Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Visualisierung und Charakterisierung der S-Protein vermittelten Fusion von Coronaviren
117 Seiten, 39 Abbildungen und 21 Tabellen, Patricia Eifart, 2007, Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, Dissertation
Die Infektion von Zellen durch das Coronavirus MHV-A59 setzt die Freisetzung des viralen Genoms nach Fusion mit der zellulären Targetmembran voraus. Die Fusionsreaktion wird vom viralen S-Protein vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Eintrittsweg von MHV-A59 in Mauszellen mit zwei unabhängige experimentellen Ansätzen untersucht. Die Infektivität konnte durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren der Clathrin-abhängigen Endozytose signifikant gehemmt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass der Eintritt von MHV-A59 in Mauszellen über die Clathrin-abhängige Endozytose erfolgt und die anschließende Fusion der viralen und zellulären Membran in einem intrazellulären Kompartiment mit niedrigem pH-Wert stattfindet. Durch Inhibitoren endosomaler Proteasen dagegen wurde die Infektivität nur leicht beeinträchtigt. Epifluoreszenz- und konfokalmikroskopische Studien zur Interaktion fluoreszenzmarkierter MHV-A59 Partikel mit Mauszellen konnten nachweisen, dass MHV-A59 über Endozytose aufgenommen wird. Die Färbung intrazellulärer Kompartimente lässt die Fusion von viraler und zellulärer Membran vermuten. Nach Bindung der Viren an die Zellen und anschließende Erniedrigung des pH-Wertes auf 5.0, welcher das Milieu endosomaler Organellen simuliert, wurde eine deutliche Färbung der Plasmamembran beobachtet. Unter neutralen pH-Bedingungen konnte dagegen keine Markierung der Plasmamembran beobachtet werden. Die Erniedrigung des pH-Werts in Abwesenheit des Rezeptors führte ferner zu einer irreversiblen Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein, die zur Inaktivierung der Fusionsaktivität und zum Verlust der Infektivität führte. Diese Reaktion konnte kryoelektronen- und fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten auf eine wesentliche Beteiligung des endozytotischen Weges für den viralen Eintritt von MHV-A59 hin und lassen vermuten, dass ein niedriger pH-Wert, bereitgestellt durch ein zelluläres endosomales Kompartiment, die Konformationsänderung im S-Protein induziert und somit die Fusionsreaktion auslöst. Die kryoelektronenmikroskopische Analyse und 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 in der natürlichen Umgebung der viralen Hüllmembran führte zur Erstellung eines vorläufigen 3D-Modells der nativen S-Protein Konformation.
Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur und Fusionsfähigkeit des S-Proteins von SARS-CoV analysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass das S-Protein von SARS-CoV als Trimer sezerniert wird. Zusätzlich wurde ein auf Fluoreszenzmikroskopie basierender Zell-Zell-Fusionsassay etabliert. Dieser konnte nachweisen, dass die Zell-Zell-Fusion zwischen S-Protein und ACE2-exprimierenden Zellen sowohl abhängig vom pH-Wert als auch von der proteolytischen Spaltung in S1- und S2-Untereinheit ist und durch Erniedrigung des pH-Wertes zusätzlich verstärkt werden kann. Die genaue Rolle des niedrigen pH-Wertes bei der Konformationsumwandlung und/oder einer Aktivierung endosomaler Proteasen bedarf weiterer Untersuchungen.
Im abschließenden Teil der Arbeit wurde auf der Basis vergleichender theoretischer Untersuchungen eine Vorhersage des mutmaßlichen Fusionspeptids des S-Proteins von MHV-A59, welches alle wesentlichen Merkmale eines internen Fusionspeptids aufweist, vorgenommen. Es liegt nahe der „Heptad-Repeat“ (HR) Domäne HR1. Experimentelle Ansätze bleiben jedoch unabdinglich, um das Fusionspeptid, insbesondere in bezug auf dessen Vermittlung der Fusion, näher zu charakterisieren.
Analysis of S-Protein mediated Fusion of Coronaviruses
117 pages, 39 Figures and 21 Tables, Patricia Eifart, 2007, Berlin, Humboldt University Berlin, Dissertation
Infection by the coronavirus mouse hepatitis virus (MHV)-A59 requires the release of the viral genome by fusion with the respective target membrane of the host cell. Fusion is mediated by the viral S-protein. Here, the entry pathway of MHV-A59 into murine cells was studied by mainly two independent approaches. Infection of cells assessed by the plaque reduction assay was strongly inhibited by lysosomotropic compounds and substances which interfere with clathrin-dependent endocytosis, suggesting that MHV-A59 is taken up via endocytosis and delivered to acidic endosomal compartments. Infection was only slightly reduced in the presence of substances inhibiting endosomal proteases. Fluorescence confocal microscopy of labeled MHV-A59 confirmed that the virus is taken up via endocytosis. Bright labeling of intracellular compartments suggests their fusion with the viral envelope. No fusion with the plasma membrane was observed under neutral pH conditions. However, when virus was bound to cells and the pH was lowered to 5.0, we observed a strong labeling of the plasma membrane. Electron microscopy revealed low pH triggered conformational alterations of the S-ectodomain. Very likely, these alterations are irreversible because low pH-treatment of viruses in the absence of target membranes caused an irreversible loss of the fusion activity. The results imply that endocytosis plays a major role in MHV-A59 infection and that the acidic pH of the endosomal compartment triggers a conformational change of the S-protein mediating fusion. Furthermore different conformations of the trimeric spike protein of the murine hepatitis virus A59 in its native environment, the viral envelope, were characterized by cryoelectron and electron microscopy. A preliminary 3D-reconsruction of the native structure at room temperature and neutral pH could be accomplished.
Besides we studied the structure and fusion capability of the spike protein expressed by SARS-CoV. The accomplished data indicate that the spike glycoprotein is secreted as a trimer. Furthermore a cell-cell fusion assay based on fluorescence microscopy was established. The fusion of spike protein and ACE2-receptor expressing cells was strongly dependent on low pH and on proteolytic cleavage of the S-protein into S1 and S2 subunit, whereas fusion could be significantly increased by lowering of the pH. Nevertheless, the precise function of low pH in either induction of the conformational change or activation of the respective endosomal protease and/or a combination of both is not unveiled yet and has to be investigated in more detail.
The final theoretical part of this thesis allowed the identification of the putative fusion peptide, which showed the main characteristics of internal fusion peptides. It is located near the HR1 region and allows the heptad regions of the spike protein to assemble in the six-helix bundle structure (6HB). This structure is of great importance to initiate the approximation of viral and cellular membrane and thus to induce fusion. However, future experiments are indispensable to characterize the main features and to elucidate the particular role of the fusion peptide in fusion mediation.
Insbesondere für umhüllte Viren ist die Fusion mit der Membran der Zielzelle von großer Bedeutung für deren Replikation. Die Virushülle besteht aus einer Lipiddoppelschicht, ähnlich denen der Plasmamembran der Wirtszelle. Durch Verschmelzung beider Membranen wird es dem Virusgenom ermöglicht in die Zelle einzudringen und sich hier zu replizieren, um neue Viruspartikel zu erzeugen. Die Membranfusion wird über virusexprimierte Glykoproteine, welche in der Hüllmembran verankert sind, vermittelt. In diesem Zusammenhang können nicht-pathogene Viruspartikel als Träger fremder genetischer Informationen dienen, die immer häufiger in der Gentherapie Verwendung finden. Dazu ist es wichtig den Mechanismus der virusvermittelten Zellfusion vollständig aufzuklären. Ein weiterer Punkt ist die Aufklärung dieses Mechanismus, um pathogene Viren wie Influenza, SARS oder HIV therapieren zu können und geeignete Gegenmittel zu entwickeln, die die Fusion verhindern oder in einem bestimmten Stadium stoppen können.
Ein kritischer Punkt bei der viralen Infektion ist die Fähigkeit des Virus, das virale Genom von einem infizierten zu einem nicht-infizierten Organismus oder von einer infizierten zu einer nicht-infizierten Zelle zu transferieren. Durch die Unfähigkeit sich selbständig zu replizieren und durch das Defizit eines eigenen Metabolismus sind Viren von ihrem Wirt/Wirtszelle abhängig. Für eine erfolgreiche Vermehrung und Verbreitung des viralen Genoms haben Viren verschiedenste Strategien entwickelt, um in die Zelle einzudringen, ohne vom Wirt erkannt und vernichtet zu werden. Die effektive Nutzung der zellulären Wege bildet die Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion. Viren sind darüber hinaus ein wichtiges Instrument zur Aufklärung verschiedener zellulärer Transportprozesse und - wege. Sie können zum einen als Gentransfervehikel benutzt werden, um spezielle Gene/RNA, siRNA oder Proteine in die Zielzelle einzubringen. Zum anderen können sie Aufschluss über die Protein-Proteininteraktion und die anschließende Signaltransduktionskaskade und Fusion geben [1]. Bei allen bekannten Viren erfolgt die Freisetzung des viralen Nukleokapsids zunächst ins Cytosol der Zelle, unabhängig davon ob das Virus den Weg des direkten Eintritts oder den endozytotischen Weg nutzt. Die meisten RNA-Viren replizieren an definierten Organellen im Cytosol der Zelle [2], wogegen DNA-haltige Viren ihr Genom zunächst in den Nukleus einschleusen müssen.
Der Clathrin-abhängige Weg ist der am häufigsten genutzte Aufnahmeweg für Viren (Abbildung 1 C, Tabelle 1). Die Viren gelangen über frühe Endosomen, aus denen sich späte Endosomen entwickeln, schließlich zu den Lysosomen. Abhängig vom Auslöser der Fusion kann an jeder Stelle dieses Weges die Freisetzung des viralen Genoms in das Cytoplasma erfolgen. Der Caveolin-abhängige Weg (D) ist Cholesterol-abhängig und über den Viren wie SV40 [8], Coxsackie-B, Mauspolyoma- und Echo-1 Viren zum Caveosom transportiert werden und anschließend über einen weiteren vesikulären Transportschritt zum ER gelangen und dort in das Cytosol entlassen werden. Ein weiterer Cholesterol-abhängiger, aber Caveolin- und Clathrin-unabhängiger Weg (E) wird von Polyomaviren und SV40 genutzt, um die Zielzelle zu infizieren. Die letzte bekannte Möglichkeit des viralen Eintritts stellt der Dynamin-2-abhängige Weg (F) dar, der ebenfalls Caveolin-abhängig ist und einen anschließenden Transport des Virus zum Caveosom beinhaltet. Dieser wird vom Echo-1 Virus genutzt.
Abhängig von Zelltyp und Virus kann die Freisetzung des viralen Nukleokapsids an fünf verschiedenen Orten stattfinden: (1) der Plasmamembran, (2) dem frühen oder (3) späten Endosom, (4) dem Caveosom oder (5) dem ER. Die Phagozytose konnte bis jetzt nicht mit dem viralen Eintritt in Verbindung gebracht werden und wurde daher nicht berücksichtigt [1].
Betrachtet man das gesamte Spektrum der Viren, so ist zu beobachten, dass der Großteil über die endozytotische Internalisierung in die Zielzelle gelangt. Die Vorteile sind offensichtlich. Durch den Transport in endozytotischen Vesikeln ist es dem Virus möglich, tief in das Cytoplasma der Zelle einzudringen, dadurch den größten zellulären Barrieren wie dem Cytoskelett und cytosolischen Proteinen auszuweichen [9] und die molekularen Motoren der Zelle zu nutzen [10]. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass während der Phase der Freisetzung noch keinerlei virale Proteine auf der Oberfläche der Zielzelle präsentiert werden und so eine Erkennung durch das Immunsystem des Wirtsorganismus nahezu ausgeschlossen ist. Die Clathrin-abhängige Endozytose ist ein kontinuierlicher Prozess und stellt für das Virus einen schnellen und effizienten Weg dar, in die Zelle zu gelangen [11]. Schon nach einigen Minuten kommt es zur Internalisierung des Virus und die anschließende pH-Erniedrigung ermöglicht die über virale Glykoproteine vermittelte rasche Verschmelzung von viraler und intrazellulärer Membran, um das virale Nukleokapsid in das Cytosol zu entlassen. Abhängig vom pH-Wert, erfolgt die Freisetzung entweder vom frühen Endosom bei einem pH-Wert von 6.5-6.0 oder vom späten Endosom bei pH 6.0-5.5. Für das Ebolavirus, SARS-CoV, MHV-2 und die nicht-umhüllten Reoviren ist ein niedriger pH-Wert allein nicht ausreichend, um die Fusion auszulösen. Zusätzlich muss eine proteolytische Spaltung der viralen Glykoproteine, ausgelöst durch die Proteasen Cathepsin L oder B, im Lumen des Endosoms stattfinden, um das virale Protein in einen fusionskompetenten Zustand zu versetzen. Für das aviane Leukosevirus (ASLV) ist neben der pH-Erniedrigung die Interaktion mit dem Rezeptor notwendig, um die Fusion auszulösen [7,12,13]. Bei Influenza A Viren findet man für ca. 40% der Partikel neben dem klassischen Eintritt der Clathrin-abhängigen Aufnahme auch den Clathrin-unabhängigen Weg [14]. Nur 5% der Viren assoziieren mit bereits bestehenden Clathrindomänen. Erst die Virusbindung induziert eine Assemblierung Clathrin-reicher Domänen unter der Plasmamembran. Diese Induktion- und Rekrutierungsreaktion für Clathrin wurde auch für das Semlikiforestvirus (SFV) und Reoviren beobachtet [15]. Endozytotische Clathrin-assoziierte Vesikel liefern ihren Inhalt an frühe Endosomen und es gibt Hinweise darauf, dass diese zu einer selektiven, spezifischen Population von Endosomen gehören [16]. Für das Vesikularstomatitisvirus (VSV) konnte gezeigt werden, dass die Fusion der viralen Membran mit Membranen der multivesikulären Endosomen (MVB) erfolgt und diese anschließend mit der Membran später Endosomen weiter verschmelzen [17]. In diesem Fall ist für die Entlassung des viralen Nukleokapsids die Fusion mit zwei zellulären Membranen Voraussetzung. Ein solcher Mechanismus konnte auch für das Anthraxtoxin des Bacillus Anthracis nachgewiesen werden [18].
Die einzelnen Schritte des endozytotischen viralen Eintritts stellen sich wie folgt dar: Der erste Kontakt zwischen Virus und Zelle erfolgt durch die Interaktion viraler Strukturproteine mit den Oberflächenproteinen der Zelle. Dies können Rezeptoren oder andere zelluläre Faktoren sein (Abbildung 2 (1)). Anschließend kommt es zur lateralen Diffusion des Virus-Rezeptor-Komplexes (2), welche eine Signaltransduktionskaskade (3) auslöst. Diese führt zur Internalisierung des Virus (4). Nach dem vesikulären Transport (5) werden die Viruspartikel zu zellulären Kompartimenten, wie Endosom, ER oder Caveosom transportiert und Konformationsumwandlungen in den viralen Oberflächenproteinen führen zur Fusion der viralen und zellulären Membranen (6). Dies ermöglicht die Freisetzung des Nukleokapsids in das Cytosol. Umhüllte Viren nutzen für diesen Vorgang die Membranfusion, wogegen nicht-umhüllte Viren durch Lyse oder Porenbildung in die Zelle eindringen. Nach gerichtetem intrazellulärem Transport entlang von Mikrotubulis (MTs) (7) findet der Import des viralen Genoms in den Zellkern statt (8), indem das Kapsid an den Nukleären Zellkernporenkomplex (NPC) bindet und das virale Genom freigesetzt wird (Abbildung 2 (9)). Die Freisetzung des viralen Genoms kann auch im Cytosol und assoziiert mit intrazellulären Membranen stattfinden.
Das am intensivsten untersuchte Virus für den Clathrin-unabhängigen, Caveolin-/Raft-abhängigen Weg ist das SV40-Virus. SV40 ist ein nicht-umhülltes Virus, des DNA als genetischen Informationsträger enthält [19,20,21]. Der Caveolae/Raft-abhängige Weg untergliedert sich in drei ähnliche Varianten (Abbildung 1 D-F). Zunächst wird die Mehrheit der internalisierten Viren zu einem pH-neutralen Kompartiment, dem Caveosom transportiert (Abbildung 1 D). Anschließend werden die virushaltigen Vesikel mit Hilfe der Mikrotubuli zum ER transportiert, wo die Freisetzung des Nukleokapsids stattfindet [8]. Auch Echo-1 und Coxsackie-B Viren nutzen diese Route [22,23]. Zusätzlich zu diesen Wegen gibt es immer mehr Hinweise auf einen Clathrin-unabhängigen Weg, der zum endosomalen System gerichtet ist (Abbildung 1 B). Dieser konnte sowohl für Arena- als auch für Influenzaviren beobachtet werden [14,24].
Die Infektivität ist von zwei Faktoren abhängig. Einerseits wird das Infektionsverhalten durch das Virus selbst und andererseits durch den infizierten Zelltyp bestimmt. Zur Untersuchung und Identifizierung des viralen Eintrittsweges werden u.a. Inhibitoren der Endozytose eingesetzt, um diesen Weg zu inhibieren. Wird die Zelle dennoch infiziert und kommt es zur Produktion von Viruspartikeln, so kann davon ausgegangen werden, dass eine Infektion unabhängig von der endozytotischen Route stattfindet. Die Substanzen, die eine Ansäuerung bestimmter Zellorganellen verhindern, werden als lysosomotrope Agenzien bezeichnet. Zur Identifizierung des viralen Eintrittsweges und zur Charakterisierung der anschließenden Fusion und Art der zellulären Membran wurden in dieser Arbeit die in Tabelle 2 zusammengefassten Substanzen verwendet. Neben den lysosomotropen Substanzen, die die Ansäuerung endozytotischer Vesikel auf verschiedene Weise verhindern, sind auch weitere Inhibitoren, die endosomale Proteasen hemmen oder Cholesterol-entziehende Reagenzien bekannt, die einen Einfluss auf die Infektivität bestimmter Viren haben.
Wie bereits erläutert, existieren für Hüllviren zwei Hauptwege des viralen Eintritts: (1) Der endosomale/endozytotische Weg und (2) der nicht-endosomale Weg [55,56]. Es existieren auch Viren, die beide Wege nutzen können. Das Japanische Encephalitis Virus (JEV) kann sowohl mit der Plasmamembran fusionieren, als auch durch endozytotische Aufnahme in die Zelle gelangen [57]. In allen Fällen ist es für die Freisetzung des viralen Genoms wichtig, dass virale und zelluläre Membran fusionieren [58].
Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) oder Filipin III führen zur Cholesterolverarmung der Plasmamembran: (1) MβCD extrahiert Cholesterol aus der Plasmamembran und (2) Filipin III bindet es und verbleibt in der Membran (Abbildung 3 D). Für MHV und andere umhüllte Viren konnte bereits ein wesentlicher Einfluss von Cholesterol auf den Eintritt gezeigt werden [52,54,61]. In neuesten Untersuchungen wurde der Einfluss endosomaler Proteasen auf die Fusion von viraler und endosomaler Membran von SARS-CoV, MHV-2 (Coronaviren) und Ebolavirus (EboV), gezeigt [4,5,6]. In diesen Experimenten wurden unter anderem Proteaseinhibitoren wie Leupeptin und E-64 verwendet (Abbildung 3 E), die die Cysteinproteasen Cathepsin L und B im endosomalen Lumen hemmen.
Für die zielgerichtete Einschleusung des viralen Genoms ist es für umhüllte Viren wichtig mit der Membran der Wirtszelle zu fusionieren. In jedem Fall sind einzelne oder ein Komplex viraler Oberflächenproteine für diesen Fusionsprozess verantwortlich. Virale Proteine unterscheiden sich grundlegend in ihrem Aktivierungsmodus und ihrer Struktur. Durch einen Auslöser wird das in der metastabilen Konformation vorliegende virale Fusionsprotein in einen Zustand versetzt, der es erlaubt über das exponierte Fusionspeptid (FP) in die Zielmembran einzudringen. Mehrere nachfolgende Konformationsumwandlungen im viralen Fusionsprotein führen zur Annäherung beider Membranen. Zunächst erfolgt eine lokale Hemifusion und die anschließende Bildung und Vergrößerung der Fusionspore ermöglicht die vollständige Verschmelzung beider Membranen. Eine Zusammenfassung über die Vielfalt viraler Fusionsproteine gibt Tabelle 3 [62]. Für Viren wie HIV-1 oder das Sendaivirus, die den nicht-endosomalen Weg nutzen [63,64] wird die Konformationsumwandlung durch Interaktion mit dem entsprechenden zellulären Rezeptor bei neutralem pH-Wert direkt an der Plasmamembran ausgelöst. Andere Viren, wie die Orthomyxoviren, zu denen das Influenzavirus A zählt, werden von den Zellen über den endosomalen Weg aufgenommen. In diesem Fall wird das endosomale Lumen durch die Aktivität einer ATP-hydrolysierenden Protonenpumpe (V-Typ ATPase) angesäuert [40] und dadurch eine Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein ausgelöst, was zur Vermittlung der Fusion von viraler und endosomaler Membran führt. Kürzlich wurde für das aviane Sarkoma-Leukosis Virus (ASLV) ein weiterer Mechanismus für die Auslösung der Konformationsumwandlung entdeckt. Die Initiierung der Fusion benötigt zunächst die Interaktion des viralen Proteins mit dem zellulären Rezeptor und erst die anschließende pH-Erniedrigung im endosomalen Lumen führt zur Konformationsumwandlung des Fusionsproteins und somit zur Fusion von viraler und zellulärer Membran [7,62].
Alle bekannten viralen Fusionsproteine bestehen aus einer großen extrazellulären Ektodomäne (Ekto), einer Transmembrandomäne (TM) und einer kurzen cytoplasmatischen Domäne (CT). Virale Fusionsproteine werden basierend auf den strukturellen Eigenschaften der Postfusionskonformation in drei Klassen I-III gegliedert [65,66,67]. Fusionsproteine der Klasse I werden als Vorläufer synthetisiert, die durch Proteasen der Wirtszelle in zwei Untereinheiten gespalten werden. Teilweise bleiben diese wie im Fall des Hämagglutinins (HA) des Influenzavirus kovalent über Disulfidbrücken oder wie im Fall des Env-Proteins von HIV durch nicht-kovalente Interaktion miteinander assoziiert. Die proteolytische Spaltung des viralen Fusionsproteins ist ein kritischer Punkt, denn hier wird der metastabile Zustand des Proteins generiert [68]. Sowohl im metastabilen als auch im fusionsaktiven Zustand bilden Fusionsproteine der Klasse I Trimere aus. Die fusionsaktiven Untereinheiten bilden eine „Hairpin“-Konformation, die aus einem zentralen α-helikalen „Coiled-Coil“ besteht, welches aus den „Heptad-Repeat“ (HR)-Sequenzen HR1 und HR2 gebildet wird [69]. Die endgültige Form niedrigster potentieller Energie enthalten „Sechs-Helix-Bündel“ (6HB) [70], die eine relativ lange (65-115 Å) zentrale „Coiled-Coil“ Struktur aufweisen. Das antiparallele „Sechs-Helix-Bündel“ findet man außerdem bei Fusionsproteinen anderer Hüllviren wie dem Retrovirus HIV-1, dem Filovirus Ebola und dem Paramyxovirus SV5 [63,71,72,73,74,75]. Es stellt somit eine hochkonservierte Struktur dar. Die fusionsaktive Struktur besteht bei Klasse II-Proteinen aus β-Faltblättern [69,76,77]. Die strukturelle Umlagerung von der Prä- in eine Postfusionskonformation resultiert immer in einer stabilen „Hairpin“-Konformation, die es der zellulären und viralen Membran ermöglicht durch Annäherung von Transmembrandomäne und Fusionspeptid zu verschmelzen. In neuesten Studien konnte eine dritte Klasse viraler Fusionsproteine identifiziert werden. Zu dieser gehören die viralen Glykoproteine G von VSV und gB des Herpes Simplex Virus (HSV) [78,79]. Diese Proteine zeichnen sich durch die Bildung einer trimeren „Hairpin“-Struktur aus, die zwei strukturelle Elemente aufweist: Einen (i) α-helikalen trimeren Kern und (ii) zusätzlich zwei Fusionsschlaufen, die am Ende der β-Faltblätter lokalisiert sind (Tabelle 4). Detaillierte Eigenschaften der viralen Fusionsproteine der Klasse I und II wurden in Tabelle 4 zusammengestellt.
Die Struktur von Fusionsproteinen der Klasse II unterscheidet sich deutlich von denen der Klasse I. Ein sehr gut untersuchtes Beispiel ist das Glykoprotein (E) des Tick-Borne-Encephalitis Virus (TBEV). Während der Synthese bilden das E-Protein und das Membranglykoprotein prM Heterodimere. Während der Virusreifung spaltet eine Wirtszellprotease prM, was in der Reorganisation des Proteins auf der Oberfläche des Virus resultiert [80]. Nach Spaltung von prM liegt E als metastabiles Homodimer vor. Die Ektodomänen des Proteins orientieren sich antiparallel. Im Unterschied zu den Trimeren der Klasse I Proteine, liegt die Ektodomäne des E-Proteins parallel zur viralen Membran vor. Das E-Protein von TBEV besteht zum Großteil aus β-Faltblättern [66,81]. Ähnliches gilt für die Struktur des Klasse II Spikeproteins des Semlikiforestvirus (SFV). Im Fall des S-Proteins von SFV besteht das metastabile Oligomer aus einem Heterodimer aus zwei membranverankerten Proteinen E1 und E2 mit einem assoziierten dritten Protein E3 [82].
Die pH-neutrale, fusionsinaktive Konformation des HA entspricht dem metastabilen Zustand (Abbildung 4 A). Der Hauptteil der benötigten Energie wird schon bei der Faltung des Proteins generiert [88]. Wie bereits erwähnt werden Influenzaviren nach der Bindung an die Wirtszelle über Endozytose aufgenommen. Während der Reifung der Endosomen kommt es durch die Aktivität von Protonenpumpen zur pH-Erniedrigung. Im späten Endosom liegt der pH-Wert bei etwa 5.5, was für die Induktion der Konformationsumwandlung des HA-Proteins ausreicht. Die Protonierung schwächt die Wechselwirkung zwischen den HA1-Untereinheiten des Trimers [89]. Dadurch kommt es zur Reorganisation der HA1-Domänen, die für weitere Strukturänderungen wichtig ist [89,90,91,92,93]. Durch den so genannten „spring-loaded“-Mechanismus trennen sich die globulären Kopfdomänen und geben HA2 frei, das durch HA1 klammerartig in einem metastabilen Zustand gehalten wird (Abbildung 4 A). Das Fusionspeptid am Ende der verlängerten dreisträngigen „Coiled-Coil“-Region wird exponiert (Abbildung 4 B). Es kann mit der Zielmembran interagieren und in diese insertieren. Durch Umlagerung von der Helix- zur Loop-Konformation bildet sich eine verkürzte Helix aus (Abbildung 4 C), die es der verlängerten C-terminalen Domäne ermöglicht zu „flippen“ und sich antiparallel zur zentralen „Coiled-Coil“-Einheit auszurichten. Durch Verkürzung der gesamten Struktur kommen Fusionspeptid und Transmembrandomäne in unmittelbare Nähe und eine Annäherung beider Membranen kann erfolgen (Abbildung 4 D).
Die Aktivierung der pH-neutralen Fusionsproteine erfolgt über die Interaktion mit einem Rezeptor/Rezeptorenkomplex auf der Oberfläche der Zielzellen [13]. Viren, die unter neutralen Bedingungen fusionieren können, verschmelzen direkt mit der Plasmamembran der Zielzelle oder mit pH-neutralen intrazellulären Kompartimenten, wie dem Caveosom [56]. Auch für Viren, die eigentlich bei neutralem pH-Wert fusionieren ist es teilweise möglich, dass eine Fusionsaktivierung durch niedrigen pH-Wert ausgelöst werden kann [95]. Die Fusion bei neutralem pH weist im Vergleich zur Aktivierung bei niedrigem pH eine deutliche Temperaturgrenze auf. Bei Temperaturen unter 20°C (T<20°C) findet fast keine Fusion mehr statt. Das Env-Protein des HIV gehört zur Klasse I der Fusionsproteine. Es wird wie das HA des Influenzavirus als Vorläuferprotein synthetisiert und während der Maturierung in gp120 und gp41 gespalten. Die native/metastabile Konformation des Env-Proteins besteht aus Trimeren, die ihrerseits aus Heterodimeren von gp120, der rezeptorbindenden Domäne, und gp41, der Fusionsdomäne, gebildet werden. Die Bindung des CD4-Rezeptors führt zu einer Konformationsumwandlung, die es ermöglicht den Co-Rezeptor zu binden. Nach dessen Bindung es zu weiteren Konformationsumwandlungen im Env-Protein kommt [96]. Der erste Schritt nach Bindung des Rezeptor-Co-Rezeptor-Komplexes durch gp120 ist die Dissoziation dieser Domäne. Dadurch werden die Fusionspeptide exponiert und können in die Zielmembran eintauchen. Ein Cluster mehrerer Env-Proteine in dieser Konformation bildet die Fusionsstelle aus. Nach weiteren Konformationsumwandlungen innerhalb des Proteins kommt es zur Ausbildung der „Sechs-Helix-Bündel“-Struktur und zur Annäherung beider Membranen, die in der Hemifusion und der Ausbildung der Fusionspore mündet. Nach Ausbildung der Fusionspore und Porenweitung kommt es zur Entlassung des viralen Nukleokapsids. Der Fusionsmechanismus des Env-Proteins ist dem des HA-Proteins sehr ähnlich. Lediglich der Auslöser der Konformationsumwandlung im viralen Protein ist unterschiedlich. Folgende allgemeingültige Eigenschaften des Fusionsmechanismus gelten für Fusionsproteine der Klasse I: (1) Umwandlung des metastabilen in einen aktivierten Zustand. (2) Exposition und Umlagerung des Fusionspeptids zur Bindung der Zielmembran. (3) Rekrutierung mehrerer aktivierter Fusionsproteine zu einer Fusionsstelle [97,98,99,100]. (4) Die anschließenden Konformationsumwandlungen und die Ausbildung der „Sechs-Helix-Bündel“-Struktur ermöglichen die Annäherung der Fusionspeptide und Transmembrandomäne.
Virale Fusionsproteine der Klasse I enthalten generell ein Fusionspeptid. Es kann intern oder N-terminal lokalisiert sein (Tabelle 5) [102,103,104]. Beispiele für interne Fusionspeptide sind das gp37-Protein des ASLV und das GP2-Protein des Ebolavirus. Das Fusionspeptid kann sich ferner am oder nahe dem N-Terminus befinden. Dies ist z.B. bei gp41 von HIV und bei HA des Influenzavirus A der Fall [84,105,106,107]. Bestimmte Eigenschaften sind in allen viralen Fusionsproteinen hoch konserviert. Die wichtigsten Eigenschaften eines Fusionspeptids können wie folgt zusammengefasst werden [108]: (1) Fusionspeptide sind kurze hydrophobe Sequenzen eines Proteins und bestehen aus 16–26 Aminosäuren [109,110,111]. (2) Sie sind reich an hydrophoben Resten wie Alanin (A), Glycin (G) und Phenylalanin (F) [109,112,113]. (3) Ein kanonisches Tripeptid (YFG oder FXG) ist in Retroviren, Paramyxoviren und Filoviren hoch konserviert [112,114,115,116]. (4) Bei internen Fusionspeptiden ist die Anwesenheit eines Prolins (P) nahe oder im Zentrum der Sequenz kritisch für die Interaktion mit der Zielmembran [116,117,118,119]. (5) Die Tendenz zur Bildung von β-Faltblattstrukturen oder α-Helices. (6) Der Wert für das Hydrophobe Moment (ΔG) sollte zwischen 3 und 4 kcal/mol liegen. (7) Die Möglichkeit der HR-Sequenzen die „Coiled-Coil“-Konformation einzunehmen.
Anhand von Untersuchungen an synthetischen Fusionspeptiden konnten Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie sich Fusionspeptide in An- oder Abwesenheit von Membranen verhalten [120,121,126,127]. In Lösung liegen die Peptide ungeordnet vor, assoziieren sie jedoch mit Membranen, nehmen sie eine Sekundärkonformation in Form von α-helikalen oder β-Faltblattstrukturen ein. Die untersuchten N-terminalen Fusionspeptide nehmen nach Assoziation mit der Membran zudem einen bestimmten Winkel ein und tauchen ausschließlich in eine Membranhälfte ein. Mutationsstudien an Fusionspeptiden ergaben, dass die Fähigkeit der Einstellung eines bestimmten Winkels essentiell ist, um die Membranstruktur zu destabilisieren [121]. Bei niedrigem pH-Wert besteht das Fusionspeptid von HA aus einer N-terminalen Helix, einem Knick und einer kurzen C-terminalen Helix [ 128 ]. Beide Helices tauchen in das äußere Leaflet der Lipiddoppelschicht ein, der Knick dagegen verbleibt an der Oberfläche. Die Glycine im Inneren der Struktur interagieren mit der Lipidschicht, wogegen geladene Aminosäurereste an der Oberfläche verbleiben und mit der hydrophilen Umgebung wechselwirken können. Werden die Glycinreste mutiert, kommt es zu veränderten Eigenschaften des Proteins. Ersetzt man Glycin (G1) durch Valin (G→V) ist die Fusionseigenschaft völlig gehemmt. Wird Glycin (G1) gegen Serin (G→S) ausgetauscht, wird lediglich Hemifusion vermittelt oder es bilden sich kleine nicht expandierende Fusionsporen [123,129,130]. Simulationen des Fusionspeptids von HIV-1 und seiner Mutanten weisen ähnliche membranpenetrierende Orientierungen auf wie HA [131].
Die meisten internen Fusionspeptide weisen neben einer großen Zahl apolarer Reste ein konserviertes Prolin im oder nahe des Zentrums auf (Tabelle 5). Dieser ist meist hoch konserviert. Mutationsstudien am Prolinrest des Fusionspeptids des EnvA-Proteins von ASLV zeigen eine Stabilisierung der „β-Turn“ Struktur [117]. Für das Fusionspeptid von ASLV wird eine „β-Loop“-Struktur angenommen, die durch Disulfidbrücken stabilisiert wird. Ähnliches konnte für das interne Fusionspeptid des Ebolavirus gezeigt werden. Nach Mutation des konservierten zentralen Prolinrests und der flankierenden Cysteinreste konnte die Fusionseigenschaft vollständig inhibiert werden [119,132]. Für das interne Fusionspeptid des G-Proteins von VSV konnte nach Mutation des zentralen Prolinrests ebenfalls eine deutlich herabgesetzte Fusionsfähigkeit nachgewiesen werden [133]. Die Idee einer Loop-Struktur für fusionskompetente Peptide wurde auch für das Fusionspeptid von TBEV E und SFV E1 gezeigt [67,81,134]. In einigen Fällen kann auch die Kooperation mehrerer Loop-Strukturen zur Auslösung der Fusion führen. Interne Fusionspeptide enthalten wie N-terminale Peptide eine große Zahl an Glycin- und hydrophoben Resten (Tabelle 5). Tauscht man einen der Glycinreste des E1-Fusionspeptids von SFV gegen Alanin aus (G→A), kommt es zur Verschiebung des pH-Schwellenwertes zur Auslösung der Fusion. Die Mutation zur Asparaginsäure (G→D) hebt die Fusionseigenschaft vollständig auf [135]. Veränderungen der hydrophoben Aminosäurereste am Anfang, der Mitte oder am Ende des internen Fusionspeptids von ASLV EnvA zu geladenen Resten beeinträchtigt die Vermittlung der Fusion gravierend [103]. Ähnlich wichtig sind die Tryptophan- und Glycinreste im internen Fusionspeptid des GP-Proteins von EboV [119]. Am Ende der Loop-Struktur des E-Fusionspeptids von TBEV ist ein großer hydrophober Rest essentiell für die Vermittlung der Membranfusion [81]. Zusammenfassend ist zu bemerken, dass interne Fusionspeptide zur Vermittlung der Membranfusion eine oder mehrere Loop-Strukturen aufweisen und ein Gemisch aus hydrophoben und flexiblen Aminosäureresten benötigen.
Coronaviren gehören zur Ordnung der Nidovirales, Familie der Coronaviridae und zum Genus Coronavirus. Sie lösen ein weites Spektrum an Krankheiten in Mensch und Tier aus. Darunter betreffen die häufigsten Erkrankungen die respiratorischen und inneren Organe. Die Epithelzellen des Verdauungs- und respiratorischen Trakts stellen die wichtigsten Orte der Virusreplikation dar. Aufgrund ihrer phylogenetischen Eigenschaften lassen sie sich in zwei Untergruppen gliedern. In der vorliegenden Arbeit wurde einerseits das Maushepatitisvirus A59 (MHV-A59) und andererseits der humanpathogene Erreger des schweren akuten Atemwegssyndroms - Severe Acute Respiratory Syndrome - kurz SARS-CoV analysiert, um den Mechanismus der Verschmelzung von Virus- und Wirtszellmembran zu untersuchen. MHV-A59 löst sowohl enterische und respiratorische Infektionen, als auch Diarrhö, Hepatitis und akute sowie chronische Demyelenisierungserkrankungen des Zentralnervensystems in Mäusen aus (Siddell et al., 1983; Wege et al., 1982). Es wurde erstmalig im Jahr 1951 von Gledhill und Andrewes beschrieben [142] und 1961 von Manaker isoliert [143]. Es gehört zur Gruppe II. SARS-CoV wurde im Jahr 2003 erstmalig entdeckt und isoliert. Im Zusammenhang mit diesem insbesondere in Südostasien beheimateten Virus traten zwei große Infektionswellen in den Jahren 2002/2003 und 2004 auf, infolge derer fast 1000 Menschen erkrankten und starben. Eine genaue Definition der phylogenetischen Zugehörigkeit für SARS-CoV steht noch aus. Angenommen wird eine enge Verwandtschaft zur Gruppe II. Bis zur endgültigen Zuordnung wird dieses Virus in der eigenständigen Gruppe III geführt.
Coronaviren weisen mit 30 kb das größte RNA-Genom aller bekannten RNA-Viren auf. Das virale Genom besteht aus einzelsträngiger RNA in positiver Orientierung (ssRNA (+)) und besitzt wie zelluläre mRNAs eine 5’-Cap-Struktur sowie einen 3’-Poly-A Strang.
Die RNA bildet zusammen mit den basischen viralen Nukleokapsidproteinen ribonukleäre Partikel (RNPs) aus, die mit dem „Envelope“-Hüllprotein (E), dem Matrixprotein (M) und darüber mit der viralen Hüllmembran assoziiert vorliegen (Abbildung 5 ). Die Strukturproteine der Coronaviren sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Die Virushülle besteht aus Lipiden der Wirtszellmembran und unterschiedlichen viralen Proteinen. Coronaviren besitzen zwei Arten membranverankerter Glykoproteine: (a) das Spikeprotein (S) und (b) die Hämagglutininesterase (HE) (Tabelle 6 und Abbildung 5 B). Die Hämagglutininesterase wird nicht in allen Coronaviren exprimiert. Das S-Protein bildet peplomere Strukturen, die weit aus der Hüllmembran des Virus herausragen und im Elektronenmikroskop deutlich sichtbar sind (Abbildung 5 A und C).
Die Infektion der Wirtszelle erfolgt bei Coronaviren in mehreren Schritten (Abbildung 6). Im ersten Schritt binden die Viren an die Zielzelle. Dies geschieht über spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der Zelle (Abbildung 6 (1)). Die S1-Untereinheit des S-Proteins ist verantwortlich für die Interaktion mit dem Rezeptor, wogegen die S2-Untereinheit fusionsaktive Eigenschaften besitzt. Anschließend erfolgt der Eintritt in die Zelle. Es ist noch ungeklärt wie Coronaviren in die Wirtszelle aufgenommen werden. Nach Freisetzung des viralen RNA-Genoms in die Wirtszelle (Abbildung 6 (2)) findet die Replikation und Transkription statt (Abbildung 6 (3)). Mit Hilfe der Translationsmaschienerie der Wirtszelle werden die überhängenden offenen Leseraster (ORF1a und ORF1b) durch den so genannten „ribosomalen Frame-Shift“-Mechanismus in ein einziges Polyprotein translatiert. Viruskodierte Proteasen spalten das Polyprotein in einzelne Fragmente, so dass sich der virale Replikationsapparat ausbilden kann. Dieser synthetisiert anschließend die genomische virale Volllängen-RNA in Negativstrangorientierung (ssRNA (-)). Parallel wird durch die diskontinuierliche Transkriptionsstrategie ein geschützter Pool subgenomischer RNAs in Negativstrangorientierung generiert. Diese RNAs dienen später als Matrize für die Synthese der mRNAs in Positivstrangrichtung (Abbildung 6 (3)). Die Nukleokapsidproteine und die genomische RNA (ssRNA (+)) assemblieren im Cytoplasma zum helikalen Nukleokapsid (Abbildung 6 (4)). Die M-, E- und S-Proteine werden durch das ER zum Golgi-Apparat transportiert, in dem das „Budding“ stattfindet. Das N-Protein interagiert mit dem M-Protein, um die Assemblierung der Viruspartikel zu initiieren.
MHV-A59 bindet über das S-Protein an den zellulären CEACAM1a-Rezeptor. Der Eintritt des Virus ist mit Rafts assoziiert und erfolgt Cholesterol-abhängig. Obwohl die Cholesterolverarmung der Zellen keinen Einfluss auf die Virusbindung hat, weist sie einen starken inhibitorischen Effekt auf die Infektivität durch MHV auf [52,54]. Bis heute ist noch nicht bekannt, welcher der beiden Wege des viralen Eintritts vom Coronavirus MHV-A59 genutzt wird. Es gibt Hinweise auf beide Wege [28,30,145]. Holmes et al. [146] konnten beobachten, dass die Fusion von MHV mit der Zielzelle allein durch Rezeptorbindung ausgelöst werden kann, was eine Initiierung der Konformationsumwandlung im S-Protein durch Rezeptorinteraktion bei neutralem pH-Wert nahe legt. Neueste Studien sprechen dem N-terminalen Bereich des CECAM1a-Rezeptors eine Hauptfunktion bei der Initiierung der Konformationsumwandlung im S-Protein zu [147,148,149,150]. Frühere Untersuchungen zeigen zudem, dass die S-Protein-vermittelte Zell-Zell-Fusion bei neutralem pH stattfinden kann. Dies geschieht nach Infektion mit MHV-A59 und führt zur Synzytienbildung. S-Proteine, die nicht in Viruspartikel sortiert werden, werden zur Zelloberfläche transportiert und können dort die Fusion zwischen den Zellen vermitteln. Einige Gruppen finden keinen oder nur einen geringen Einfluss lysosomotroper Substanzen auf die Infektivität von Mausfibroblastenzellen durch MHV-A59 [5,32,48,151]. Andere Untersuchungen belegen dagegen, dass die Infektion von MHV durch Behandlung der Wirtszelle mit lysosomotropen Substanzen beeinträchtigt werden kann [30,152,153]. Kryzystyniak et al. berichten für das Infektionsverhalten von MHV-3 eine Sensitivität gegenüber lysosomotropen Substanzen [153]. MHV-JHM kann in Abhängigkeit vom Zelltyp sowohl den endosomalen, als auch den nicht-endosomalen Weg nutzen [28,150].
Für die Bindung und die anschließende Vermittlung der Fusion von viraler und zellulärer Membran ist bei Coronaviren das S-Protein verantwortlich. Es gehört zur Klasse I viraler Fusionsproteine [154], ist als Homotrimer organisiert und über die Transmembrandomäne in der viralen Hüllmembran verankert (Abbildung 7). Es besitzt ein Molekulargewicht von 180-220 kDa je Monomer.
Die S2-Untereinheit beinhaltet die Transmembrandomäne, das Fusionspeptid und die HR-Sequenzen HR1 und HR2 (Abbildung 7 B und E). HR1 und HR2-Domänen bilden den Fusionskern des S-Proteins und organisieren sich als „Coiled-Coil“ (Abbildung 7 D). Sie sind denen anderer Coronaviren [154,159,160] und anderer Fusionsproteine der Klasse I, wie dem HA des Influenzavirus [69], dem gp41 des HIV-1 [75] und dem Fusionsprotein der Paramyxoviren [161] sehr ähnlich. Für SARS-CoV konnte gezeigt werden, dass die Reste 916-950 von HR1 und die Reste 1151- 1185 von HR2 miteinander interagieren [162]. Im linearen Schema des viralen S-Proteins wird deutlich, wie ähnlich die S-Proteine bei Coronaviren der verschiedenen Familien aufgebaut sind (Abbildung 7 E). Das Gen des S-Proteins ist über alle drei Gruppen der Coronaviren hoch konserviert und es wird angenommen, dass für alle Gruppen ein ähnlicher Fusionsmechanismus existiert, der dem allgemeinen Fusionsmechanismus für virale Proteine der Klasse I entspricht [159]. Neben der Aufklärung der Kristallstruktur des Fusionskerns („Coiled-Coil“ aus HR1 und HR2) von SARS-CoV und MHV [159,160,163,164] konnte kürzlich eine kryoelektronenmikroskopische 3D-Rekonstruktion des SARS-Virus Partikels angefertigt werden (Abbildung 7 A-D) [165]. In neuesten kristallographischen Studien gelang die Charakterisierung der Interaktion des ACE2-Rezeptors mit der Rezeptorbindungsdomäne des S-Proteins (Abbildung 7 C und D) [165,166]. Die durchschnittliche Anzahl der S-Proteine pro SARS-CoV liegt bei 65 (Abbildung 7 A). Diese Zahl kommt der durch biochemische Studien berechneten von 66.7 sehr nahe [167]. In aktuellen Studien zur Fusion von SARS-CoV wurde sowohl ein Einfluss des pH-Werts [59,168,169] als auch die Interaktion mit einem entsprechenden Rezeptor für die Auslösung der Fusion verantwortlich gemacht [59,168,170,171].
Das S-Protein von MHV-A59 wird im ER der Wirtszelle synthetisiert und oligomerisiert zu Trimeren. Ein Teil des S-Proteins wird zur Zelloberfläche transportiert, wo es abhängig vom Zelltyp zur Zell-Zell-Fusion und Ausbildung von Synzytien kommen kann. Im Viruspartikel selbst besteht das 1,324 Aminosäuren (AS) lange S-Protein (Abbildung 7 E) aus der N-terminalen Ektodomäne (1,263 AS), die stark glykosyliert ist, der hydrophoben Transmembrandomäne (29 AS) und einer kurzen hydrophilen C-terminalen intraviralen Domäne (32 AS). Im Zuge der Proteinreifung wird das S-Protein im Golgi-Apparat von einer zelleigenen Furin-ähnlichen Protease in S1- und S2-Untereinheit gespalten [151,152]. Die Untereinheiten S1 und S2 bleiben nichtkovalent verbunden. Die S1-Untereinheit ist für die CEACAM1a-Rezeptorbindung und die S2-Untereinheit für die Auslösung der Fusionsreaktion [175] verantwortlich. Neben der Transmembran- und C-terminalen Domäne beinhaltet die S2-Untereinheit das Fusionspeptid und die HR1- und HR2-Sequenzen. Diese bilden wie andere virale Fusionsproteine der Klasse I die „Coiled-Coil“ Struktur aus [154,159,163]. Es gibt Hinweise auf verschiedene Auslöser der Konformationsumwandlung im S-Protein von MHV-A59. Detaillierte Modelle der S-Protein-vermittelten Fusionsreaktion von MHV-A59 existieren noch nicht.
Für Coronaviren wird vermutet, dass die S2-Untereinheit das Fusionspeptid beinhaltet. Die S2-Untereinheit besitzt folgende charakteristische strukturelle Eigenschaften [87,102,105,112]: (i) ein Fusionspeptid [176,177], (ii) zwei längere α-Helices, typischerweise 4,3–hydrophobe HR-Sequenzen [154,159] und (iii) eine Ansammlung aromatischer Aminosäuren proximal zur (iv) hydrophoben Transmembrandomäne. Vermutlich reicht allein die Insertion der Fusionspeptide in die Zielmembran aus, um eine Destabilisierung dieser zu induzieren und die anschließende Fusion auszulösen [116,178,179,180]. Aufgrund ihrer starken Neigung mit Membranen zu interagieren, ist es möglich hydrophobe Proteinsequenzen, wie Fusionspeptide, über die Hydrophobizitätsskala von Wimley und White (WWIH) zu identifizieren [181].
Zur Identifizierung des Infektionsweges von MHV-A59 sollte der Effekt inhibitorischer und lysosomotroper Substanzen, die die Endozytose hemmen oder die Ansäuerung zellulärer Organellen verhindern, getestet werden. Die vermeintliche Rolle endosomaler Cysteinproteasen bei der Auslösung der Fusion sollte für MHV-A59 untersucht werden. Cholesterolreiche Membrandomänen (Rafts) scheinen beim Eintritt von MHV-A59 eine Rolle zu spielen. Dazu werden Cholesterol-bindende/-komplexierende Substanzen und ihr Effekt auf die Infektivität von MHV-A59 getestet. Epifluoreszenz- und konfokalmikroskopische Untersuchungen zur Virus-Zell- und Zell-Zell-Fusion sollen Aufschluss über den Verlauf der Fusion geben. In biophysikalischen Messungen sollen die Bedingungen einer effektiven Fusion charakterisiert werden. Zum besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem S-Protein und dessen zellulären Rezeptor sowie zur Aufklärung der verschiedenen Struktureigenschaften und Konformationen sollten in Zusammenarbeit mit K.Ludwig und C.Böttcher von der FU-Berlin die 3D-Strukturen des S-Proteins und intakter MHV-A59 Partikel erstmalig elektronen- und kryoelektronenmikroskopisch aufgeklärt werden.
Die Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59 soll im abschließenden Teil der Arbeit erfolgen, da Fusionspeptide im Verlauf des Fusionsprozesses eine essentielle Rolle übernehmen. Durch die Erstellung von Hydrophobizitätsplots, Sequenzabgleichen mit bekannten Fusionspeptiden anderer Viren und nach Analyse der Sekundärstrukturen definierter Fusionspeptidkandidaten soll eine Auswahl an Fusionspeptiden ermittelt bzw. Vorhersage gegeben werden, die die Basis für zukünftige experimentelle Untersuchungen bilden sollen.
Alle verwendeten Chemikalien stammen, soweit nicht anders angegeben, von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland) oder Roche (Mannheim, Deutschland).
Für die Zellkultur wurde DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) von Gibco Invitrogen Corporation (Karlsruhe, Deutschland) mit oder ohne Zusatz von unterschiedlichen Mengen an fetalem Kälberserum (FCS; Invitrogen Corporation) verwendet. Der Waschpuffer HANKs-Salts wurde von der Biochrom KG (Berlin, Deutschland) bezogen. Zum Ablösen der Zellen wurde Trypsin (50 µg/ml)/EDTA (20 µg/ml)-Lösung (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) verwendet. Die Antibiotika wurden von den Firmen Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, Deutschland), Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) und Biochrom KG (Berlin, Deutschland) bezogen.
Die Transfektionslösungen Lipofectin® (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), PolyFect® (Qiagen, Hilden, Deutschland) und DreamFect™ (OZ Biosciences, Marseille, Frankreich) wurden für die transiente Transfektion eukaryotischer Zellen verwendet.
Zur Aufreinigung der Proteine wurden NiNTA-Agarose Beads der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) und Protein-G-Sepharose Beads der Firma GE Healthcare (München, Deutschland) verwendet.
Humane Erythrozyten (Charité, Berlin, Deutschland)
Eukaryotische Zellen
Je nach Zelltyp erreichen eukaryotische Zellen in Kultur bei 90-95% ihre Konfluenz und müssen umgesetzt werden, da sie sonst absterben. Zur Kultivierung werden die Zellen von der Zellkulturschale gelöst, vereinzelt, verdünnt und ausplattiert. Je nach Zelltyp und Wachstumsbedingungen müssen bestimmte Verdünnungen eingehalten werden.
30 Minuten vorher werden Medien sowie Puffer und Trypsin/EDTA auf 37°C erwärmt.
Kontrolle der Zellen und Zelldichte unter dem Lichtmikroskop
Absaugen des Mediums
2x mit HANKs-Puffer oder PBS waschen
Trypsin (50 μg/ml)/EDTA zugeben und für 5 Minuten bei 37°C/5% CO2 inkubieren
Aufnehmen der abgelösten Zellen in Medium
Verdünnung der Zellsuspension
Ausplattieren der Zellen in der gewünschten Verdünnung
Zum Einfrieren werden die in Medium aufgenommenen Zellen bei 800 rpm (250 x g) und 4°C zentrifugiert und in eiskaltem Wachstumsmedium mit 5-10% DMSO aufgenommen. Aliquots werden in gekühlte Kryoröhrchen überführt, für 24 Stunden bei -80°C eingefroren und anschließend in flüssigen Stickstoff (N2) überführt.
Zum Auftauen der Zellen werden die Kryoröhrchen zunächst im Eisbad inkubiert und anschließend im Wasserbad bei 37°C vollständig aufgetaut. Um Kontaminationen zu vermeiden, wird das Röhrchen mit 70% EtOH oder Isopropanol gesäubert. Die Zellen werden in frisches Wachstumsmedium überführt, zentrifugiert, erneut in frischem Medium aufgenommen und ausplattiert.
Mit sterilen Zahnstochern/Pipettenspitzen werden einzelne Kolonien von der Platte gepickt und zunächst in 5 ml LB-Medium (mit Antibiotika) überführt. Die Inkubation bei 37°C erfolgt für mind. 8 Stunden und 160 rpm bis eine deutliche Trübung des Mediums zu erkennen ist. Die Vorkultur wird je nach Ansatz für eine Mini- oder Maxi-DNA-Präparation weiter verwendet. Für eine Maxi-Präparation wird ein Teil der Vorkultur in 200-500 ml LB-Medium (mit Antibiotikum) überführt und ü.N. bei 37°C schüttelnd inkubiert.
Zur Aufbewahrung transformierter Bakterien wird ein Glycerol- oder DMSO-Stock angelegt. Dazu werden 900 μl einer Vorkultur entweder mit 100 μl Glycerol (96%) oder 100 μl DMSO (100%) versetzt und in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Aufbewahrung erfolgt bei -80°C.
Kompetente Bakterien (Tabelle 9) (100 μl) werden mit 20 ng – 1 μg zirkulärer Plasmid-DNA für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach werden sie bei 42°C für 45 Sekunden einem „Hitzeschock“ ausgesetzt. Anschließend wird der Ansatz in 900 μl LB-Medium (ohne Antibiotika) überführt und für 1 Stunde bei 160 rpm und 37°C schüttelnd inkubiert. Die Vorkultur wird abzentrifugiert, das Bakterienpellet in ca. 50 μl resuspendiert und auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert.
Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Leervektoren wurden in Tabelle 10 zusammengestellt. Die Plasmide und der Leervektor pCDNA3.1 myc/His A weisen jeweils eine Ampicillin-Resistenz auf, wogegen der Vektor EYFP-N1 eine Kanamycin-Resistenz besitzt.
Zur Isolierung kleiner Mengen Plasmid-DNA werden kleine Säulen der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) verwendet. Die Präparation erfolgt nach Herstellerangaben. Aus 1-1.5 ml Bakterienkultur können 1-15 μg reiner Plasmid-DNA isoliert werden.
Zur Isolierung großer Mengen Plasmid-DNA werden Säulen der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) oder Marligen Biosciences Inc. (Ijamsville, MD, USA) verwendet. Die Präparation erfolgt nach Herstellerangaben. Nach Aufreinigung von 250-500 ml einer Übernachtkultur können 500-800 μg Plasmid-DNA isoliert werden.
Die aufgereinigte Plasmid-DNA mit dem entsprechenden Gen wird zunächst mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut. Der Zielvektor wird ebenfalls mit diesen Enzymen inkubiert. Zur Überprüfung des Restriktionsverdaus und für die anschließende Gelextraktion wird ein 1% Agarosegel angefertigt. Das Insert und der Zielvektor wurden über die Gelextraktionsreaktion und anschließende Säulenaufreinigung (Qiagen, Hilden, Deutschland) eluiert. Um die Effizienz der Ligation zu erhöhen, wird der Zielvektor anschließend mit der alkalischen Phosphatase (SAP) im entsprechenden Puffersystem nach Herstellerangaben dephosphoryliert. Anschließend erfolgt die Ligation mit dem „Rapid-DNA-Ligations-Kit“: Insert und dephosphorylierter Zielvektor werden nach Herstellangaben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend in kompetente Bakterien transformiert und ausplattiert. Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum werden ü.N. bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Zur Überprüfung der Klonierung werden am folgenden Tag mind. 10 Kolonien gepickt und jeweils 1-1.5 ml Kultur angeimpft. Zur Isolierung der DNA dient die Mini-DNA-Präparation. Die Größe der isolierten DNA wird über Agarosegelelektrophorese überprüft. Ein positiver Klon wird amplifiziert und mittels Restriktionsverdau und Agarosegelelktrophorese überprüft. Zudem wird die Expression des Proteins im eukaryotischen Zellsystem überprüft. Die gefärbten Gele werden mit der Desaga®-Videodokumentationsanlage digitalisiert und mit Hilfe der Desaga®-View Software ausgewertet.
Je nach Herstellerangaben werden zunächst DNA-Liposomen-Gemische angefertigt. Das Zellmedium ohne Zusätze wie Antibiotika oder FCS (D0-) wird jeweils mit DNA oder dem entsprechenden Transfektionsreagenz (Lipofectin®, PolyFect® oder DreamFect™) versetzt und das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Transfektion werden die Zellen 2x mit Wachstumsmedium gewaschen und anschließend für mindestens 4 Stunden mit dem DNA-Liposomen-Gemisch bei 5% CO2 und 37°C inkubiert. Nach 4 Stunden sollte die Plasmid-DNA in die Zelle aufgenommen worden sein. Steht das zu exprimierende Gen unter Kontrolle des T7-Promotors, werden die Zellen vor der Transfektion zusätzlich mit dem rekombinanten Vakziniavirus VTF7.3, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, infiziert. Nach Infektion der Zellen mit dem Virus kommt es zum Erliegen der zellulären Proteinsynthese, und es werden ausschließlich virale Gene und damit die T7-RNA-Polymerase exprimiert. Somit steht eine ausreichende Menge an T7-Polymerase zur effizienten Transkription des T7-Expressionsplasmids zur Verfügung. Nachteil dieses Systems ist, dass die Vakziniavirusinfektion zu einem starken cytopathischen Effekt und damit zum Zelltod führt. Eine dauerhafte Expression und längere Inkubation der Zellen ist also nicht möglich.
Die in Tabelle 12 aufgeführten Proteine werden als membranverankerte oder sezernierte Varianten im eukaryotischen Zellsystem exprimiert.
Die verkürzten Varianten des S-Proteins und ACE2-Rezeptors: pSecTag-2B S-Ekto und pCDNA3 ACE2-Ekto-C9 werden nach erfolgreicher Expression in HEK293T- und/oder VeroE6-Zellen in das Zellmedium sezerniert. Das proteinhaltige Medium wird von den Zellen abgenommen, sofort mit Proteaseinhibitoren versetzt und zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Zur Konzentrierung werden die Überstände mittels Centricon C-100 mit einem Cut-Off von 100 kDa für das S-Protein oder einem Cut-Off von 30 kDa für den ACE2-Rezeptor bei 1000 x g und 4°C für mehrere Runden jeweils 10 Minuten zentrifugiert, bis ein Endvolumen von ca. 1 ml erreicht ist.
In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene S-Proteinvarianten mit (His)6-Tag exprimiert. Die Ernte erfolgt wie beschrieben und die anschließende Aufreinigung wird entweder über NiNTA-Agarose Beads (Qiagen, Hilden, Deutschland) oder mittels Ni-HiTrap-Säulen (GE Healthcare, München, Deutschland) über die Äkta-Anlage (GE Healthcare, München, Deutschland) nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Elution der Proteine mit der entsprechenden Imidazolkonzentration (300-500 mM) werden die Proben für mindestens 16 h gegen Na-Acetatpuffer (150 mM NaCl, 20 mM Acetat, pH 7.4) dialysiert, um das Imidazol zu entfernen. Die Proteinproben werden ferner in C-100 Centricons (Millipore, Schwalbach, Deutschland) konzentriert und anschließend sofort für die Elektronenmikroskopie verwendet.
Zur Identifizierung der Proteine wird eine SDS-PAGE unter Verwendung des Minigel-Systems (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland) durchgeführt. Unter reduzierenden Bedingungen werden je 50 µl Probe mit je 12.5 µl Probenpuffer (0.5 M Tris, pH 6.8, 5 % SDS, 25 % Glycerol, 0.05 % Bromphenol blau, 25% β-Mercaptoethanol) versetzt und 5 min bei 96°C inkubiert. Unter nicht-reduzierenden/nativen Bedingungen werden je 50 μl Probe mit je 12.5 µl Probenpuffer (0.5 M Tris, pH 6.8, 25 % Glycerol, 0.05 % Bromphenol blau) versetzt und 5 min bei RT inkubiert. Bei nicht-reduzierenden Gelen enthalten die verwendeten Puffer oder Gele kein SDS. Pro Geltasche eines 10-12%igen Polyacrylamidgels werden jeweils 10-30 µl der entsprechenden Probenlösung aufgetragen. Die Proteinbanden werden mittels Coomassie- oder Silberfärbung visualisiert. Die digitale Dokumentation der gefärbten Gele erfolgt mit der Desaga®-Videodokumentationsanlage und mit Hilfe der Desaga®-View Software.
Für die Westernblotanalyse werden die Proteine zunächst ihrer Größe nach über ein reduzierendes SDS-Gel aufgetrennt. Das Blotten erfolgt nach Herstellerangaben des „ECL+ Western-Blotting Detection Kits“ wie folgt:
Transfer der aufgetrennten Proteine auf die Hybond ECL (PVDF) – Membran
Block der unspezifischen Bindungsstellen mit Blockingpuffer
Primärer Antikörper
HRP-gekoppelter Sekundärantikörper
ECL+ Detektionsreagenz
Exposition auf einen lichtempfindlichen ECL+ Film
Entwicklung des Films
Dokumentation
Zum Nachweis der Varianten von S- und ACE2-Rezeptorprotein werden die in der Tabelle 13 aufgeführten Antikörper benutzt. Als Sekundärantikörper wird der im „ECL+ Westernblotting-Detection Kit“ enthaltene polyklonale HRP-gekoppelte Antikörper verwendet.
MHV-A59 und MHV-S4 werden in 17Cl-1 Zellen gezüchtet [183]. Die 17Cl-1 Mausfibroblastenzellen werden in T175-Zellkulturflaschen in DMEM mit 10% FCS (D10) bis zur Konfluenz bei 5% CO2 und 37°C vermehrt und bei einer MOI von 10 PFU/Zelle des jeweiligen Virus inokuliert. Für die Aufzucht von MHV-A59 mit ungespaltenem S-Protein (MHV-A59 FI) werden die Zellen mit dem Furininhibitor (FI) Peptidyl-Chloromethylketon (dec-RVKR-cmk) bei einer Konzentration von 75 μM vorinkubiert und anschließend mit MHV-A59 bei einer MOI von 10 PFU/Zelle in der Anwesenheit des Inhibitors infiziert. Vor der Infektion wird das Wachstumsmedium abgenommen und die Zellschicht 2x mit DMEM 2%-FCS (D2) gewaschen. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C und regelmäßigem Schütteln der Zellkulturflaschen (all 10 Minuten) werden 20 ml Infektionsmedium (D2) zugegeben. Die inokulierten Zellen werden bei 37°C/5 % CO2 für 46-48 h inkubiert.
VSV wird auf BHK-21 Zellen gezüchtet. Die BHK-21 Zellen werden bis zur Konfluenz in T175-Zellkulturflaschen oder ∅ 15 cm Petrischalen in MEM mit 10% FCS (M10) angezüchtet und vermehrt. Für die Viruszucht werden die Zellen bei einer MOI von 0.1 PFU/Zelle in MEM mit 2% FCS-haltigem Medium (M2) infiziert und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden 20 ml M2 hinzugegeben und die inokulierten Zellen bei 37°C/5% CO2 für 16-24 h inkubiert.
Die Aufreinigung der verschiedenen MHV-Varianten: -A59, -S4 und -A59 FI erfolgt nach dem Protokoll von Sturman und Takemoto [183] mit einigen Modifikationen von Tsai et al. [184]. Das virushaltige Medium wird 46-48 h nach der Infektion (p.i.) von den Zellen abgenommen und sofort für 30 Minuten und 4°C im Beckman JA 25.5 Rotor (Beckman, Krefeld, Deutschland) bei 10,000 x g zentrifugiert, um Zelltrümmer und Nuklei zu entfernen. Zur Erstellung des Polyethylenglycol (PEG)-Präzipitats (PEG-Präzipitat) werden dem gereinigten Überstand anschließend 2.2% NaCl und 10% PEG-8000 (Promega, Mannheim, Deutschland) zugeführt. Dieser wird anschließend bei 4°C unter ständigem Rühren für 4 Stunden inkubiert und erneut bei 10,000 x g und 4°C zentrifugiert. Das virushaltige Pellet wird in BisTris-Puffer (150 mM NaCl, 25 mM BisTris, pH 6.5) aufgenommen, über einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten (30% und 50% (w/w)) geschichtet und für 16 Stunden in einem Beckman SW40 Ti Rotor über Nacht bei 4°C und 28,000 rpm (110,000 x g) in der Ultrazentrifuge (UZ) zentrifugiert. Die Virusbande an der Phasengrenze zwischen 30% und 50% Saccharose wird in BisTris-Puffer (pH 6.5) aufgenommen, aliquotiert und bei -80°C gelagert. Viren die 46-48 p.i. geerntet werden, besitzen einen Titer von 1-2 x 109 pfu/ml auf. Für die Experimente werden die Viren für mehrere Stunden bei 4°C gegen BisTris-Puffer pH 6.5 mit 5% Glycerol dialysiert, um die Saccharose zu entfernen. Dazu wird ein Dialyseschlauch mit einem MWCO von 12-14 kDa (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) verwendet.
Für die Isolierung des S-Proteins aus intakten Virionen müssen diese zunächst mit einem detergenzhaltigen Lysepuffer, der das nichtionische Detergenz NP-40 enthält, solubilisiert werden. Dazu werden 1 ml dialysierter Virussuspension mit dem NP40-Lysepuffer versetzt, so dass eine Endkonzentration von 1% NP40 erreicht wird. Die Solubilisierung der Viren erfolgt bei 4°C durch Inkubation bei 700 rpm für 30 Minuten. Die behandelten Viren werden anschließend über einen kontinuierlichen 15-50%igen Saccharosedichtegradienten geschichtet und bei 38,000 rpm (180,000 x g), 4°C für 18 h im SW60 zentrifugiert Um eine Aggregation der Proteine zu vermeiden, beinhaltet die Saccharoselösung stets 0.1% NP-40. Die einzelnen Fraktionen werden mittels des Gradientenfraktionators von oben abgenommen und in vorgekühlte Eppendorfröhrchen überführt. Die Refraktionsindizes der 20-50%igen Saccharoselösungen mit 0.1% NP-40 werden mit einem digitalen Bausch und Lomb Abbé Refraktometer bestimmt. Die Analyse der einzelnen Fraktionen erfolgt über SDS-PAGE. Die Proteinkonzentration nach der Methode von Bradford et al. [185] betrug 2-3 mg/ml. Die Phospholipidmenge wird nach der Methode von Böttcher et al. [186] bestimmt, nachdem die Lipide nach der Methode von Bligh and Dyer [187] aus den Virosomen extrahiert werden. Das Pellet wird in 1 ml BisTris-Puffer pH 6.5 aufgenommen. Für die kryoelektronenmikroskopische Analysen werden die S-Protein-Fraktionen erneut gegen BisTris-Puffer dialysiert und konzentriert.
Für die Herstellung der SUVs werden die Lipide zunächst in den aufgeführten Konzentrationen (Tabelle 14) als chloroformhaltige Lösungen in ein Reagenzglas überführt, das Lösungsmittel unter Stickstoffzufuhr abgedampft und nach Zugabe von 5 μl EtOH gevortext. Schließlich wird die Gesamtmenge von 1.5 μM Lipid mit 10 mol% DOGS-NTA Ni in 500 μl Na-Acetatpuffer (150 mM NaCl, 20 mM Na-Acetat Trihydrat, pH 7.4, entgast) aufgenommen und auf Eis für 20 Minuten im Branson Sonifier Model W250 (Carouge-Geneve, Genf, Schweiz) im Eisbad mit Ultraschall (Output 4) beschallt. Nach Zentrifugation (1,500 x g, 4°C, 10 min) werden die SUV erneut in Na-Acetatpuffer aufgenommen und sofort verwendet.
Ein Tropfen der vorinkubierten Präparatlösung wird auf ein mit Kohlelochfolie überspanntes Elektronenmikroskopie-Grid (200 Maschen,1 μm Lochdurchmesser, R1/4 Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Deutschland) gegeben, welches vorher mittels einer 60-sekündigen Plasmabehandlung bei 8 W in einer BALTEC MED 020 Anlage hydrophilisiert wurde. Die überschüssige Flüssigkeit wird mittels Filterpapier abgesaugt bis ein ultradünner Film der Probenlösung entstanden ist, der die Löcher des Karbonfilms überspannt. Die Proben werden über einen Guillotine-ähnlichen Mechanismus unmittelbar in flüssiges Ethan eingeschossen. Die Abkühlrate liegt dabei in der Größenordnung von 104 K/s, so dass es zu einem amorphen Gefrieren des Präparatwassers kommt („Vitrifizierung“). Die vitrifizierten Präparate werden mit Hilfe eines Gatan-Kryohalters (Model 626, Gatan Inc., Kalifornien, CA, USA) unter flüssigem Stickstoff in ein Philips CM12 Transmissions-Elektronenmikroskop (FEI Company, Oregon, OR, USA) überführt. Die Mikroskopie wird bei 94 K (-174°C) Probentemperatur unter Anwendung des “Low-Dose“-Protokolls des Mikroskops bei einer Primär-Vergrößerung von 58.300 x und einer Beschleunigungsspannung von 100 kV (LaB6 – Belichtung) durchgeführt. Der eingestellte Defokus beträgt 1.5 μm.
Ein Tropfen der vorinkubierten Probenlösung wird auf ein befilmtes Grid (hydrophilisierter Kohlefilm auf 400-maschigem Trägernetz) gegeben. Nach 30 Sekunden wird die überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapierstreifen abgesaugt und die kontrastverstärkende schwermetallhaltige Färbelösung (1% Phosphorwolframsäurelösung (PTA), pH 7.4) hinzu gegeben und nach 45 Sekunden wieder mit Filterpapier abgesaugt. Anschließend trocknet die Probe an der Luft. Mittels eines Standardhalters wird die getrocknete Probe in ein mit einer LaB6-Kathode bestücktes Elektronenmikroskop Philips CM12 (FEI Company, Oregon, OR, USA) transferiert. Die Bilder werden bei einem Defokus von 0,6 μm mit einer primären Vergrößerung von 58.300 x bei 100 kV (CS = 2 mm) aufgenommen.
Die elektronenmikroskopischen Negative werden mittels laseroptischer Diffraktion auf Astigmatismus und Drift überprüft. Optisch einwandfreie Negative werden mit einem „Heidelberg Primescan“-Trommelscanner (Heidelberger Druckmaschinen AG, Heidelberg, Deutschland) bei einer nominalen Pixelgröße von 0,68 Å digitalisiert, was einer Scanauflösung von 4 µm entspricht. An den eingescannten Abbildungen der MHV-A59-Virionen werden anschließend einzelne Trimere des S-Proteins interaktiv ausgewählt und aus den digitalisierten Negativen als 400x400 Pixel große Einzelbilder extrahiert. Diese Einzelbilder (ca. 2800 S-Protein-Trimere) werden nach dem Verfahren von Sander et al. hinsichtlich der Kontrastübertragunsfunktion korrigiert [132]. Aus Gründen der Recheneffizienz werden korrigierte Einzelbilder auf 1,37 Å/Pixel Auflösung reduziert. Alle Schritte der Bildverarbeitung erfolgen mit Hilfe der IMAGIC-5 Software (Image Science GmbH, Berlin, Deutschland) welche unter Linux auf einem Beowulf-Cluster [188]. Zur Berechnung der dreidimensionale Rekonstruktion der Struktur wird das "angular reconstitution"-Verfahren angewendet [189]. Dazu werden nach Filterung und Normierung der Einzelbilder die inzwischen fest etablierten Verfahren des „Multi-Referenz-Alignment“ [190], multivariate statistische Analyse und automatische hierarchische Klassifizierung [191] benutzt, um rauschreduzierte Summenbilder typischer Projektionsansichten des Proteins zu erhalten. Die Zuordnung der Raumwinkel („Eulerwinkel“) erfolgt unter Nutzung des „common line projection theorem" [189].
Zur Bestimmung des viralen Titers werden die Zellen am Vortag in 6-well Platten ausplattiert. Verschiedene Log-Virus-Verdünnungen werden in D2-Infektionsmedium erstellt. Nachdem die Zellen 2x mit D2-Medium gewaschen wurden, werden jeweils 0.5 ml der Viruslösung für 1 Stunde mit den Zellen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernung des virushaltigen Überstands werden die Zellen mit 0.75% Oxoid-Agarose-DMEM 2% FCS (Oxoid, Hampshire, UK) überschichtet und 24 – 48 h bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Zur Visualisierung der Plaques (PFU) erfolgt die Färbung der Zellen mit einer 3.3% Neutralrot-Lösung bei 37°C für 1 Stunde. Anschließend wird die Färbelösung entfernt und die Inkubation bei 31°C für 3 Stunden ermöglicht die Entfärbung der Plaques. Die gefärbten Platten werden mit der Desaga®-Videodokumentationsanlage (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) digitalisiert und die PFU mit Hilfe der Desaga®-View Software ausgezählt. Zur Bestimmung des viralen Titers wird folgende Formel (1) verwendet:
Für den Plaquereduktionsassay (PRA) werden die Zellen vor der Inokulation mit dem Virus für 30 min mit lysosomotropen Agenzien, endozytosehemmenden Substanzen, Proteaseinhibitoren, MβCD oder Filipin III behandelt. Tabelle 15 fasst die verwendeten Inhibitoren und Substanzen zusammen.
Zur Untersuchung der Fusionsaktivität des Coronavirus MHV-A59 wird der Fluoreszenzdequenching (FDQ)-Assay verwendet. 17Cl-1 Mausfibroblasten dienen als Zielzellen und werden mit fluoreszenzmarkierten Viren inkubiert. Der FDQ-Assay basiert auf der Umverteilung des lipidähnlichen Fluoreszenzmarker Octadecylrhodamin-B-chlorid (R18) der nach Fusion von viraler und zellulärer Membran ein Dequenching zur Folge hat, das zu einem Fluoreszenzanstieg führt.
Die Präparation der Erythrozytenghost wird nach der Methode von Dodge et al. [192] durchgeführt. Das Erythrozytenkonzentrat wird dreimal mit PBS gewaschen (2,000 x g, 10 min, 4°C) und in eiskaltem Hämolysepuffer I (5.8 mM NaH2 PO4/Na2HPO4) resuspendiert. Nach Inkubation für 20 min bei 4°C wird die Suspension 20 min bei 20,400 x g, 4°C, zentrifugiert, das Pellet in eiskaltem Hämolysepuffer I resuspendiert und für weitere 10 min bei 4°C inkubiert. Danach erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 20,400 x g und 4°C. Dieselbe Inkubation und anschließende Zentrifugation wird so oft wiederholt, bis die Erythrozytenghost farblos sind. Zum Schluss werden die Erythrozytenghost mit 70 ml kaltem PBS gewaschen (10 min, 20,400 x g, 4°C). Sie können nach Zusatz von 0.02% NaN3 bis zu zwei Wochen bei 4°C aufbewahrt werden.
Für den FDQ-Assay werden 17Cl-1 Zellen in T75-Zellkulturflaschen gezüchtet und geerntet (107 Zellen/ml). Fluoreszenzmarkierte MHV-A59 werden in eiskaltem PBS+ bei einer Konzentration von 3-5 pfu/Zelle zu den Zellen gegeben und 40 min bei 4°C leicht schüttelnd (200-300 rpm) inkubiert. Um die nicht gebundenen Viren zu entfernen, wird die Virus-Zell-Suspension zweimal mit PBS+ bei 300 x g gewaschen, und das Pellet in 300 µl PBS+ resuspendiert. 150 µl der Virus-Zell-Suspension werden zu 1.85 ml Na-Acetat-Puffer (150 mM Nach, 20 mM Na-Acetat Trihydrat, pH 7.4 und 37°C) in einer Quarzküvette gegeben, und die Änderung der Fluoreszenzintensität bei 4°C und 37°C bei entweder pH 7.4 oder 5.0 verfolgt [193]. Die Fusion wird mit dem Spektrofluorimeter (Aminco-Bowman, Urbana, IL, USA) bei einer Anregungswellenlänge von 560 nm, einer Emissionswellenlänge von 590 nm (cut-off Filter 570 nm, Zeitauflösung 1 sec) und einer Spaltbreite von 4 nm verfolgt. I 0 ist die Fluoreszenzintensität der gefärbten Viren gebunden an die Zielzellen zum Zeitpunkt t=0. Die zeitabhängige Fluoreszenzintensität I(t) wird für 30 min bei den benannten pH-Werten verfolgt. Um ein vollständiges Dequenching zu erreichen und das Fluoreszenzmaximum zu bestimmen, werden 0.2% Triton X-100 zugegeben. Das Ausmaß der Fusion (F) ist proportional zum Fluoreszenzmaximum (%) und wird definiert als [195] Formel (2):
Subkonfluente 17Cl-1 Zellen in 35 mm/14 mm2 Glassbodenschälchen (MaTek, Ashlands, MA, USA) werden mit fluoreszenzmarkierten MHV-A59 bei einer MOI von 5 – 10 pfu/Zelle für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Für weitere Experimente erfolgt die Inkubation der Zellen mit lysosomotropen Reagenzien, Proteaseinhibitoren oder Cholesterol-entziehenden Substanzen (Tabelle 15). Um ungebundenes Virus zu entfernen werden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend werden die Virus-Zell-Komplexe bei pH-Werten von 5.0 und 7.0 für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Ausbildung von Synzytien nach Infektion verschiedener Mauszelllinien mit MHV-A59 oder MHV-S4 wird 24 h p.i. mittels Phasenkontrsatmikroskopie analysiert. In zusätzlichen Experimenten werden die markierten Viren für 15 Minuten einem pH-Wert von 5.0 bei 37°C oder 4°C ausgesetzt, neutralisiert und das Fusionsverhalten bei pH 7.0 und 5.0 verfolgt. Alle Proben werden sofort über Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet. Die Bildaufnahmen erfolgen in jedem Fall mit Hilfe der MetaView Software (Universal Imaging, Buckinghamshire, UK). Die primäre Bildbearbeitung und -auswertung wird mit Hilfe der MetaMorph Software (Universal Imaging, Buckinghamshire, GB) durchgeführt, gefolgt von der Bearbeitung mit Adobe® Photoshop® und Adobe® Illustrator® (Adobe Systems GmbH, München, Germany).
Zusätzlich zu den epifluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen werden mit Hilfe des FluoView™ FV-1000 Konfokalmikroskops (Olympus, Hamburg, Deutschland) konfokalmikrokopische Analysen der Virus-Zell-Fusion durchgeführt. R18-markierte MHV-A59 werden mit dem 543 nm Laser angeregt und die Emission wird bei BP 590-655 detektiert. Für die Aufnahmen wird ein Öl-Immersions-Objektiv mit einer 60x Vergrößerung und einer numerischen Apertur (NA) von 1.35 (Olympus, Hamburg, Deutschland) verwendet. Alle Experimente werden, wenn nicht anders angemerkt bei 37°C durchgeführt. Die Auswertung der konfokalen Bilder erfolgt mittels der Olympus FluoView™ Software Version 1.4 a (Olympus, Hamburg, Deutschland).
HEK293T-Zellen werden am Vortag in 30 mm/14mm2 Glassbodenschälchen ausplattiert, am Folgetag mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert und mit VTF7.3 infiziert. Für die IFM werden die Zellen 2x mit PBS-BSA-Puffer gewaschen und anschließend mit dem entsprechenden Primärantikörper in PBS-BSA-Puffer (Tabelle 16) für mind. 2 Stunden inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS-BSA wird der entsprechende fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper (Tabelle 16) hinzu gegeben und für weitere 2 Stunden im Dunkeln mit den Zellen inkubiert. Die anschließende Fluoreszenzmikroskopie erfolgt bei Raumtemperatur mit dem Mikroskop Axiovert 100 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) unter Verwendung eines 40 x Objektivs (Apoplan, Leica Mikrosysteme, Bensheim, Deutschland). Die eingesetzten Fluorophore werden mit folgenden Einstellungen detektiert: Alexa Fluor 594 – 510-560 nm BP-Anregungsfilter/590 nm LP-Emissionsfilter, FITC (Fluoresceinisothiocyanat) – 450-490 nm Anregungsfilter/520 nm LP-Emissionsfilter. Die Aufnahme der Bilder erfolgt mittels der angeschlossenen gekühlten CCD-Kamera und der MetaView Software (Universal Imaging, Buckinghamshire, UK). Die fluoreszenzmikroskopischen Bilder werden wie beschrieben prozessiert und ausgewertet.
Für die Fusionsexperimente werden HEK293T-Zellen parallel mit der pCDNA3 S-Full (HEK293T-S) und dem pEYFP-N1-Plasmid (Tabelle 12) transfiziert und mit VTF7.3 infiziert. VeroE6 werden mit der pCDNA3 ACE2-Full (VeroE6-ACE2) transfiziert und ebenfalls mit VTF7.3 infiziert. Abgelöste VeroE6-Zellen (107 Zellen/ml) werden mit dem Membranmarker R18 markiert: Unter vorsichtigem Schütteln werden 20 µl R18 (2 mM in Ethanol) zu den Zellen gegeben. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln werden 10 ml eiskaltes DMEM mit 5 % FCS (D5) zugegeben und 15 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen werden 2x mit PBS+ gewaschen (5 min bei 4°C, 380 x g). Im weiteren Verlauf der Experimente werden HE293T-S Zellen mit 50 μl des cytosolischen Markers Calcein-AM (1 mM in DMSO) markiert. Calcein-AM diffundiert durch die Membran lebender Zellen ins Cytosol und wird dort von zelleigenen unspezifischen Esterasen zu Calcein umgewandelt, indem das Acetoxymethyl abgespalten wird. Es liegt dann in grün fluoreszierender Form und geladen vor und kann nicht mehr aus den Zellen permeieren. VeroE6-ACE2 Zellen werden in Suspension entweder wie beschrieben mit 20 μl des Membranmarkers R18 (2 mM in EtOH) oder mit 50 μl des cytosolischen Markers CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) Tetramethylrhodamin (1 mM in DMSO) markiert.
Die HEK293T-S Zellen (EYFP oder Calcein-AM, grün) werden mit den VeroE6-ACE2 Zellen (R18 oder CMTMR, rot) inkubiert und unter gelegentlichem Schwenken auf Eis inkubiert: Dazu werden je 500 μl VeroE6-ACE2 zu den HEK293T-S Zellen hinzugegeben und für mind. 60 min auf Eis inkubiert. Nicht gebundene Zellen werden nach mehrmaligem Waschen mit eiskaltem PBS+ entfernt. Die Zell-Zell-Fusion wurde anschließend unter verschiedenen Bedingungen analysiert. Tabelle 17 fasst die untersuchten Bedingungen zusammen:
Die Zell-Zell-Fusion wird durch die Erhöhung der Umgebungstemperatur auf 37°C, durch Erniedrigung des pH-Werts oder durch Zugabe von Proteasen (Trypsin-TPCK (1 mg/ml)) induziert (Tabelle 17). Nach 15 min Inkubation im Brutschrank (37°C) werden die Zellen mikroskopisch analysiert. Dabei wird der Übergang der einzelnen Fluorophore von Zelle zu Zelle kontrolliert. Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen werden bei Raumtemperatur am Mikroskop Axiovert 100 unter Verwendung eines 40x Öl-Immersions Objektivs mit einer NA von 1.35 durchgeführt. Die Fluorophore werden mit folgenden Einstellungen detektiert: Rhodamin – 510-560 nm BP-Anregungsfilter/590 nm LP-Emissionsfilter, Calcein-AM – 450-490 nm Anregungsfilter/520 nm LP-Emissionsfilter. Die Aufnahme der Bilder erfolgt wie beschrieben.
Für die Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59 wird zunächst die primäre Aminosäuresequenz des S-Proteins von MHV-A59 aus der Swiss-Prot Database entnommen und mit den Kriterien für Fusionspeptide abgeglichen (siehe Einleitung). Die anschließende Anfertigung der Hydrophobizitätsplots der Volllängenvariante sowie der S2-Untereinheit des S-Proteins von MHV-A59 mit Hilfe der Membrane-Protein-Explorer Software - MPex - [196] ermöglicht die Auffindung hydrophober Proteinbereiche. Die Erstellung der Hydrophobizitätsplots basiert auf der Hydrophobizitätsskala einzelner Aminosäurereste nach Wimley und White (WWIH-Skala) und sagt aus, welche Energiebarriere (ΔG (kcal/mol)) überwunden werden muss, um einen Aminosäurerest von der wässrigen Phase in die Lipidphase zu überführen [181]. Hydrophile Reste besitzen einen negativen ΔG-Wert, wogegen hydrophobe Reste einen positiven ΔG-Wert aufweisen. Die durchschnittlichen Hydrophobizitätswerte von 19 Aminosäureresten werden unter Nutzung der WWIH-Skala herangezogen, um die entsprechenden Hydrophobizitätsplots zu generieren. Nach Ermittlung geeigneter Fusionspeptidkandidaten wird deren individueller ΔG-Wert bestimmt. Nach Vergleich der Aminosäuresequenzen der Fusionspeptidkandidaten mit bereits bekannten Fusionspeptiden anderer viraler Fusionsproteine wird mit Hilfe spezieller Programme die Sekundärstruktur berechnet und analysiert.
Das S-Protein von SARS-CoV wird mittels eines optimierten Expressionssystems in HEK293T Zellen exprimiert. Zur Untersuchung der Wechselwirkung des SARS-CoV S-Proteins mit dem humanen Rezeptor hACE2 [156] wird ACE2 im selben Zelltyp exprimiert. Drei Varianten des viralen Fusionsproteins wurden exprimiert und analysiert: (1) zwei Volllängenvarianten (S-Full) und (2) eine verkürzte Variante ohne Transmembrandomäne (S-Ekto). Die S-Ekto-Variante wird in das Zellmedium sezerniert und anschließend über den C-terminalen (His)6 -Tag isoliert und aufgereinigt. Nach Dialyse beider Varianten wurden die Proteinkonzentrationen, die Reinheit und die Größe bestimmt. Der Rezeptor ACE2 wurde ebenfalls als Volllängen- (ACE-Full) oder verkürzte Variante (ACE2-Ekto) exprimiert. Die Isolierung erfolgte mittels Immunopräzipitation. Ziel der Aufreinigung war die Isolierung beider Proteine in hochreiner Form, um anschließend eine kryoelektronenmikroskopische 3D-Strukturanalyse durchzuführen.
Zur Optimierung der Bedingungen für die Expression und Anreicherung der entsprechenden Proteine wurden zunächst verschiedene Transfektionsbedingungen und Zelltypen getestet.
Um eine zu starke Cytotoxizität zu vermeiden wurden ferner verschiedene Verdünnungen des rekombinanten Vakziniavirus VTF7.3 (VV) getestet. VeroE6 und HEK293T Zellen unterschieden sich sehr deutlich im Expressionsmuster des S-Proteins von SARS-CoV. VeroE6 Zellen exprimierten eine relativ geringe Konzentration an S-Ektoprotein (Abbildung 8 A – Spuren 2,3,5 und 6). HEK293T Zellen dagegen zeigten eine deutlich höhere Ausbeute (Abbildung 8 A – Spuren 8, 9, 11 und 12). Die Inkubationszeit spielte für die jeweiligen Expressionsraten eine untergeordnete Rolle. Die Inkubation für 24 oder 48 h zeigte keine wesentlichen Unterschiede im Expressionsniveau. Als effektivste Transfektionsmethode für das S-Protein von SARS-CoV stellte sich die Transfektion mit DreamFect (DF) heraus (Abbildung 8 B – Spuren 3-7). Auch ohne Infektion der Zellen mit VTF7.3 konnten hohe Konzentrationen an Protein gewonnen werden. Nachhaltig verbessert wurde dieser Effekt durch den Einsatz des VTF7.3 Virus (Abbildung 8 B – Spur 5). Eine zweite Ernte war möglich und erlaubte eine, wenn auch geringere, Proteinausbeute (Abbildung 8 B – Spuren 6 und 7). Im Vergleich dazu war es unter Verwendung von PolyFect (PF) zwingend notwendig die Zellen mit VTF7.3 zu infizieren, da diese sonst lediglich eine geringe Proteinausbeute zeigten (Abbildung 8 B – Spur 2). Die Ausbeute nach der Infektion war vergleichbar mit der nach Transfektion mit DreamFect allein (Abbildung 8 B - Spur 1).
Die Isolierung und Aufreinigung des S-Proteins erfolgte über den C-terminalen (His)6-Tag. Die Ektodomäne des Proteins wurde in das Medium sezerniert, konzentriert und anschließend über NiNTA-Agarose aufgereinigt. Mittels eines Imidazolstufengradienten wurde das gebundene Protein eluiert (siehe Material und Methoden). Um das überschüssige Imidazol zu entfernen, wurden die Proteinproben anschließend dialysiert und erneut konzentriert. Dies war notwendig, da Imidazol bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen stören würde.
Zur Untersuchung des Oligomerisierungsgrades des S-Proteins wurde ferner ein nicht-reduzierendes/natives Gel angefertigt (Abbildung 9 C). Im Wesentlichen wurden zwei Oligomerisierungsgrade beobachtet. Die Mehrheit der S-Proteine bildeten Trimere mit einem Molekulargewicht von 500 kDa aus (Abbildung 9 C). Eine Bande mit einem etwas höheren Molekulargewicht von ca. 660 kDa entspricht womöglich höheren Oligomerisierungsformen (Tetramere). Ferner finden sich eine schwache Monomerbande und Proteinbanden mit einem niedrigeren Molekulargewicht, möglicherweise Abbauprodukte des viralen Proteins. Eine Dimerisierung des S-Proteins konnte nicht beobachtet werden.
Die Expression der Volllängenvariante des S-Proteins von SARS-CoV erfolgte in HEK293T-Zellen und wurde nach Solubilisierung der Zellmembranen mit einem detergenzhaltigen Puffer isoliert. Die Detektion der Proteine erfolgte nach Auftrennung über eine reduzierende SDS-PAGE und den anschließenden Westernblot. Die Proteinausbeute war bei keiner der gezeigten Fraktionen zufrieden stellend und auch nach Konzentrierung der Proteine konnte keine Anreicherung festgestellt werden (Abbildung 10 Spur 4). Der polyklonale Antikörper #IMG-542 zeigte nicht die gewünschte Spezifität (Abbildung 10 Spuren 1, 3 und 5). Zum einen lag dies an der deutlich höheren Zahl an Fremdproteinen im gewonnenen Gesamtzelllysat, welche auch nach der differentiellen Dichtezentrifugation nicht reduziert werden konnte. Eine hochreine Aufreinigung des Proteins wie im Fall der S-Ekto Variante war mit diesem Konstrukt und der angewandten Methode nicht möglich.
Nach erfolgreicher Aufreinigung der sezernierten Variante des S-Proteins von SARS-CoV wurde die Volllängenvariante des Proteins (S-Full) mit einem myc-(His)6-Tag kloniert und exprimiert. Für die Klonierung wurde der vorhandene Vektor pcDNA3-S-Full verwendet. Als Zielvektor wurde die pcDNA3.1 myc/His A mit einem C-terminalen myc und (His)6-Epitop verwendet. Der die Sequenz für das S-Protein beinhaltende Donor-Vektor pcDNA3-S-Full wurde einem Restriktionsverdau mit BamHI und XbaI unterzogen, um die entsprechende DNA-Sequenz (Insert) für das S-Full Protein zu erhalten (Abbildung 11 A – Spur 3). Der Akzeptor-Vektor pcDNA3.1 myc/His A wurde ebenfalls verdaut und so linearisiert (Abbildung 11 A – Spur 2). Anschließend wurde die S-Full Sequenz (Insert) über die Restriktionsseiten BamHI und XbaI („sticky ends“ = überhängende Enden) in den Vektor kloniert. Zur Überprüfung der Ligation wurde die Transformation in kompetenten CMK603 Bakterien durchgeführt, diese wurden ausplattiert und sieben positive Klone analysiert. Eine positiver Klon (#7) wurde amplifiziert und nach Verdau mit den verwendeten Restriktionsenzymen BamHI und XbaI über ein Agarosegel analysiert. Die resultierenden Banden (Vektor und Insert) wiesen das erwartete Molekulargewicht von 5.5 kb pcDNA 3.1/myc-His A Vektor und 3.9 kb das S-Full Insert mit einer Gesamtgröße von ~10 kb auf (Abbildung 11 B - Spur 2). Als Vergleich wurde der unverdaute Vektor analysiert (Abbildung 11 B – Spur 1).
Zur Überprüfung der erfolgreichen Klonierung und Expression der myc-His-getaggten Volllängenvariante des S-Proteins wurden HEK293T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen der pcDNA3.1/myc-His-A-S-Full transfiziert, mit VTF7.3 infiziert und das Proteinexpressionsprofil über Westernblot analysiert (siehe Material und Methoden).
VeroE6 Zellen exprimieren den Rezeptor ACE2, der kürzlich als Rezeptor für SARS-CoV identifiziert wurde [156], endogen. Im Experiment wurde das Expressionsniveau von ACE2-Full in VeroE6 Zellen (untransfiziert) und HEK293T Zellen (transfiziert) verglichen. Die verkürzte Variante ACE2-Ekto wurde außerdem in HEK293T Zellen exprimiert. Für die Analyse der Volllängenvarianten mussten die Zellen solubilisiert und die verschiedenen zellulären Membranen wie beschrieben getrennt werden.
Die Isolierung der Viren sowie des S-Proteins von MHV-A59 erfolgte nach der von Sturman et al. [197] beschriebenen Methode. Intakte MHV-A59 wurden in 17Cl-1 Zellen vermehrt, isoliert, aufgereinigt und konzentriert (siehe Material und Methoden). Das S-Protein wurde anschließend aus der Detergenzextraktion von MHV-A59 aufgereinigt. Das Detergenzextrakt von nativen Coronaviren enthält die membranständigen Glykoproteine S, E und M. Im Vergleich zu den Coronaviren der anderen Untergruppen exprimiert MHV-A59 keine Hämagglutininesterase (HE). Das S-Protein mit einer Größe von 180-250 kDa läuft im Vergleich zu SARS-CoV für MHV-A59 als eine Bande. Es liegt in nicht-reduzierenden nativen Proteingelen als Trimer vor (nicht gezeigt).
Zur Vermehrung von MHV-A59 in 17Cl-1 Mausfibroblastenzellen wurden die Zellen infiziert, und das virushaltige Medium 46–48 h p.i. geerntet. Nach Zentrifugation der Zellreste (P) wurden die im Überstand befindlichen Viren präzipitiert und zentrifugiert (PEG-Präzipitat, siehe Material und Methoden). Das virushaltige PEG-Pellet wurde zunächst in BisTris-Puffer (pH 6.5) aufgenommen und über einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten geschichtet. Nach Ultrazentrifugation war an der Phasengrenze beider Saccharoselösungen eine deutliche Virusbande sichtbar. Diese wurde in BisTris-Puffer aufgenommen und dialysiert, um die Saccharose zu entfernen.
Die Strukturproteine M, N und S von MHV-A59 konnten aus aufgereinigten Viren isoliert werden. In den Fraktionen 20-23 fand sich die reinste Ausbeute an S-Protein (Abbildung 15 B). In fast jeder Fraktion wurden M-Proteinaggregate gefunden (Abbildung 15 A und B). Lediglich in Fraktion 23 (Abbildung 15 A) konnte eine reine S-Protein Fraktion mit der Volllängenvariante S > 250 kDa und einer gespaltenen Variante S1/S2 mit einem Molekulargewicht von 90 kDa isoliert werden. Die Fraktionen mit dem höchsten und reinsten Proteingrad an S-Protein wurden gepoolt, dialysiert und für weitere Experimente verwendet.
Zur Vermeidung der Aggregatbildung wurden Ni-lipidhaltige Liposomen (SUVs) hergestellt. Das S-Protein, welches einen C-terminalen (His)6-Tag besitzt, sollte an die in den Liposomen enthaltenen Ni-haltigen Kopfgruppen der Lipide binden und sich ausgehend vom C-Terminus auf der Oberfläche der SUVs orientieren und verschiedene Ausrichtungswinkel einnehmen. Dies hätte gleichzeitig den Vorteil, dass für eine spätere 3D-Rekonstruktion eine Vielfalt von Ansichten mit verschiedenen Raumwinkeln zur Verfügung stehen würde.
Die Ni-lipidhaltigen Liposomen weisen eine Größe ca. 100 nm im Durchmesser auf (Abbildung 17 A). Eine Lösung des S-Proteins (Abbildung 17 B) wurde mit den Ni-haltigen SUVs inkubiert (Abbildung 17 C). Eine Ausrichtung der Proteine an den Liposomen konnte nicht beobachtet werden, allerdings wiesen die Vesikel nach Inkubation mit dem viralen Fusionsprotein sowohl einen größeren Durchmesser als auch eine Veränderung in ihrer Form auf. Die anfänglich runde, gleichmäßige Form wurde zunehmend unregelmäßiger (Abbildung 17 C). Es konnte nicht festgestellt werden, ob die beobachteten Veränderungen der Liposomen auf die Zugabe der S-Proteine zurückzuführen war und welchen Einfluss das Vorhandensein des viralen Fusionsproteins auf deren Gestalt hatte.
Unbehandelte Viren zeigen pleomorphe oder sphärische Gestalt und weisen einen Durchmesser von 80 – 200 nm (mehrheitlich 120 nm) auf. Die wohl definierten S-Proteine mit einer Länge von ungefähr 20 nm zeigen die Form eines elongierten Dreiecks mit der breiten Seite distal zur viralen Membran (Abbildung 18 A, S1). Die proximale Spitze des Dreiecks ist über eine dünne, flexible Verbindung in der viralen Membran verankert (Abbildung 18 A, S2). Diese Beobachtung ist konsistent mit der bereits von Sturman et al. [197] publizierten.
Nach Inkubation der Viren bei niedrigem pH-Wert (5.0) und 37°C werden deutliche strukturelle Veränderungen der S-Proteine sichtbar. Diese entsprechen vermutlich den verschiedenen Stadien der Konformationsänderungen. Einige Viren weisen noch immer S-Proteine auf, jedoch in deutlich geringerer Dichte (Abbildung 18 B-C). Die strukturellen Veränderungen können jedoch nicht eindeutig charakterisiert werden. Zahlreiche Virionen zeigen keine S-Proteine mehr (Abbildung 18 D) oder weisen lange, dünne, elongierte Spikes auf, denen die Kopfregion fehlt (Abbildung 18 E). In Kontrollversuchen mit Virionen, die bei neutralem pH-Wert und 37°C inkubiert wurden, konnten keine Konformationsänderungen im S-Protein beobachtet werden (Abbildung 18 F). Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine Konformationsänderung im viralen S-Protein von MHV-A59 direkt durch einen niedrigen pH-Wert induziert werden kann.
Aus den elektronenmikroskopisch digitalisierten Negativen, die mit einer Primärvergrößerung von 50.000 x unter Low-Dose-Bedingungen mikroskopiert wurden und nach Digitalisierung mittels Heidelberg Primescan Trommelscanner eine Auflösung von 1,56 Ǻ/Pixel besitzen (siehe Material und Methoden), wurden interaktiv zunächst 2.800 brauchbare Einzelpartikel selektiert.
Die Bildverarbeitung nach der Einzelpartikelmethode wurde mit der Software IMAGIC-5 durchgeführt und lieferte als Ergebnis von multivariater statistischer Analyse und Klassifizierung typische Projektionen des S-Proteins als Klassensummen (Abbildung 19 A). Diese weisen eine deutlich verbessertes „Signal-zu-Rausch-Ratio“ auf. Die Eigenschaften und Dimensionen des S-Proteins konnten mit dieser Methode sehr gut eingeschätzt werden: Die Grundform erinnert an einen invertierten Kreiskegel mit einer möglichen Gliederung in Stamm- und Kopfregion bei einer Länge von 160 Ǻ und einem maximalen Durchmesser von 120 Ǻ (Abbildung 19 B und C). Die Anfertigung einer vorläufigen 3D-Rekonstruktion untermauert die in den Klassensummen gewonnen Erkenntnisse. Der dünnen Verbindung proximal zur viralen Membran (rot) folgt eine erste dichtere Zone mit einem Durchmesser von 67 Ǻ (dunkelblau) (Abbildung 19 B). Der Stamm setzt sich bis zu einer Höhe von 90 Ǻ fort (dunkelblau + hellblau) (Abbildung 19 B). Es schließt sich die deutlich breitere Kopfregion mit einem Durchmesser bis zu 122 Ǻ an (grün) (Abbildung 19 B). Die Ansicht von oben bestätigt die Trimerform und dreifache Symmetrie des S-Proteins. Drei exponierte „Flügel“ dominieren die Kopfdomäne und sind vermutlich für die Rezeptorbindung verantwortlich (Abbildung 19 C). Die mutmaßlichen Rezeptorbindungsstellen sind farblich gekennzeichnet.
Um zu ermitteln, ob MHV-A59 die Zelle über den endozytotischen, Clathrin-abhängigen Weg infiziert und die Infektion das saure Milieu später Endosomen benötigt, wurde dieser Weg in verschiedenen Mauszelllinien mit Substanzen, die einerseits die Endozytose hemmen oder andererseits die Ansäuerung der Endosomen verhindern [11], inhibiert. Zu den eingangs erwähnten Substanzen gehört Chlorpromazin, welches die Bildung Clathrin-haltiger Vesikel hemmt, indem es das Adapterprotein AP-2 bindet und von der Plasmamembran entfernt [47] und somit die Clathrin-abhängige Endozytose verhindert [38,44,45,46]. Zur Neutralisierung der Umgebung mit niedrigem pH-Wert oder zur Unterbindung der endosomalen Ansäuerung wurden folgende lysosomotrope Agenzien verwendet: (I) Ammoniumchlorid, eine schwache Base, die in endosomalen Vesikeln akkumuliert und deren saures Milieu neutralisiert [5,30,39,59]. (II) Monensin, ein Ionophor, welches den Protongradienten über der endosomalen Membran zerstört und als schwache Base fungiert [28,40,48,49]. (III) Bafilomycin A1 sowie Concanamycin A sind spezifische Inhibitoren der V-Typ H+ -ATPase in eukaryotischen Zellen [36,39,40,60]. Die Konzentrationen der eingesetzten Substanzen und Inhibitoren wurden anhand bereits durchgeführter Untersuchungen an Hüllviren gewählt, deren Infektivität nachweislich vom endosomalen/endozytotischen Weg abhängt [29,30,37,38,40,41,43,44,46,153,198]. Mittels DAPI-Färbung konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit den beschriebenen Substanzen keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Zellen hatte (nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die erfolgreiche Infektion der Zellen durch MHV-A59 über den Clathrin-abhängigen, endozytotischen Weg erfolgt und als Hauptroute für den Eintritt des Virus dient. Zusätzlich scheint eine Umgebung mit niedrigem pH-Wert, wie sie in den endosomalen Kompartimenten der Zelle vorzufinden ist, Voraussetzung für die Freisetzung des Nukleokapsids in das Cytoplasma der Zelle zu sein. Vergleichbare Experimente wurden mit LR-7 und DBT-Zellen, die ebenfalls durch MHV-A59 infizierbar sind, durchgeführt. Die Inkubation dieser Zellen mit den lysosomotropen Substanzen Ammoniumchlorid, Bafilomycin A1, Monensin und Chlorpromazin zeigen den gleichen inhibitorischen Effekt wie bei 17Cl-1 Zellen. Die Infektivität war nach Inkubation mit 100 nM Bafilomycin, 10 μM Monensin oder 15 μM Chlorpromazin vollständig unterdrückt (Abbildung 20 A). Nach Inkubation mit 20 mM Ammoniumchlorid konnte die Infektion bis zu 70% (LR-7) oder zu 100% (DBT) reduziert werden (Abbildung 20 A). Diese Ergebnisse sind konsistent mit der bereits beobachteten Verzögerung der MHV-A59 Infektion Ammoniumchlorid-behandelter L2-Zellen [30]. Im Vergleich dazu bewahrte MHV-S4, ein rekombinantes Virus, welches das S-Protein von MHV-JHM exprimiert und den nicht-endozytotischen, clathrin-unabhängigen Weg des viralen Eintritts nutzt [145,153] seine Infektivität nach Behandlung der Zellen (17Cl-1, LR-7 oder DBT) mit 20 mM Ammoniumchlorid oder 100 nM Bafilomycin größtenteils bei (Abbildung 20 B). Für MHV-S4 infizierte LR-7 Zellen hatten Ammoniumchlorid und Bafilomycin A1 einen geringen Effekt auf die Infektivität (Abbildung 20, graue Balken). MHV-S4 infizierte DBT- und 17Cl-1 Zellen zeigten nach Inkubation mit Ammoniumchlorid ebenfalls keine signifikante Reduktion der Infektivität (Abbildung 20 B). Allerdings lag diese bei MHV-S4 infizierten 17Cl-1 Zellen, die mit Bafilomycin A1 behandelt wurden bei knapp 40% (Abbildung 20, links, grauer Balken).
Neuere Studien gaben zusätzlich Hinweise darauf, dass der Eintritt umhüllter Viren in die Zielzelle mit Lipiddomänen assoziiert ist, die Cholesterol enthalten [26,52,53,54]. Nach der Komplexierung von Cholesterol und Verarmung der Plasmamembran von 17Cl-1 Zellen durch Inkubation mit 15 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) (siehe Material und Methoden) konnte die Infektion mit MHV-A59 vollständig blockiert werden (Abbildung 20 C). Eine Inhibierung der Infektion bis zu 70% wurde nach Inkubation der Zellen mit der cholesterol-bindenden Substanz Filipin III (5 µg/ml) beobachtet (Abbildung 20 C). In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass die eingesetzten Konzentrationen den Eintritt und die Infektivität von umhüllten Viren effizient inhibieren können [26,52,53]. Die gewonnenen Daten sind ein weiterer Beweis für die Notwendigkeit von Cholesterol und/oder Cholesterol-reichen Membrandomänen für den Eintritt und die Infektivität von MHV-A59, wie dies bereits in früheren Arbeiten gezeigt werden konnte [52,54]. Als Kontrolle wurden 17Cl-1 Zellen ferner mit VSV infiziert. VSV kann unabhängig von Cholesterol und/oder Cholesterol-reichen Membrandomänen (Rafts) in die Zelle eindringen [199,200]. Eine geringe Reduktion der VSV-Infektivität von 8% wurde für Zellen beobachtet, die mit MβCD behandelt wurden (Abbildung 20 C). Diese Ergebnisse stützen die Aussage, dass der Haupteintrittsweg von MHV-A59 der endozytotische Weg ist, da frühere Untersuchungen zur Clathrin-abhängigen Endozytose zeigen konnten, dass diese Cholesterol-abhängig ist und nach Behandlung der Zellen mit MβCD inhibiert werden kann [61,201].
Ferner gibt es Hinweise darauf, dass die Spaltung des S-Proteins von Coronaviren essentiell für deren Fusionsaktivität ist. Abhängig vom Virusstamm erfolgt die Spaltung bereits während der Maturierung in der Wirtszelle. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Fusionsaktivität/Infektivität von Coronaviren, wie SARS-CoV und MHV-2 von der proteolytischen Spaltung des S-Proteins durch endosomale Proteasen abhängt [5,6,202]. Um diese Frage zu adressieren und zu untersuchen, ob eine solche Spaltung auch für die Fusion von MHV-A59 wichtig ist, wurden 17Cl-1 Zellen in der Anwesenheit von Leupeptin und E-64, Proteaseinhibitoren, die Proteasen, wie Cathepsin L in endosomalen Organellen mit niedrigem pH-Wert inhibieren, mit MHV-A59 infiziert. Diese Inhibitoren wurden in anderen Studien bereits in vergleichbaren Konzentrationen eingesetzt [4,5,6]. In den durchgeführten Experimenten wurde für die Inhibitoren - Leupeptin und E-64 - ein geringer Einfluss auf die Infektivität von MHV-A59 beobachtet (Abbildung 20 D, graue Balken). Die virale Replikation war nur zu 20% für Leupeptin (10 µg/ml) und zu 30% für E-64 (10 µM) reduziert. Vermutlich spielen endosomale Proteasen bei der Infektion und Auslösung der Fusionsreaktion von MHV-A59 eine untergeordnete Rolle. Um die Effektivität der eingesetzten Konzentrationen der Proteaseinhibitoren zu verifizieren, wurden 17Cl-1 Zellen in Anwesenheit der Inhibitoren mit MHV-A59 FI infiziert. MHV-A59 FI exprimiert ausschließlich ungespaltenes S-Protein (siehe Material und Methoden). In Abwesenheit der Proteaseinhibitoren war die Infektivität von MHV-A59 FI vergleichbar mit der von MHV-A59 (Abbildung 20 D, Kontrolle). Im Vergleich zu MHV-A59 (graue Balken) konnte die Infektivität von MHV-A59 FI vollständig inhibiert werden, nachdem die Zellen mit den Inhibitoren Leupeptin (10 μg/ml) oder E-64 (10 μM) behandelt wurden (Abbildung 20 D, schwarze Balken).
Um die durch den Plaquereduktionsassay gewonnenen Hinweise darauf, dass die Fusion von Virus und Plasmamembran nur bei niedrigem pH-Wert effizient ablaufen kann, zu untermauern, wurde der Lipid-Mischungs-Assay basierend auf dem Dequenching des R18-Fluorophors angewandt [193]. Viren, die mit R18 in selbstlöschender Konzentration markiert wurden, wurden mit den Zielzellen bei 4°C inkubiert, um die Bindung zu ermöglichen. Anschließend wurden die Virus-Zell-Komplexe in einer Küvette bei neutralem pH (7.0) und 37°C für 30 min inkubiert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Zitronensäure (250 mM) auf pH 5.0 erniedrigt (siehe Material und Methoden). Es konnte ein starker und schneller Anstieg der Fluoreszenzintensität beobachtet werden. Dieser wurde der Aufhebung der Selbstlöschung durch die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der Zielzelle und der damit verbundenen Erhöhung der Fluoreszenzintensität zugeschrieben (Abbildung 21 A). Nach 600 sec waren ca. 25-30% der Viren fusioniert. Längere Inkubation zeigte ein kontinuierliches moderateres Fluoreszenzdequenching, welches bis zu einem Wert von 40% anstieg. Das Dequenching des Fluorophors war ferner temperaturabhängig. Bei 20°C konnte noch immer ein signifikantes Dequenching beobachtet werden, dies erreichte allerdings ein geringeres Ausmaß (Abbildung 21 B). Im Vergleich dazu wurde bei neutralem pH-Wert (pH 7.0) ein kontinuierlicher, aber sehr schwacher Anstieg der Fluoreszenzintensität bei 37°C beobachtet (Abbildung 21 A). Dieser mündete in ein sehr viel geringeres Fusionsausmaß von unter 10%. Vermutlich hing dieser langsame Fluoreszenzanstieg mit dem unspezifischen Übergang des Fluorophors von viraler zu zellulärer Membran oder mit intrazellulären Fusionsereignissen zusammen.
Um die in den virologischen (Plaqueassay) und fluoreszenzspektrometrischen Experimenten gewonnenen Hinweise darauf, dass ein niedriger pH-Wert die Fusion zwischen viraler und zellulärer Membran auslösen kann, zu untermauern, wurden fluoreszenzmikrokopischen Analysen durchgeführt. Zur Visualisierung der Fusion von MHV-A59 wurden die Viren mit R18 markiert und mit 17Cl-1 Zellen auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Virus-Zell-Komplexe bei 37°C entweder bei neutralem pH (pH 7.0) oder niedrigem pH (pH 5.0) inkubiert, um die Bedingungen des endosomalen Kompartiments zu simulieren (siehe Material und Methoden). Zum Zeitpunkt t=0 konnte eine punktförmige Fluoreszenz beobachtet, welche den entsprechenden an die Plasmamembran der Zielzelle gebundenen Viren zugeordnet werden konnte. Gemäß der Größe der Fluoreszenzpunkte liegt eine gewisse Anzahl der Viren co-lokalisiert oder aggregiert vor (Abbildung 22 D). Ein ähnliches Fluoreszenzbild ergab sich 5 min nach Inkubation bei neutralem pH (Abbildung 22 A). Allerdings wurde erst 15 min nach Inkubation bei pH 7.0 und 37°C ein sehr schwaches R18-Signal entsprechender intrazellulärer Kompartimente beobachtet (Abbildung 22 C). Vermutlich spiegelt diese Markierung die Lokalisierung von MHV-A59 in Endosomen und die anschließende Fusion mit der endosomalen Membran wider. Dies konnte durch die Beobachtung gestützt werden, dass keinerlei intrazelluläre Färbung nach 15-minütiger Inkubation bei neutralem pH und Raumtemperatur festgestellt werden konnte (nicht gezeigt). Es ist bekannt, dass die Endozytose bei Raumtemperatur nur sehr eingeschränkt stattfinden kann [203].
Im Gegensatz dazu zeigen Virus-Zell-Komplexe nach Inkubation bei pH 5.0 und 37°C schon nach 5 min eine starke Fluoreszenz, die über die gesamte Plasmamembran der Zelle verteilt ist (Abbildung 23 C und D). Die Fusion der Viren mit der Zielzelle findet unter niedrigen pH-Bedingungen, die das Milieu der Endosomen/Lysosomen simuliert, effizient und schnell, direkt an der Plasmamembran der Zielzelle statt. Die Analyse der konfokalen 3D-Stacks sowie die Erstellung konfokaler Fluoreszenzplots entlang der x- und y-Achsen konnten bestätigen, dass ausschließlich die Plasmamembran der Zelle gefärbt war (Abbildung 23 D). Um zu klären, ob die beobachtete punktförmige intrazelluläre R18-Fluoreszenz bei neutralem pH mit der Fusion der Viren mit der endosomalen Membran zusammenhing, wurden 17Cl-1 Zellen mit 20 mM Ammoniumchlorid vorinkubiert und die intrazelluläre Färbung nach Inkubation der Virus-Zell-Komplexe bei pH 7.0, 37°C für 30 min in Anwesenheit des Inhibitors analysiert. Als Kontrolle wurden unbehandelte Zellen unter gleichen Bedingungen analysiert (Abbildung 24 B). Diese Zellen zeigen eine ähnliche zelluläre Markierung kleiner, zellulärer Organellen wie bereits beschrieben. Für die Zellen, die mit Ammoniumchlorid behandelt wurden, zeigte sich eine andere intrazelluläre Markierung. Das Fluoreszenzsignal war geringer und eher schwach (Abbildung 24 A). Vermutlich konnten einige Viren internalisiert werden (punktförmige Fluoreszenz), die eigentliche Fusion mit der endosomalen Membran jedoch konnte durch die lysosomotrope Aktivität des Ammoniumchlorids verhindert werden. Zu bemerken war außerdem, dass die punktförmigen Fluoreszenzsignale an der Plasmamembran der Kontrollzellen auch noch 30 min nach Inkubation zu beobachten waren. Diese entspricht vermutlich Viren, die noch nicht über Endozytose in die Zellen aufgenommen wurden. Zusätzlich untermauern diese Beobachtungen die Erkenntniss, dass MHV-A59 unter neutralen pH-Bedingungen nicht fähig ist mit der Plasmamembran zu fusionieren, wie dies für Virus-Zell-Komplexe der Fall ist, die bei niedrigem pH inkubiert werden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für Zellen erzielt, die mit Bafilomycin A1 inkubiert wurden (nicht gezeigt).
Das intrazelluläre Markierungsmuster der Zellen, die mit fluoreszenzmarkierten MHV-A59 bei pH 7.0 und 37°C in der Anwesenheit der Proteaseinhibitoren E-64 und Leupeptin inkubiert wurden, ist analog zu dem bei den unbehandelten Kontrollzellen beobachteten (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse untermauern, dass eine zusätzliche Spaltung des S-Proteins von MHV-A59 in der Zielzelle nicht notwendig ist, um die Virus-Zell-Fusion zu induzieren, da es im maturierten Virus bereits gespalten vorliegt.
Das Fusionsverhalten S-Protein exprimierender Zellen zur Identifizierung des Auslösers der SARS-CoV vermittelten Fusion wurde im weiteren Verlauf der Experimente fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Die Zielzellen tragen den humanen ACE2-Rezeptor auf ihrer Oberfläche. Zur Visualisierung der Zell-Zell-Fusion werden die Zellen mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert und die Fusion unter verschiedenen Bedingungen (pH-Wert, Temperatur, Proteasen) untersucht. Die Volllängenvarianten der Proteine werden in den entsprechenden Zellsystemen exprimiert (siehe D.1 und Material und Methoden).
Für die Fusionsexperimente war es außerdem wichtig die S-Protein exprimierenden HEK293T Zellen (HEK293T-S) zusätzlich mit einem zellulären Farbstoff zu markieren. Dazu wurden diese parallel mit dem pEYFP-N1-Plamid transfiziert, welches die Information für eine Variante des GFP-Proteins – EYFP – enthielt. EYFP liegt nach Expression löslich in der Zelle vor (nicht gezeigt). Die Überprüfung der Co-Expression von pEYFP und S-Protein ergab allerdings, dass keine der pEYFP-positiven Zellen auch S-Protein auf ihrer Oberfläche exprimierten (nicht gezeigt). Demzufolge wurden die Zellen für die folgenden Fusionsexperimente mit anderen cytosolischen Markern markiert (siehe Material und Methoden).
Zur Untersuchung der Fusion von S-Protein und ACE2-Rezeptor exprimierenden Zellen werden VeroE6-ACE2 Zellen mit dem Membranmarker R18 (rot) und HEK293T-S Zellen mit dem cytosolischen Marker Calcein-AM (grün) markiert. Ein deutliches Mischen der (1) Membranlipide (rot) und des (2) Cytosols (grün) kann nach Inkubation bei pH 5.0 und Zugabe von Trypsin (+) beobachtet werden (Abbildung 27 A). Dies deutet auf eine vollständige Zell-Zell-Fusion hin. Diese ist einerseits durch das Mischen der Lipide („Lipid Mixing“, R18 -rot) und andererseits durch das Mischen des cytosolischen Inhalts („Content Mixing“, Calcein-AM (grün)) charakterisiert. Im Gegensatz dazu wird ohne Zugabe von Trypsin (-) unter niedrigen pH-Bedingungen (pH 5.0) sowie unter neutralen pH-Bedingungen mit (+) oder ohne (-) Trypsin lediglich die Mischung der Lipide („Lipid Mixing“) beobachtet (Abbildung 27 B-D).
Dies deutet auf Hemifusion hin. Die äußeren Leaflets verschmelzen, eine vollständige Fusion findet jedoch nicht statt. Ähnliches kann außerdem nach Inkubation Calcein-AM gefärbter HEK293T-S Zellen (grün) mit CMTMR-gefärbten VeroE6-ACE2 Zellen (rot) beobachtet werden (Abbildung 27 F-H). Unter diesen Bedingungen (pH 5.0 und pH 7.0, jeweils ohne Trypsin (-)) findet keine vollständige Zell-Zell-Fusion statt (Abbildung 27 F-H). Die jeweiligen Kontrollexperimente mit nicht-transfizierten Zellen werden bei pH 5.0 ohne Trypsinbehandlung (-) durchgeführt. Keine der Kontrollen zeigt Zell-Zell- oder Hemifusion (Abbildung 27 E und H).
Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse dafür, dass eine vollständige Zell-Zell-Fusion („Content“- und „Lipid-Mixing“) von HEK293T-S und VeroE6-ACE2 Zellen erst nach Inkubation bei pH 5.0 nach proteolytischer Spaltung (Trypsin) und 37°C ausgelöst werden kann. Zusätzlich kommt es nach Inkubation bei niedrigem pH-Wert auch ohne die Zugabe von Trypsin zur so genannten Hemifusion („Lipid-Mixing“) (Abbildung 27 B-D). Im Gegensatz dazu wird „Content-Mixing“ ohne Trypsin (-), weder unter neutralen noch unter niedrigen pH-Bedingungen beobachtet (Abbildung 27 F und G). Vermutlich wird allein durch die Interaktion mit dem ACE2-Rezeptor eine Konformationsänderung im S-Protein ausgelöst, welche zur Fusion der äußeren Leaflets von viraler und zellulärer Membran führt. Unklar bleibt, welche Rolle ein niedriger pH-Wert bei der Auslösung der Konformationsänderung/Fusionsreaktion spielt. Zum einen könnte die pH-Erniedrigung notwendig sein, um die für die Spaltung des S-Proteins erforderliche endosomale Protease zu aktivieren [6] oder sie ist direkt an der Initiierung der Konformationsumwandlung des S-Proteins beteiligt. Außer Frage steht die Notwendigkeit des ACE2-Rezeptors für die Initiierung der Konformationsumwandlung im S-Protein, da Kontrollzellen ohne ACE2-Rezeptormolekül nicht fähig sind mit S-Protein exprimierenden Zellen zu fusionieren (nicht gezeigt). Zusätzlich sind Zellen, die kein S-Protein exprimierten unter den getesteten Bedingungen (pH 5.0, 37°C) fusionsinkompetent (Abbildung 27 E und H). Die Initiierung der Konformationsänderung im S-Protein von SARS-CoV und die anschließende Auslösung der Fusion ist somit von 3 Faktoren abhängig: (1) Von der Interaktion mit dem ACE2-Rezeptor. (2) Von der anschließenden und/oder gleichzeitigen proteolytischen Spaltung des S-Proteins durch eine Protease (endosomale, zelluläre oder extrazelluläre) und (3) einem niedrigen pH-Wert (pH 5.0), der durch ein zelluläres Organell mit niedrigem pH-Wert bereitgestellt werden muss.
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Ausgehend von der primären Aminosäuresequenz des S-Proteins von MHV-A59 werden die bekannten Kriterien für Fusionspeptide herangezogen (Einleitung, Material und Methoden). Der erste Schritt besteht darin die primäre Aminosäuresequenz in die bekannten Proteindomänen zu unterteilen.
Die Sequenzanalyse eines Proteins auf Ebene der Aminosäuresequenz ermöglicht die Auffindung einzelner Motive, die für bestimmte Proteinfunktionen wichtig sind. Das S-Protein der Coronaviren ist das größte bekannte virale Fusionsprotein der Klasse I mit einem Molekulargewicht von 150 – 180 kDa. Es ist an zahlreichen extrazellulären Asparagin (Asn)-Resten glykosyliert und kann weitere Modifikationen wie Myristylierungen und Palmitoylierungen aufweisen.
Die Aminosäurekomposition bestimmt die Eigenschaften einer Proteinsequenz. Zur Analyse und Identifizierung fusionsaktiver Bereiche eines Proteins wurde zunächst ein Hydrophobizitätsplot des S-Proteins von MHV-A59 erstellt. Dieser dient zur Ermittlung hydrophober Proteinbereiche. Die Erstellung der Hydrophobizitätsplots basiert auf der Hydrophobizitätsskala einzelner Aminosäurereste nach Wimley und White (WWIH-Skala) und sagt aus, welche Energiebarriere (ΔG (kcal/mol)) überwunden werden muss, um einen Aminosäurerest von der wässrigen Phase in die Lipidphase zu überführen [181] (siehe Material und Methoden). Hydrophile Reste besitzen einen negativen ΔG-Wert, wogegen hydrophobe Reste einen positiven ΔG-Wert aufweisen. Die durchschnittlichen Hydrophobizitätswerte von 19 Aminosäuren werden unter Nutzung der WWIH-Skala herangezogen, um die entsprechenden Hydrophobizitätsplots zu generieren. Diese werden mit der Software – MPex - [196] erstellt und ausgewertet (Abbildung 30).
Ausgehend von den vier vorhergesagten Proteinsegmenten (FP1-4) werden die Eigenschaften mit den bereits identifizierten Fusionspeptiden anderer umhüllter Viren abgeglichen. Die Sequenzen des GP2-Proteins des Ebolavirus und des gp41 des HIV-1 dienen als Referenz. Sie werden nach den beschriebenen Kriterien abgeglichen (siehe Einleitung) [102,104,106,115,116,119,206,207,208]. Aufgrund der Länge kommen für FP1 und FP3 jeweils 2 Sequenzen in Frage (Tabelle 21). FP1 und FP3 sowie Varianten davon zeigen im Hydrophobizitätsplot und dessen Vergleich mit den bereits identifizierten Fusionspeptiden von HIV-1 und EboV die größten Übereinstimmungen (Tabelle 21 und Abbildung 31). Die erste Region (FP1-1) liegt über 200 Reste C-terminal von der Trypsinspaltungsstelle (AS 713 RAHR 717) entfernt, kurz vor der HR1-Region (AS 947-1082), beinhaltet die Reste 933-960 und weist einen ΔG-Wert von 1.98 kcal/mol auf (Tabelle 21, Abbildung 31 C). Eine kürzere Variante dieser Sequenz, FP1-2, liegt etwas C-terminaler, besteht aus den Aminosäureresten 937-956 und weist einen ΔG-Wert von 1.83 kcal/mol auf (Tabelle 21, Abbildung 31 C). FP3 liegt C-terminal zu FP1, erstreckt sich über die Reste 1108-1126 und weist einen ΔG-Wert von 5.56 kcal/mol auf (Tabelle 21 und Abbildung 31 D). FP3-2 hat eine Länge von 22 AS und besitzt einen ΔG-Wert von 3.96 kcal/mol. Die möglichen Fusionspeptide FP1, FP3 und ihre Varianten gehören zur Kategorie der internen Fusionspeptide, wie sie im GP2 von EboV [102] und dem TM-Protein von ASLV [103] vorkommen. Interne Fusionspeptide liegen weit entfernt von der möglichen proteolytischen Spaltungsstelle des viralen Glykoproteins.
Die Sequenzanalyse der Fusionspeptidkandidaten und ihrer Varianten offenbart eine Anzahl konservierter Eigenschaften. Alle vier Sequenzen (FP1-1 und –2, FP3-1 und -2) sind kurz, bestehen aus höchstens 27 Aminosäureresten und enthalten vorwiegend hydrophobe Aminosäurereste wie Alanin (A), Glycin (G) und Phenylalanin (F). Ein weiteres typisches Merkmal für interne Fusionspeptide ist der Prolinrest (P) im oder nahe des Zentrums der Peptidsequenz [116,117,118,119]. Die zentralen Prolinreste (P) von FP1 und FP3 liegen jeweils höchstens 2 AS von der zentralen Aminosäure entfernt (Tabelle 21).
Die vier Fusionspeptidkandidaten (FP1-4) wurden in der S2-Sequenz farbig unterlegt (Abbildung 32 A) und sind im linearen Schema als schwarze Balken dargestellt (Abbildung 32 C). Nach den Lokalisierungsstudien innerhalb der Primärsequenz der S2-Untereiheit konnten zwei geeignete Fusionspeptidkandidaten - FP1-1 und FP1-2 - identifiziert werden (Abbildung 33).
FP1-1 und FP1-2 (Abbildung 33, Tabelle 21) befinden sich N-terminal zur HR1-Region, weisen einen ΔG-Wert von 2 kcal/mol auf und stimmen mit der Mehrheit der bereits beschriebenen Kriterien für interne Fusionspeptide überein. Ein zentrales Prolin in beiden Sequenzen könnte mit der Zielmembran interagieren. FP1-1 und FP1-2 befinden sich mindestens 200 AS weit entfernt von der proteolytischen Spaltungsstelle (RRAHR), was sie als interne Fusionspeptide prädestiniert. Für interne Fusionspeptide von viralen Fusionsproteinen der Klasse I ist bekannt, dass sie präferentiell α-helikale Sekundärstrukturen ausbilden [62]. Nach Analyse der möglichen Sekundärstrukturen konnte ermittelt werden, dass FP1-1 und FP1-2 α- Helices ausbilden und einen Helixgrad von über 80% aufweisen (Abbildung 33 C). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FP1-1 und FP1-2 besonders geeignet erscheinen als mögliche Fusionspeptide zu fungieren. Sie erfüllen die wichtigsten Kriterien interner Fusionspeptide.
Das S-Protein von SARS-CoV wird als Trimer exprimiert. Die Fusionsaktivität des S-Proteins von SARS-CoV wird bestimmt durch: (1) S-ACE2-Rezeptor-Interaktion, (2) die proteolytische Spaltung in S1- und S2- Untereinheit und (3) einen niedrigen pH-Wert, vermutlich bereitgestellt durch ein zelluläres Organell. Unklar bleibt die Rolle des niedrigen pH-Werts bei der Auslösung der Fusionsreaktion.
Die erste elektronenmikroskopische Charakterisierung des Infektionsweges von MHV-A59 in einer Mauszelle wurde von David-Ferreira und Kollegen 1965 durchgeführt [209]. Die Virusbindung schien eine Invagination der Plasmamembran zur Folge zu haben. Eine Stunde nach Inokulation fanden sie die Viren in intrazellulären Organellen nahe der Plasmamembran vor. Dies war der erste Hinweis auf die Nutzung intrazellulärer Organellen für die Aufnahme und den nachfolgenden Transport der Viren in das Zellinnere. Zwei bis drei Stunden nach Infektion wurden die Partikel in elektronendichteren zellulären Organellen vorgefunden. Die Viruspartikel waren häufig noch intakt, teilweise aber ohne virale Hüllmembran, was eine vorangegangene Fusion vermuten lässt.
Alle verwendeten lysosomotropen Substanzen - Ammoniumchlorid, Monensin, Bafilomycin und Concanamycin - unterdrücken die Infektion von 17Cl-1, LR-7 und DBT Zellen durch MHV-A59 nahezu vollständig. Bafilomycin A1 könnte auf zwei Arten mit der endozytotischen Route interferieren. Einerseits verhindert es die Ansäuerung endosomaler/lysosomaler Organellen durch Blockierung der vakuolaren V-Typ-ATPase. Andererseits inhibiert es den Transport von frühen zu späten Endosomen [38,158]. Einen direkten Beweis für die Relevanz der endozytotischen Aufnahme von MHV-A59 in die Zielzelle liefert die Inhibierung der Infektion durch Chlorpromazin. Diese kationische amphiphile Substanz verhindert die Bildung Clathrin-haltiger Vesikel, indem sie die Bindung des Adapterproteins AP-2 an die Plasmamembran hemmt [47]. Auf diese Weise kommt die gesamte Clathrin-abhängige Endozytose der Zelle zum Erliegen [38,44,45,46]. Die gewonnenen Erkenntnisse lassen vermuten, dass MHV-A59 die Zelle über einen Clathrin-abhängigen Weg infiziert (Abbildung 34). Die Sensitivität der MHV-A59 Infektion gegenüber lysosomotropen Agenzien steht in Übereinstimmung mit einem solchen Eintrittsweg, da Clathrin-haltige Vesikel ihren Inhalt meist an Endosomen liefern, die ein saures Milieu aufweisen. Zusätzlich wird der Befund der endozytotischen Aufnahme dadurch gestützt, dass eine Unterdrückung der Infektion von MHV-A59 nach Cholesterolverarmung zu beobachten ist. In früheren Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass die Clathrin-abhängige Endozytose durch den Entzug von Cholesterol nach Behandlung mit MβCD stark inhibiert ist [61,201].
Interessanterweise finden Rottier und seine Mitarbeiter, dass die Empfindlichkeit gegenüber Bafilomycin A1 und Chlorpromazin für MHV-A59 mit ungespaltenem S-Protein gegenüber Viren mit gespaltenem S-Protein erhöht ist [152]. Die erhöhte Sensitivität könnte mit der Inhibierung der Spaltung durch endosomale/lysosomale Proteasen erklärt werden. Allerdings zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Fusion von MHV-A59 und dessen Infektion nicht oder nur gering von endosomalen Proteasen abhängig ist (siehe Ergebnisse). Dies ist nicht überraschend, da bekannt ist, dass eine Spaltung des S-Proteins von MHV-A59 in S1- und S2-Untereinheit bereits während der Virusmaturierung stattfindet [151,152]. Proteaseinhibitoren, die endosomale Cysteinprotease wie Cathepsin L und B hemmen, zeigen lediglich einen geringen Einfluss auf die Infektion von 17Cl-1 Zellen durch MHV-A59. Dennoch wird eine Erhöhung der Infektionseffizienz durch Zugabe von Trypsin beobachtet [151]. Das Virus MHV-A59 FI mit vollständig ungespaltenem S-Protein zeigt nach Inhibierung der Proteasen einen deutlichen Rückgang der Infektivität (> 90%) (siehe Ergebnisse). Für die erfolgreiche Spaltung des S-Proteins in S1- und S2-Untereinheit ist die Protease Furin oder ein furin-ähnliches Enzym verantwortlich. Furininhibitoren können lediglich die S-Protein induzierte Zell-Zell-Fusion verhindern, haben jedoch keinen Einfluss auf die Virus-Zell-Fusion [152].
Die fluoreszenzspektrometrischen und –mikroskopischen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein endozytotisches Kompartiment (Endosom/Lysosom) mit einem sauren Lumen eine Rolle beim Eintritt von MHV-A59 in die Zelle spielt. Die durchgeführten Experimente liefern Hinweise darauf, dass für die Fusion der viralen Hüllmembran mit der zellulären Membran keine Proteasen oder andere endosomale Faktoren benötigt werden. Die Erniedrigung des pH-Wertes allein ist ausreichend, um die Fusion von MHV-A59 mit 17Cl-1 Zellen zu induzieren. Während bei neutralem pH-Wert keine Fusion detektiert werden konnte, erfolgte eine sehr schnelle Fusion nach Ansäuerung des Suspensionsmediums (siehe Ergebnisse). Der Fusionsprozess war ferner temperaturabhängig, wie dies bereits für andere Hüllviren beschrieben wurde [41,195,211,212]. Bei Raumtemperatur findet unter allen untersuchten pH-Bedingungen eine deutlich langsamere Fusion statt, die in einem wesentlich geringeren Fusionsausmaß mündet. Zudem liefern die fluoreszenzmikroskopischen Daten einen klaren Beweis dafür, dass ein niedriger pH-Wert die Fusionsaktivität von MHV-A59 auslöst. Nach Bindung von MHV-A59 an 17Cl-1 Zellen findet eine schnelle und effiziente Fusion der viralen Hüllmembran mit der Plasmamembran nach Ansäuerung des Mediums bei 37°C statt. Dies entspricht den Verhältnissen, die im Lumen des späten endosomalen Kompartiments herrschen. Im Gegensatz dazu findet keine oder nur geringe Fusion unter neutralen pH-Bedingungen und 37°C statt. Werden die Virus-Zell-Komplexe jedoch länger als > 10 Minuten bei 37°C inkubiert, wird eine intrazelluläre Markierung beobachtet, die durch Inkubation mit lysosomotropen Agenzien erfolgreich inhibiert werden kann (siehe Ergebnisse). Diese Beobachtungen unterstützen die Annahme, dass MHV-A59 den endozytotischen Weg für den Eintritt in die Zelle nutzt und anschließend zu endosomalen Kompartimenten transportiert wird, wo die eigentliche Fusion stattfindet. In weiteren Experimenten konnte ausgeschlossen werden, dass endosomale Proteasen der Wirtszelle für den viralen Eintritt von MHV-A59 und die damit verbundene Auslösung der Fusionsreaktion notwendig sind (siehe Ergebnisse). Die Schlussfolgerungen, dass die Infektion von MHV-A59 über die endozytotische Aufnahme und den anschließenden Transport zu einem endosomalen Kompartiment erfolgt und ein niedriger pH-Wert die Fusion und Konformationsumwandlung im S-Protein direkt auslösen kann, steht in Übereinstimmung mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnissen eines weiteren Mitglieds der Coronavirusfamilie, dem infektiösen Bronchitisvirus - IBV [213]. Die Infektivität von IBV kann wie bei MHV-A59 durch lysosomotrope Agenzien und Inhibitoren der pH-abhängigen Endozytose blockiert werden, wird aber durch Proteaseinhibitoren nicht beeinflusst. Zusätzlich kann die pH-abhängige Fusion durch den auf R18 basierenden Fluoreszenzdequenchingassay nachgewiesen werden. Dieser Weg des zellulären Eintritts scheint, wenn nicht für alle, so doch für einige Mitglieder der Coronavirusfamilie zu gelten.
Das S-Protein von SARS-CoV konnte sowohl in der Volllängenvariante (S-Full), als auch als verkürzte Ektodomäne (S-Ekto) im eukaryotischen Zellsystem als C-terminal (His)6-getaggte Variante exprimiert und aufgereinigt werden. Im nativen Proteingel konnte nachgewiesen werden, dass die Ektodomäne als Trimer oder Monomer exprimiert wird. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den bereits veröffentlichten Daten von Xiao et al. [173,214]. Diese zeigen, dass die Ektodomäne des S-Proteins von SARS-CoV als Trimer mit einem Molekulargewicht (MW) von ca. 512 kDa vorliegt. Ein geringerer Anteil des Proteins wird als Monomer mit einem MW von 200 kDa exprimiert. Interessanterweise kann der N-terminale Anteil des S-Proteins Dimere mit einem Molekulargewicht von ~230 kDa ausbilden [214]. Im Gegensatz zu anderen viralen Fusionsproteinen konnte der native, oligomere Zustand des Proteins ohne Zugabe von Crosslinkern nachgewiesen werden. Dies liegt vermutlich daran, dass ein Großteil der S-Proteine im nativen Zustand ungespalten ist. Im Gegensatz zu anderen S-Proteinen der Coronavirus-Familie, die während ihrer Maturierung in der Wirtszelle proteolytisch in S1- und S2-Untereinheiten gespalten werden [151,152,215,216], ist dies bei SARS-CoV nicht der Fall [156,217]. Sowohl durch SDS-PAGE als auch nach Westernblotanalyse konnte nachgewiesen werden, dass die Mehrheit der exprimierten Fusionsproteine in der ungespaltenen Form (180-200 kDa) vorliegt und ein sehr geringer Teil als gespaltene S1/S2 (90 kDa)-Bande auftritt (siehe Ergebnisse). Zusätzlich konnte bestätigt werden, dass S-Monomere in glykosylierter (200 kDa) und nicht-glykosylierter (180 kDa) Form exprimiert werden.
Mit dem Ziel der Aufklärung der 3D-Struktur des S-Proteins wurde das aufgereinigte S-Protein elektronenmikroskopisch analysiert. Die Proteinausbeute, die mit dem verwendeten Expressionssystem erreicht werden konnte, war leider nicht ausreichend, um eine Rekonstitution des viralen Fusionsproteins in Liposomen durchführen zu können. Die angefertigten elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen vorwiegend Aggregate von Proteinen, die in ihrer Größe nicht den erwarteten hochmolekularen Komplexen (500-600 kDa) entsprechen. Möglicherweise führte die Wechselwirkung der 1%igen Phosphorwolframsäure mit den viralen Proteinen zu deren Degradation. Bemühungen zur Optimierung der Transfektions-, Expressions- und Aufreinigungsbedingungen schlugen weitgehend fehl. Dennoch gelang es nach Analyse einer Präparation der S-Volllängenvariante vereinzelte S-Proteine zu identifizieren, welche in Abmessungen in Übereinstimmung mit der erwarteten Größe stand (siehe Ergebnisse). Zur Analyse der aufgereinigten S-Proteine von SARS-CoV in verschiedenen Orientierungen wurden zusätzlich Ni-Lipidhaltige SUVs hergestellt und mit den entsprechenden (His)6-Tag Varianten des S-Proteins inkubiert. Es konnte keine Anlagerung oder Ausrichtung der Proteine an die Liposomen beobachtet werden. Lediglich Veränderungen in Form und Gestalt der SUVs wurden erfasst (siehe Ergebnisse).
Die Zusammenlagerung der S2-Untereinheiten zu Rosetten ist vergleichbar mit der Situation der HA2-Untereinheit nach der Fusion. Das Hämagglutinins (HA) des Influenzavirus A, bildet nach pH-Erniedrigung und proteolytischem Abbau der rezeptorbindenden HA1-Domäne ebenfalls Rosetten aus [219]. Ähnliches wird für die S2-Trimere des S-Proteins von SARS-CoV angenommen, da auch diese nach Dissoziation der S1-Untereinheiten Rosetten ausbilden. Im intakten Virus oder Pseudovirus liegen die S-Proteine jedoch bereits als Trimere vor, eine Trimerisierung ist für den viralen Eintritt also nicht mehr notwendig. Die physiologische Relevanz der pH-induzierten Trimerisierung für den Eintritt in die Zelle bleibt unklar. Die Behandlung mit Trypsin kann die Fusion von S-Protein exprimierenden Zellen bei neutralem pH-Wert zusätzlich unterstützen [6,168]. Nach Behandlung mit Trypsin, Thermolysin oder Elastase kann der Eintritt für S-Protein beinhaltende Pseudovirionen trotz Inhibierung mit lysosomotropen Agenzien ermöglicht werden [6,220]. Insbesondere im Hinblick auf die Länge des HR1/HR2-Komplexes der S2-Untereinheit weisen die von Li et al. beobachteten S2-Rosetten typische Charakteristika der Postfusionskonformation auf [154].
Neben der Untersuchung des in Zellen exprimierten S-Proteins von SARS-CoV wurden S-Proteine von MHV-A59 an intakten Viruspartikeln untersucht. Soweit bekannt, wurden für MHV-A59 noch keine kryoelektronenmikroskopischen Untersuchungen durchgeführt. Lediglich elektronenmikroskopische Aufnahmen früherer Arbeiten geben Hinweise auf Form und Orientierung der S-Proteine in der viralen Hüllmembran [197]. Die Viruspartikel konnten in der vorliegenden Arbeit in hochreiner Form isoliert werden und zeigen runde, ovale oder nierenförmige Gestalt (siehe Ergebnisse), wie dies bereits für andere Coronaviren wie SARS-CoV beschrieben wurde [165]. Unter neutralen pH-Bedingungen zeigen die Virionen gut definierte S-Proteine mit einer ungefähren Länge von 20 nm (180-200 Å), die aus einer kurzen Stammregion und einer großen, globulären, triangulären Kopfdomäne bestehen, die distal der Hüllmembran orientiert ist. Die ermittelte Morphologie des S-Proteins steht sowohl mit der von Sturman et al. publizierten [197] als auch mit den neuesten Untersuchungen an SARS-CoV [165,218] in Übereinstimmung. Diese Arbeiten zeigen für das gesamte S-Protein ausgehend von der viralen Hüllmembran eine Ausdehnung von 180 Å. Die Struktur besitzt eine kurze Stammdomäne und eine große Kopfdomäne triangulärer Form.
Für eine 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 mit der Einzelpartikelmethode war es im Verlauf der weiteren Untersuchungen wichtig einzelne, nicht überlappende S-Protein-Partikel zu finden, die sich in vielen unterschiedlichen Raumwinkeln orientierten. Für isolierte Viruspartikel mit zahlreichen S-Proteinen auf der Oberfläche wurden die Untersuchungen zunächst unter neutralen pH-Bedingungen durchgeführt. Auf diese Weise konnten mehr als 2800 Einzelpartikel extrahiert werden, die in 440 Klassensummenbildern zusammengefasst wurden (Abbildung 36). Ausschnitt A der Abbildung 36 zeigt die membranverankerten S-Proteine eines MHV-A59 Viruspartikels (Details siehe Ergebnisse). Für die 3D-Rekonstruktrion stellte vor allem das Fehlen von Ansichten von oben, sogenannten „Top Views“, eine Schwierigkeit dar.
Dennoch gelang nach Abgleich der Klassensummenbilder die Erstellung einer vorläufigen 3D-Rekonstruktion. Die Hauptstrukturmerkmale des S-Proteins von MHV-A59 sind Kopf- und Halsdomäne (siehe Ergebnisse). Die Kopfdomäne wiest drei exponierte „Flügel“ auf und erscheint prädestiniert für die Bindung des Rezeptormoleküls.
Beniac et al. verfolgten in ihren Untersuchungen einen ähnlichen Ansatz der 3D-Rekonstruktion des S-Proteins für SARS-CoV, wie dies in der vorliegenden Arbeit für das S-Protein von MHV-A59 erfolgte (Abbildung 38). Überraschenderweise kamen sie zu einer gänzlich anderen Struktur (Abbildung 38 F-H). Als mögliche Ursache wurde zunächst die Verwendung des Kontrastmittels Phosphorwolframsäure in Erwägung gezogen, da die Daten von Beniac et al. aus reinen Kryo-TEM-Aufnahmen gewonnen wurden. Die rein kryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen von MHV-A59 ohne Kontrastmittel zeigen allerdings die gleiche Morphologie und Struktur der S-Proteine wie nach Verwendung des Kontrastmittels (Abbildung 38 A). Die Primärsequenzen der S-Proteine von SARS-CoV und MHV-A59 ähneln sich sehr und weisen eine Sequenzhomolgie von über 30% auf. Ein Unterschied findet sich in der Länge der Sequenzen: Das S-Protein von MHV-A59 ist mit 1,324 AS-Resten etwas länger, als das von SARS-CoV mit 1,255 AS-Resten, dies entspricht auch den ermittelten Größenunterschieden des resultierenden Trimers. Ferner liegt das S-Protein von SARS-CoV vermutlich ungespalten vor, wogegen das S-Protein von MHV-A59 nach der Virusmaturierung gespalten ist. Der Spaltungsgrad des S-Proteins von SARS-CoV wird in der Literatur nach wie vor kontrovers diskutiert. Neuesten Studien zufolge wird das S-Protein durch die zelluläre Protease (Xa) in der Wirtszelle posttranslational in S1 und S2 gespalten [223]. Ähnliches wurde bereits von Wu et al. in VeroE6 Zellen nachgewiesen, die mit SARS-CoV infiziert wurden [166]. Frühere Untersuchungen dagegen zeigen, dass das S-Protein von SARS-CoV in der Wirtszelle nicht prozessiert wird [217]. Schließlich konnten Li et al. nachweisen, dass nach Inkubation bei niedrigem pH-Wert eine Trimerisierung der S0-Monomere stattfindet. Diese Struktur weist tatsächlich einen breiteren Kopf auf (Abbildung 39 B), besitzt allerdings nicht die Dimensionen der von Beniac et al. beschriebenen Struktur. Die Köpfe sind stärker voneinander separiert und die Stammdomäne erscheint wesentlich breiter. Möglicherweise wirkt sich das Fehlen der Transmembrandomäne und/oder der intraviralen Domäne auf die Form des S-Proteins aus. Die von Li et al. beschriebenen L-förmigen Monomere und die trypsingespaltenen Trimere ähneln teilweise der in dieser Arbeit rekonstruierten 3D-Struktur des S-Proteins von MHV-A59. Dennoch bleibt die Frage bestehen, warum sich die S0-Konformation von Li et al. so stark von der S0-Anordnung von Beniac et al. unterscheidet.
Zusätzliche Experimente sollten Aufschluss über die unterschiedlichen Konformationszustände des S-Proteins von MHV-A59 geben. Nach Inkubation bei pH 5.0 und 37°C wurden verschiedene Anordnungen der S-Proteine erfasst, die vermutlich unterschiedlichen Intermediaten der Konformationsstadien entsprechen (siehe Ergebnisse). Die häufigste Form der Konformation des S-Proteins nach pH-Erniedrigung stellen verlängerte, dünne Stämme dar, die keine Kopfdomäne tragen (Abbildung 39 D’). Die Inkubation der Viren bei pH 5.0 führt im S-Protein von MHV-A59 vermutlich zur Dissoziation der S1-Untereinheiten, wie dies von Li et al. für SARS-CoV nach proteolytischer Spaltung und Inkubation mit Harnstoff beschrieben wurde (Abbildung 39 D [218]). Für MHV-A59 ist jedoch bekannt, dass die proteolytische Spaltung der S-Proteine bereits während der Maturierung in der Wirtszelle erfolgt (Abbildung 39 A‘-C’) [152]. Somit ist unseren Daten zufolge die pH-Erniedrigung allein ausreichend, um die Dissoziation der rezeptorbindenden S1-Untereinheiten zu induzieren (Abbildung 39 D’). Diese Experimente zeigen, dass die Konformationsänderung des S-Proteins tatsächlich durch den pH-Wert beeinflusst werden kann.
Für SARS-CoV wurde das mutmaßliche Fusionspeptid kürzlich von Sainz et al. identifiziert und charakterisiert [108]. Basierend auf den konservierten Eigenschaften bereits bekannter Fusionspeptide und nach Auswertung der Hydrophobizitätsplots der S2-Untereinheit von SARS-CoV, gelang zunächst die Identifizierung von zwei Fusionspeptidkandidaten (SARSWW-1 und SARSWW-2). Diese liegen in der Nähe des N-Terminus der S2-Untereinheit und gehören somit zur Klasse der N-terminalen Fusionspeptide. Beide Peptide sind reich an Alanin-, Glycin- und Phenylalaninresten. Ferner besitzen sie ein charakteristisches Tripeptid (YFG/FXG). Nur eines der 19 Aminosäuren langen Peptide - SARSWW-1 - war in der Lage Liposomen zur Fusion zu bringen.
Für das Coronavirus MHV-A59 wird ein intern lokalisiertes Fusionspeptid angenommen, welches vermutlich nahe der HR1-Region liegt [176,177,230]. Bis jetzt konnte für das Coronavirus MHV-A59 jedoch noch kein Fusionspeptid identifiziert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Eigenschaften bereits bekannter Fusionspeptide, durch Analyse der Hydrophobizitätsplots und möglicher Sekundärstrukturen versucht, geeignete Fusionspeptidkandidaten zu ermitteln. Zur detaillierten Analyse wurden Hydrophobizitätsplots der Volllängenvariante und der S2-Untereinheit des S-Proteins erstellt. Neben den bereits bekannten hydrophoben Regionen, wie dem Signalpeptid am N-Terminus und der Transmembrandomäne am C-terminalen Ende des Proteins, konnten in der S2-Untereinheit zunächst vier Fusionspeptidkandidaten (FP1-FP4) identifiziert werden (siehe Ergebnisse). Im weiteren Verlauf der Untersuchungen wurden die Hydrophobizitätsplots der Fusionspeptidkandidaten mit denen bereits bekannter viraler Fusionspeptide von HIV und EboV verglichen (siehe Ergebnisse). Es ist gelungen, zwei geeignete Fusionspeptidkandidaten - FP1-1 und FP1-2 - zu identifizieren, die mehrheitlich alle Charakteristika für Fusionspeptide erfüllen. Nach Lage im viralen Fusionsprotein gehören sie zu den internen Fusionspeptiden wie die Fusionspeptide von EboV [102] und ASLV [103]. Beide Fusionspeptidkandidaten weisen eine Länge von höchstens 27 Aminosäuren auf und bestehen vorwiegend aus hydrophoben Resten wie Alanin (A), Glycin (G) und Phenylalanin (F). Die Hydrophobizitätswerte der Kandidaten bewegen sich im Bereich von ΔG = 2-6 kcal/mol. Alle Fusionspeptidkandidaten weisen zudem einen für interne Fusionspeptide charakteristischen zentralen Prolinrest auf, der für die Interaktion mit der Zielmembran essentiell ist [116,117,118,119]. Nach Analyse der Sekundärstruktur kann festgestellt werden, dass die Fusionspeptidkandidaten FP1-1 und FP1-2 eine α-helikale Konformation einnehmen (siehe Ergebnisse).
Die Auflösung der vorläufigen 3D-Struktur des S-Proteins von MHV-A59 bedarf weiterer Optimierung. Zusätzlich könnten S-CEACAM1a-Interaktionsstudien Aufschluss über die Lokalisierung der Rezeptorbindungsdomäne geben. Vergleiche mit bereits bekannten Strukturen viraler Fusionsproteine könnten zur Aufklärung des zugrunde liegenden Fusionsmechanismus beitragen. Die gravierenden Unterschiede zur bereits veröffentlichten 3D-Struktur des S-Proteins von SARS-CoV sollten im Detail analysiert werden. In diesem Zusammenhang stellt die kryoelektronenmikroskopische Analyse ungespaltener S-Proteine einen besonders wichtigen experimentellen Ansatz dar. Die 3D-Rekonstruktion ungespaltener S-Proteine könnte mit Hilfe der Virusvariante MHV-A59 FI angefertigt werden.
Nach theoretischer Identifizierung des Fusionspeptidkandidaten von MHV-A59 sollten experimentelle Untersuchungen mit entsprechenden synthetischen Peptiden durchgeführt werden. Zusätzlich könnten Mutationsstudien Aufschluss über die an der Fusion beteiligten Aminosäurereste liefern.