A Einleitung

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Die Fusion von Membranen spielt in allen biologischen Systemen eine essentielle Rolle. Beim Austausch genetischer Informationen und ihrer Reassemblierung müssen zum Beispiel Spermium und Eizelle fusionieren. Auch in anderen biologischen Systemen wie dem neuronalen Netzwerk ist es essentiell Informationen auszutauschen. Dies geschieht über synaptische Vesikel, die an der Zielmembran fusionieren müssen, um ihre Botenstoffe freisetzen zu können. Membranfusion spielt auch eine wesentliche Rolle bei der Myogenese. Es entstehen vielkernige Synzytien, die sich anschließend in Skelettmuskelzellen differenzieren.

Insbesondere für umhüllte Viren ist die Fusion mit der Membran der Zielzelle von großer Bedeutung für deren Replikation. Die Virushülle besteht aus einer Lipiddoppelschicht, ähnlich denen der Plasmamembran der Wirtszelle. Durch Verschmelzung beider Membranen wird es dem Virusgenom ermöglicht in die Zelle einzudringen und sich hier zu replizieren, um neue Viruspartikel zu erzeugen. Die Membranfusion wird über virusexprimierte Glykoproteine, welche in der Hüllmembran verankert sind, vermittelt. In diesem Zusammenhang können nicht-pathogene Viruspartikel als Träger fremder genetischer Informationen dienen, die immer häufiger in der Gentherapie Verwendung finden. Dazu ist es wichtig den Mechanismus der virusvermittelten Zellfusion vollständig aufzuklären. Ein weiterer Punkt ist die Aufklärung dieses Mechanismus, um pathogene Viren wie Influenza, SARS oder HIV therapieren zu können und geeignete Gegenmittel zu entwickeln, die die Fusion verhindern oder in einem bestimmten Stadium stoppen können.

A.1 Wege des viralen Eintritts

Ein kritischer Punkt bei der viralen Infektion ist die Fähigkeit des Virus, das virale Genom von einem infizierten zu einem nicht-infizierten Organismus oder von einer infizierten zu einer nicht-infizierten Zelle zu transferieren. Durch die Unfähigkeit sich selbständig zu replizieren und durch das Defizit eines eigenen Metabolismus sind Viren von ihrem Wirt/Wirtszelle abhängig. Für eine erfolgreiche Vermehrung und Verbreitung des viralen Genoms haben Viren verschiedenste Strategien entwickelt, um in die Zelle einzudringen, ohne vom Wirt erkannt und vernichtet zu werden. Die effektive Nutzung der zellulären Wege bildet die Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion. Viren sind darüber hinaus ein wichtiges Instrument zur Aufklärung verschiedener zellulärer Transportprozesse und - wege. Sie können zum einen als Gentransfervehikel benutzt werden, um spezielle Gene/RNA, siRNA oder Proteine in die Zielzelle einzubringen. Zum anderen können sie Aufschluss über die Protein-Proteininteraktion und die anschließende Signaltransduktionskaskade und Fusion geben [1]. Bei allen bekannten Viren erfolgt die Freisetzung des viralen Nukleokapsids zunächst ins Cytosol der Zelle, unabhängig davon ob das Virus den Weg des direkten Eintritts oder den endozytotischen Weg nutzt. Die meisten RNA-Viren replizieren an definierten Organellen im Cytosol der Zelle [2], wogegen DNA-haltige Viren ihr Genom zunächst in den Nukleus einschleusen müssen.

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Derzeit gibt es Hinweise auf sechs verschiedene Wege des viralen Eintritts (Abbildung 1). Dazu gehört die Makropinozytose (A). Über diesen Weg treten Adenoviren in die Zelle ein, der Clathrin-unabhängige Weg (B), der eine Fusion der viralen Membran mit der Plasmamembran unter neutralen pH-Bedingungen voraussetzt. Dieser wird unter anderem von HIV, Influenza- (ca. 40%) und Arenaviren genutzt (Tabelle 1).

Tabelle 1: Wege des viralen Eintritts

Clathrin-unabhängig

Clathrin-abhängig

Umhüllte Viren

HSV-1

Influenza

Sendaivirus

Coronaviren: SARS-CoV**, MHV-2**

HIV

Ebola Virus (EboV)**

Influenza

ASLV/ALV***

VSV

SFV

Nicht-umhüllte Viren

Picornaviren – Poliovirus*

Reoviren**

Polyomaviren

SV40

*[3]; **SARS-CoV, Ebola, MHV-2 und Reoviren: Proteolytische Spaltung der viralen Glykoproteine im sauren Milieu des Endosoms [4,5,6]; ***ASLV/ALV: Rezeptor-Bindung und Erniedrigung des pH [7].

Der Clathrin-abhängige Weg ist der am häufigsten genutzte Aufnahmeweg für Viren (Abbildung 1 C, Tabelle 1). Die Viren gelangen über frühe Endosomen, aus denen sich späte Endosomen entwickeln, schließlich zu den Lysosomen. Abhängig vom Auslöser der Fusion kann an jeder Stelle dieses Weges die Freisetzung des viralen Genoms in das Cytoplasma erfolgen. Der Caveolin-abhängige Weg (D) ist Cholesterol-abhängig und über den Viren wie SV40 [8], Coxsackie-B, Mauspolyoma- und Echo-1 Viren zum Caveosom transportiert werden und anschließend über einen weiteren vesikulären Transportschritt zum ER gelangen und dort in das Cytosol entlassen werden. Ein weiterer Cholesterol-abhängiger, aber Caveolin- und Clathrin-unabhängiger Weg (E) wird von Polyomaviren und SV40 genutzt, um die Zielzelle zu infizieren. Die letzte bekannte Möglichkeit des viralen Eintritts stellt der Dynamin-2-abhängige Weg (F) dar, der ebenfalls Caveolin-abhängig ist und einen anschließenden Transport des Virus zum Caveosom beinhaltet. Dieser wird vom Echo-1 Virus genutzt.

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Abbildung 1: Wege des viralen Eintritts [1]. (A) Makropinozytose. (B) Clathrin-unabhängiger, direkter Eintritt nach Fusion mit der Plasmamembran (PM). (C) Clathrin-abhängiger Weg über frühe und späte Endosomen zu Lysosomen. (D) Caveolin-abhängiger, Cholesterol-abhängiger Weg mit anschließendem Transport zum Caveosom und ER. (E) Cholesterol-abhängiger, Caveolin- und Clathrin-unabhängiger Weg mit anschließendem Transport zum Caveosom und ER. (F) Dynamin-2-abhängiger, Caveolin-abhängiger Weg mit Transport zum Caveosom und ER.

Abhängig von Zelltyp und Virus kann die Freisetzung des viralen Nukleokapsids an fünf verschiedenen Orten stattfinden: (1) der Plasmamembran, (2) dem frühen oder (3) späten Endosom, (4) dem Caveosom oder (5) dem ER. Die Phagozytose konnte bis jetzt nicht mit dem viralen Eintritt in Verbindung gebracht werden und wurde daher nicht berücksichtigt [1].

A.1.1 Der Clathrin-abhängige virale Eintritt 

Betrachtet man das gesamte Spektrum der Viren, so ist zu beobachten, dass der Großteil über die endozytotische Internalisierung in die Zielzelle gelangt. Die Vorteile sind offensichtlich. Durch den Transport in endozytotischen Vesikeln ist es dem Virus möglich, tief in das Cytoplasma der Zelle einzudringen, dadurch den größten zellulären Barrieren wie dem Cytoskelett und cytosolischen Proteinen auszuweichen [9] und die molekularen Motoren der Zelle zu nutzen [10]. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass während der Phase der Freisetzung noch keinerlei virale Proteine auf der Oberfläche der Zielzelle präsentiert werden und so eine Erkennung durch das Immunsystem des Wirtsorganismus nahezu ausgeschlossen ist. Die Clathrin-abhängige Endozytose ist ein kontinuierlicher Prozess und stellt für das Virus einen schnellen und effizienten Weg dar, in die Zelle zu gelangen [11]. Schon nach einigen Minuten kommt es zur Internalisierung des Virus und die anschließende pH-Erniedrigung ermöglicht die über virale Glykoproteine vermittelte rasche Verschmelzung von viraler und intrazellulärer Membran, um das virale Nukleokapsid in das Cytosol zu entlassen. Abhängig vom pH-Wert, erfolgt die Freisetzung entweder vom frühen Endosom bei einem pH-Wert von 6.5-6.0 oder vom späten Endosom bei pH 6.0-5.5. Für das Ebolavirus, SARS-CoV, MHV-2 und die nicht-umhüllten Reoviren ist ein niedriger pH-Wert allein nicht ausreichend, um die Fusion auszulösen. Zusätzlich muss eine proteolytische Spaltung der viralen Glykoproteine, ausgelöst durch die Proteasen Cathepsin L oder B, im Lumen des Endosoms stattfinden, um das virale Protein in einen fusionskompetenten Zustand zu versetzen. Für das aviane Leukosevirus (ASLV) ist neben der pH-Erniedrigung die Interaktion mit dem Rezeptor notwendig, um die Fusion auszulösen [7,12,13]. Bei Influenza A Viren findet man für ca. 40% der Partikel neben dem klassischen Eintritt der Clathrin-abhängigen Aufnahme auch den Clathrin-unabhängigen Weg [14]. Nur 5% der Viren assoziieren mit bereits bestehenden Clathrindomänen. Erst die Virusbindung induziert eine Assemblierung Clathrin-reicher Domänen unter der Plasmamembran. Diese Induktion- und Rekrutierungsreaktion für Clathrin wurde auch für das Semlikiforestvirus (SFV) und Reoviren beobachtet [15]. Endozytotische Clathrin-assoziierte Vesikel liefern ihren Inhalt an frühe Endosomen und es gibt Hinweise darauf, dass diese zu einer selektiven, spezifischen Population von Endosomen gehören [16]. Für das Vesikularstomatitisvirus (VSV) konnte gezeigt werden, dass die Fusion der viralen Membran mit Membranen der multivesikulären Endosomen (MVB) erfolgt und diese anschließend mit der Membran später Endosomen weiter verschmelzen [17]. In diesem Fall ist für die Entlassung des viralen Nukleokapsids die Fusion mit zwei zellulären Membranen Voraussetzung. Ein solcher Mechanismus konnte auch für das Anthraxtoxin des Bacillus Anthracis nachgewiesen werden [18].

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Abbildung 2: Der endozytotische virale Eintritt in die Zelle [1]. Neun Schritte des viralen Eintritts werden bis zur Freisetzung des Nukleokapsids durchlaufen. In diesem Beispiel wird das virale Nukleokapsid in den Nukleus transportiert.

Die einzelnen Schritte des endozytotischen viralen Eintritts stellen sich wie folgt dar: Der erste Kontakt zwischen Virus und Zelle erfolgt durch die Interaktion viraler Strukturproteine mit den Oberflächenproteinen der Zelle. Dies können Rezeptoren oder andere zelluläre Faktoren sein (Abbildung 2 (1)). Anschließend kommt es zur lateralen Diffusion des Virus-Rezeptor-Komplexes (2), welche eine Signaltransduktionskaskade (3) auslöst. Diese führt zur Internalisierung des Virus (4). Nach dem vesikulären Transport (5) werden die Viruspartikel zu zellulären Kompartimenten, wie Endosom, ER oder Caveosom transportiert und Konformationsumwandlungen in den viralen Oberflächenproteinen führen zur Fusion der viralen und zellulären Membranen (6). Dies ermöglicht die Freisetzung des Nukleokapsids in das Cytosol. Umhüllte Viren nutzen für diesen Vorgang die Membranfusion, wogegen nicht-umhüllte Viren durch Lyse oder Porenbildung in die Zelle eindringen. Nach gerichtetem intrazellulärem Transport entlang von Mikrotubulis (MTs) (7) findet der Import des viralen Genoms in den Zellkern statt (8), indem das Kapsid an den Nukleären Zellkernporenkomplex (NPC) bindet und das virale Genom freigesetzt wird (Abbildung 2 (9)). Die Freisetzung des viralen Genoms kann auch im Cytosol und assoziiert mit intrazellulären Membranen stattfinden.

A.1.2 Der Clathrin-unabhängige virale Eintritt

Das am intensivsten untersuchte Virus für den Clathrin-unabhängigen, Caveolin-/Raft-abhängigen Weg ist das SV40-Virus. SV40 ist ein nicht-umhülltes Virus, des DNA als genetischen Informationsträger enthält [19,20,21]. Der Caveolae/Raft-abhängige Weg untergliedert sich in drei ähnliche Varianten (Abbildung 1 D-F). Zunächst wird die Mehrheit der internalisierten Viren zu einem pH-neutralen Kompartiment, dem Caveosom transportiert (Abbildung 1 D). Anschließend werden die virushaltigen Vesikel mit Hilfe der Mikrotubuli zum ER transportiert, wo die Freisetzung des Nukleokapsids stattfindet [8]. Auch Echo-1 und Coxsackie-B Viren nutzen diese Route [22,23]. Zusätzlich zu diesen Wegen gibt es immer mehr Hinweise auf einen Clathrin-unabhängigen Weg, der zum endosomalen System gerichtet ist (Abbildung 1 B). Dieser konnte sowohl für Arena- als auch für Influenzaviren beobachtet werden [14,24].

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Die direkte Fusion des Virus mit der Plasmamembran findet unter neutralen pH-Bedingungen statt. Vergleicht man den pH-unabhängigen mit dem pH-abhängigen Weg, wird offensichtlich, dass beim direkten Eintritt und nach Fusion mit der Plasmamembran das Nukleokapsid zunächst das Cytoskelettnetzwerk aus Aktin-, Intermediärfilamenten und Mikrotubuli (MT) durchdringen muss, um seinen Bestimmungsort zu erreichen. Da die virale Replikation immer im oder in der Nähe des Nukleus stattfindet, ist ein Transport bis zu diesem Organell unabdinglich. Der direkte Eintritt besitzt allerdings auch Vorteile. Zum einen ist die Gefahr des proteolytischen Abbaus durch den gerichteten Transport in endosomalen Vesikeln zu den Lysosomen sehr gering. Zum anderen werden während der Virusreplikation nicht benötigte virale Glykoproteine an die Oberfläche der infizierten Zelle transportiert. Die Zellen können unter diesen Bedingungen mit der Nachbarzelle fusionieren. Dieser Vorgang wird als Zell-Zell-Fusion bezeichnet, bei der es zur Ausbildung von Synzytien - vielkernigen Zellkomplexen - kommt. Der schnelle Transfer viraler genetischer Information ist so ohne die Bildung von Viruspartikeln möglich. Zellverbände und Gewebe können auf diese Art besonders schnell und effizient infiziert werden. Für die Infektion weiterer Organismen und die Verbreitung der viralen genetischen Information ist es jedoch unablässig Viruspartikel zu bilden.

A.1.3 Identifizierung des viralen Eintrittswegs

Die Infektivität ist von zwei Faktoren abhängig. Einerseits wird das Infektionsverhalten durch das Virus selbst und andererseits durch den infizierten Zelltyp bestimmt. Zur Untersuchung und Identifizierung des viralen Eintrittsweges werden u.a. Inhibitoren der Endozytose eingesetzt, um diesen Weg zu inhibieren. Wird die Zelle dennoch infiziert und kommt es zur Produktion von Viruspartikeln, so kann davon ausgegangen werden, dass eine Infektion unabhängig von der endozytotischen Route stattfindet. Die Substanzen, die eine Ansäuerung bestimmter Zellorganellen verhindern, werden als lysosomotrope Agenzien bezeichnet. Zur Identifizierung des viralen Eintrittsweges und zur Charakterisierung der anschließenden Fusion und Art der zellulären Membran wurden in dieser Arbeit die in Tabelle 2 zusammengefassten Substanzen verwendet. Neben den lysosomotropen Substanzen, die die Ansäuerung endozytotischer Vesikel auf verschiedene Weise verhindern, sind auch weitere Inhibitoren, die endosomale Proteasen hemmen oder Cholesterol-entziehende Reagenzien bekannt, die einen Einfluss auf die Infektivität bestimmter Viren haben.

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Tabelle 2: Inhibitoren der Endozytose und andere Substanzen

Substanz

Konzentration

Literatur

Lysosomotrope Substanzen

Ammoniumchlorid

10-50 mM

[5,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35]

Bafilomycin A1

20 – 100 nM

[25,27,28,29,31,36,37,38,39,40,41,42,43]

Chlorpromazin

10-14 μM

[26,38,44,45,46,47]

Concanamycin A

10-100 nM

[41]

Monensin

1-10 µM

[27,28,40,48,49]

Proteaseinhibitoren

E-64

1-10 µM

[4,5,6]

Leupeptin

1-10 µg/ml

[4,5,50,51]

Cholesterolentzug/-bindung

Filipin III

1-15 μg/ml

[26,52,53]

Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD)

5-15 mM

[26,52,54]

Wie bereits erläutert, existieren für Hüllviren zwei Hauptwege des viralen Eintritts: (1) Der endosomale/endozytotische Weg und (2) der nicht-endosomale Weg [55,56]. Es existieren auch Viren, die beide Wege nutzen können. Das Japanische Encephalitis Virus (JEV) kann sowohl mit der Plasmamembran fusionieren, als auch durch endozytotische Aufnahme in die Zelle gelangen [57]. In allen Fällen ist es für die Freisetzung des viralen Genoms wichtig, dass virale und zelluläre Membran fusionieren [58].

Abbildung 3: Die Wirkungsweise lysosomotroper Substanzen und anderer Inhibitoren (modifiziert, [1].Lysosomotrope Substanzen wie Ammoniumchlorid (A), Monensin (B), Bafilomycin A1 und Concanamycin A (B) führen zur Neutralisierung des sauren Lumens von Endosomen und verhindern so die Auslösung des pH-abhängigen Fusionsprozesses. (C) Chlorpromazin verhindert die Bildung Clathrin-haltiger Vesikel und somit den endozytotischen Transport der Zelle. (D) MβCD und Filipin III führen zur Cholesterolverarmung der Plasmamembran der Zielzelle. (E) Proteaseinhibitoren wie Leupeptin und E-64 inhibieren Cysteinproteasen im Lumen von Endosomen.

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In Abbildung 3 sind die Wirkungsweisen der einzelnen Inhibitoren veranschaulicht, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden. Chlorpromazin (Abbildung 3 C) inhibiert die Endozytose, indem es die Bildung Clathrin-haltiger Vesikel hemmt [47] und so die gesamte Clathrin-abhängige Endozytose der Zelle zum Erliegen kommt [38,44,45,46]. Um die pH-Erniedrigung in den Endosomen zu verhindern, werden lysosomotrope Substanzen wie Ammoniumchlorid (Abbildung 3 A), eine schwache Base, die in endosomalen Vesikeln akkumuliert und dadurch zur Neutralisierung des pH-Werts im Endosom führt [5,30,39,59], verwendet. Einen ähnlichen Wirkungsmechanismus besitzt Monensin (Abbildung 3 A), ein Ionophor, welches den Protonengradienten über der endosomalen Membran zerstört und somit eine Erhöhung des pH-Wertes auslöst [28,40,48,49]. Die Substanzen Bafilomycin A1 und Concanamycin A (Abbildung 3 B) verhindern die Ansäuerung des Lumens zellulärer Organellen, indem sie die V-Typ-H+-ATPase in eukaryotischen Zellen inhibieren [36,39,40,60].

Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) oder Filipin III führen zur Cholesterolverarmung der Plasmamembran: (1) MβCD extrahiert Cholesterol aus der Plasmamembran und (2) Filipin III bindet es und verbleibt in der Membran (Abbildung 3 D). Für MHV und andere umhüllte Viren konnte bereits ein wesentlicher Einfluss von Cholesterol auf den Eintritt gezeigt werden [52,54,61]. In neuesten Untersuchungen wurde der Einfluss endosomaler Proteasen auf die Fusion von viraler und endosomaler Membran von SARS-CoV, MHV-2 (Coronaviren) und Ebolavirus (EboV), gezeigt [4,5,6]. In diesen Experimenten wurden unter anderem Proteaseinhibitoren wie Leupeptin und E-64 verwendet (Abbildung 3 E), die die Cysteinproteasen Cathepsin L und B im endosomalen Lumen hemmen.

A.2 Virale Fusionsproteine

Für die zielgerichtete Einschleusung des viralen Genoms ist es für umhüllte Viren wichtig mit der Membran der Wirtszelle zu fusionieren. In jedem Fall sind einzelne oder ein Komplex viraler Oberflächenproteine für diesen Fusionsprozess verantwortlich. Virale Proteine unterscheiden sich grundlegend in ihrem Aktivierungsmodus und ihrer Struktur. Durch einen Auslöser wird das in der metastabilen Konformation vorliegende virale Fusionsprotein in einen Zustand versetzt, der es erlaubt über das exponierte Fusionspeptid (FP) in die Zielmembran einzudringen. Mehrere nachfolgende Konformationsumwandlungen im viralen Fusionsprotein führen zur Annäherung beider Membranen. Zunächst erfolgt eine lokale Hemifusion und die anschließende Bildung und Vergrößerung der Fusionspore ermöglicht die vollständige Verschmelzung beider Membranen. Eine Zusammenfassung über die Vielfalt viraler Fusionsproteine gibt Tabelle 3 [62]. Für Viren wie HIV-1 oder das Sendaivirus, die den nicht-endosomalen Weg nutzen [63,64] wird die Konformationsumwandlung durch Interaktion mit dem entsprechenden zellulären Rezeptor bei neutralem pH-Wert direkt an der Plasmamembran ausgelöst. Andere Viren, wie die Orthomyxoviren, zu denen das Influenzavirus A zählt, werden von den Zellen über den endosomalen Weg aufgenommen. In diesem Fall wird das endosomale Lumen durch die Aktivität einer ATP-hydrolysierenden Protonenpumpe (V-Typ ATPase) angesäuert [40] und dadurch eine Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein ausgelöst, was zur Vermittlung der Fusion von viraler und endosomaler Membran führt. Kürzlich wurde für das aviane Sarkoma-Leukosis Virus (ASLV) ein weiterer Mechanismus für die Auslösung der Konformationsumwandlung entdeckt. Die Initiierung der Fusion benötigt zunächst die Interaktion des viralen Proteins mit dem zellulären Rezeptor und erst die anschließende pH-Erniedrigung im endosomalen Lumen führt zur Konformationsumwandlung des Fusionsproteins und somit zur Fusion von viraler und zellulärer Membran [7,62].

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Tabelle 3: Virale Fusionsproteine

(A) Virale Fusionsproteine [ 62 ]

Virusfamilie

Proteine

pH Fusion

Klasse

Fusionspeptide

Orthomyxovirus

HA

sauer

I

N-terminal

Alphavirus

E1

sauer

II

intern

Flavivirus

E

sauer

II

intern

Rhabdovirus

G

sauer

?

intern

Bunyavirus

G1/G2

sauer

?

?

Arenavirus

GP

sauer

?

?

Filovirus

GP

sauer

I

intern

Retrovirus

Env

neutral

I

N-terminal, intern

Herpesvirus

gB, gD, gH, gL

neutral

?

?

Coronavirus

S

neutral

I

intern

Poxvirus

unbekannt

neutral

?

?

Hepadnavirus

S

neutral?

?

?

Iridovirus

unbekannt

unbekannt

?

?

(B) Klassifizierung viraler Fusionsproteine [ 65 ]

Virusfamilie

Virusspezies

Klasse

Fusionsprotein

Orthomyxoviridae

Influenza A










I

HA

Influenza C

HEF



Paramyxoviridae

Semianvirus 5



F

Humaner Parainfluenzavirus

NDV

RSV

Filoviridae

EboV

GP2



Retroviridae

MMLV

TM

HIV-1

gp41

SIV

gp41

HTLV

gp21

Human syncytib-2

TM

Visnavirus

TM

Coronaviridae

MHV

S2

SARS-CoV

E2

Flaviviridae

TBEV


II

E

Dengue 2 und 3

E

Togaviridae

SFV

E1

Rhabdoviridae

VSV


III

G

Herpesviridae

HSV

gB

Alle bekannten viralen Fusionsproteine bestehen aus einer großen extrazellulären Ektodomäne (Ekto), einer Transmembrandomäne (TM) und einer kurzen cytoplasmatischen Domäne (CT). Virale Fusionsproteine werden basierend auf den strukturellen Eigenschaften der Postfusionskonformation in drei Klassen I-III gegliedert [65,66,67]. Fusionsproteine der Klasse I werden als Vorläufer synthetisiert, die durch Proteasen der Wirtszelle in zwei Untereinheiten gespalten werden. Teilweise bleiben diese wie im Fall des Hämagglutinins (HA) des Influenzavirus kovalent über Disulfidbrücken oder wie im Fall des Env-Proteins von HIV durch nicht-kovalente Interaktion miteinander assoziiert. Die proteolytische Spaltung des viralen Fusionsproteins ist ein kritischer Punkt, denn hier wird der metastabile Zustand des Proteins generiert [68]. Sowohl im metastabilen als auch im fusionsaktiven Zustand bilden Fusionsproteine der Klasse I Trimere aus. Die fusionsaktiven Untereinheiten bilden eine „Hairpin“-Konformation, die aus einem zentralen α-helikalen „Coiled-Coil“ besteht, welches aus den „Heptad-Repeat“ (HR)-Sequenzen HR1 und HR2 gebildet wird [69]. Die endgültige Form niedrigster potentieller Energie enthalten „Sechs-Helix-Bündel“ (6HB) [70], die eine relativ lange (65-115 Å) zentrale „Coiled-Coil“ Struktur aufweisen. Das antiparallele „Sechs-Helix-Bündel“ findet man außerdem bei Fusionsproteinen anderer Hüllviren wie dem Retrovirus HIV-1, dem Filovirus Ebola und dem Paramyxovirus SV5 [63,71,72,73,74,75]. Es stellt somit eine hochkonservierte Struktur dar. Die fusionsaktive Struktur besteht bei Klasse II-Proteinen aus β-Faltblättern [69,76,77]. Die strukturelle Umlagerung von der Prä- in eine Postfusionskonformation resultiert immer in einer stabilen „Hairpin“-Konformation, die es der zellulären und viralen Membran ermöglicht durch Annäherung von Transmembrandomäne und Fusionspeptid zu verschmelzen. In neuesten Studien konnte eine dritte Klasse viraler Fusionsproteine identifiziert werden. Zu dieser gehören die viralen Glykoproteine G von VSV und gB des Herpes Simplex Virus (HSV) [78,79]. Diese Proteine zeichnen sich durch die Bildung einer trimeren „Hairpin“-Struktur aus, die zwei strukturelle Elemente aufweist: Einen (i) α-helikalen trimeren Kern und (ii) zusätzlich zwei Fusionsschlaufen, die am Ende der β-Faltblätter lokalisiert sind (Tabelle 4). Detaillierte Eigenschaften der viralen Fusionsproteine der Klasse I und II wurden in Tabelle 4 zusammengestellt.

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Tabelle 4: Eigenschaften viraler Fusionsproteine der Klassen I und II [62]

Eigenschaften

Klasse I

Klasse II

Typ integraler Membranproteine

Typ I

Typ I

synthetisiert als

inaktiver Vorläufer

inaktiver Vorläufer

Status auf Virion

metastabil

metastabil

Orientierung im Virus (bezüglich der Membran)


perpendikulär


parallel

Zum metastabilen Zustand umgewandelt durch

proteolytische Prozessierung im Fusionsprotein-Vorläufer

proteolytische Prozessierung eines assoziierten Proteins

Zahl der Untereinheiten im Fusionsprotein


2


1

Sekundärstruktur der Fusionsuntereinheit


α-Helix


β-Faltblatt

Aktivierung der fusionsaktiven Form durch


niedriger pH oder Rezeptor(en)


niedriger pH

oligomerer Status des metastabilen Proteins


Trimer


Dimer

oligomerer Status des fusionsaktiven Proteins


Trimer


Trimer

Lokalisierung des Fusionspeptids


N-terminal oder intern


interner Loop

Struktur der finalen fusionsaktiven Form

Trimere „Hairpin“-Struktur („Coiled-Coil“)

Trimere „Hairpin“-Struktur (nicht-„Coiled-Coil“)

Die Struktur von Fusionsproteinen der Klasse II unterscheidet sich deutlich von denen der Klasse I. Ein sehr gut untersuchtes Beispiel ist das Glykoprotein (E) des Tick-Borne-Encephalitis Virus (TBEV). Während der Synthese bilden das E-Protein und das Membranglykoprotein prM Heterodimere. Während der Virusreifung spaltet eine Wirtszellprotease prM, was in der Reorganisation des Proteins auf der Oberfläche des Virus resultiert [80]. Nach Spaltung von prM liegt E als metastabiles Homodimer vor. Die Ektodomänen des Proteins orientieren sich antiparallel. Im Unterschied zu den Trimeren der Klasse I Proteine, liegt die Ektodomäne des E-Proteins parallel zur viralen Membran vor. Das E-Protein von TBEV besteht zum Großteil aus β-Faltblättern [66,81]. Ähnliches gilt für die Struktur des Klasse II Spikeproteins des Semlikiforestvirus (SFV). Im Fall des S-Proteins von SFV besteht das metastabile Oligomer aus einem Heterodimer aus zwei membranverankerten Proteinen E1 und E2 mit einem assoziierten dritten Protein E3 [82].

A.2.1 Aktivierung der Fusion durch niedrigen pH-Wert 

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Für die Aktivierung der Fusionsreaktion durch einen niedrigen pH-Wert ist das Influenzavirus A ein besonders gut untersuchtes Beispiel. Es besitzt zwei Glykoproteine: die Neuraminidase (NA) und das Hämagglutinin (HA). Die Neuraminidase spaltet Sialinsäuremoleküle auf der Oberfläche der Zellen oder Viruspartikel. Diese Spaltungsreaktion ermöglicht die Abtrennung neu gebildeter Viruspartikel von der Wirtszelle. Die Neuraminidase entfernt auch die Sialinsäure vom HA-Protein selbst und verhindert so die Aggregation der Viren [83]. Hämagglutinin vermittelt sowohl die Bindung der Viren an sialinsäurehaltige, zelluläre Rezeptoren, als auch die Fusion der Virushülle mit der Zellmembran [84,85]. Es wird als fusionsinaktives Vorläuferprotein HA0 synthetisiert, das als Trimer vorliegt (Abbildung 4 A und F). Die fusionskompetente Form des HA-Trimers entsteht nach der Spaltung des HA0 durch zelleigene Proteasen im trans-Golgi-Netzwerk. HA1 bildet die globuläre Kopfdomäme, die die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) beinhaltet und einen Teil des Stammes der HA-Ektodomäne bildet (Abbildung 4). Den Rest des Stammes bildet HA2 (Abbildung 4). Außerdem beinhaltet HA2 die Transmembrandomäne aus 24-28 ungeladenen, hydrophoben Aminosäuren und die C-terminale intravirale Domäne. Am N-Terminus des HA2 befindet sich das Fusionspeptid (Abbildung 4), das innerhalb der Virusfamilie hoch konserviert ist. Es besteht aus 16 hydrophoben Aminosäuren und spielt eine essentielle Rolle bei der Fusionsvermittlung [86]. Die gesamte Ektodomäne ragt etwa 135 Å aus der Membran hervor und kann durch Bromelain, eine Cysteinprotease, gespalten werden. Die so isolierte HA-Ektodomäne (BHA, bromelaingespaltenes HA) wurde bereits kristallisiert und die Röntgenkristallstruktur mit einer Auflösung von 3 Å bei neutralem pH-Wert bestimmt [87]. Diese Struktur des HA ist allerdings nicht fusionsaktiv. Bei niedrigen pH-Werten findet eine irreversible Konformationsumwandlung des HA statt. Im Zuge dieser Strukturänderungen ist es in der Lage die Membranfusion zu induzieren.

Die pH-neutrale, fusionsinaktive Konformation des HA entspricht dem metastabilen Zustand (Abbildung 4 A). Der Hauptteil der benötigten Energie wird schon bei der Faltung des Proteins generiert [88]. Wie bereits erwähnt werden Influenzaviren nach der Bindung an die Wirtszelle über Endozytose aufgenommen. Während der Reifung der Endosomen kommt es durch die Aktivität von Protonenpumpen zur pH-Erniedrigung. Im späten Endosom liegt der pH-Wert bei etwa 5.5, was für die Induktion der Konformationsumwandlung des HA-Proteins ausreicht. Die Protonierung schwächt die Wechselwirkung zwischen den HA1-Untereinheiten des Trimers [89]. Dadurch kommt es zur Reorganisation der HA1-Domänen, die für weitere Strukturänderungen wichtig ist [89,90,91,92,93]. Durch den so genannten „spring-loaded“-Mechanismus trennen sich die globulären Kopfdomänen und geben HA2 frei, das durch HA1 klammerartig in einem metastabilen Zustand gehalten wird (Abbildung 4 A). Das Fusionspeptid am Ende der verlängerten dreisträngigen „Coiled-Coil“-Region wird exponiert (Abbildung 4 B). Es kann mit der Zielmembran interagieren und in diese insertieren. Durch Umlagerung von der Helix- zur Loop-Konformation bildet sich eine verkürzte Helix aus (Abbildung 4 C), die es der verlängerten C-terminalen Domäne ermöglicht zu „flippen“ und sich antiparallel zur zentralen „Coiled-Coil“-Einheit auszurichten. Durch Verkürzung der gesamten Struktur kommen Fusionspeptid und Transmembrandomäne in unmittelbare Nähe und eine Annäherung beider Membranen kann erfolgen (Abbildung 4 D).

Abbildung 4 : Modell der HA-vermittelten Membranfusion (A. Herrmann). (A) HA liegt zunächst im metastabilen Zustand vor. (B) Nach Bindung und pH-Erniedrigung kommt es zu Konformationsumwandlungen innerhalb des Proteins. Die Fusionspeptide tauchen in die Zielmembran ein. (C) Durch einen als „Spring-Loaded“ Mechanismus bezeichneten Vorgang kommt es zur Verkürzung der HA-Moleküle, durch die eine Annäherung der N-teminalen Fusionspeptide und der C-terminalen Transmembrandomänen erfolgt, was schließlich zur Annäherung der Membranen und zur Ausbildung der „Sechs-Helix-Bündel“-Struktur führt. (D) Zunächst wird die Hemifusion ausgelöst. Die äußeren Lipidschichten verschmelzen miteinander. (E) Nachdem die Membranen fusioniert sind, kommt es zur Ausbildung der Fusionspore. (F) Die Weitung der Fusionspore ermöglicht die Entlassung des viralen Nukleokapsids. 

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Das nächste Fusionsintermediat ist die Hemifusion, ein metastabiler Zustand, der sehr kurzlebig ist (Abbildung 4 D). Die äußeren Lipidschichten der beiden Membranen verschmelzen miteinander und bilden den „Stalk“, eine halsähnliche Struktur mit einer negativen Krümmung. Die noch nicht fusionierten inneren Lipidschichten bilden ein "Diaphragma" aus (Abbildung 4 D). Nachdem auch die inneren Lipidschichten miteinander verschmolzen sind, folgt die Bildung einer frühen Fusionspore mit einer Porengröße von 1-2 nm (Abbildung 4 E) [94]. Die frühen Poren können sich wiederholt öffnen und schließen ("flickering"). Am Ende findet eine irreversible Weitung der Fusionsporen statt, durch die das virale Nukleokapsid schließlich in das Cytoplasma entlassen wird (Abbildung 4 F).

A.2.2 Aktivierung der Fusion durch Rezeptorinteraktion

Die Aktivierung der pH-neutralen Fusionsproteine erfolgt über die Interaktion mit einem Rezeptor/Rezeptorenkomplex auf der Oberfläche der Zielzellen [13]. Viren, die unter neutralen Bedingungen fusionieren können, verschmelzen direkt mit der Plasmamembran der Zielzelle oder mit pH-neutralen intrazellulären Kompartimenten, wie dem Caveosom [56]. Auch für Viren, die eigentlich bei neutralem pH-Wert fusionieren ist es teilweise möglich, dass eine Fusionsaktivierung durch niedrigen pH-Wert ausgelöst werden kann [95]. Die Fusion bei neutralem pH weist im Vergleich zur Aktivierung bei niedrigem pH eine deutliche Temperaturgrenze auf. Bei Temperaturen unter 20°C (T<20°C) findet fast keine Fusion mehr statt. Das Env-Protein des HIV gehört zur Klasse I der Fusionsproteine. Es wird wie das HA des Influenzavirus als Vorläuferprotein synthetisiert und während der Maturierung in gp120 und gp41 gespalten. Die native/metastabile Konformation des Env-Proteins besteht aus Trimeren, die ihrerseits aus Heterodimeren von gp120, der rezeptorbindenden Domäne, und gp41, der Fusionsdomäne, gebildet werden. Die Bindung des CD4-Rezeptors führt zu einer Konformationsumwandlung, die es ermöglicht den Co-Rezeptor zu binden. Nach dessen Bindung es zu weiteren Konformationsumwandlungen im Env-Protein kommt [96]. Der erste Schritt nach Bindung des Rezeptor-Co-Rezeptor-Komplexes durch gp120 ist die Dissoziation dieser Domäne. Dadurch werden die Fusionspeptide exponiert und können in die Zielmembran eintauchen. Ein Cluster mehrerer Env-Proteine in dieser Konformation bildet die Fusionsstelle aus. Nach weiteren Konformationsumwandlungen innerhalb des Proteins kommt es zur Ausbildung der „Sechs-Helix-Bündel“-Struktur und zur Annäherung beider Membranen, die in der Hemifusion und der Ausbildung der Fusionspore mündet. Nach Ausbildung der Fusionspore und Porenweitung kommt es zur Entlassung des viralen Nukleokapsids. Der Fusionsmechanismus des Env-Proteins ist dem des HA-Proteins sehr ähnlich. Lediglich der Auslöser der Konformationsumwandlung im viralen Protein ist unterschiedlich. Folgende allgemeingültige Eigenschaften des Fusionsmechanismus gelten für Fusionsproteine der Klasse I: (1) Umwandlung des metastabilen in einen aktivierten Zustand. (2) Exposition und Umlagerung des Fusionspeptids zur Bindung der Zielmembran. (3) Rekrutierung mehrerer aktivierter Fusionsproteine zu einer Fusionsstelle [97,98,99,100]. (4) Die anschließenden Konformationsumwandlungen und die Ausbildung der „Sechs-Helix-Bündel“-Struktur ermöglichen die Annäherung der Fusionspeptide und Transmembrandomäne.

A.2.3 Die Zwei-Schritt Aktivierung des Alpharetrovirus

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Nach neuesten Erkenntnissen gibt es ein drittes Modell der viralen Fusion. Dies konnte kürzlich für das Alpharetrovirus (ASLV) gezeigt werden. Im ersten Schritt findet bei neutralem pH die Bindung des Virus über das virale Glykoprotein Env an den zellulären Rezeptor statt. Die anschließende Exposition im sauren Milieu des Endosoms führt zur Auslösung der Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein, die schließlich in der Fusion beider Membranen mündet [7]. Die Rolle des niedrigen pH-Werts konnte durch zwei Schlüsselbeobachtungen enträtselt werden: (1) Die ständige Anwesenheit lysosomotroper Substanzen unterdrückte die Synthese des viralen reversen Transkripts und (2) Zellen, die das Env-Protein und den viralen Rezeptor exprimierten, bildeten erst nach Inkubation bei niedrigem pH-Wert Synzytien aus. Eine kürzlich erschienene Studie konnte zeigen, dass die Fusion des Alpharetrovirus bei neutralem pH bis zur Stufe der Lipidmischung (Hemifusion) erfolgt [95], und das die anschließende Rezeptorbindung und Exposition im endosomalen Milieu mit niedrigem pH-Wert spezifische Konformationsumwandlungen im viralen Env-Protein auslösen [101].

A.3 Virale Fusionspeptide 

Virale Fusionsproteine der Klasse I enthalten generell ein Fusionspeptid. Es kann intern oder N-terminal lokalisiert sein (Tabelle 5) [102,103,104]. Beispiele für interne Fusionspeptide sind das gp37-Protein des ASLV und das GP2-Protein des Ebolavirus. Das Fusionspeptid kann sich ferner am oder nahe dem N-Terminus befinden. Dies ist z.B. bei gp41 von HIV und bei HA des Influenzavirus A der Fall [84,105,106,107]. Bestimmte Eigenschaften sind in allen viralen Fusionsproteinen hoch konserviert. Die wichtigsten Eigenschaften eines Fusionspeptids können wie folgt zusammengefasst werden [108]: (1) Fusionspeptide sind kurze hydrophobe Sequenzen eines Proteins und bestehen aus 16–26 Aminosäuren [109,110,111]. (2) Sie sind reich an hydrophoben Resten wie Alanin (A), Glycin (G) und Phenylalanin (F) [109,112,113]. (3) Ein kanonisches Tripeptid (YFG oder FXG) ist in Retroviren, Paramyxoviren und Filoviren hoch konserviert [112,114,115,116]. (4) Bei internen Fusionspeptiden ist die Anwesenheit eines Prolins (P) nahe oder im Zentrum der Sequenz kritisch für die Interaktion mit der Zielmembran [116,117,118,119]. (5) Die Tendenz zur Bildung von β-Faltblattstrukturen oder α-Helices. (6) Der Wert für das Hydrophobe Moment (ΔG) sollte zwischen 3 und 4 kcal/mol liegen. (7) Die Möglichkeit der HR-Sequenzen die „Coiled-Coil“-Konformation einzunehmen.

Tabelle 5: Virale Fusionspeptide

Lage

Fusionsprotein

Virus

Sequenz



N-terminal



Klasse I

Influenza HA2

GLFGAIAGFIENGWEG

Sendai F1

FFGAVIGTIALGVATA

RSV F1

FLGFLLGVGSAIASGV

HIV gp41

AAIGALFLFGLGAAGSTMGAA



Intern


Klasse I

EboV GP

GAAIGLAWIP YFGPAA

ASLV gp37

IFASILAPGVAAAQAL


Klasse II

SFV E1

DYQCKVYTGVYPFMWGGAYCFCD

TBE E

DRGWGNHCGLFGKGSIVA

Intern

Klasse III

VSV G

QGTWLNGFPPQSCGYATV

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Fusionspeptide sind hydrophobe Proteinsequenzen, die mit der Membran in Wechselwirkung treten und eine essentielle Rolle bei der Fusionsreaktion übernehmen [120,121,122,123]. Während des Fusionsprozesses müssen Fusionspeptid und Transmembrandomäne stabil mit der jeweiligen Membran assoziiert bleiben, um eine erfolgreiche Fusion zu gewährleisten. Die Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein ermöglicht es dem Fusionspeptid stabil in der Zielmembran zu verankern und weitere Konformationsumwandlungen der Ektodomäne des viralen Fusionsproteins führen zur Fusion. Innerhalb einer Virusfamilie ist die Sequenz meist hoch konserviert. Gallaher und Kollegen konnten außerdem zeigen, dass obwohl sich die Fusionspeptide der Fusionsproteine der Klasse I von Orthomyxo-, Paramyxoviren, Retro-, Arena- und Filoviren in Länge und Sequenz stark unterschieden, strukturell sehr ähnlich aufgebaut sind [102,105]. Fusionspeptide der viralen Fusionsproteine der Klasse II zu denen Alpha- und Flaviviren gehören, sind meist intern lokalisiert und bilden drei antiparallele β-Faltblatt Strukturen aus [66,124,125].

A.3.1 N-terminale Fusionspeptide

Anhand von Untersuchungen an synthetischen Fusionspeptiden konnten Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie sich Fusionspeptide in An- oder Abwesenheit von Membranen verhalten [120,121,126,127]. In Lösung liegen die Peptide ungeordnet vor, assoziieren sie jedoch mit Membranen, nehmen sie eine Sekundärkonformation in Form von α-helikalen oder β-Faltblattstrukturen ein. Die untersuchten N-terminalen Fusionspeptide nehmen nach Assoziation mit der Membran zudem einen bestimmten Winkel ein und tauchen ausschließlich in eine Membranhälfte ein. Mutationsstudien an Fusionspeptiden ergaben, dass die Fähigkeit der Einstellung eines bestimmten Winkels essentiell ist, um die Membranstruktur zu destabilisieren [121]. Bei niedrigem pH-Wert besteht das Fusionspeptid von HA aus einer N-terminalen Helix, einem Knick und einer kurzen C-terminalen Helix [ 128 ]. Beide Helices tauchen in das äußere Leaflet der Lipiddoppelschicht ein, der Knick dagegen verbleibt an der Oberfläche. Die Glycine im Inneren der Struktur interagieren mit der Lipidschicht, wogegen geladene Aminosäurereste an der Oberfläche verbleiben und mit der hydrophilen Umgebung wechselwirken können. Werden die Glycinreste mutiert, kommt es zu veränderten Eigenschaften des Proteins. Ersetzt man Glycin (G1) durch Valin (G→V) ist die Fusionseigenschaft völlig gehemmt. Wird Glycin (G1) gegen Serin (G→S) ausgetauscht, wird lediglich Hemifusion vermittelt oder es bilden sich kleine nicht expandierende Fusionsporen [123,129,130]. Simulationen des Fusionspeptids von HIV-1 und seiner Mutanten weisen ähnliche membranpenetrierende Orientierungen auf wie HA [131].

A.3.2 Interne Fusionspeptide

Die meisten internen Fusionspeptide weisen neben einer großen Zahl apolarer Reste ein konserviertes Prolin im oder nahe des Zentrums auf (Tabelle 5). Dieser ist meist hoch konserviert. Mutationsstudien am Prolinrest des Fusionspeptids des EnvA-Proteins von ASLV zeigen eine Stabilisierung der „β-Turn“ Struktur [117]. Für das Fusionspeptid von ASLV wird eine „β-Loop“-Struktur angenommen, die durch Disulfidbrücken stabilisiert wird. Ähnliches konnte für das interne Fusionspeptid des Ebolavirus gezeigt werden. Nach Mutation des konservierten zentralen Prolinrests und der flankierenden Cysteinreste konnte die Fusionseigenschaft vollständig inhibiert werden [119,132]. Für das interne Fusionspeptid des G-Proteins von VSV konnte nach Mutation des zentralen Prolinrests ebenfalls eine deutlich herabgesetzte Fusionsfähigkeit nachgewiesen werden [133]. Die Idee einer Loop-Struktur für fusionskompetente Peptide wurde auch für das Fusionspeptid von TBEV E und SFV E1 gezeigt [67,81,134]. In einigen Fällen kann auch die Kooperation mehrerer Loop-Strukturen zur Auslösung der Fusion führen. Interne Fusionspeptide enthalten wie N-terminale Peptide eine große Zahl an Glycin- und hydrophoben Resten (Tabelle 5). Tauscht man einen der Glycinreste des E1-Fusionspeptids von SFV gegen Alanin aus (G→A), kommt es zur Verschiebung des pH-Schwellenwertes zur Auslösung der Fusion. Die Mutation zur Asparaginsäure (G→D) hebt die Fusionseigenschaft vollständig auf [135]. Veränderungen der hydrophoben Aminosäurereste am Anfang, der Mitte oder am Ende des internen Fusionspeptids von ASLV EnvA zu geladenen Resten beeinträchtigt die Vermittlung der Fusion gravierend [103]. Ähnlich wichtig sind die Tryptophan- und Glycinreste im internen Fusionspeptid des GP-Proteins von EboV [119]. Am Ende der Loop-Struktur des E-Fusionspeptids von TBEV ist ein großer hydrophober Rest essentiell für die Vermittlung der Membranfusion [81]. Zusammenfassend ist zu bemerken, dass interne Fusionspeptide zur Vermittlung der Membranfusion eine oder mehrere Loop-Strukturen aufweisen und ein Gemisch aus hydrophoben und flexiblen Aminosäureresten benötigen.

A.3.3 Die Rolle viraler Fusionspeptide während der Fusion

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Fusionspeptide spielen an verschiedenen Stellen des Fusionsprozesses eine essentielle Rolle. Durch Mutationen der Fusionspeptide, bei der ungeladene Reste in geladene Reste umgewandelt wurden [103,136,137,138], konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle bei der Verankerung des Fusionsproteins in der Zielmembran spielen. Die Energie, die durch das Eintauchen des Fusionspeptids eines einzelnen HA-Trimers in die Zielmembran entsteht, ist ausreichend, um die Ausbildung der „Stalk-Struktur“ auszulösen [139]. Das Fusionspeptid kann zudem helfen die „Stalk-Bildung“ auszulösen indem es Wasser von der Lipid-Wasser Grenze entfernt und somit zur Erniedrigung der abstoßenden Kräfte zweier fusionierender Membranen beiträgt [126]. Fusionspeptide sind außerdem bei der Öffnung und Weitung der Fusionspore beteiligt sind. Die beschriebene HA-Mutante, die anstelle des Glycins (G1) ein Serin (S) trägt, kann nur die Mischung von Lipiden („Lipid-Mixing“), also Hemifusion vermitteln, aber keine vollständige Fusion auslösen [129]. Defekte in der Ausbildung von Synzytien und eine Einschränkung der Infektivität zeigt die Mutante des HIV Env-Proteins, bei der das Fusionspeptid die Mutation V2E (V→E) beinhaltet [136]. Biophysikalische Studien an synthetischen Fusionspeptiden, die diese Mutation tragen, weisen daraufhin, dass eine Aggregation mehrerer Fusionspeptide notwendig ist, um die Porenbildung auszulösen [140,141].

A.4 Coronaviren

Coronaviren gehören zur Ordnung der Nidovirales, Familie der Coronaviridae und zum Genus Coronavirus. Sie lösen ein weites Spektrum an Krankheiten in Mensch und Tier aus. Darunter betreffen die häufigsten Erkrankungen die respiratorischen und inneren Organe. Die Epithelzellen des Verdauungs- und respiratorischen Trakts stellen die wichtigsten Orte der Virusreplikation dar. Aufgrund ihrer phylogenetischen Eigenschaften lassen sie sich in zwei Untergruppen gliedern. In der vorliegenden Arbeit wurde einerseits das Maushepatitisvirus A59 (MHV-A59) und andererseits der humanpathogene Erreger des schweren akuten Atemwegssyndroms - Severe Acute Respiratory Syndrome - kurz SARS-CoV analysiert, um den Mechanismus der Verschmelzung von Virus- und Wirtszellmembran zu untersuchen. MHV-A59 löst sowohl enterische und respiratorische Infektionen, als auch Diarrhö, Hepatitis und akute sowie chronische Demyelenisierungserkrankungen des Zentralnervensystems in Mäusen aus (Siddell et al., 1983; Wege et al., 1982). Es wurde erstmalig im Jahr 1951 von Gledhill und Andrewes beschrieben [142] und 1961 von Manaker isoliert [143]. Es gehört zur Gruppe II. SARS-CoV wurde im Jahr 2003 erstmalig entdeckt und isoliert. Im Zusammenhang mit diesem insbesondere in Südostasien beheimateten Virus traten zwei große Infektionswellen in den Jahren 2002/2003 und 2004 auf, infolge derer fast 1000 Menschen erkrankten und starben. Eine genaue Definition der phylogenetischen Zugehörigkeit für SARS-CoV steht noch aus. Angenommen wird eine enge Verwandtschaft zur Gruppe II. Bis zur endgültigen Zuordnung wird dieses Virus in der eigenständigen Gruppe III geführt.

A.4.1 Aufbau und Replikation von Coronaviren 

Coronaviren weisen mit 30 kb das größte RNA-Genom aller bekannten RNA-Viren auf. Das virale Genom besteht aus einzelsträngiger RNA in positiver Orientierung (ssRNA (+)) und besitzt wie zelluläre mRNAs eine 5’-Cap-Struktur sowie einen 3’-Poly-A Strang.

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Abbildung 5 : Coronaviren. (A) EM-Micrograph und (B) schematische Darstellung des SARS-CoV [ 144 ] . (C) EM-Micrograph von MHV-A59 (K. Ludwig und C. Böttcher, FU- Berlin). Balken: (A) 100 nm, (C) 200 Å.

Die RNA bildet zusammen mit den basischen viralen Nukleokapsidproteinen ribonukleäre Partikel (RNPs) aus, die mit dem „Envelope“-Hüllprotein (E), dem Matrixprotein (M) und darüber mit der viralen Hüllmembran assoziiert vorliegen (Abbildung 5 ). Die Strukturproteine der Coronaviren sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Die Virushülle besteht aus Lipiden der Wirtszellmembran und unterschiedlichen viralen Proteinen. Coronaviren besitzen zwei Arten membranverankerter Glykoproteine: (a) das Spikeprotein (S) und (b) die Hämagglutininesterase (HE) (Tabelle 6 und Abbildung 5 B). Die Hämagglutininesterase wird nicht in allen Coronaviren exprimiert. Das S-Protein bildet peplomere Strukturen, die weit aus der Hüllmembran des Virus herausragen und im Elektronenmikroskop deutlich sichtbar sind (Abbildung 5 A und C).

Tabelle 6: Strukturproteine der Coronaviren

Protein

Molekular gewicht (kDa)

Eigenschaft

Funktion


S


180-200

glykosyliertes
Membranprotein Typ I;
Trimer

Bindung an spezifischen Rezeptor,
Fusionsaktivität


N


50-60

Hauptkomponente des
Nukleokapsids; basisch


Kerntransportsignal


M


25


Membranglykoprotein

Verbindung zwischen Nukleokapsid
und Virushülle


E


10

integrales Membranprotein

pH-regulierender Ionenkanal

HE*

60-70

Integrales Membranprotein

Unterstützung bei Bindung und Fusion

*HE – Hämagglutinesterase wird nur exklusiv in einigen Coronaviren der Gruppe II, nicht aber in MHV-A59 oder SARS-CoV exprimiert.

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Virale Glykoproteine auf der Oberfläche der Virionen sind die Hauptantigene und lösen die nachfolgende Immunreaktion im infizierten Organismus aus. Dies wird sowohl für Diagnostik und Therapie als auch für die Prophylaxe genutzt. Den weiteren großen Anteil viraler Proteine machen die Nichtstrukturproteine (NSP) aus, deren Funktion häufig noch ungeklärt ist.

Die Infektion der Wirtszelle erfolgt bei Coronaviren in mehreren Schritten (Abbildung 6). Im ersten Schritt binden die Viren an die Zielzelle. Dies geschieht über spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der Zelle (Abbildung 6 (1)). Die S1-Untereinheit des S-Proteins ist verantwortlich für die Interaktion mit dem Rezeptor, wogegen die S2-Untereinheit fusionsaktive Eigenschaften besitzt. Anschließend erfolgt der Eintritt in die Zelle. Es ist noch ungeklärt wie Coronaviren in die Wirtszelle aufgenommen werden. Nach Freisetzung des viralen RNA-Genoms in die Wirtszelle (Abbildung 6 (2)) findet die Replikation und Transkription statt (Abbildung 6 (3)). Mit Hilfe der Translationsmaschienerie der Wirtszelle werden die überhängenden offenen Leseraster (ORF1a und ORF1b) durch den so genannten „ribosomalen Frame-Shift“-Mechanismus in ein einziges Polyprotein translatiert. Viruskodierte Proteasen spalten das Polyprotein in einzelne Fragmente, so dass sich der virale Replikationsapparat ausbilden kann. Dieser synthetisiert anschließend die genomische virale Volllängen-RNA in Negativstrangorientierung (ssRNA (-)). Parallel wird durch die diskontinuierliche Transkriptionsstrategie ein geschützter Pool subgenomischer RNAs in Negativstrangorientierung generiert. Diese RNAs dienen später als Matrize für die Synthese der mRNAs in Positivstrangrichtung (Abbildung 6 (3)). Die Nukleokapsidproteine und die genomische RNA (ssRNA (+)) assemblieren im Cytoplasma zum helikalen Nukleokapsid (Abbildung 6 (4)). Die M-, E- und S-Proteine werden durch das ER zum Golgi-Apparat transportiert, in dem das „Budding“ stattfindet. Das N-Protein interagiert mit dem M-Protein, um die Assemblierung der Viruspartikel zu initiieren.

Abbildung 6: Replikationszyklus von Coronaviren [144]). (1) Bindung und Eintritt des Virus in die Zelle. (2) Fusion des Virus mit der zellulären Membran und Freisetzung des Nukleokapsids in die Wirtszelle (Uncoating). (3) Replikation und Transkription der viralen Proteine. (4) Assemblierung neuer Viruspartikel und (5) Freisetzung dieser. Zur Vereinfachung wurde nur eine Variante des Eintritts gezeigt.

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Während des Transports des Virus durch den Golgi-Apparat werden die Kohlenhydratreste modifiziert. Bei einigen Coronaviren werden die S-Proteine hier proteolytisch in S1- und S2-Untereinheit gespalten. Die S-Proteine, die nicht in Viruspartikeln assemblieren, werden zur Zelloberfläche transportiert. Schließlich werden die Viren nach Fusion der virusbeladenen Vesikel mit der Plasmamembran von der Zielzelle freigesetzt (Abbildung 6 Freisetzung (5)) [144].

A.4.2 Der virale Eintritt von MHV-A59

MHV-A59 bindet über das S-Protein an den zellulären CEACAM1a-Rezeptor. Der Eintritt des Virus ist mit Rafts assoziiert und erfolgt Cholesterol-abhängig. Obwohl die Cholesterolverarmung der Zellen keinen Einfluss auf die Virusbindung hat, weist sie einen starken inhibitorischen Effekt auf die Infektivität durch MHV auf [52,54]. Bis heute ist noch nicht bekannt, welcher der beiden Wege des viralen Eintritts vom Coronavirus MHV-A59 genutzt wird. Es gibt Hinweise auf beide Wege [28,30,145]. Holmes et al. [146] konnten beobachten, dass die Fusion von MHV mit der Zielzelle allein durch Rezeptorbindung ausgelöst werden kann, was eine Initiierung der Konformationsumwandlung im S-Protein durch Rezeptorinteraktion bei neutralem pH-Wert nahe legt. Neueste Studien sprechen dem N-terminalen Bereich des CECAM1a-Rezeptors eine Hauptfunktion bei der Initiierung der Konformationsumwandlung im S-Protein zu [147,148,149,150]. Frühere Untersuchungen zeigen zudem, dass die S-Protein-vermittelte Zell-Zell-Fusion bei neutralem pH stattfinden kann. Dies geschieht nach Infektion mit MHV-A59 und führt zur Synzytienbildung. S-Proteine, die nicht in Viruspartikel sortiert werden, werden zur Zelloberfläche transportiert und können dort die Fusion zwischen den Zellen vermitteln. Einige Gruppen finden keinen oder nur einen geringen Einfluss lysosomotroper Substanzen auf die Infektivität von Mausfibroblastenzellen durch MHV-A59 [5,32,48,151]. Andere Untersuchungen belegen dagegen, dass die Infektion von MHV durch Behandlung der Wirtszelle mit lysosomotropen Substanzen beeinträchtigt werden kann [30,152,153]. Kryzystyniak et al. berichten für das Infektionsverhalten von MHV-3 eine Sensitivität gegenüber lysosomotropen Substanzen [153]. MHV-JHM kann in Abhängigkeit vom Zelltyp sowohl den endosomalen, als auch den nicht-endosomalen Weg nutzen [28,150].

A.4.3 Das S-Protein von Coronaviren

Für die Bindung und die anschließende Vermittlung der Fusion von viraler und zellulärer Membran ist bei Coronaviren das S-Protein verantwortlich. Es gehört zur Klasse I viraler Fusionsproteine [154], ist als Homotrimer organisiert und über die Transmembrandomäne in der viralen Hüllmembran verankert (Abbildung 7). Es besitzt ein Molekulargewicht von 180-220 kDa je Monomer.

A.4.3.1 Das S-Protein von SARS-CoV

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Das trimere S-Protein von SARS-CoV weist ein Molekulargewicht von ungefähr 500 kDa auf [155]. Die S1-Untereinheit ist für die Bindung des zellulären Rezeptors - ACE2 [156] - und die S2-Untereinheit für die Vermittlung der Fusionsreaktion verantwortlich (Abbildung 7 E). Die Untereinheiten S1 und S2 bleiben über kovalente Disulfidbrücken miteinander assoziiert. Obwohl frühere Studien andeuten, dass die Spaltung des S-Proteins für die Vermittlung der Fusion nicht notwendig ist [152,157,158], gibt es neuesten Untersuchungen zufolge Hinweise darauf, dass die Spaltung der Ektodomäne des S-Proteins von SARS-CoV und MHV-2 für die Fusionsreaktion essentiell sein könnte. Die proteoytische Spaltung des Proteins findet ausschließlich im endosomalen Kompartiment der Zelle statt (Chandran et al., 2005; Qiu et al., 2006; Simmons et al., 2005).

Die S2-Untereinheit beinhaltet die Transmembrandomäne, das Fusionspeptid und die HR-Sequenzen HR1 und HR2 (Abbildung 7 B und E). HR1 und HR2-Domänen bilden den Fusionskern des S-Proteins und organisieren sich als „Coiled-Coil“ (Abbildung 7 D). Sie sind denen anderer Coronaviren [154,159,160] und anderer Fusionsproteine der Klasse I, wie dem HA des Influenzavirus [69], dem gp41 des HIV-1 [75] und dem Fusionsprotein der Paramyxoviren [161] sehr ähnlich. Für SARS-CoV konnte gezeigt werden, dass die Reste 916-950 von HR1 und die Reste 1151- 1185 von HR2 miteinander interagieren [162]. Im linearen Schema des viralen S-Proteins wird deutlich, wie ähnlich die S-Proteine bei Coronaviren der verschiedenen Familien aufgebaut sind (Abbildung 7 E). Das Gen des S-Proteins ist über alle drei Gruppen der Coronaviren hoch konserviert und es wird angenommen, dass für alle Gruppen ein ähnlicher Fusionsmechanismus existiert, der dem allgemeinen Fusionsmechanismus für virale Proteine der Klasse I entspricht [159]. Neben der Aufklärung der Kristallstruktur des Fusionskerns („Coiled-Coil“ aus HR1 und HR2) von SARS-CoV und MHV [159,160,163,164] konnte kürzlich eine kryoelektronenmikroskopische 3D-Rekonstruktion des SARS-Virus Partikels angefertigt werden (Abbildung 7 A-D) [165]. In neuesten kristallographischen Studien gelang die Charakterisierung der Interaktion des ACE2-Rezeptors mit der Rezeptorbindungsdomäne des S-Proteins (Abbildung 7 C und D) [165,166]. Die durchschnittliche Anzahl der S-Proteine pro SARS-CoV liegt bei 65 (Abbildung 7 A). Diese Zahl kommt der durch biochemische Studien berechneten von 66.7 sehr nahe [167]. In aktuellen Studien zur Fusion von SARS-CoV wurde sowohl ein Einfluss des pH-Werts [59,168,169] als auch die Interaktion mit einem entsprechenden Rezeptor für die Auslösung der Fusion verantwortlich gemacht [59,168,170,171].

Abbildung 7: Das S-Protein der Coronaviren [165,171]. (A) Dreidimensionale (3D)-Rekonstruktion von SARS-CoV. Orange – S-Protein, blau/pink – virale Hüllmembran, rot - Nukleokapsid. (B) Das S-Protein mit den möglichen Rezeptorbindungsdomänen für ACE2 und der Stammdomäne mit den mutmaßlichen Fusionspeptiden. (C) „Top-View“ auf das S-Protein mit gebundenem ACE2-Rezeptor (lila). (D) Lage des Fusionskerns aus HR1 und HR2 (PDB-2FXP [172]) im Inneren der Proteinstruktur. Bindung des ACE2-Rezeptors (lila) an die Rezeptorbindungsdomäne (PDB-2AJF [166]) (rot) des S-Proteins. Kolorierung nach zylindrischer Tiefe. (E) Lineares Schema der S-Proteine von SARS-CoV und MHV. Pfeil: Proteolytische Spaltungsstelle zwischen S1 und S2-Untereinheit [171]. SP- Signalpeptid, RBD - Rezeptorbindungsdomäne, HR - Heptad-Repeat, TM - Transmembrandomäne, CT - cytoplasmatische Domäne.

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Es konnte ferner gezeigt werden, dass die S-Protein-vermittelte Zell-Zell-Fusion keine pH-Aktivierung benötigt [173,174]. Dies spricht für eine Aktivierung der Konformationsumwandlung durch S-Protein-Rezeptorinteraktion bei neutralem pH-Wert. Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass neben der Rezeptorbindung eine anschließende proteolytische Spaltung des S-Proteins im sauren Milieu des Endosoms stattfinden muss, um eine erfolgreiche Fusion und Infektion zu ermöglichen [6]. Berücksichtigt man die neuesten Erkenntnisse zur S-Protein vermittelten Fusion von SARS-CoV und MHV-2 lässt sich ein neues Modell der Fusion erstellen: Im nativen/metastabilen Zustand liegt das S-Protein als Trimer vor und die HR2-Region bildet α-helikale Strukturen aus, die den Stamm des Proteins bilden. Die HR1-Domänen liegen in „Random-Coil“ Konformation vor, die von der S1-Domäne bedeckt werden. Nach Rezeptorbindung wird das Virus über den endozytotischen Weg in die Zelle aufgenommen. Anschließend erfolgt der Transport vom frühen zum späten Endosom und es kommt durch die Aktivität der endosomalen Protease Cathepsin zur Spaltung des S-Proteins in S1 und S2-Untereinheit. Erst durch diesen Mechanismus kann die endgültige Fusionsreaktion ausgelöst werden. Die S1-Untereinheit dissoziiert und parallel finden in der S2-Untereinheit strukturelle Veränderungen statt, die eine Exposition der Fusionspeptide zur Folge hat. Diese können nun in die Zielmembran eintauchen. Anschließend bildet HR1 Trimere aus, wogegen die HR2-Trimere zu Monomeren dissoziieren. Dadurch kann sich die fusionskompetente „Sechs-Helix-Bündel“-Struktur ausbilden. Virale und zelluläre Membran kommen in enge Nachbarschaft, was die Hemifusion auslöst. Anschließend bildet sich die Fusionspore aus. Nach vollständiger Fusion kann das virale Nukleokapsid in das Cytoplasma der Zelle entlassen werden.

A.4.3.2 Das S-Protein von MHV-A59

Das S-Protein von MHV-A59 wird im ER der Wirtszelle synthetisiert und oligomerisiert zu Trimeren. Ein Teil des S-Proteins wird zur Zelloberfläche transportiert, wo es abhängig vom Zelltyp zur Zell-Zell-Fusion und Ausbildung von Synzytien kommen kann. Im Viruspartikel selbst besteht das 1,324 Aminosäuren (AS) lange S-Protein (Abbildung 7 E) aus der N-terminalen Ektodomäne (1,263 AS), die stark glykosyliert ist, der hydrophoben Transmembrandomäne (29 AS) und einer kurzen hydrophilen C-terminalen intraviralen Domäne (32 AS). Im Zuge der Proteinreifung wird das S-Protein im Golgi-Apparat von einer zelleigenen Furin-ähnlichen Protease in S1- und S2-Untereinheit gespalten [151,152]. Die Untereinheiten S1 und S2 bleiben nichtkovalent verbunden. Die S1-Untereinheit ist für die CEACAM1a-Rezeptorbindung und die S2-Untereinheit für die Auslösung der Fusionsreaktion [175] verantwortlich. Neben der Transmembran- und C-terminalen Domäne beinhaltet die S2-Untereinheit das Fusionspeptid und die HR1- und HR2-Sequenzen. Diese bilden wie andere virale Fusionsproteine der Klasse I die „Coiled-Coil“ Struktur aus [154,159,163]. Es gibt Hinweise auf verschiedene Auslöser der Konformationsumwandlung im S-Protein von MHV-A59. Detaillierte Modelle der S-Protein-vermittelten Fusionsreaktion von MHV-A59 existieren noch nicht.

A.4.4 Das Fusionspeptid der Coronaviren

Für Coronaviren wird vermutet, dass die S2-Untereinheit das Fusionspeptid beinhaltet. Die S2-Untereinheit besitzt folgende charakteristische strukturelle Eigenschaften [87,102,105,112]: (i) ein Fusionspeptid [176,177], (ii) zwei längere α-Helices, typischerweise 4,3–hydrophobe HR-Sequenzen [154,159] und (iii) eine Ansammlung aromatischer Aminosäuren proximal zur (iv) hydrophoben Transmembrandomäne. Vermutlich reicht allein die Insertion der Fusionspeptide in die Zielmembran aus, um eine Destabilisierung dieser zu induzieren und die anschließende Fusion auszulösen [116,178,179,180]. Aufgrund ihrer starken Neigung mit Membranen zu interagieren, ist es möglich hydrophobe Proteinsequenzen, wie Fusionspeptide, über die Hydrophobizitätsskala von Wimley und White (WWIH) zu identifizieren [181].

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Bislang ist es noch nicht gelungen das Fusionspeptid von MHV-A59 zu identifizieren. Im Vergleich zu SARS-CoV handelt es sich beim Fusionspeptid von MHV-A59 vermutlich um ein intern lokalisiertes Fusionspeptid nahe der HR1-Region. Aufgrund von Mutationsstudien wurden bereits drei geeignete Fusionspeptidkandidaten PEP-1-3 für MHV identifiziert [176,182]. Sie scheinen eine essentielle Rolle bei der Vermittlung der Zell-Zell-Fusion zu spielen.


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05.12.2008