E Diskussion

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Die wesentlichen in der Diskussion zu erörternden Ergebnisse sind nachfolgend kurz zusammengefasst: Der Eintritt von MHV-A59 ist Cholesterol-abhängig. Dies deutet gegebenenfalls auf eine Beteiligung von Cholesterol-reichen Domänen/Rafts bei der Aufnahme der Viren hin. Die Infektivität von MHV-A59 wird durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren des Clathrin-abhängigen Endozytoseweges gehemmt. Nach Inkubation der Viren mit den Zielzellen findet man MHV-A59 in zellulären Organellen, vermutlich Endosomen, vor. Die Fusion der viralen Membran von MHV-A59 mit der Membran der Zielzelle kann durch Erniedrigung des pH-Wertes ausgelöst werden. Die proteolytische Spaltung des S-Proteins durch endosomale Proteasen der Wirtszelle ist für die Infektivität von MHV-A59 nicht erforderlich, da während der Reifung des Virus in der Wirtszelle das Protein bereits gespalten wird. Die Inkubation von MHV-A59 bei niedrigem pH-Wert löst eine irreversible Konformationsumwandlung im S-Protein aus, die einen Verlust der Infektivität und Fusionsaktivität zur Folge hat. Ein niedriger pH-Wert ist demzufolge ausreichend, um die Konformationsänderung im S-Protein von MHV-A59 auszulösen.

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Das S-Protein von MHV-A59 bildet charakteristische peplomere Strukturen auf der Oberfläche von Viruspartikeln aus. Die vorläufige 3D-Rekonstruktion des Proteins ermöglicht die Gliederung in Kopf- und Stammregion. Drei ausgeprägte „Flügel“ dominieren den prägnanten Kopf und sind prädestiniert für die Rezeptorbindung. Das 25 Aminosäuren lange Fusionspeptid FP-1 mit der Primärsequenz 924-ISGYTTGATAAAMFPP-WSAAAGVPFSLSVQYRINGL-959 beinhaltet vermutlich das Fusionspeptid von MHV-A59. Es befindet sich 200 Aminosäurereste entfernt von der mutmaßlichen Trypsinspaltungsstelle in der Nähe der HR1-Region, bildet voraussichtlich α-helikale Sekundärstrukturen aus und besitzt einen für interne Fusionspeptide charakteristischen zentralen Prolinrest.

Das S-Protein von SARS-CoV wird als Trimer exprimiert. Die Fusionsaktivität des S-Proteins von SARS-CoV wird bestimmt durch: (1) S-ACE2-Rezeptor-Interaktion, (2) die proteolytische Spaltung in S1- und S2- Untereinheit und (3) einen niedrigen pH-Wert, vermutlich bereitgestellt durch ein zelluläres Organell. Unklar bleibt die Rolle des niedrigen pH-Werts bei der Auslösung der Fusionsreaktion.

E.1 Identifizierung des Infektionsweges von Coronaviren

Die erste elektronenmikroskopische Charakterisierung des Infektionsweges von MHV-A59 in einer Mauszelle wurde von David-Ferreira und Kollegen 1965 durchgeführt [209]. Die Virusbindung schien eine Invagination der Plasmamembran zur Folge zu haben. Eine Stunde nach Inokulation fanden sie die Viren in intrazellulären Organellen nahe der Plasmamembran vor. Dies war der erste Hinweis auf die Nutzung intrazellulärer Organellen für die Aufnahme und den nachfolgenden Transport der Viren in das Zellinnere. Zwei bis drei Stunden nach Infektion wurden die Partikel in elektronendichteren zellulären Organellen vorgefunden. Die Viruspartikel waren häufig noch intakt, teilweise aber ohne virale Hüllmembran, was eine vorangegangene Fusion vermuten lässt.

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Für die Identifizierung und Charakterisierung des Eintrittsweges des Coronavirus MHV-A59 in Mauszellen wurden in der vorliegenden Arbeit zwei unabhängige experimentelle Ansätze verfolgt. Zur Untersuchung der Infektion verschiedener Mauszelllinien durch MHV-A59 wurde zunächst der Plaqueassay durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung des viralen Eintritts und die anschließenden Analyse der Fusion mit der Zielmembran ermöglichte einen detaillierten Blick auf die ersten Schritte der viralen Infektion durch MHV-A59. Beide Ansätze kommen zu vergleichbaren Ergebnissen. Die Infektion durch MHV-A59 ist empfindlich gegenüber Substanzen, die mit der Endozytose und der endozytotischen Aufnahme sowie dem Transport von Viren zu sauren intrazellulären Kompartimenten interferierten. Eine Umgebung mit niedrigem pH-Wert löst die Fusion von MHV-A59 mit der Membran der Zielzelle direkt aus. Dies konnte durch die Beobachtung einer schnellen Fusion von MHV-A59 mit der Plasmamembran von 17Cl-1 Zielzellen nach Erniedrigung des pH-Werts gezeigt werden. Die Hemmung des Fusionspotenzials durch Vorinkubation der Virionen bei pH 5.0 in Abwesenheit der Zielmembran und die elektronenmikroskopische Aufnahmen von Viren, die einem niedrigen pH-Puls ausgesetzt wurden, lassen vermuten, dass eine irreversible Konformationsumwandlung im S-Protein von MHV-A59 die Fusion zwischen viraler Hüll- und Zielmembran auslöst.

Alle verwendeten lysosomotropen Substanzen - Ammoniumchlorid, Monensin, Bafilomycin und Concanamycin - unterdrücken die Infektion von 17Cl-1, LR-7 und DBT Zellen durch MHV-A59 nahezu vollständig. Bafilomycin A1 könnte auf zwei Arten mit der endozytotischen Route interferieren. Einerseits verhindert es die Ansäuerung endosomaler/lysosomaler Organellen durch Blockierung der vakuolaren V-Typ-ATPase. Andererseits inhibiert es den Transport von frühen zu späten Endosomen [38,158]. Einen direkten Beweis für die Relevanz der endozytotischen Aufnahme von MHV-A59 in die Zielzelle liefert die Inhibierung der Infektion durch Chlorpromazin. Diese kationische amphiphile Substanz verhindert die Bildung Clathrin-haltiger Vesikel, indem sie die Bindung des Adapterproteins AP-2 an die Plasmamembran hemmt [47]. Auf diese Weise kommt die gesamte Clathrin-abhängige Endozytose der Zelle zum Erliegen [38,44,45,46]. Die gewonnenen Erkenntnisse lassen vermuten, dass MHV-A59 die Zelle über einen Clathrin-abhängigen Weg infiziert (Abbildung 34). Die Sensitivität der MHV-A59 Infektion gegenüber lysosomotropen Agenzien steht in Übereinstimmung mit einem solchen Eintrittsweg, da Clathrin-haltige Vesikel ihren Inhalt meist an Endosomen liefern, die ein saures Milieu aufweisen. Zusätzlich wird der Befund der endozytotischen Aufnahme dadurch gestützt, dass eine Unterdrückung der Infektion von MHV-A59 nach Cholesterolverarmung zu beobachten ist. In früheren Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass die Clathrin-abhängige Endozytose durch den Entzug von Cholesterol nach Behandlung mit MβCD stark inhibiert ist [61,201].

Abbildung 34 : Modell des Infektionsweges von MHV-A59. Nach Bindung des Virus an den Rezeptor CEACAM1a erfolgt die endozytotische Aufnahme. Clathrin assembliert um das endozytotische Vesikel und es kommt zu dessen Abschnürung. Die virusbeladenen Vesikel werden zu frühen Endosomen transportiert und reifen dann weiter zu späten Endosomen. Ausgelöst durch einen niedrigen pH-Wert (pH 5.5 – 5.0) wird das virale Nukleokapsid in das Cytoplasma der Zelle entlassen und die eigentliche Fusion von viraler und zellulärer Membran erfolgt („Uncoating“).

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Die Annahme, dass ein endozytotisches Kompartiment eine Rolle bei der Infektion von MHV-A59 spielt, steht in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von Rottier und Mitarbeitern [152]. Sie fanden heraus, dass die Infektion von LR-7 Zellen mit MHV-A59 mit bereits gespaltenem S-Protein empfindlich auf die anschließende Behandlung der Zellen mit Chlorpromazin und Bafilomycin A1 reagierte. Der beobachtete Einfluss von Bafilomycin A1 war jedoch weniger ausgeprägt als in den vorliegenden Experimenten, wogegen ein eindeutiger inhibitorischer Effekt von Chlorpromazin nachgewiesen werden konnte. Dies könnte daran liegen, dass in der beschriebenen Arbeit eine niedrigere Konzentration an Bafilomycin A1 (50 nM) verwendet wurde. Eine weitere Studie dagegen steht im Widerspruch zu den in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnissen. Mitarbeiter um Weiss et al. konnten keinen Einfluss auf die Infektion von L2 Fibroblastenzellen nach Infektion mit einer rekombinanten Variante von MHV-A59 (RA59) beobachten [210]. Weder in Anwesenheit von Bafilomycin A1 noch in der von Ammoniumchlorid wurde die Infektion signifikant unterdrückt [5]. Für die Diskrepanz dieser Ergebnisse könnte es mehrere Gründe geben. Wie kürzlich gezeigt werden konnte [152], hängt der Eintrittsweg von MHV im wesentlichen von zwei Faktoren ab: (i) dem Virusstamm und (ii) dem Zelltyp. Einen weiteren kritischen Punkt stellt die (iii) Dauer der Inkubation der Zellen mit den jeweiligen Substanzen dar. Während in der vorliegenden Arbeit, wie auch in den meisten anderen Untersuchungen mit Coronaviren oder anderen Hüllviren, die lysosomotropen Substanzen die gesamte Inkubationszeit und auch während der Infektion anwesend waren, wurden diese in der Studie von Qiu et al. [5] eine Stunde nach der Infektion entfernt. Ein Teil der rekombinanten Viren könnte demzufolge intakt geblieben sein. Die Wiederherstellung der pH-Bedingungen im endosomalen Kompartiment nach Entfernung der Reagenzien könnte daraufhin eine Reaktivierung des Fusionspotentials des viralen S-Proteins auslösen. Für andere Coronaviren wie MHV-2 [5] und SARS-CoV [6] konnte bereits ein pH-abhängiger Eintrittsweg beschrieben werden. Für diese Viren bleibt jedoch unklar, ob ein niedriger pH-Wert eine direkte Konformationsumwandlung des S-Proteins auslösen kann oder auf indirektem Weg zur Auslösung der Fusionsreaktion führt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die pH-Abhängigkeit der Infektivität von MHV-2 und SARS-CoV auf der proteolytischen Spaltung des viralen Fusionsproteins durch endosomale Proteasen wie Cathepsin L basiert. Diese sind im Lumen später Endosomen und Lysosomen lokalisiert und ermöglichen die Aktivierung des Fusionspotenzials des S-Proteins. Ähnliches wurde bereits für das Ebolavirus gezeigt [4]. Die S-Proteine von MHV-2 und SARS-CoV werden im Gegensatz zu den S-Proteinen anderer Coronaviren während der Partikelreifung in der Wirtszelle nicht in S1- und S2-Untereinheiten gespalten. Daher müssen sie in einem späteren proteolytischen Spaltungsschritt, möglicherweise erst nach dem Eintritt in die Zielzelle, aktiviert werden, um ihre volle Fusionskapazität zu erlangen. Endosomale Proteasen spalten das virale S-Protein im Endosom so, dass es zu Konformationsumwandlungen kommt, welche die Fusion zwischen viraler Hüllmembran und endosomaler Membran vermitteln. In der Tat konnte gezeigt werden, dass nach Behandlung der Viren mit Trypsin eine proteolytische Aktivierung der Fusionsaktivität des S-Proteins ausgelöst werden kann [5,6].

Interessanterweise finden Rottier und seine Mitarbeiter, dass die Empfindlichkeit gegenüber Bafilomycin A1 und Chlorpromazin für MHV-A59 mit ungespaltenem S-Protein gegenüber Viren mit gespaltenem S-Protein erhöht ist [152]. Die erhöhte Sensitivität könnte mit der Inhibierung der Spaltung durch endosomale/lysosomale Proteasen erklärt werden. Allerdings zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Fusion von MHV-A59 und dessen Infektion nicht oder nur gering von endosomalen Proteasen abhängig ist (siehe Ergebnisse). Dies ist nicht überraschend, da bekannt ist, dass eine Spaltung des S-Proteins von MHV-A59 in S1- und S2-Untereinheit bereits während der Virusmaturierung stattfindet [151,152]. Proteaseinhibitoren, die endosomale Cysteinprotease wie Cathepsin L und B hemmen, zeigen lediglich einen geringen Einfluss auf die Infektion von 17Cl-1 Zellen durch MHV-A59. Dennoch wird eine Erhöhung der Infektionseffizienz durch Zugabe von Trypsin beobachtet [151]. Das Virus MHV-A59 FI mit vollständig ungespaltenem S-Protein zeigt nach Inhibierung der Proteasen einen deutlichen Rückgang der Infektivität (> 90%) (siehe Ergebnisse). Für die erfolgreiche Spaltung des S-Proteins in S1- und S2-Untereinheit ist die Protease Furin oder ein furin-ähnliches Enzym verantwortlich. Furininhibitoren können lediglich die S-Protein induzierte Zell-Zell-Fusion verhindern, haben jedoch keinen Einfluss auf die Virus-Zell-Fusion [152].

Die fluoreszenzspektrometrischen und –mikroskopischen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein endozytotisches Kompartiment (Endosom/Lysosom) mit einem sauren Lumen eine Rolle beim Eintritt von MHV-A59 in die Zelle spielt. Die durchgeführten Experimente liefern Hinweise darauf, dass für die Fusion der viralen Hüllmembran mit der zellulären Membran keine Proteasen oder andere endosomale Faktoren benötigt werden. Die Erniedrigung des pH-Wertes allein ist ausreichend, um die Fusion von MHV-A59 mit 17Cl-1 Zellen zu induzieren. Während bei neutralem pH-Wert keine Fusion detektiert werden konnte, erfolgte eine sehr schnelle Fusion nach Ansäuerung des Suspensionsmediums (siehe Ergebnisse). Der Fusionsprozess war ferner temperaturabhängig, wie dies bereits für andere Hüllviren beschrieben wurde [41,195,211,212]. Bei Raumtemperatur findet unter allen untersuchten pH-Bedingungen eine deutlich langsamere Fusion statt, die in einem wesentlich geringeren Fusionsausmaß mündet. Zudem liefern die fluoreszenzmikroskopischen Daten einen klaren Beweis dafür, dass ein niedriger pH-Wert die Fusionsaktivität von MHV-A59 auslöst. Nach Bindung von MHV-A59 an 17Cl-1 Zellen findet eine schnelle und effiziente Fusion der viralen Hüllmembran mit der Plasmamembran nach Ansäuerung des Mediums bei 37°C statt. Dies entspricht den Verhältnissen, die im Lumen des späten endosomalen Kompartiments herrschen. Im Gegensatz dazu findet keine oder nur geringe Fusion unter neutralen pH-Bedingungen und 37°C statt. Werden die Virus-Zell-Komplexe jedoch länger als > 10 Minuten bei 37°C inkubiert, wird eine intrazelluläre Markierung beobachtet, die durch Inkubation mit lysosomotropen Agenzien erfolgreich inhibiert werden kann (siehe Ergebnisse). Diese Beobachtungen unterstützen die Annahme, dass MHV-A59 den endozytotischen Weg für den Eintritt in die Zelle nutzt und anschließend zu endosomalen Kompartimenten transportiert wird, wo die eigentliche Fusion stattfindet. In weiteren Experimenten konnte ausgeschlossen werden, dass endosomale Proteasen der Wirtszelle für den viralen Eintritt von MHV-A59 und die damit verbundene Auslösung der Fusionsreaktion notwendig sind (siehe Ergebnisse). Die Schlussfolgerungen, dass die Infektion von MHV-A59 über die endozytotische Aufnahme und den anschließenden Transport zu einem endosomalen Kompartiment erfolgt und ein niedriger pH-Wert die Fusion und Konformationsumwandlung im S-Protein direkt auslösen kann, steht in Übereinstimmung mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnissen eines weiteren Mitglieds der Coronavirusfamilie, dem infektiösen Bronchitisvirus - IBV [213]. Die Infektivität von IBV kann wie bei MHV-A59 durch lysosomotrope Agenzien und Inhibitoren der pH-abhängigen Endozytose blockiert werden, wird aber durch Proteaseinhibitoren nicht beeinflusst. Zusätzlich kann die pH-abhängige Fusion durch den auf R18 basierenden Fluoreszenzdequenchingassay nachgewiesen werden. Dieser Weg des zellulären Eintritts scheint, wenn nicht für alle, so doch für einige Mitglieder der Coronavirusfamilie zu gelten.

E.2 Die Struktur des S-Proteins von Coronaviren

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In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Ansätzen die Struktur des S-Proteins von Coronaviren analysiert und charakterisiert. Im eukaryotischen Zellsystem wurden zunächst verschiedene Varianten des S-Proteins von SARS-CoV exprimiert und aufgereinigt. In einem weiteren Ansatz wurden infektiöse MHV-A59 Virionen gezüchtet und isoliert, um die Struktur des S-Proteins an intakten Viruspartikeln zu untersuchen.

E.2.1 Das S-Protein von SARS-CoV

Das S-Protein von SARS-CoV konnte sowohl in der Volllängenvariante (S-Full), als auch als verkürzte Ektodomäne (S-Ekto) im eukaryotischen Zellsystem als C-terminal (His)6-getaggte Variante exprimiert und aufgereinigt werden. Im nativen Proteingel konnte nachgewiesen werden, dass die Ektodomäne als Trimer oder Monomer exprimiert wird. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den bereits veröffentlichten Daten von Xiao et al. [173,214]. Diese zeigen, dass die Ektodomäne des S-Proteins von SARS-CoV als Trimer mit einem Molekulargewicht (MW) von ca. 512 kDa vorliegt. Ein geringerer Anteil des Proteins wird als Monomer mit einem MW von 200 kDa exprimiert. Interessanterweise kann der N-terminale Anteil des S-Proteins Dimere mit einem Molekulargewicht von ~230 kDa ausbilden [214]. Im Gegensatz zu anderen viralen Fusionsproteinen konnte der native, oligomere Zustand des Proteins ohne Zugabe von Crosslinkern nachgewiesen werden. Dies liegt vermutlich daran, dass ein Großteil der S-Proteine im nativen Zustand ungespalten ist. Im Gegensatz zu anderen S-Proteinen der Coronavirus-Familie, die während ihrer Maturierung in der Wirtszelle proteolytisch in S1- und S2-Untereinheiten gespalten werden [151,152,215,216], ist dies bei SARS-CoV nicht der Fall [156,217]. Sowohl durch SDS-PAGE als auch nach Westernblotanalyse konnte nachgewiesen werden, dass die Mehrheit der exprimierten Fusionsproteine in der ungespaltenen Form (180-200 kDa) vorliegt und ein sehr geringer Teil als gespaltene S1/S2 (90 kDa)-Bande auftritt (siehe Ergebnisse). Zusätzlich konnte bestätigt werden, dass S-Monomere in glykosylierter (200 kDa) und nicht-glykosylierter (180 kDa) Form exprimiert werden.

Mit dem Ziel der Aufklärung der 3D-Struktur des S-Proteins wurde das aufgereinigte S-Protein elektronenmikroskopisch analysiert. Die Proteinausbeute, die mit dem verwendeten Expressionssystem erreicht werden konnte, war leider nicht ausreichend, um eine Rekonstitution des viralen Fusionsproteins in Liposomen durchführen zu können. Die angefertigten elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen vorwiegend Aggregate von Proteinen, die in ihrer Größe nicht den erwarteten hochmolekularen Komplexen (500-600 kDa) entsprechen. Möglicherweise führte die Wechselwirkung der 1%igen Phosphorwolframsäure mit den viralen Proteinen zu deren Degradation. Bemühungen zur Optimierung der Transfektions-, Expressions- und Aufreinigungsbedingungen schlugen weitgehend fehl. Dennoch gelang es nach Analyse einer Präparation der S-Volllängenvariante vereinzelte S-Proteine zu identifizieren, welche in Abmessungen in Übereinstimmung mit der erwarteten Größe stand (siehe Ergebnisse). Zur Analyse der aufgereinigten S-Proteine von SARS-CoV in verschiedenen Orientierungen wurden zusätzlich Ni-Lipidhaltige SUVs hergestellt und mit den entsprechenden (His)6-Tag Varianten des S-Proteins inkubiert. Es konnte keine Anlagerung oder Ausrichtung der Proteine an die Liposomen beobachtet werden. Lediglich Veränderungen in Form und Gestalt der SUVs wurden erfasst (siehe Ergebnisse).

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In zwei kürzlich veröffentlichten Arbeiten konnte die Struktur der SARS-Virionen sowie des viralen S-Proteins charakterisiert werden [165,218]. Beniac et al. erstellten eine 3D-Rekonstruktion des S-Proteins. Zusätzlich gelang mit Hilfe der Kryoelektronenmikroskopie die Rekonstruktion intakter SARS-CoV Virionen. Die Struktur des S-Protein Trimers konnte mit einer Auflösung von 16 Å rekonstruiert werden. Demnach hat das S-Protein einen Durchmesser von 180 Å und ragt 160 Å aus der Virushülle hervor. Das Protein ist über einen kurzen, dünnen Stamm in der Virusmembran verankert. Die Masse des trimeren S-Proteins beträgt etwa 500 kDa [155,214]. Dies ist konsistent mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen. Nach biochemischen Studien besitzt ein Virion durchschnittlich 66,7 S-Proteine [167]. Dies konnte anhand der Berechnungen von Beniac et al. bestätigt werden, die eine durchschnittliche Zahl von 65 S-Proteinen pro Viruspartikel beschreiben [165]. Im Gegensatz zu diesen Untersuchungen führten Li et al. ähnliche Analysen an exprimierten rekombinanten S-Proteinen in einem in vitro Expressionssystem durch [218]. Sie konnten nachweisen, dass die Ektodomäne des S-Proteins (S-e) vier verschiedenen Konformationszustände einnehmen kann (Abbildung 35 A-D): Es liegt entweder als L-förmiges S-e Monomer (A), als ungespaltenes S-e Trimers (B), als gespaltenes S-e Trimer (C) oder in Form von elongierten S2-Trimer-Rosetten mit dissoziierten S1-Monomeren (D) vor. S-e Monomere besitzen ein Molekulargewicht von 157 kDa und eine Länge von 160 Å. Durch pH-Erniedrigung kommt es zu einer irreversiblen Umlagerung der L-förmigen Struktur des S-Protein Monomers und zur Ausbildung nelkenförmiger Trimere mit einem MW von 520 kDa (Abbildung 35 A und B) [218]. Nach Trypsinbehandlung der Monomere finden Li et al. zwei Fragmente von 100 kDa und 70 kDa vor, wobei das größere vermutlich der S1- und das kleinere Fragment der S2-Untereinheit entspricht. Das Trimer kann mittels Trypsin gespalten werden, allerdings verbleibt die S2-Untereinheit auch bei hohen Trypsinkonzentrationen ungespalten. Die proteolytische Spaltung des S-Proteins findet an der Grenze zwischen S1- und S2-Untereinheit an der konservierten proteolytische Spaltungsstelle (RRXRR) statt. Dies hat zur Folge, dass die S1-Untereinheiten als lösliche Monomere dissoziieren und die S2-Untereinheiten Rosetten ausbilden können (Abbildung 35 D). Dieser Zustand stellt vermutlich die Situation nach Auslösung der Fusion, den so genannten „Postfusionszustand“, dar. Interaktionsstudien mit löslichem ACE2-Rezeptor und aufgereinigten S-Proteinen zeigen, dass ACE2 sowohl S-e Monomere, als auch S-e Trimere binden kann (Abbildung 35 E). Die Bindung der Trimere findet an der Knopfregion des Proteins statt. Vermutlich beinhaltet diese die Rezeptorbindungsdomäne.

Abbildung 35: Das S-Protein von SARS-CoV [218]. (A-D) Schematische Darstellung und elektronenmikroskopische Aufnahmen aufgereinigter S-Proteine. (A) S-e Monomere weisen eine L-förmige Gestalt mit einer Länge von 160 Å auf. (B) Durch pH-Erniedrigung kommt es zur Trimerisierung der S-Proteine, die eine nelkenförmige Konformation einnehmen. (C) Die S-Trimere sind sehr stabil und behalten nach Trypsinspaltung ihre Struktur bei. (D) Nach Inkubation mit 1M Harnstoff bilden gespaltene S-Proteintrimere Rosetten aus. (E) Die Bindung der katalytischen Untereinheit des ACE2-Rezeptors erfolgt sowohl mit S-e Monomeren als auch mit S-e Trimeren. 

Die Zusammenlagerung der S2-Untereinheiten zu Rosetten ist vergleichbar mit der Situation der HA2-Untereinheit nach der Fusion. Das Hämagglutinins (HA) des Influenzavirus A, bildet nach pH-Erniedrigung und proteolytischem Abbau der rezeptorbindenden HA1-Domäne ebenfalls Rosetten aus [219]. Ähnliches wird für die S2-Trimere des S-Proteins von SARS-CoV angenommen, da auch diese nach Dissoziation der S1-Untereinheiten Rosetten ausbilden. Im intakten Virus oder Pseudovirus liegen die S-Proteine jedoch bereits als Trimere vor, eine Trimerisierung ist für den viralen Eintritt also nicht mehr notwendig. Die physiologische Relevanz der pH-induzierten Trimerisierung für den Eintritt in die Zelle bleibt unklar. Die Behandlung mit Trypsin kann die Fusion von S-Protein exprimierenden Zellen bei neutralem pH-Wert zusätzlich unterstützen [6,168]. Nach Behandlung mit Trypsin, Thermolysin oder Elastase kann der Eintritt für S-Protein beinhaltende Pseudovirionen trotz Inhibierung mit lysosomotropen Agenzien ermöglicht werden [6,220]. Insbesondere im Hinblick auf die Länge des HR1/HR2-Komplexes der S2-Untereinheit weisen die von Li et al. beobachteten S2-Rosetten typische Charakteristika der Postfusionskonformation auf [154].

E.2.2 Die S-Protein-vermittelte Fusion von SARS-CoV

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Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse zu Fusionsstudien S-Protein exprimierender Zellen stimmen mit den bisher erzielten Daten anderer Gruppen weitgehend überein. Die durch das S-Protein von SARS-CoV vermittelte Fusion ist sowohl abhängig von der (i) Anwesenheit des Rezeptors ACE2, (ii) von einer Umgebung mit niedrigem pH-Wert und der (iii) proteolytischen Spaltung in S1 und S2 durch eine Protease (endosomale Protease) (siehe Ergebnisse). Unklar bleibt die Rolle des pH-Wertes. Zum einen könnte er für die Aktivierung der endosomalen Protease verantwortlich sein, die nur unter niedrigen pH-Bedingungen optimal arbeiten kann. Zum anderen könnte ein niedriger pH-Wert eine direkte Konformationsumwandlung im S-Protein induzieren. Möglich wäre auch eine Kombination aus beidem. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Xiao et al. (S-Protein) [173] und Li et al. (ACE2-Rezeptor) [156] konnte nachgewiesen werden, dass die Volllängenvarianten des S-Proteins und des ACE2-Rezeptors auf der Oberfläche der Zellen exprimiert werden. In verschiedenen experimentellen Ansätzen konnte bestätigt werden, dass die Zell-Zell-Fusion nur unter bestimmten Bedingungen ablaufen kann. Im Gegensatz zu den Untersuchungen von Hofmann et al. [59], die eine Abhängigkeit der SARS-CoV Infektivität von einer niedrigen pH-Umgebung nachweisen konnten, indem sie die Ansäuerung zellulärer Organellen mittels Ammoniumchlorid verhinderten, war die Inkubation der Zell-Zell-Komplexe bei niedrigem pH allein nicht ausreichend, um Zell-Zell-Fusion zu induzieren. Erst nach zusätzlicher Inkubation S-Protein exprimierender Zellen mit Trypsin konnte eine erfolgreiche Zell-Zell-Fusion beobachtet werden (siehe Ergebnisse). Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den Experimenten von Simmons et al. und Yan et al. [6,168,169]. In weiteren Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass S-Protein beinhaltende Pseudoviren nur nach Ansäuerung mit der endosomalen Membran fusionieren [6,59]. Dennoch wurde in keiner der vorliegenden Veröffentlichungen bestätigt, dass der Eintrittsweg von SARS-CoV Clathrin-abhängig erfolgt. In nachfolgenden Experimenten dieser und anderer Gruppen konnte zusätzlich gezeigt werden, dass eine proteolytische Spaltung des S-Proteins mit Proteasen, wie Cathepsin L, die im endosomalen Kompartiment lokalisiert sind, essentiell ist, um eine Konformationsumwandlung im S-Protein von SARS-CoV auszulösen, welche zur Fusion von viraler und zellulärer Membran führt [6,221]. Ein ähnlicher Mechanismus wurde bereits für das Ebolavirus beschrieben [4]. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der Notwendigkeit der proteolytischen Spaltung durch endosomale Proteasen auch ein deutlicher Einfluss des pH-Wertes, unabhängig von der Aktivierung der Proteasen, gefunden. Ein niedriger pH-Wert verstärkt die Zell-Zell-Fusionsreaktion S-Protein und ACE2-Rezeptor exprimierender Zellen zusätzlich (siehe Ergebnisse).

E.3 Das S-Protein von MHV-A59

E.3.1 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59

Neben der Untersuchung des in Zellen exprimierten S-Proteins von SARS-CoV wurden S-Proteine von MHV-A59 an intakten Viruspartikeln untersucht. Soweit bekannt, wurden für MHV-A59 noch keine kryoelektronenmikroskopischen Untersuchungen durchgeführt. Lediglich elektronenmikroskopische Aufnahmen früherer Arbeiten geben Hinweise auf Form und Orientierung der S-Proteine in der viralen Hüllmembran [197]. Die Viruspartikel konnten in der vorliegenden Arbeit in hochreiner Form isoliert werden und zeigen runde, ovale oder nierenförmige Gestalt (siehe Ergebnisse), wie dies bereits für andere Coronaviren wie SARS-CoV beschrieben wurde [165]. Unter neutralen pH-Bedingungen zeigen die Virionen gut definierte S-Proteine mit einer ungefähren Länge von 20 nm (180-200 Å), die aus einer kurzen Stammregion und einer großen, globulären, triangulären Kopfdomäne bestehen, die distal der Hüllmembran orientiert ist. Die ermittelte Morphologie des S-Proteins steht sowohl mit der von Sturman et al. publizierten [197] als auch mit den neuesten Untersuchungen an SARS-CoV [165,218] in Übereinstimmung. Diese Arbeiten zeigen für das gesamte S-Protein ausgehend von der viralen Hüllmembran eine Ausdehnung von 180 Å. Die Struktur besitzt eine kurze Stammdomäne und eine große Kopfdomäne triangulärer Form.

Für eine 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 mit der Einzelpartikelmethode war es im Verlauf der weiteren Untersuchungen wichtig einzelne, nicht überlappende S-Protein-Partikel zu finden, die sich in vielen unterschiedlichen Raumwinkeln orientierten. Für isolierte Viruspartikel mit zahlreichen S-Proteinen auf der Oberfläche wurden die Untersuchungen zunächst unter neutralen pH-Bedingungen durchgeführt. Auf diese Weise konnten mehr als 2800 Einzelpartikel extrahiert werden, die in 440 Klassensummenbildern zusammengefasst wurden (Abbildung 36). Ausschnitt A der Abbildung 36 zeigt die membranverankerten S-Proteine eines MHV-A59 Viruspartikels (Details siehe Ergebnisse). Für die 3D-Rekonstruktrion stellte vor allem das Fehlen von Ansichten von oben, sogenannten „Top Views“, eine Schwierigkeit dar.

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Abbildung 36 : Die Struktur des S-Proteins von MHV-A59. (A) Einzelmoleküle der membranverankerten S-Proteine. Balken: 100 Å. (B) Klassensummenbilder 189-191 aus 440 extrahierten Klassensummenbildern des S-Proteins. Balken: 200 Å. (C und D) 3D-Rekonstruktion des S-Proteins in Isosurface-Darstellung als Seitenansicht und „Top-View“. 

Dennoch gelang nach Abgleich der Klassensummenbilder die Erstellung einer vorläufigen 3D-Rekonstruktion. Die Hauptstrukturmerkmale des S-Proteins von MHV-A59 sind Kopf- und Halsdomäne (siehe Ergebnisse). Die Kopfdomäne wiest drei exponierte „Flügel“ auf und erscheint prädestiniert für die Bindung des Rezeptormoleküls.

Abbildung 37 : Vergleich der Struktur der S-Proteine von SARS-CoV und MHV-A59. (A) Trimere SARS-CoV S-Proteine nach Trypsinspaltung [218]. (B) Monomere der S-Ektodomäne von SARS-CoV [218]. (C) Vergrößerung eines Monomers der S-Ektodomäne. (D) Mögliche Anordnung des S-Monomers von SARS-CoV im 3D-Modell von MHV-A59. Balken: 500 Å.

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Ein Vergleich der von Li et al. publizierten Struktur des S-Proteins von SARS-CoV mit der in der vorliegenden Arbeit ermittelten vorläufigen 3D-Struktur des S-Proteins von MHV-A59 zeigt einige Ähnlichkeiten auf (Abbildung 37). Die Trimere, die nach pH-Erniedrigung eine gewürznelkenförmige Struktur aufweisen, entsprechen weniger den ermittelten Klassensummen. Die trypsingespaltenen Trimere (S1+S2) von SARS-CoV dagegen sind den S-Proteinen der MHV-A59 Partikel sowohl in deren Dimension (Länge: 160 Å, Breite: 120 Å) als auch deren Struktur auffallend ähnlich (Abbildung 37 A). Dies ist konsistent mit unseren sowie mit bereits publizierten Daten, die zeigen, dass S-Proteine von MHV-A59, die in 17Cl-1 Zellen gezüchtet wurden, gespalten (S1+S2) vorliegen [151] und für die Auslösung der Fusion und/oder Konformationsänderung keiner proteolytischen Spaltung im Endosomen mehr bedürfen (siehe Ergebnisse). Die Monomere der S-Ektodomäne von SARS-CoV dagegen weisen eine L-förmige Gestalt auf und stimmen erstaunlich gut mit der vorläufige 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 überein (Abbildung 37 B-D). S-Proteinmonomere lagern sich erst nach Einnahme ihrer endgültigen Konformation zu stabilen Trimeren zusammen. Dies findet in vivo im Golgi-Apparat statt [222]. Die elongierten Postfusionskonformationen der S2-Untereinheiten, die von Li et al. nach Inkubation mit Harnstoff beobachtet wurden, entsprechen den langen dünnen S-Proteinen, die in der vorliegenden Arbeit nach Inkubation bei pH 5.0 und 37°C beobachtet wurden (siehe Ergebnisse).

Abbildung 38: Vergleich der 3D-Struktur der S-Proteine von MHV-A59 (A-C) (K. Ludwig) und SARS-CoV (E-G) [165]. (A) Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme von MHV-A59 (ohne Kontrastmittelzusatz). (B und C) Isosurface-Darstellung des S-Proteins von MHV-A59. (D und H) Überlagerung der S-Proteine von MHV-A59 und SARS-CoV (durchscheinend). (E) Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme von SARS-CoV. (F und G) Isosurface-Darstellung des S-Proteins von SARS-CoV.

Beniac et al. verfolgten in ihren Untersuchungen einen ähnlichen Ansatz der 3D-Rekonstruktion des S-Proteins für SARS-CoV, wie dies in der vorliegenden Arbeit für das S-Protein von MHV-A59 erfolgte (Abbildung 38). Überraschenderweise kamen sie zu einer gänzlich anderen Struktur (Abbildung 38 F-H). Als mögliche Ursache wurde zunächst die Verwendung des Kontrastmittels Phosphorwolframsäure in Erwägung gezogen, da die Daten von Beniac et al. aus reinen Kryo-TEM-Aufnahmen gewonnen wurden. Die rein kryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen von MHV-A59 ohne Kontrastmittel zeigen allerdings die gleiche Morphologie und Struktur der S-Proteine wie nach Verwendung des Kontrastmittels (Abbildung 38 A). Die Primärsequenzen der S-Proteine von SARS-CoV und MHV-A59 ähneln sich sehr und weisen eine Sequenzhomolgie von über 30% auf. Ein Unterschied findet sich in der Länge der Sequenzen: Das S-Protein von MHV-A59 ist mit 1,324 AS-Resten etwas länger, als das von SARS-CoV mit 1,255 AS-Resten, dies entspricht auch den ermittelten Größenunterschieden des resultierenden Trimers. Ferner liegt das S-Protein von SARS-CoV vermutlich ungespalten vor, wogegen das S-Protein von MHV-A59 nach der Virusmaturierung gespalten ist. Der Spaltungsgrad des S-Proteins von SARS-CoV wird in der Literatur nach wie vor kontrovers diskutiert. Neuesten Studien zufolge wird das S-Protein durch die zelluläre Protease (Xa) in der Wirtszelle posttranslational in S1 und S2 gespalten [223]. Ähnliches wurde bereits von Wu et al. in VeroE6 Zellen nachgewiesen, die mit SARS-CoV infiziert wurden [166]. Frühere Untersuchungen dagegen zeigen, dass das S-Protein von SARS-CoV in der Wirtszelle nicht prozessiert wird [217]. Schließlich konnten Li et al. nachweisen, dass nach Inkubation bei niedrigem pH-Wert eine Trimerisierung der S0-Monomere stattfindet. Diese Struktur weist tatsächlich einen breiteren Kopf auf (Abbildung 39 B), besitzt allerdings nicht die Dimensionen der von Beniac et al. beschriebenen Struktur. Die Köpfe sind stärker voneinander separiert und die Stammdomäne erscheint wesentlich breiter. Möglicherweise wirkt sich das Fehlen der Transmembrandomäne und/oder der intraviralen Domäne auf die Form des S-Proteins aus. Die von Li et al. beschriebenen L-förmigen Monomere und die trypsingespaltenen Trimere ähneln teilweise der in dieser Arbeit rekonstruierten 3D-Struktur des S-Proteins von MHV-A59. Dennoch bleibt die Frage bestehen, warum sich die S0-Konformation von Li et al. so stark von der S0-Anordnung von Beniac et al. unterscheidet.

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E.3.2 Konformationen des S-Proteins von MHV-A59

Zusätzliche Experimente sollten Aufschluss über die unterschiedlichen Konformationszustände des S-Proteins von MHV-A59 geben. Nach Inkubation bei pH 5.0 und 37°C wurden verschiedene Anordnungen der S-Proteine erfasst, die vermutlich unterschiedlichen Intermediaten der Konformationsstadien entsprechen (siehe Ergebnisse). Die häufigste Form der Konformation des S-Proteins nach pH-Erniedrigung stellen verlängerte, dünne Stämme dar, die keine Kopfdomäne tragen (Abbildung 39 D’). Die Inkubation der Viren bei pH 5.0 führt im S-Protein von MHV-A59 vermutlich zur Dissoziation der S1-Untereinheiten, wie dies von Li et al. für SARS-CoV nach proteolytischer Spaltung und Inkubation mit Harnstoff beschrieben wurde (Abbildung 39 D [218]). Für MHV-A59 ist jedoch bekannt, dass die proteolytische Spaltung der S-Proteine bereits während der Maturierung in der Wirtszelle erfolgt (Abbildung 39 A‘-C’) [152]. Somit ist unseren Daten zufolge die pH-Erniedrigung allein ausreichend, um die Dissoziation der rezeptorbindenden S1-Untereinheiten zu induzieren (Abbildung 39 D’). Diese Experimente zeigen, dass die Konformationsänderung des S-Proteins tatsächlich durch den pH-Wert beeinflusst werden kann.

Abbildung 39 : Konformationszustände des S-Proteins von SARS-CoV (A-D) [218] und MHV-A59 (A’-D’, siehe Ergebnisse).

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S-Proteine von MHV-A59, die bei niedrigem pH-Wert inkubiert wurden, erfuhren ferner eine irreversible Konformationsumwandlung, die einen Verlust der Fusionsaktivität und Infektivität zur Folge hatte (siehe Ergebnisse). In vorangegangenen Studien konnte eine Konformationsumwandlung im S-Protein von MHV-A59 nach Erniedrigung des pH-Wertes auf 6.5 und Bindung an den Rezeptors ausgelöst werden [148,224,225]. Neben der Wechselwirkung des viralen Fusionsproteins mit dem Rezeptor scheint auch ein niedriger pH-Wert eine Rolle bei der Auslösung der Konformationsumwandlung im S-Protein von MHV-A59 zu spielen. In aktuellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der MHV/BHK-Stamm des Virus BHK-Zellen trotz des Fehlens des CEACAM-Rezeptors infizieren kann [226]. Heparansulfat konnte auch für andere Virusspezies als Rezeptor identifiziert werden. Für das humane Rhinovirus Typ 89 (HR89) und das Herpesvirus Typ 8 (HH8) fungiert Heparansulfat ebenfalls als Rezeptor [42,227]. Nicht immer ist mit der Bindung des Virus auch eine Internalisierung verbunden. HR89 nutzt Heparansulfat in erster Linie zur Bindung. Für den Eintritt jedoch sind weitere zelluläre Faktoren wichtig [42]. Ähnliches gilt für das Influenzavirus, das HA-Protein bindet Sialinsäurereste auf der Oberfläche der Zielzellen [69]. Neben der Notwendigkeit des Rezeptors für den Eintritt in die Zelle wurde die Anwesenheit weiterer zellulärer Faktoren für MHV in früheren Arbeiten diskutiert [228,229]. Bis heute konnte ein solcher Faktor jedoch nicht identifiziert werden. Die irreversible Konformationsumwandlung und der Verlust des Fusionspotentials sind typische Merkmale von Klasse I Fusionsproteinen, unabhängig davon, ob die strukturellen Veränderungen durch Rezeptorbindung (bei neutralem pH) oder durch pH-Erniedrigung (ohne oder mit Rezeptor) ausgelöst werden (siehe Einleitung [62]). Ein gut untersuchtes Beispiel ist das HA-Protein des Influenzavirus A. Es durchläuft eine schnelle, irreversible Konformationsumwandlung bei niedrigem pH und erhöhten Temperaturen [86,194]. Bei niedrigen Temperaturen jedoch konnte keine inaktive Postfusionskonformation des HA-Proteins nach pH-Erniedrigung gefunden werden. In diesem Fall blieb die Fusionskapazität des Proteins erhalten [194,212]. In der vorliegenden Arbeit konnten für MHV-A59 ähnliche Beobachtungen gemacht werden. Nach Inkubation der Viruspartikel bei niedrigen Temperaturen (4°C), bei pH 5.0 und anschließender Neutralisierung war MHV-A59 noch immer in der Lage mit den Zellen zu fusionieren.

E.4 Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59

Für SARS-CoV wurde das mutmaßliche Fusionspeptid kürzlich von Sainz et al. identifiziert und charakterisiert [108]. Basierend auf den konservierten Eigenschaften bereits bekannter Fusionspeptide und nach Auswertung der Hydrophobizitätsplots der S2-Untereinheit von SARS-CoV, gelang zunächst die Identifizierung von zwei Fusionspeptidkandidaten (SARSWW-1 und SARSWW-2). Diese liegen in der Nähe des N-Terminus der S2-Untereinheit und gehören somit zur Klasse der N-terminalen Fusionspeptide. Beide Peptide sind reich an Alanin-, Glycin- und Phenylalaninresten. Ferner besitzen sie ein charakteristisches Tripeptid (YFG/FXG). Nur eines der 19 Aminosäuren langen Peptide - SARSWW-1 - war in der Lage Liposomen zur Fusion zu bringen.

Für das Coronavirus MHV-A59 wird ein intern lokalisiertes Fusionspeptid angenommen, welches vermutlich nahe der HR1-Region liegt [176,177,230]. Bis jetzt konnte für das Coronavirus MHV-A59 jedoch noch kein Fusionspeptid identifiziert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Eigenschaften bereits bekannter Fusionspeptide, durch Analyse der Hydrophobizitätsplots und möglicher Sekundärstrukturen versucht, geeignete Fusionspeptidkandidaten zu ermitteln. Zur detaillierten Analyse wurden Hydrophobizitätsplots der Volllängenvariante und der S2-Untereinheit des S-Proteins erstellt. Neben den bereits bekannten hydrophoben Regionen, wie dem Signalpeptid am N-Terminus und der Transmembrandomäne am C-terminalen Ende des Proteins, konnten in der S2-Untereinheit zunächst vier Fusionspeptidkandidaten (FP1-FP4) identifiziert werden (siehe Ergebnisse). Im weiteren Verlauf der Untersuchungen wurden die Hydrophobizitätsplots der Fusionspeptidkandidaten mit denen bereits bekannter viraler Fusionspeptide von HIV und EboV verglichen (siehe Ergebnisse). Es ist gelungen, zwei geeignete Fusionspeptidkandidaten - FP1-1 und FP1-2 - zu identifizieren, die mehrheitlich alle Charakteristika für Fusionspeptide erfüllen. Nach Lage im viralen Fusionsprotein gehören sie zu den internen Fusionspeptiden wie die Fusionspeptide von EboV [102] und ASLV [103]. Beide Fusionspeptidkandidaten weisen eine Länge von höchstens 27 Aminosäuren auf und bestehen vorwiegend aus hydrophoben Resten wie Alanin (A), Glycin (G) und Phenylalanin (F). Die Hydrophobizitätswerte der Kandidaten bewegen sich im Bereich von ΔG = 2-6 kcal/mol. Alle Fusionspeptidkandidaten weisen zudem einen für interne Fusionspeptide charakteristischen zentralen Prolinrest auf, der für die Interaktion mit der Zielmembran essentiell ist [116,117,118,119]. Nach Analyse der Sekundärstruktur kann festgestellt werden, dass die Fusionspeptidkandidaten FP1-1 und FP1-2 eine α-helikale Konformation einnehmen (siehe Ergebnisse).

E.5 Ausblick

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Lysosomotrope Substanzen, Inhibitoren der Clathrin-abhängigen Endozytose und Cholesterol-entziehende Substanzen konnten die Infektivität von MHV-A59 deutlich beeinträchtigen. Es bedarf dennoch zusätzlicher Untersuchungen, so z.B. in welchem Maße gegebenenfalls Cytoskelettelemente wie Actin und Mikrotubuli am intrazellulären Transport der Virus-haltigen endozytotischen Vesikel beteiligt sind. Die Art des zellulären Organells, in welchem der eigentliche Fusionsprozess stattfindet, konnte noch nicht identifiziert werden. Der direkte Nachweis der Beteiligung von Clathrin-haltigen Vesikeln am Transport von MHV-A59 könnte mit Hilfe von EYFP-Clathrin erfolgen. Ungeklärt bleibt auch die Rolle des CEACAM1a-Rezeptors. Einige Untersuchungen zeigen, dass dieser lediglich für die Bindung, nicht aber für die Auslösung der Fusion von Bedeutung ist [226]. Andere Untersuchungen dagegen bestätigen eine direkte Beteiligung bei der Auslösung der Konformationsumwandlung im S-Protein von MHV [148,224,225]. Die Konformationsänderung im S-Protein von MHV-A59 konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes ausgelöst werden und hatte sowohl den Verlust der Fusionsaktivität als auch der Infektivität zur Folge. Ungeklärt bleibt die Art der Konformationsumwandlung: (1) Erfolgt lediglich die Dissoziation der S1-Untereinheiten oder kommt es auch zu Veränderungen in der S2-Untereinheit? (2) Welcher Art sind die inter-/intramolekularen Wechselwirkungen, die durch die Erniedrigung des pH-Wertes verändert bzw. aufgehoben werden und welche Aminosäurereste sind daran beteiligt?

Die Auflösung der vorläufigen 3D-Struktur des S-Proteins von MHV-A59 bedarf weiterer Optimierung. Zusätzlich könnten S-CEACAM1a-Interaktionsstudien Aufschluss über die Lokalisierung der Rezeptorbindungsdomäne geben. Vergleiche mit bereits bekannten Strukturen viraler Fusionsproteine könnten zur Aufklärung des zugrunde liegenden Fusionsmechanismus beitragen. Die gravierenden Unterschiede zur bereits veröffentlichten 3D-Struktur des S-Proteins von SARS-CoV sollten im Detail analysiert werden. In diesem Zusammenhang stellt die kryoelektronenmikroskopische Analyse ungespaltener S-Proteine einen besonders wichtigen experimentellen Ansatz dar. Die 3D-Rekonstruktion ungespaltener S-Proteine könnte mit Hilfe der Virusvariante MHV-A59 FI angefertigt werden.

Nach theoretischer Identifizierung des Fusionspeptidkandidaten von MHV-A59 sollten experimentelle Untersuchungen mit entsprechenden synthetischen Peptiden durchgeführt werden. Zusätzlich könnten Mutationsstudien Aufschluss über die an der Fusion beteiligten Aminosäurereste liefern.

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Die Fusionsaktivität des S-Proteins von SARS-CoV wird bestimmt durch: (1) S-ACE2-Rezeptor-Interaktion, (2) die proteolytische Spaltung in S1 und S2 und (3) einen niedrigen pH-Wert, bereitgestellt durch ein zelluläres Organell. Unklar bleibt die Rolle des niedrigen pH-Wertes. Zusätzliche Untersuchungen sind notwendig, um zu evaluieren, in wie weit der pH-Wert sowohl für die Aktivität der Protease als auch für die Auslösung der Konformationsänderung/Fusionsreaktion verantwortlich ist. Kontroverse Ergebnisse zur pH-Abhängigkeit des viralen Eintritts von SARS-CoV erschweren die Untersuchungen zusätzlich. Mehrere Gruppen fanden keinen Einfluss lysosomotroper Substanzen auf die Infektivität von SARS-CoV [231] oder beobachteten Zell-Zell-Fusion unter neutralen pH-Bedingungen [156]. Andere Untersuchungen konnten eine pH-Abhängigkeit der viralen Infektivität von SARS-CoV nachweisen [168,169]. Auch die Rolle der endosomalen Proteasen bleibt weiterhin ungeklärt, da es auch zur Spaltung des S-Proteins in S1 und S2 unterschiedliche Daten gibt. Einige Publikationen zeigen eine posttranslationale Spaltung des S-Proteins [223,232], wogegen andere Gruppen keine Spaltung beobachten konnten [217].


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05.12.2008