B Zielsetzung

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Ziel der Arbeit ist die Aufklärung der S-Protein-vermittelten Fusion von Coronaviren und die Identifizierung des Infektionsweges von MHV-A59. Die ersten Schritte der viralen Infektion sind die Bindung und die anschließende Fusion von Virus- und Targetmembran. Für Coronaviren wie MHV-A59 und SARS-CoV steht bis heute eine vollständige Aufklärung des Infektionsweges sowie der Bedingungen, die zu einer Fusion führen, aus.

Zur Identifizierung des Infektionsweges von MHV-A59 sollte der Effekt inhibitorischer und lysosomotroper Substanzen, die die Endozytose hemmen oder die Ansäuerung zellulärer Organellen verhindern, getestet werden. Die vermeintliche Rolle endosomaler Cysteinproteasen bei der Auslösung der Fusion sollte für MHV-A59 untersucht werden. Cholesterolreiche Membrandomänen (Rafts) scheinen beim Eintritt von MHV-A59 eine Rolle zu spielen. Dazu werden Cholesterol-bindende/-komplexierende Substanzen und ihr Effekt auf die Infektivität von MHV-A59 getestet. Epifluoreszenz- und konfokalmikroskopische Untersuchungen zur Virus-Zell- und Zell-Zell-Fusion sollen Aufschluss über den Verlauf der Fusion geben. In biophysikalischen Messungen sollen die Bedingungen einer effektiven Fusion charakterisiert werden. Zum besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem S-Protein und dessen zellulären Rezeptor sowie zur Aufklärung der verschiedenen Struktureigenschaften und Konformationen sollten in Zusammenarbeit mit K.Ludwig und C.Böttcher von der FU-Berlin die 3D-Strukturen des S-Proteins und intakter MHV-A59 Partikel erstmalig elektronen- und kryoelektronenmikroskopisch aufgeklärt werden.

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In der vorliegenden Arbeit sollen ferner detaillierte Untersuchungen zum Mechanismus des durch das S-Protein von SARS-CoV vermittelten Fusionsprozesses durchgeführt werden. Dazu werden Experimente in einem eukaryotischen Expressionssystem durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Bedingungen, bei der eine erfolgreiche Zell-Zell-Fusion ACE2-Rezeptor- und S-Protein-exprimierender Zellen ausgelöst werden kann, soll im Detail untersucht werden. Verschiedene Varianten des viralen Fusionsproteins sollen biochemisch, biophysikalisch und elektronenmikroskopisch charakterisiert werden.

Die Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59 soll im abschließenden Teil der Arbeit erfolgen, da Fusionspeptide im Verlauf des Fusionsprozesses eine essentielle Rolle übernehmen. Durch die Erstellung von Hydrophobizitätsplots, Sequenzabgleichen mit bekannten Fusionspeptiden anderer Viren und nach Analyse der Sekundärstrukturen definierter Fusionspeptidkandidaten soll eine Auswahl an Fusionspeptiden ermittelt bzw. Vorhersage gegeben werden, die die Basis für zukünftige experimentelle Untersuchungen bilden sollen.


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05.12.2008