C Material und Methoden

↓21

C.1 Chemikalien und Lösungen

Alle verwendeten Chemikalien stammen, soweit nicht anders angegeben, von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland) oder Roche (Mannheim, Deutschland).

↓22

Als Standardpuffer wurde PBS (Phosphatpuffer), pH 7.4, mit 156 mM NaCl und 5.8 mM NaH2PO4/Na2HPO4 eingesetzt. PBS+ enthielt zusätzlich 2 mM Mg2+/ 2 mM Ca2+ und wurde von Biochrom KG (Berlin, Deutschland) bezogen. Für Messungen bei Werten unter pH 6 wurde Natriumacetat (NaAc)-puffer (150 mM NaCl, 20 mM Natriumactat Trihydrat, pH 7.4) verwendet. Die Zusammensetzung anderer Puffer, die nur für bestimmte Präparationen verwendet wurden, wird in den entsprechenden Abschnitten angegeben.

Für die Zellkultur wurde DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) von Gibco Invitrogen Corporation (Karlsruhe, Deutschland) mit oder ohne Zusatz von unterschiedlichen Mengen an fetalem Kälberserum (FCS; Invitrogen Corporation) verwendet. Der Waschpuffer HANKs-Salts wurde von der Biochrom KG (Berlin, Deutschland) bezogen. Zum Ablösen der Zellen wurde Trypsin (50 µg/ml)/EDTA (20 µg/ml)-Lösung (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) verwendet. Die Antibiotika wurden von den Firmen Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland), Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) und Biochrom KG (Berlin, Deutschland) bezogen.

Die Transfektionslösungen Lipofectin® (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), PolyFect® (Qiagen, Hilden, Deutschland) und DreamFect™ (OZ Biosciences, Marseille, Frankreich) wurden für die transiente Transfektion eukaryotischer Zellen verwendet.

↓23

Octadecylrhodamin-B-chlorid (R18) und der Acetomethylester des Calceins (Calcein-AM) wurden von Molecular Probes (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) stammen die DOGS-NTA-Ni Lipide (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[N(5-Amino-1-Carboxypentyl)iminodiAceticAcid] Succinyl (Nickel Salz)) und alle anderen verwendeten Lipide.

Zur Aufreinigung der Proteine wurden NiNTA-Agarose Beads der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) und Protein-G-Sepharose Beads der Firma GE Healthcare (München, Deutschland) verwendet.

C.2 Biologisches Material

C.2.1 Viren

Tabelle 7: Viren

Virus

Stamm

Beschreibung

Quelle


MHV-A59


Ohio 1999


-

Prof. J. Ziebuhr, Würzburg, Deutschland


MHV-S4


MHV-A59

rekombinanter MHV-Stamm S-Protein von JHM exprimierend

P. J.M. Rottier, Utrecht, Niederlande


MHV-A59 FI


Ohio 1999

MHV-A59 mit ungespaltenem S-Protein


P. Eifart

VSV

Indiana

-

K. Ludwig

Influenza A

X-31

-

-


Vakziniavirus (VV)

VTF7.3

rekombinantes VV, T7-Polymerase exprimierend

Prof. M.F.G. Schmidt, Berlin, Deutschland

C.2.2 Zellen

↓24

  1. Humane Erythrozyten (Charité, Berlin, Deutschland)
  2. Eukaryotische Zellen

Tabelle 8: Eukaryotische Zellen

Zelllinie

Organismus

Beschreibung

Organ


17Cl-1*


Maus

Mus musculus, Derivat der Balb3T3/c Zelllinie


Fibroblast, Embryo


DBT **


Maus


Mus musculus

murine Astrocytoma, Nervengewebe


LR-7**


Maus

Mus musculus, Derivat der L-Zellen


Fibroblast, Bindegewebe

HEK293T

Mensch

Homo Sapiens

Fibroblast, Niere, Embryo

NCTC 929 (L929)***

Maus

Mus musculus

Fibroblast, Bindegewebe

NCTC 1469***

Maus

Mus musculus

Epithel, Leber

VeroE6 #

Affe

Cercopithecus aethiops

Fibroblast, Niere

BHK-21

Hamster

Mesocricetus auratus

Fibroblast, Niere

*17Cl-1 Zellen – J. Ziebuhr, Würzburg, Deutschland, DBT und LR-7 Zellen – P. J.M. Rottier, Utrecht, Niederlande, ***NCTC 929 und 1469 Zellen – ECACC. #VeroE6-Zellen – M. Veit, FU Berlin, Deutschland

C.2.3 Bakterien

Tabelle 9: Bakterien

Stamm

Beschreibung

Quelle


E. coli CMK603

thi-1 thr-1 leuB6 lacY1 tonA21 supE44 hsdRk hsdMk Δlac-pro F´ [traD6 proAB+ lacZΔM15]


K. Rand, Cambridge


E. coli Xli-Blue

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F‘ proAB lacIq ΔM15(lacZ) Tn10 (tetr)]

Stratagene (La Jolla, CA, USA)

C.3 Eukaryotische Zellkultur

↓25

Alle Plastikwaren für die Zellkultur wurden von den Firmen Nunc, Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland), Greiner Bio One (Frickenhausen, Deutschland), BD Bisosciences (Heidelberg, Deutschland) und Sarstedt (Nümbrecht, Deutschland) bezogen. Die Medien DMEM und MEM wurden bei Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) oder MEM bei Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.

C.3.1 Passagieren eukaryotischer Zellen

Je nach Zelltyp erreichen eukaryotische Zellen in Kultur bei 90-95% ihre Konfluenz und müssen umgesetzt werden, da sie sonst absterben. Zur Kultivierung werden die Zellen von der Zellkulturschale gelöst, vereinzelt, verdünnt und ausplattiert. Je nach Zelltyp und Wachstumsbedingungen müssen bestimmte Verdünnungen eingehalten werden.

  1. 30 Minuten vorher werden Medien sowie Puffer und Trypsin/EDTA auf 37°C erwärmt.
  2. Kontrolle der Zellen und Zelldichte unter dem Lichtmikroskop
  3. Absaugen des Mediums
  4. 2x mit HANKs-Puffer oder PBS waschen
  5. Trypsin (50 μg/ml)/EDTA zugeben und für 5 Minuten bei 37°C/5% CO2 inkubieren
  6. Aufnehmen der abgelösten Zellen in Medium
  7. Verdünnung der Zellsuspension

↓26

  1. Ausplattieren der Zellen in der gewünschten Verdünnung

C.3.2 Einfrieren und Auftauen eukaryotischer Zellen

Zum Einfrieren werden die in Medium aufgenommenen Zellen bei 800 rpm (250 x g) und 4°C zentrifugiert und in eiskaltem Wachstumsmedium mit 5-10% DMSO aufgenommen. Aliquots werden in gekühlte Kryoröhrchen überführt, für 24 Stunden bei -80°C eingefroren und anschließend in flüssigen Stickstoff (N2) überführt.

Zum Auftauen der Zellen werden die Kryoröhrchen zunächst im Eisbad inkubiert und anschließend im Wasserbad bei 37°C vollständig aufgetaut. Um Kontaminationen zu vermeiden, wird das Röhrchen mit 70% EtOH oder Isopropanol gesäubert. Die Zellen werden in frisches Wachstumsmedium überführt, zentrifugiert, erneut in frischem Medium aufgenommen und ausplattiert.

C.4 Molekularbiologie

↓27

Alle Lösungen, Puffer und Restriktionsenzyme für die Molekularbiologie wurden von den Firmen Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), Qiagen (Hilden, Deutschland), Marligen Biosciences Inc. (Ijamsville, MD, USA), NEB (Frankfurt a.M., Deutschland) und GE Healthcare (München, Deutschland) erworben. Die Antibiotika wurden von den Firmen Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland) und Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.

C.4.1 Bakterienkultur

C.4.1.1 Vorkultur

Mit sterilen Zahnstochern/Pipettenspitzen werden einzelne Kolonien von der Platte gepickt und zunächst in 5 ml LB-Medium (mit Antibiotika) überführt. Die Inkubation bei 37°C erfolgt für mind. 8 Stunden und 160 rpm bis eine deutliche Trübung des Mediums zu erkennen ist. Die Vorkultur wird je nach Ansatz für eine Mini- oder Maxi-DNA-Präparation weiter verwendet. Für eine Maxi-Präparation wird ein Teil der Vorkultur in 200-500 ml LB-Medium (mit Antibiotikum) überführt und ü.N. bei 37°C schüttelnd inkubiert.

C.4.1.2 Einfrieren und Auftauen von Bakterien

Zur Aufbewahrung transformierter Bakterien wird ein Glycerol- oder DMSO-Stock angelegt. Dazu werden 900 μl einer Vorkultur entweder mit 100 μl Glycerol (96%) oder 100 μl DMSO (100%) versetzt und in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Aufbewahrung erfolgt bei -80°C.

↓28

Das Auftauen erfolgt auf Eis. Um das überschüssige DMSO zu entfernen werden die Zellen mit vorgewärmtem LB-Medium gewaschen und zentrifugiert. Das Sediment wird erneut in LB-Medium aufgenommen und eine entsprechende Kultur (10-500 ml) angeimpft. Der Zentrifugations- und Waschschritt entfällt bei der Konservierung mit Glycerol.

C.4.2 Transformation von Bakterien

Kompetente Bakterien (Tabelle 9) (100 μl) werden mit 20 ng – 1 μg zirkulärer Plasmid-DNA für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach werden sie bei 42°C für 45 Sekunden einem „Hitzeschock“ ausgesetzt. Anschließend wird der Ansatz in 900 μl LB-Medium (ohne Antibiotika) überführt und für 1 Stunde bei 160 rpm und 37°C schüttelnd inkubiert. Die Vorkultur wird abzentrifugiert, das Bakterienpellet in ca. 50 μl resuspendiert und auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert.

C.4.3 Aufreinigung der Plasmide

Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Leervektoren wurden in Tabelle 10 zusammengestellt. Die Plasmide und der Leervektor pCDNA3.1 myc/His A weisen jeweils eine Ampicillin-Resistenz auf, wogegen der Vektor EYFP-N1 eine Kanamycin-Resistenz besitzt.

↓29

Tabelle 10: Vektoren und Plasmide

Plasmide

Quelle

pCDNA3 S-Full*

[173]

pSecTag2B S-Ekto

[173]

pCDNA3.1 (+) ACE2-Full C9**

[156]

pCDNA 3.1 (+) ACE2-Ekto C9**

[156]

Leervektoren

Quelle

pCDNA3.1 myc/His A***

M. Veit FU-Berlin (Invitrogen)

EYFP-N1***

M. Veit FU-Berlin (Clontech)

*S-Protein – [173] , **ACE2-Rezeptor – [156], ***M. Veit, FU-Berlin, Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland), Clontech (Mountainview, CA, USA).

C.4.3.1 Plasmid-DNA Mini-Präparation

Zur Isolierung kleiner Mengen Plasmid-DNA werden kleine Säulen der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) verwendet. Die Präparation erfolgt nach Herstellerangaben. Aus 1-1.5 ml Bakterienkultur können 1-15 μg reiner Plasmid-DNA isoliert werden.

C.4.3.2 Plasmid-DNA Maxi-Präparation

Zur Isolierung großer Mengen Plasmid-DNA werden Säulen der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) oder Marligen Biosciences Inc. (Ijamsville, MD, USA) verwendet. Die Präparation erfolgt nach Herstellerangaben. Nach Aufreinigung von 250-500 ml einer Übernachtkultur können 500-800 μg Plasmid-DNA isoliert werden.

C.4.4 Konzentrationsbestimmung und Reinheitsgrad aufgereinigter DNA

↓30

Durch Bestimmung der optischen Dichte (OD) einer DNA-Lösung bei 260 nm kann deren Konzentration bestimmt werden. Zur Feststellung des Verunreinigungsgrades durch Proteine wird zusätzlich das Verhältnis der OD bei 260 nm und 280 nm ermittelt. Ein optimaler Reinheitsgrad liegt zwischen 1.8 und 2.0. Zur Verifizierung des Plasmids werden zusätzlich Restriktionsstudien durchgeführt. Nach Inkubation der Plasmid-DNA mit den jeweiligen Restriktionsenzymen in dem vom Hersteller angegebenen Puffer werden DNA und Enzyme für mind. 2 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend über Agarosegelelektrophorese überprüft. Die verwendeten Restriktionsenzyme mit den entsprechenden Schnittstellen wurden in Tabelle 11 zusammengefasst.

Tabelle 11: Restriktionsenzyme

Restriktionsenzym

Schnittstelle

Apa I

5'-G G G C C^C-3'
3'-C^C C G G G-5'

BamHI

5'-G^G A T C C-3'
3'-C C T A G^G-5'

EcoRI

5'-G^A A T T C-3'
3'-C T T A A^G-5'

XbaI

5'-T^C T A G A-3'
3'-A G A T C^T-5'

Alle Restriktionsenzyme wurden von der Firma Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland) bezogen.

C.4.5 Klonierung der Plasmid-DNA

Die aufgereinigte Plasmid-DNA mit dem entsprechenden Gen wird zunächst mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut. Der Zielvektor wird ebenfalls mit diesen Enzymen inkubiert. Zur Überprüfung des Restriktionsverdaus und für die anschließende Gelextraktion wird ein 1% Agarosegel angefertigt. Das Insert und der Zielvektor wurden über die Gelextraktionsreaktion und anschließende Säulenaufreinigung (Qiagen, Hilden, Deutschland) eluiert. Um die Effizienz der Ligation zu erhöhen, wird der Zielvektor anschließend mit der alkalischen Phosphatase (SAP) im entsprechenden Puffersystem nach Herstellerangaben dephosphoryliert. Anschließend erfolgt die Ligation mit dem „Rapid-DNA-Ligations-Kit“: Insert und dephosphorylierter Zielvektor werden nach Herstellangaben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend in kompetente Bakterien transformiert und ausplattiert. Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum werden ü.N. bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Zur Überprüfung der Klonierung werden am folgenden Tag mind. 10 Kolonien gepickt und jeweils 1-1.5 ml Kultur angeimpft. Zur Isolierung der DNA dient die Mini-DNA-Präparation. Die Größe der isolierten DNA wird über Agarosegelelektrophorese überprüft. Ein positiver Klon wird amplifiziert und mittels Restriktionsverdau und Agarosegelelktrophorese überprüft. Zudem wird die Expression des Proteins im eukaryotischen Zellsystem überprüft. Die gefärbten Gele werden mit der Desaga®-Videodokumentationsanlage digitalisiert und mit Hilfe der Desaga®-View Software ausgewertet.

C.5 Expression rekombinanter Proteine im eukaryotischen Zellsystem

↓31

Zur Expression des S-Protein von SARS-CoV und dessen Chimären in HEK293T-Zellen und des ACE2-Rezeptors und dessen Chimären in VeroE6-Zellen wird ein auf VTF7.3-basierendes Expressionssystem verwendet. Die exprimierten Proteine werden entweder aufgereinigt oder für fluoreszenzmikroskopische Fusionsexperimente genutzt.

C.5.1 Transfektion eukaryotischer Zellen

Je nach Herstellerangaben werden zunächst DNA-Liposomen-Gemische angefertigt. Das Zellmedium ohne Zusätze wie Antibiotika oder FCS (D0-) wird jeweils mit DNA oder dem entsprechenden Transfektionsreagenz (Lipofectin®, PolyFect® oder DreamFect™) versetzt und das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Transfektion werden die Zellen 2x mit Wachstumsmedium gewaschen und anschließend für mindestens 4 Stunden mit dem DNA-Liposomen-Gemisch bei 5% CO2 und 37°C inkubiert. Nach 4 Stunden sollte die Plasmid-DNA in die Zelle aufgenommen worden sein. Steht das zu exprimierende Gen unter Kontrolle des T7-Promotors, werden die Zellen vor der Transfektion zusätzlich mit dem rekombinanten Vakziniavirus VTF7.3, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, infiziert. Nach Infektion der Zellen mit dem Virus kommt es zum Erliegen der zellulären Proteinsynthese, und es werden ausschließlich virale Gene und damit die T7-RNA-Polymerase exprimiert. Somit steht eine ausreichende Menge an T7-Polymerase zur effizienten Transkription des T7-Expressionsplasmids zur Verfügung. Nachteil dieses Systems ist, dass die Vakziniavirusinfektion zu einem starken cytopathischen Effekt und damit zum Zelltod führt. Eine dauerhafte Expression und längere Inkubation der Zellen ist also nicht möglich.

Tabelle 12: Verwendete Plasmide und exprimierte Proteine

Plasmid

Protein

Beschreibung

T7-Promotor

pCDNA3 S-Full*

S-Full

SARS-CoV S-Protein Volllänge

+

pSecTag2B S-Ekto*

S-Ekto

SARS-CoV S-Protein

Ektodomäne

+

pCDNA3.1 (+) ACE2-Full C9**

ACE2-Full

ACE2-Rezeptor (human) mit C9-Peptid

+

pCDNA 3.1 (+) ACE2-Ekto C9**

ACE2-Ekto

ACE2-Rezeptor (human) Ektodomäne mit C9-Peptid

+

*S-Protein – [173] , **ACE2-Rezeptor – [156].

↓32

In der vorliegenden Arbeit werden zwei Varianten des S-Proteins von SARS-CoV: S-Full und -ekto, sowie zwei Varianten des ACE2-Rezeptors: ACE2-Full und -Ekto exprimiert (Tabelle 12). Die Volllängenvarianten (-Full) enthalten neben der Sequenz für die Ektodomäne zusätzlich die Sequenzen für Transmembran- und cytoplasmatische Domäne und werden membranverankert exprimiert. Die Varianten der Ektodomänen beider Proteine dagegen werden in das Zellmedium sezerniert. Alle verwendeten Plasmide stehen unter Kontrolle des T7-Promotors. Außerdem wird die in dieser Arbeit klonierte Volllängenvariante des S-Proteins von SARS-CoV – pCDNA3.1 myc/His A in HEK293T-Zellen exprimiert und aufgereinigt.

 

C.5.2 Expression, Isolierung und Analyse der Proteine 

Die in Tabelle 12 aufgeführten Proteine werden als membranverankerte oder sezernierte Varianten im eukaryotischen Zellsystem exprimiert.

C.5.2.1 Isolierung der Volllängenvarianten

↓33

Die Volllängenvarianten des S-Proteins von SARS-CoV: pCDNA3 S-Full und pCDNA3.1 myc/His S-Full werden wie beschrieben in HEK293T-Zellen exprimiert (siehe C.5.1). Die Variante des ACE2-Rezeptors – pCDNA3 ACE2-Full-C9 wird sowohl in HEK293T als auch in VeroE6-Zellen exprimiert. Die Expression der membranverankerten Proteine erfolgt für höchstens 24 h bei 5%CO2 und 31°C. Die Zellen werden anschließend mit dem detergenzhaltigen RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 10 mM HNa2O4•PH2O pH 7.2, 0.5 mM PMSF) solubilisiert. Zur Vermeidung der proteolytischen Degradation wird ein 1x Proteaseinhibitorcocktail (1000x: Aprotinin (1 mg/ml), Leupeptin (1 mg/ml), Pepstatin 1 mg/ml, Antipain 5 mg/ml, Benzamidin 157 mg/ml in DMSO) zugesetzt.

C.5.2.2 Isolierung sezernierter Proteinvarianten

Die verkürzten Varianten des S-Proteins und ACE2-Rezeptors: pSecTag-2B S-Ekto und pCDNA3 ACE2-Ekto-C9 werden nach erfolgreicher Expression in HEK293T- und/oder VeroE6-Zellen in das Zellmedium sezerniert. Das proteinhaltige Medium wird von den Zellen abgenommen, sofort mit Proteaseinhibitoren versetzt und zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Zur Konzentrierung werden die Überstände mittels Centricon C-100 mit einem Cut-Off von 100 kDa für das S-Protein oder einem Cut-Off von 30 kDa für den ACE2-Rezeptor bei 1000 x g und 4°C für mehrere Runden jeweils 10 Minuten zentrifugiert, bis ein Endvolumen von ca. 1 ml erreicht ist.

C.5.2.3 Aufreinigung der Proteinvarianten mit (His)6-Tag

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene S-Proteinvarianten mit (His)6-Tag exprimiert. Die Ernte erfolgt wie beschrieben und die anschließende Aufreinigung wird entweder über NiNTA-Agarose Beads (Qiagen, Hilden, Deutschland) oder mittels Ni-HiTrap-Säulen (GE Healthcare, München, Deutschland) über die Äkta-Anlage (GE Healthcare, München, Deutschland) nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Elution der Proteine mit der entsprechenden Imidazolkonzentration (300-500 mM) werden die Proben für mindestens 16 h gegen Na-Acetatpuffer (150 mM NaCl, 20 mM Acetat, pH 7.4) dialysiert, um das Imidazol zu entfernen. Die Proteinproben werden ferner in C-100 Centricons (Millipore, Schwalbach, Deutschland) konzentriert und anschließend sofort für die Elektronenmikroskopie verwendet.

C.5.2.4 Aufreinigung der Proteinvarianten ohne Tag

↓34

Die Aufreinigung des ACE2-Rezeptors erfolgt mittels Immunopräzipitation (IP) mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers anti-hACE2 (Tabelle 13, R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland). Dazu wird das Immunopräzipitations-Kit von GE Healthcare (München, Deutschland) mit entsprechenden Protein-G-Sepharose Beads benutzt. Im ersten Schritt werden Proteine (Antigen) und Antikörper bei 4°C für mind. 1 Stunde inkubiert, anschließend die Antikörper-bindenden Protein-G-Sepharosebeads hinzu gegeben und weiter bei 4°C inkubiert. Nach abschließender Zentrifugation liegen die Antigen-Antikörper-Komplexe am Protein-G-Sepharose-Sediment gebunden vor und können nach Denaturierung im reduzierenden SDS-Probenpuffer über Westernblot detektiert werden.

C.5.3 SDS-PAGE und Native Gelelektrophorese

Zur Identifizierung der Proteine wird eine SDS-PAGE unter Verwendung des Minigel-Systems (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland) durchgeführt. Unter reduzierenden Bedingungen werden je 50 µl Probe mit je 12.5 µl Probenpuffer (0.5 M Tris, pH 6.8, 5 % SDS, 25 % Glycerol, 0.05 % Bromphenol blau, 25% β-Mercaptoethanol) versetzt und 5 min bei 96°C inkubiert. Unter nicht-reduzierenden/nativen Bedingungen werden je 50 μl Probe mit je 12.5 µl Probenpuffer (0.5 M Tris, pH 6.8, 25 % Glycerol, 0.05 % Bromphenol blau) versetzt und 5 min bei RT inkubiert. Bei nicht-reduzierenden Gelen enthalten die verwendeten Puffer oder Gele kein SDS. Pro Geltasche eines 10-12%igen Polyacrylamidgels werden jeweils 10-30 µl der entsprechenden Probenlösung aufgetragen. Die Proteinbanden werden mittels Coomassie- oder Silberfärbung visualisiert. Die digitale Dokumentation der gefärbten Gele erfolgt mit der Desaga®-Videodokumentationsanlage und mit Hilfe der Desaga®-View Software.

C.5.4 Westernblotanalyse

Für die Westernblotanalyse werden die Proteine zunächst ihrer Größe nach über ein reduzierendes SDS-Gel aufgetrennt. Das Blotten erfolgt nach Herstellerangaben des „ECL+ Western-Blotting Detection Kits“ wie folgt:

↓35

  1. Transfer der aufgetrennten Proteine auf die Hybond ECL (PVDF) – Membran
  2. Block der unspezifischen Bindungsstellen mit Blockingpuffer
  3. Primärer Antikörper
  4. HRP-gekoppelter Sekundärantikörper
  5. ECL+ Detektionsreagenz
  6. Exposition auf einen lichtempfindlichen ECL+ Film
  7. Entwicklung des Films
  8. Dokumentation

Tabelle 13: Verwendete Antikörper

Antikörper

Epitop

Organismus

Verdünnung

Quelle


anti-SARS S-Full
#IMG-542


S-Protein SARS CoV


Kaninchen


1:2500

IMGENEX Corp, San Diego, CA, USA


anti-c-myc


c-myc-Tag


Maus


1:2500 – 1:5000

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland


anti-hACE2


hACE2-Rezeptor


Maus


1:500

R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland


anti-(His)6-Tag


(His)6-Tag


Maus oder Kaninchen


1:1000

Dianova, Heidelberg, Deutschland

Zum Nachweis der Varianten von S- und ACE2-Rezeptorprotein werden die in der Tabelle 13 aufgeführten Antikörper benutzt. Als Sekundärantikörper wird der im „ECL+ Westernblotting-Detection Kit“ enthaltene polyklonale HRP-gekoppelte Antikörper verwendet.

C.6 Viruszucht

C.6.1 Zucht von Influenzaviren

↓36

Die Zucht von Influenzaviren erfolgt in befruchteten und 11 Tage bebrüteten Hühnereiern. In die Allantoishöhle der Eier werden je 100 µl einer voreingestellten Virus-Suspension (102-10-1 HAU/ml) inokuliert. Die Inkubation der infizierten Eier erfolgt für 2 Tage bei 37°C und zur Abtötung der Embryonen über Nacht bei 4°C. Nach Entfernung der Eierschale im Bereich der Luftkammer wird die virushaltige Allantoisflüssigkeit entnommen.

C.6.2 Zucht von MHV

MHV-A59 und MHV-S4 werden in 17Cl-1 Zellen gezüchtet [183]. Die 17Cl-1 Mausfibroblastenzellen werden in T175-Zellkulturflaschen in DMEM mit 10% FCS (D10) bis zur Konfluenz bei 5% CO2 und 37°C vermehrt und bei einer MOI von 10 PFU/Zelle des jeweiligen Virus inokuliert. Für die Aufzucht von MHV-A59 mit ungespaltenem S-Protein (MHV-A59 FI) werden die Zellen mit dem Furininhibitor (FI) Peptidyl-Chloromethylketon (dec-RVKR-cmk) bei einer Konzentration von 75 μM vorinkubiert und anschließend mit MHV-A59 bei einer MOI von 10 PFU/Zelle in der Anwesenheit des Inhibitors infiziert. Vor der Infektion wird das Wachstumsmedium abgenommen und die Zellschicht 2x mit DMEM 2%-FCS (D2) gewaschen. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C und regelmäßigem Schütteln der Zellkulturflaschen (all 10 Minuten) werden 20 ml Infektionsmedium (D2) zugegeben. Die inokulierten Zellen werden bei 37°C/5 % CO2 für 46-48 h inkubiert.

C.6.3 Zucht von VSV

VSV wird auf BHK-21 Zellen gezüchtet. Die BHK-21 Zellen werden bis zur Konfluenz in T175-Zellkulturflaschen oder ∅ 15 cm Petrischalen in MEM mit 10% FCS (M10) angezüchtet und vermehrt. Für die Viruszucht werden die Zellen bei einer MOI von 0.1 PFU/Zelle in MEM mit 2% FCS-haltigem Medium (M2) infiziert und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden 20 ml M2 hinzugegeben und die inokulierten Zellen bei 37°C/5% CO2 für 16-24 h inkubiert.

C.7 Virusaufreinigung

C.7.1 Aufreinigung des Influenzavirus

↓37

Zur Aufreinigung der gezüchteten Viren wird zunächst die Allantoisflüssigkeit bzw. das Erhaltungsmedium 30 min bei 1,000 x g und 4°C zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile abzutrennen. Durch Ultrazentrifugation bei 100,000 x g (1.5 h, 4°C) werden die Virionen sedimentiert und anschließend in einem geringeren Volumen PBS resuspendiert. Daraufhin werden die Viren über einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (60 %, 40 %, 20 % w/v Saccharose in HNE-Puffer, pH 7.4: 5 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) geschichtet und 16 h bei 100,000 x g, 4°C zentrifugiert. Die sichtbare Virusbande wird abgenommen und im dreifachen Volumen PBS gewaschen (100,000 x g, 1h, 4°C). Zuletzt werden die Viren in PBS aufgenommen und bei -80°C gelagert.

C.7.2 Aufreinigung der Maushepatitisviren und Isolierung des S-Proteins

Die Aufreinigung der verschiedenen MHV-Varianten: -A59, -S4 und -A59 FI erfolgt nach dem Protokoll von Sturman und Takemoto [183] mit einigen Modifikationen von Tsai et al. [184]. Das virushaltige Medium wird 46-48 h nach der Infektion (p.i.) von den Zellen abgenommen und sofort für 30 Minuten und 4°C im Beckman JA 25.5 Rotor (Beckman, Krefeld, Deutschland) bei 10,000 x g zentrifugiert, um Zelltrümmer und Nuklei zu entfernen. Zur Erstellung des Polyethylenglycol (PEG)-Präzipitats (PEG-Präzipitat) werden dem gereinigten Überstand anschließend 2.2% NaCl und 10% PEG-8000 (Promega, Mannheim, Deutschland) zugeführt. Dieser wird anschließend bei 4°C unter ständigem Rühren für 4 Stunden inkubiert und erneut bei 10,000 x g und 4°C zentrifugiert. Das virushaltige Pellet wird in BisTris-Puffer (150 mM NaCl, 25 mM BisTris, pH 6.5) aufgenommen, über einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten (30% und 50% (w/w)) geschichtet und für 16 Stunden in einem Beckman SW40 Ti Rotor über Nacht bei 4°C und 28,000 rpm (110,000 x g) in der Ultrazentrifuge (UZ) zentrifugiert. Die Virusbande an der Phasengrenze zwischen 30% und 50% Saccharose wird in BisTris-Puffer (pH 6.5) aufgenommen, aliquotiert und bei -80°C gelagert. Viren die 46-48 p.i. geerntet werden, besitzen einen Titer von 1-2 x 109 pfu/ml auf. Für die Experimente werden die Viren für mehrere Stunden bei 4°C gegen BisTris-Puffer pH 6.5 mit 5% Glycerol dialysiert, um die Saccharose zu entfernen. Dazu wird ein Dialyseschlauch mit einem MWCO von 12-14 kDa (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) verwendet.

Für die Isolierung des S-Proteins aus intakten Virionen müssen diese zunächst mit einem detergenzhaltigen Lysepuffer, der das nichtionische Detergenz NP-40 enthält, solubilisiert werden. Dazu werden 1 ml dialysierter Virussuspension mit dem NP40-Lysepuffer versetzt, so dass eine Endkonzentration von 1% NP40 erreicht wird. Die Solubilisierung der Viren erfolgt bei 4°C durch Inkubation bei 700 rpm für 30 Minuten. Die behandelten Viren werden anschließend über einen kontinuierlichen 15-50%igen Saccharosedichtegradienten geschichtet und bei 38,000 rpm (180,000 x g), 4°C für 18 h im SW60 zentrifugiert Um eine Aggregation der Proteine zu vermeiden, beinhaltet die Saccharoselösung stets 0.1% NP-40. Die einzelnen Fraktionen werden mittels des Gradientenfraktionators von oben abgenommen und in vorgekühlte Eppendorfröhrchen überführt. Die Refraktionsindizes der 20-50%igen Saccharoselösungen mit 0.1% NP-40 werden mit einem digitalen Bausch und Lomb Abbé Refraktometer bestimmt. Die Analyse der einzelnen Fraktionen erfolgt über SDS-PAGE. Die Proteinkonzentration nach der Methode von Bradford et al. [185] betrug 2-3 mg/ml. Die Phospholipidmenge wird nach der Methode von Böttcher et al. [186] bestimmt, nachdem die Lipide nach der Methode von Bligh and Dyer [187] aus den Virosomen extrahiert werden. Das Pellet wird in 1 ml BisTris-Puffer pH 6.5 aufgenommen. Für die kryoelektronenmikroskopische Analysen werden die S-Protein-Fraktionen erneut gegen BisTris-Puffer dialysiert und konzentriert.

C.8 Herstellung von SUV mit Ni-Lipiden

↓38

Zur elektronenmikroskopischen Analyse der isolierten Proteinvarianten des S-Proteins (S-Ekto- und S-Full-(His)6-Tag) von SARS-CoV werden SUV (small unilamellar vesicles) hergestellt, um eine Orientierung der Proteine im Raum zu ermöglichen und eine eventuelle Degradation durch Proteasen auszuschließen. DOGS-NTA Lipide enthalten ein Nickel-Ion (Ni) in der Kopfgruppe. Folgende Lipide wurden für die Herstellung der Ni-haltigen Liposomen (SUV) verwendet:

Tabelle 14: Verwendete Lipide für die Liposomen-Herstellung

Lipid

Stammlösung

Endkonzentration

Lyso-PC

10 mg/ml

0.75 μM

DOPC

25 mg/ml

0.75 μg

DOGS-NTA Ni

25 mg/ml

0.15 μM (10mol%)

Für die Herstellung der SUVs werden die Lipide zunächst in den aufgeführten Konzentrationen (Tabelle 14) als chloroformhaltige Lösungen in ein Reagenzglas überführt, das Lösungsmittel unter Stickstoffzufuhr abgedampft und nach Zugabe von 5 μl EtOH gevortext. Schließlich wird die Gesamtmenge von 1.5 μM Lipid mit 10 mol% DOGS-NTA Ni in 500 μl Na-Acetatpuffer (150 mM NaCl, 20 mM Na-Acetat Trihydrat, pH 7.4, entgast) aufgenommen und auf Eis für 20 Minuten im Branson Sonifier Model W250 (Carouge-Geneve, Genf, Schweiz) im Eisbad mit Ultraschall (Output 4) beschallt. Nach Zentrifugation (1,500 x g, 4°C, 10 min) werden die SUV erneut in Na-Acetatpuffer aufgenommen und sofort verwendet.

C.9 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

↓39

Die elektronen- und kryoelektronenmikroskopische Analyse der Proben erfolgt in Kollaboration mit C. Böttcher und K. Ludwig vom Zentrum für Elektronenmikroskopie der Freien Universität Berlin, Deutschland. Zur Charakterisierung und Analyse der Struktur und Konformation des S-Proteins von SARS-CoV und MHV-A59 werden sowohl isolierte Varianten des S-Proteins von SARS-CoV als auch intakte MHV-A59 analysiert.

C.9.1 Kryoelektronenmikroskopie

Ein Tropfen der vorinkubierten Präparatlösung wird auf ein mit Kohlelochfolie überspanntes Elektronenmikroskopie-Grid (200 Maschen,1 μm Lochdurchmesser, R1/4 Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Deutschland) gegeben, welches vorher mittels einer 60-sekündigen Plasmabehandlung bei 8 W in einer BALTEC MED 020 Anlage hydrophilisiert wurde. Die überschüssige Flüssigkeit wird mittels Filterpapier abgesaugt bis ein ultradünner Film der Probenlösung entstanden ist, der die Löcher des Karbonfilms überspannt. Die Proben werden über einen Guillotine-ähnlichen Mechanismus unmittelbar in flüssiges Ethan eingeschossen. Die Abkühlrate liegt dabei in der Größenordnung von 104 K/s, so dass es zu einem amorphen Gefrieren des Präparatwassers kommt („Vitrifizierung“). Die vitrifizierten Präparate werden mit Hilfe eines Gatan-Kryohalters (Model 626, Gatan Inc., Kalifornien, CA, USA) unter flüssigem Stickstoff in ein Philips CM12 Transmissions-Elektronenmikroskop (FEI Company, Oregon, OR, USA) überführt. Die Mikroskopie wird bei 94 K (-174°C) Probentemperatur unter Anwendung des “Low-Dose“-Protokolls des Mikroskops bei einer Primär-Vergrößerung von 58.300 x und einer Beschleunigungsspannung von 100 kV (LaB6 – Belichtung) durchgeführt. Der eingestellte Defokus beträgt 1.5 μm.

C.9.2 Elektronenmikroskopie an negativkontrastierten Proben

Ein Tropfen der vorinkubierten Probenlösung wird auf ein befilmtes Grid (hydrophilisierter Kohlefilm auf 400-maschigem Trägernetz) gegeben. Nach 30 Sekunden wird die überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapierstreifen abgesaugt und die kontrastverstärkende schwermetallhaltige Färbelösung (1% Phosphorwolframsäurelösung (PTA), pH 7.4) hinzu gegeben und nach 45 Sekunden wieder mit Filterpapier abgesaugt. Anschließend trocknet die Probe an der Luft. Mittels eines Standardhalters wird die getrocknete Probe in ein mit einer LaB6-Kathode bestücktes Elektronenmikroskop Philips CM12 (FEI Company, Oregon, OR, USA) transferiert. Die Bilder werden bei einem Defokus von 0,6 μm mit einer primären Vergrößerung von 58.300 x bei 100 kV (CS = 2 mm) aufgenommen.

↓40

Ein Teil der Aufnahmen (Kryo-TEM und Negativkontrastierung) wird mit dem „Tecnai F20“ (FEI Company, Oregon) wie beschrieben angefertigt.

C.9.3 Rechnergestützte Bildverarbeitung nach der Einzelpartikelmethode

Die elektronenmikroskopischen Negative werden mittels laseroptischer Diffraktion auf Astigmatismus und Drift überprüft. Optisch einwandfreie Negative werden mit einem „Heidelberg Primescan“-Trommelscanner (Heidelberger Druckmaschinen AG, Heidelberg, Deutschland) bei einer nominalen Pixelgröße von 0,68 Å digitalisiert, was einer Scanauflösung von 4 µm entspricht. An den eingescannten Abbildungen der MHV-A59-Virionen werden anschließend einzelne Trimere des S-Proteins interaktiv ausgewählt und aus den digitalisierten Negativen als 400x400 Pixel große Einzelbilder extrahiert. Diese Einzelbilder (ca. 2800 S-Protein-Trimere) werden nach dem Verfahren von Sander et al. hinsichtlich der Kontrastübertragunsfunktion korrigiert [132]. Aus Gründen der Recheneffizienz werden korrigierte Einzelbilder auf 1,37 Å/Pixel Auflösung reduziert. Alle Schritte der Bildverarbeitung erfolgen mit Hilfe der IMAGIC-5 Software (Image Science GmbH, Berlin, Deutschland) welche unter Linux auf einem Beowulf-Cluster [188]. Zur Berechnung der dreidimensionale Rekonstruktion der Struktur wird das "angular reconstitution"-Verfahren angewendet [189]. Dazu werden nach Filterung und Normierung der Einzelbilder die inzwischen fest etablierten Verfahren des „Multi-Referenz-Alignment“ [190], multivariate statistische Analyse und automatische hierarchische Klassifizierung [191] benutzt, um rauschreduzierte Summenbilder typischer Projektionsansichten des Proteins zu erhalten. Die Zuordnung der Raumwinkel („Eulerwinkel“) erfolgt unter Nutzung des „common line projection theorem" [189]. 

C.10 Plaqueassay und Plaquereduktionsassay

Zur Bestimmung des viralen Titers werden die Zellen am Vortag in 6-well Platten ausplattiert. Verschiedene Log-Virus-Verdünnungen werden in D2-Infektionsmedium erstellt. Nachdem die Zellen 2x mit D2-Medium gewaschen wurden, werden jeweils 0.5 ml der Viruslösung für 1 Stunde mit den Zellen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernung des virushaltigen Überstands werden die Zellen mit 0.75% Oxoid-Agarose-DMEM 2% FCS (Oxoid, Hampshire, UK) überschichtet und 24 – 48 h bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Zur Visualisierung der Plaques (PFU) erfolgt die Färbung der Zellen mit einer 3.3% Neutralrot-Lösung bei 37°C für 1 Stunde. Anschließend wird die Färbelösung entfernt und die Inkubation bei 31°C für 3 Stunden ermöglicht die Entfärbung der Plaques. Die gefärbten Platten werden mit der Desaga®-Videodokumentationsanlage (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) digitalisiert und die PFU mit Hilfe der Desaga®-View Software ausgezählt. Zur Bestimmung des viralen Titers wird folgende Formel (1) verwendet:

↓41

Für den Plaquereduktionsassay (PRA) werden die Zellen vor der Inokulation mit dem Virus für 30 min mit lysosomotropen Agenzien, endozytosehemmenden Substanzen, Proteaseinhibitoren, MβCD oder Filipin III behandelt. Tabelle 15 fasst die verwendeten Inhibitoren und Substanzen zusammen.

Tabelle 15: Inhibitoren der Endozytose und andere Substanzen

Substanz

Konzentration

Lysosomotrope Substanzen

Ammoniumchlorid

10-50 mM

Bafilomycin A1

20 – 100 nM

Concanamycin A

10-100 nM

Monensin

1-10 µM

Endozytosehemmende Substanzen

Chlorpromazin-HCl

10-15 μM

Proteaseinhibitoren

E-64

1-10 µM

Leupeptin

1-10 µg/ml

Cholesterolentzug/-Bindung

Flipin III

1-15 μg/ml

Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD)

5-15 mM

↓42

Die Virusinokulation erfolgt wie beschrieben in der Anwesenheit der Inhibitoren bei einer MOI von 1 PFU/Zelle oder mit Log-Virus-Verdünnungen. Die Auswertung der Titer erfolgt20-24 h nach Inokulation (p.i.). Als Kontrollen dienen nicht-infizierte (MOCK) oder unbehandelte/infizierte (Kontrolle) Zellen. Die Lösungen werden entweder in DMSO (Endkonzentration ≤ 0.25%), 100% EtOH oder ddH2O angesetzt. Um die Überlebensfähigkeit der Zellen in Anwesenheit der entsprechenden Substanzen (Tabelle 15) zu überprüfen werden die Zellen mit diesen inkubiert und nach 24-48 h mit 4’,6-diamidino-2-phenylidole-dihydrochlorid (DAPI) gefärbt. DAPI kann in apoptotische Zellen eindringen und färbt die Zellkerne, wogegen eine Färbung der Zellkerne bei lebenden Zellen nicht möglich ist. Die Auswertung erfolgt mittels Epifluoreszenzmikroskopie. Für weitere Experimente werden die Zellen mit den lysosomotropen Substanzen Ammoniumchlorid oder Bafilomycin A1 inkubiert, die Viren gebunden und anschließend für 5 min/37°C einem pH-Puls (pH 5.0) ausgesetzt. Nach Neutralisierung wird wie beschrieben ein Plaqueassay durchgeführt.

C.11 Charakterisierung und Analyse der Fusion von Coronaviren

Zur Untersuchung der Fusionsaktivität des Coronavirus MHV-A59 wird der Fluoreszenzdequenching (FDQ)-Assay verwendet. 17Cl-1 Mausfibroblasten dienen als Zielzellen und werden mit fluoreszenzmarkierten Viren inkubiert. Der FDQ-Assay basiert auf der Umverteilung des lipidähnlichen Fluoreszenzmarker Octadecylrhodamin-B-chlorid (R18) der nach Fusion von viraler und zellulärer Membran ein Dequenching zur Folge hat, das zu einem Fluoreszenzanstieg führt.

C.11.1 Herstellung von Erythrozytenghost

Die Präparation der Erythrozytenghost wird nach der Methode von Dodge et al. [192] durchgeführt. Das Erythrozytenkonzentrat wird dreimal mit PBS gewaschen (2,000 x g, 10 min, 4°C) und in eiskaltem Hämolysepuffer I (5.8 mM NaH2 PO4/Na2HPO4) resuspendiert. Nach Inkubation für 20 min bei 4°C wird die Suspension 20 min bei 20,400 x g, 4°C, zentrifugiert, das Pellet in eiskaltem Hämolysepuffer I resuspendiert und für weitere 10 min bei 4°C inkubiert. Danach erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 20,400 x g und 4°C. Dieselbe Inkubation und anschließende Zentrifugation wird so oft wiederholt, bis die Erythrozytenghost farblos sind. Zum Schluss werden die Erythrozytenghost mit 70 ml kaltem PBS gewaschen (10 min, 20,400 x g, 4°C). Sie können nach Zusatz von 0.02% NaN3 bis zu zwei Wochen bei 4°C aufbewahrt werden.

C.11.2 Markierung der Viren

↓43

Für die Markierung von MHV-A59 mit R18 unter selbstlöschenden Fluoreszenzbedingungen [193] werden 100 μl einer 2 mg/ml konzentrierten Viruslösung mit 0.5 μl einer 2.2 mM R18-Lösung (in EtOH) versetzt, bei 700 rpm, RT für 30 Minuten im Dunkel schüttelnd inkubiert, wie bereits für die Markierung von Influenzaviren beschrieben [194]. Das nicht eingebaute R18 wird nach Zentrifugation bei 55,000 x g und 4°C für 10 min entfernt. Nach einem Waschschritt mit PBS+ werden die markierten Viren in 100 μl eiskaltem PBS+ aufgenommen. Nahezu 90% der Fluoreszenz liegt „gequencht“ in der viralen Membran vor. Die Markierung der Viren hat keinen Einfluss auf die Infektivität, was durch den Plaqueassay bestätigt werden konnte.

C.11.3 Fusionsmessungen

Für den FDQ-Assay werden 17Cl-1 Zellen in T75-Zellkulturflaschen gezüchtet und geerntet (107 Zellen/ml). Fluoreszenzmarkierte MHV-A59 werden in eiskaltem PBS+ bei einer Konzentration von 3-5 pfu/Zelle zu den Zellen gegeben und 40 min bei 4°C leicht schüttelnd (200-300 rpm) inkubiert. Um die nicht gebundenen Viren zu entfernen, wird die Virus-Zell-Suspension zweimal mit PBS+ bei 300 x g gewaschen, und das Pellet in 300 µl PBS+ resuspendiert. 150 µl der Virus-Zell-Suspension werden zu 1.85 ml Na-Acetat-Puffer (150 mM Nach, 20 mM Na-Acetat Trihydrat, pH 7.4 und 37°C) in einer Quarzküvette gegeben, und die Änderung der Fluoreszenzintensität bei 4°C und 37°C bei entweder pH 7.4 oder 5.0 verfolgt [193]. Die Fusion wird mit dem Spektrofluorimeter (Aminco-Bowman, Urbana, IL, USA) bei einer Anregungswellenlänge von 560 nm, einer Emissionswellenlänge von 590 nm (cut-off Filter 570 nm, Zeitauflösung 1 sec) und einer Spaltbreite von 4 nm verfolgt. I 0 ist die Fluoreszenzintensität der gefärbten Viren gebunden an die Zielzellen zum Zeitpunkt t=0. Die zeitabhängige Fluoreszenzintensität I(t) wird für 30 min bei den benannten pH-Werten verfolgt. Um ein vollständiges Dequenching zu erreichen und das Fluoreszenzmaximum zu bestimmen, werden 0.2% Triton X-100 zugegeben. Das Ausmaß der Fusion (F) ist proportional zum Fluoreszenzmaximum (%) und wird definiert als [195] Formel (2):

↓44

Für weitere Experimente werden die Viren bei pH 5.0 für 15 min bei 37°C inkubiert und nach Neutralisierung an die Zellen gebunden. Das Fluoreszenzdequenching wird wie beschrieben gemessen. Die Auswertung der Daten erfolgt mit Hilfe von Sigma Plot 8.0 und 10.0 (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, USA).

C.12 Mikroskopie

C.12.1 Epifluoreszenzmikroskopie

Subkonfluente 17Cl-1 Zellen in 35 mm/14 mm2 Glassbodenschälchen (MaTek, Ashlands, MA, USA) werden mit fluoreszenzmarkierten MHV-A59 bei einer MOI von 5 – 10 pfu/Zelle für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Für weitere Experimente erfolgt die Inkubation der Zellen mit lysosomotropen Reagenzien, Proteaseinhibitoren oder Cholesterol-entziehenden Substanzen (Tabelle 15). Um ungebundenes Virus zu entfernen werden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend werden die Virus-Zell-Komplexe bei pH-Werten von 5.0 und 7.0 für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Ausbildung von Synzytien nach Infektion verschiedener Mauszelllinien mit MHV-A59 oder MHV-S4 wird 24 h p.i. mittels Phasenkontrsatmikroskopie analysiert. In zusätzlichen Experimenten werden die markierten Viren für 15 Minuten einem pH-Wert von 5.0 bei 37°C oder 4°C ausgesetzt, neutralisiert und das Fusionsverhalten bei pH 7.0 und 5.0 verfolgt. Alle Proben werden sofort über Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet. Die Bildaufnahmen erfolgen in jedem Fall mit Hilfe der MetaView Software (Universal Imaging, Buckinghamshire, UK). Die primäre Bildbearbeitung und -auswertung wird mit Hilfe der MetaMorph Software (Universal Imaging, Buckinghamshire, GB) durchgeführt, gefolgt von der Bearbeitung mit Adobe® Photoshop® und Adobe® Illustrator® (Adobe Systems GmbH, München, Germany).

C.12.2 Konfokalmikroskopie

Zusätzlich zu den epifluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen werden mit Hilfe des FluoView™ FV-1000 Konfokalmikroskops (Olympus, Hamburg, Deutschland) konfokalmikrokopische Analysen der Virus-Zell-Fusion durchgeführt. R18-markierte MHV-A59 werden mit dem 543 nm Laser angeregt und die Emission wird bei BP 590-655 detektiert. Für die Aufnahmen wird ein Öl-Immersions-Objektiv mit einer 60x Vergrößerung und einer numerischen Apertur (NA) von 1.35 (Olympus, Hamburg, Deutschland) verwendet. Alle Experimente werden, wenn nicht anders angemerkt bei 37°C durchgeführt. Die Auswertung der konfokalen Bilder erfolgt mittels der Olympus FluoView™ Software Version 1.4 a (Olympus, Hamburg, Deutschland).

C.13 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Fusion von SARS-CoV

C.13.1 Überprüfung der Oberflächenexpression des S-Proteins von SARS-CoV und des humanen Rezeptors hACE2

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Die Volllängenvarianten der Proteine SARS-CoV S und des humanen Rezeptors hACE2 werden in HEK293T-Zellen exprimiert und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie (IFM) analysiert. Tabelle 16 fasst die für die IFM verwendeten Primär- und Sekundärantikörper zusammen:

Tabelle 16: Antikörper für die IFM

Epitop

Primärantikörper

Sekundärantikörper


S-Full

anti-S-Full #IMG-542 (IMGENEX Corp., San Diego, CA; USA)

anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)


ACE2-Full

anti-hACE2 #MAB933 (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland)

anti-Maus FITC (Jackson ImmunoResearch Inc., West Grove, PA, USA)

HEK293T-Zellen werden am Vortag in 30 mm/14mm2 Glassbodenschälchen ausplattiert, am Folgetag mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert und mit VTF7.3 infiziert. Für die IFM werden die Zellen 2x mit PBS-BSA-Puffer gewaschen und anschließend mit dem entsprechenden Primärantikörper in PBS-BSA-Puffer (Tabelle 16) für mind. 2 Stunden inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS-BSA wird der entsprechende fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper (Tabelle 16) hinzu gegeben und für weitere 2 Stunden im Dunkeln mit den Zellen inkubiert. Die anschließende Fluoreszenzmikroskopie erfolgt bei Raumtemperatur mit dem Mikroskop Axiovert 100 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) unter Verwendung eines 40 x Objektivs (Apoplan, Leica Mikrosysteme, Bensheim, Deutschland). Die eingesetzten Fluorophore werden mit folgenden Einstellungen detektiert: Alexa Fluor 594 – 510-560 nm BP-Anregungsfilter/590 nm LP-Emissionsfilter, FITC (Fluoresceinisothiocyanat) – 450-490 nm Anregungsfilter/520 nm LP-Emissionsfilter. Die Aufnahme der Bilder erfolgt mittels der angeschlossenen gekühlten CCD-Kamera und der MetaView Software (Universal Imaging, Buckinghamshire, UK). Die fluoreszenzmikroskopischen Bilder werden wie beschrieben prozessiert und ausgewertet.

C.13.2 Kultur der Zellen

↓46

Für den Fusionsassay werden die transfizierten Zellen (HEK293T und VeroE6) in T75-Zellkulturflaschen bei 37°C/5 % CO2 in D10 kultiviert. Für die fluoreszenzmikroskopischen Messungen werden die Zellen geerntet. Dazu wird die Zellschicht zweimal mit HANKs-Puffer gewaschen und für 5 min bei 37 °C mit 2 ml 0.25% Trypsin/EDTA inkubiert. Anschließend werden die Zellen in 10 ml D10 resuspendiert und 30 min bei 4 C° inkubiert. Die Zellen werden 2x mit eiskaltem PBS+ gewaschen und in 1 ml PBS+ (107 Zellen/ml) resuspendiert.

C.13.3 Markierung der Zellen

Für die Fusionsexperimente werden HEK293T-Zellen parallel mit der pCDNA3 S-Full (HEK293T-S) und dem pEYFP-N1-Plasmid (Tabelle 12) transfiziert und mit VTF7.3 infiziert. VeroE6 werden mit der pCDNA3 ACE2-Full (VeroE6-ACE2) transfiziert und ebenfalls mit VTF7.3 infiziert. Abgelöste VeroE6-Zellen (107 Zellen/ml) werden mit dem Membranmarker R18 markiert: Unter vorsichtigem Schütteln werden 20 µl R18 (2 mM in Ethanol) zu den Zellen gegeben. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln werden 10 ml eiskaltes DMEM mit 5 % FCS (D5) zugegeben und 15 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen werden 2x mit PBS+ gewaschen (5 min bei 4°C, 380 x g). Im weiteren Verlauf der Experimente werden HE293T-S Zellen mit 50 μl des cytosolischen Markers Calcein-AM (1 mM in DMSO) markiert. Calcein-AM diffundiert durch die Membran lebender Zellen ins Cytosol und wird dort von zelleigenen unspezifischen Esterasen zu Calcein umgewandelt, indem das Acetoxymethyl abgespalten wird. Es liegt dann in grün fluoreszierender Form und geladen vor und kann nicht mehr aus den Zellen permeieren. VeroE6-ACE2 Zellen werden in Suspension entweder wie beschrieben mit 20 μl des Membranmarkers R18 (2 mM in EtOH) oder mit 50 μl des cytosolischen Markers CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) Tetramethylrhodamin (1 mM in DMSO) markiert.

C.13.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung zur Fusion

Die HEK293T-S Zellen (EYFP oder Calcein-AM, grün) werden mit den VeroE6-ACE2 Zellen (R18 oder CMTMR, rot) inkubiert und unter gelegentlichem Schwenken auf Eis inkubiert: Dazu werden je 500 μl VeroE6-ACE2 zu den HEK293T-S Zellen hinzugegeben und für mind. 60 min auf Eis inkubiert. Nicht gebundene Zellen werden nach mehrmaligem Waschen mit eiskaltem PBS+ entfernt. Die Zell-Zell-Fusion wurde anschließend unter verschiedenen Bedingungen analysiert. Tabelle 17 fasst die untersuchten Bedingungen zusammen:

↓47

Tabelle 17: Bedingungen der Zell-Zell-Fusion

pH-Wert

Marker

Trypsin-TPCK

(1)


5.0

EYFP
R18

+

-


7.4

EYFP
R18

+

-

(2)


5.0

Calcein AM
R18

+

-


7.4

Calcein AM
R18

+

-

Kontrolle

nicht transfiziert

-

(3)

5.0

Calcein-AM
CMTMR

-

7.4

-

Kontrolle

nicht transfiziert

-

Die Zell-Zell-Fusion wird durch die Erhöhung der Umgebungstemperatur auf 37°C, durch Erniedrigung des pH-Werts oder durch Zugabe von Proteasen (Trypsin-TPCK (1 mg/ml)) induziert (Tabelle 17). Nach 15 min Inkubation im Brutschrank (37°C) werden die Zellen mikroskopisch analysiert. Dabei wird der Übergang der einzelnen Fluorophore von Zelle zu Zelle kontrolliert. Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen werden bei Raumtemperatur am Mikroskop Axiovert 100 unter Verwendung eines 40x Öl-Immersions Objektivs mit einer NA von 1.35 durchgeführt. Die Fluorophore werden mit folgenden Einstellungen detektiert: Rhodamin – 510-560 nm BP-Anregungsfilter/590 nm LP-Emissionsfilter, Calcein-AM – 450-490 nm Anregungsfilter/520 nm LP-Emissionsfilter. Die Aufnahme der Bilder erfolgt wie beschrieben.

C.14 Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59

Für die Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59 wird zunächst die primäre Aminosäuresequenz des S-Proteins von MHV-A59 aus der Swiss-Prot Database entnommen und mit den Kriterien für Fusionspeptide abgeglichen (siehe Einleitung). Die anschließende Anfertigung der Hydrophobizitätsplots der Volllängenvariante sowie der S2-Untereinheit des S-Proteins von MHV-A59 mit Hilfe der Membrane-Protein-Explorer Software - MPex - [196] ermöglicht die Auffindung hydrophober Proteinbereiche. Die Erstellung der Hydrophobizitätsplots basiert auf der Hydrophobizitätsskala einzelner Aminosäurereste nach Wimley und White (WWIH-Skala) und sagt aus, welche Energiebarriere (ΔG (kcal/mol)) überwunden werden muss, um einen Aminosäurerest von der wässrigen Phase in die Lipidphase zu überführen [181]. Hydrophile Reste besitzen einen negativen ΔG-Wert, wogegen hydrophobe Reste einen positiven ΔG-Wert aufweisen. Die durchschnittlichen Hydrophobizitätswerte von 19 Aminosäureresten werden unter Nutzung der WWIH-Skala herangezogen, um die entsprechenden Hydrophobizitätsplots zu generieren. Nach Ermittlung geeigneter Fusionspeptidkandidaten wird deren individueller ΔG-Wert bestimmt. Nach Vergleich der Aminosäuresequenzen der Fusionspeptidkandidaten mit bereits bekannten Fusionspeptiden anderer viraler Fusionsproteine wird mit Hilfe spezieller Programme die Sekundärstruktur berechnet und analysiert.

↓48

 


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05.12.2008