proteasen dagegen wurde die Infektivität nur leicht beeinträchtigt. Epifluoreszenz- und konfokalmikroskopische Studien zur Interaktion fluoreszenzmarkierter MHV-A59 Partikel mit Mauszellen konnten nachweisen, dass MHV-A59 über Endozytose aufgenommen wird. Die Färbung intrazellulärer Kompartimente lässt die Fusion von viraler und zellulärer Membran vermuten. Nach Bindung der Viren an die Zellen und anschließende Erniedrigung des pH-Wertes auf 5.0, welcher das Milieu endosomaler Organellen simuliert, wurde eine deutliche Färbung der Plasmamembran beobachtet. Unter neutralen pH-Bedingungen konnte dagegen keine Markierung der Plasmamembran beobachtet werden. Die Erniedrigung des pH-Werts in Abwesenheit des Rezeptors führte ferner zu einer irreversiblen Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein, die zur Inaktivierung der Fusionsaktivität und zum Verlust der Infektivität führte. Diese Reaktion konnte kryoelektronen- und fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten auf eine wesentliche Beteiligung des endozytotischen Weges für den viralen Eintritt von MHV-A59 hin und lassen vermuten, dass ein niedriger pH-Wert, bereitgestellt durch ein zelluläres endosomales Kompartiment, die Konformationsänderung im S-Protein induziert und somit die Fusionsreaktion auslöst. Die kryoelektronenmikroskopische Analyse und 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 in der natürlichen Umgebung der viralen Hüllmembran führte zur Erstellung eines vorläufigen 3D-Modells der nativen S-Protein Konformation.

Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur und Fusionsfähigkeit des S-Proteins von SARS-CoV analysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass das S-Protein von SARS-CoV als Trimer sezerniert wird. Zusätzlich wurde ein auf Fluoreszenzmikroskopie basierender Zell-Zell-Fusionsassay etabliert. Dieser konnte nachweisen, dass die Zell-Zell-Fusion zwischen S-Protein und ACE2-exprimierenden Zellen sowohl abhängig vom pH-Wert als auch von der proteolytischen Spaltung in S1- und S2-Untereinheit ist und durch Erniedrigung des pH-Wertes zusätzlich verstärkt werden kann. Die genaue Rolle des niedrigen pH-Wertes bei der Konformationsumwandlung und/oder einer Aktivierung endosomaler Proteasen bedarf weiterer Untersuchungen.

Im abschließenden Teil der Arbeit wurde auf der Basis vergleichender theoretischer Untersuchungen eine Vorhersage des mutmaßlichen Fusionspeptids des S-Proteins von MHV-A59, welches alle wesentlichen Merkmale eines internen Fusionspeptids aufweist, vorgenommen. Es liegt nahe der „Heptad-Repeat“ (HR) Domäne HR1. Experimentelle Ansätze bleiben jedoch unabdinglich, um das Fusionspeptid, insbesondere in bezug auf dessen Vermittlung der Fusion, näher zu charakterisieren.

Eigene Schlagworte: Coronavirus, MHV-A59, Zelleintritt, SARS-CoV, Fusionsprotein, 3D-Struktur, Spikeprotein, Fusion, Fluoreszenzmikroskopie, Konformationsumwandlung, Endozytose

Abstract

Analysis of S-Protein mediated Fusion of Coronaviruses

117 pages, 39 Figures and 21 Tables, Patricia Eifart, 2007, Berlin, Humboldt University Berlin, Dissertation

Infection by the coronavirus mouse hepatitis virus (MHV)-A59 requires the release of the viral genome by fusion with the respective target membrane of the host cell. Fusion is mediated by the viral S-protein. Here, the entry pathway of MHV-A59 into murine cells was studied by mainly two independent approaches. Infection of cells assessed by the plaque reduction assay was strongly inhibited by lysosomotropic compounds and substances which interfere with clathrin-dependent endocytosis, suggesting that MHV-A59 is taken up via endocytosis and delivered to acidic endosomal compartments. Infection was only slightly reduced in the presence of substances inhibiting endosomal proteases. Fluorescence confocal microscopy of labeled MHV-A59 confirmed that the virus is taken up via endocytosis. Bright labeling of intracellular compartments suggests their fusion with the viral envelope. No fusion with the plasma membrane was observed under neutral pH conditions. However, when virus was bound to cells and the pH was lowered to 5.0, we observed a strong labeling of the plasma membrane. Electron microscopy revealed low pH triggered conformational alterations of the S-ectodomain. Very likely, these alterations are irreversible because low pH-treatment of viruses in the absence of target membranes caused an irreversible loss of the fusion activity. The results imply that endocytosis plays a major role in MHV-A59 infection and that the acidic pH of the endosomal compartment triggers a conformational change of the S-protein mediating fusion. Furthermore different conformations of the trimeric spike protein of the murine hepatitis virus A59 in its native environment, the viral envelope, were characterized by cryoelectron and electron microscopy. A preliminary 3D-reconsruction of the native structure at room temperature and neutral pH could be accomplished.

Besides we studied the structure and fusion capability of the spike protein expressed by SARS-CoV. The accomplished data indicate that the spike glycoprotein is secreted as a trimer. Furthermore a cell-cell fusion assay based on fluorescence microscopy was established. The fusion of spike protein and ACE2-receptor expressing cells was strongly dependent on low pH and on proteolytic cleavage of the S-protein into S1 and S2 subunit, whereas fusion could be significantly increased by lowering of the pH. Nevertheless, the precise function of low pH in either induction of the conformational change or activation of the respective endosomal protease and/or a combination of both is not unveiled yet and has to be investigated in more detail.

The final theoretical part of this thesis allowed the identification of the putative fusion peptide, which showed the main characteristics of internal fusion peptides. It is located near the HR1 region and allows the heptad regions of the spike protein to assemble in the six-helix bundle structure (6HB). This structure is of great importance to initiate the approximation of viral and cellular membrane and thus to induce fusion. However, future experiments are indispensable to characterize the main features and to elucidate the particular role of the fusion peptide in fusion mediation.

Keywords: Coronavirus, MHV-A59, Cell Entry, SARS-CoV, fusion protein, 3D structure, S protein, Fusion, Fluorescence Microscopy, Conformation, Endocytosis

Inhaltsverzeichnis

Tabellen

Bilder

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05.12.2008