Visualisierung und Charakterisierung der S-Protein vermittelten Fusion von Coronaviren

117 Seiten, 39 Abbildungen und 21 Tabellen, Patricia Eifart, 2007, Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, Dissertation

Die Infektion von Zellen durch das Coronavirus MHV-A59 setzt die Freisetzung des viralen Genoms nach Fusion mit der zellulären Targetmembran voraus. Die Fusionsreaktion wird vom viralen S-Protein vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Eintrittsweg von MHV-A59 in Mauszellen mit zwei unabhängige experimentellen Ansätzen untersucht. Die Infektivität konnte durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren der Clathrin-abhängigen Endozytose signifikant gehemmt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass der Eintritt von MHV-A59 in Mauszellen über die Clathrin-abhängige Endozytose erfolgt und die anschließende Fusion der viralen und zellulären Membran in einem intrazellulären Kompartiment mit niedrigem pH-Wert stattfindet. Durch Inhibitoren endosomaler Proteasen dagegen wurde die Infektivität nur leicht beeinträchtigt. Epifluoreszenz- und konfokalmikroskopische Studien zur Interaktion fluoreszenzmarkierter MHV-A59 Partikel mit Mauszellen konnten nachweisen, dass MHV-A59 über Endozytose aufgenommen wird. Die Färbung intrazellulärer Kompartimente lässt die Fusion von viraler und zellulärer Membran vermuten. Nach Bindung der Viren an die Zellen und anschließende Erniedrigung des pH-Wertes auf 5.0, welcher das Milieu endosomaler Organellen simuliert, wurde eine deutliche Färbung der Plasmamembran beobachtet. Unter neutralen pH-Bedingungen konnte dagegen keine Markierung der Plasmamembran beobachtet werden. Die Erniedrigung des pH-Werts in Abwesenheit des Rezeptors führte ferner zu einer irreversiblen Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein, die zur Inaktivierung der Fusionsaktivität und zum Verlust der Infektivität führte. Diese Reaktion konnte kryoelektronen- und fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten auf eine wesentliche Beteiligung des endozytotischen Weges für den viralen Eintritt von MHV-A59 hin und lassen vermuten, dass ein niedriger pH-Wert, bereitgestellt durch ein zelluläres endosomales Kompartiment, die Konformationsänderung im S-Protein induziert und somit die Fusionsreaktion auslöst. Die kryoelektronenmikroskopische Analyse und 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 in der natürlichen Umgebung der viralen Hüllmembran führte zur Erstellung eines vorläufigen 3D-Modells der nativen S-Protein Konformation.

Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur und Fusionsfähigkeit des S-Proteins von SARS-CoV analysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass das S-Protein von SARS-CoV als Trimer sezerniert wird. Zusätzlich wurde ein auf Fluoreszenzmikroskopie basierender Zell-Zell-Fusionsassay etabliert. Dieser konnte nachweisen, dass die Zell-Zell-Fusion zwischen S-Protein und ACE2-exprimierenden Zellen sowohl abhängig vom pH-Wert als auch von der proteolytischen Spaltung in S1- und S2-Untereinheit ist und durch Erniedrigung des pH-Wertes zusätzlich verstärkt werden kann. Die genaue Rolle des niedrigen pH-Wertes bei der Konformationsumwandlung und/oder einer Aktivierung endosomaler Proteasen bedarf weiterer Untersuchungen.

Im abschließenden Teil der Arbeit wurde auf der Basis vergleichender theoretischer Untersuchungen eine Vorhersage des mutmaßlichen Fusionspeptids des S-Proteins von MHV-A59, welches alle wesentlichen Merkmale eines internen Fusionspeptids aufweist, vorgenommen. Es liegt nahe der „Heptad-Repeat“ (HR) Domäne HR1. Experimentelle Ansätze bleiben jedoch unabdinglich, um das Fusionspeptid, insbesondere in bezug auf dessen Vermittlung der Fusion, näher zu charakterisieren.

Analysis of S-Protein mediated Fusion of Coronaviruses

117 pages, 39 Figures and 21 Tables, Patricia Eifart, 2007, Berlin, Humboldt University Berlin, Dissertation

Infection by the coronavirus mouse hepatitis virus (MHV)-A59 requires the release of the viral genome by fusion with the respective target membrane of the host cell. Fusion is mediated by the viral S-protein. Here, the entry pathway of MHV-A59 into murine cells was studied by mainly two independent approaches. Infection of cells assessed by the plaque reduction assay was strongly inhibited by lysosomotropic compounds and substances which interfere with clathrin-dependent endocytosis, suggesting that MHV-A59 is taken up via endocytosis and delivered to acidic endosomal compartments. Infection was only slightly reduced in the presence of substances inhibiting endosomal proteases. Fluorescence confocal microscopy of labeled MHV-A59 confirmed that the virus is taken up via endocytosis. Bright labeling of intracellular compartments suggests their fusion with the viral envelope. No fusion with the plasma membrane was observed under neutral pH conditions. However, when virus was bound to cells and the pH was lowered to 5.0, we observed a strong labeling of the plasma membrane. Electron microscopy revealed low pH triggered conformational alterations of the S-ectodomain. Very likely, these alterations are irreversible because low pH-treatment of viruses in the absence of target membranes caused an irreversible loss of the fusion activity. The results imply that endocytosis plays a major role in MHV-A59 infection and that the acidic pH of the endosomal compartment triggers a conformational change of the S-protein mediating fusion. Furthermore different conformations of the trimeric spike protein of the murine hepatitis virus A59 in its native environment, the viral envelope, were characterized by cryoelectron and electron microscopy. A preliminary 3D-reconsruction of the native structure at room temperature and neutral pH could be accomplished.

Besides we studied the structure and fusion capability of the spike protein expressed by SARS-CoV. The accomplished data indicate that the spike glycoprotein is secreted as a trimer. Furthermore a cell-cell fusion assay based on fluorescence microscopy was established. The fusion of spike protein and ACE2-receptor expressing cells was strongly dependent on low pH and on proteolytic cleavage of the S-protein into S1 and S2 subunit, whereas fusion could be significantly increased by lowering of the pH. Nevertheless, the precise function of low pH in either induction of the conformational change or activation of the respective endosomal protease and/or a combination of both is not unveiled yet and has to be investigated in more detail.

The final theoretical part of this thesis allowed the identification of the putative fusion peptide, which showed the main characteristics of internal fusion peptides. It is located near the HR1 region and allows the heptad regions of the spike protein to assemble in the six-helix bundle structure (6HB). This structure is of great importance to initiate the approximation of viral and cellular membrane and thus to induce fusion. However, future experiments are indispensable to characterize the main features and to elucidate the particular role of the fusion peptide in fusion mediation.

Coronavirus MHV-A59 Cell Entry SARS-CoV fusion protein 3D structure S protein Fusion Fluorescence Microscopy Conformation Endocytosis Inhaltsverzeichnis

• A Einleitung

  • A.1 Wege des viralen Eintritts

    • A.1.1 Der Clathrin-abhängige virale Eintritt 

    • A.1.2 Der Clathrin-unabhängige virale Eintritt

    • A.1.3 Identifizierung des viralen Eintrittswegs

  • A.2 Virale Fusionsproteine

    • A.2.1 Aktivierung der Fusion durch niedrigen pH-Wert 

    • A.2.2 Aktivierung der Fusion durch Rezeptorinteraktion

    • A.2.3 Die Zwei-Schritt Aktivierung des Alpharetrovirus

  • A.3 Virale Fusionspeptide 

    • A.3.1 N-terminale Fusionspeptide

    • A.3.2 Interne Fusionspeptide

    • A.3.3 Die Rolle viraler Fusionspeptide während der Fusion

  • A.4 Coronaviren

    • A.4.1 Aufbau und Replikation von Coronaviren 

    • A.4.2 Der virale Eintritt von MHV-A59

    • A.4.3 Das S-Protein von Coronaviren

      • A.4.3.1 Das S-Protein von SARS-CoV

      • A.4.3.2 Das S-Protein von MHV-A59

    • A.4.4 Das Fusionspeptid der Coronaviren

• B Zielsetzung

• C Material und Methoden

  • C.1 Chemikalien und Lösungen

  • C.2 Biologisches Material

    • C.2.1 Viren

    • C.2.2 Zellen

    • C.2.3 Bakterien

  • C.3 Eukaryotische Zellkultur

    • C.3.1 Passagieren eukaryotischer Zellen

    • C.3.2 Einfrieren und Auftauen eukaryotischer Zellen

  • C.4 Molekularbiologie

    • C.4.1 Bakterienkultur

      • C.4.1.1 Vorkultur

      • C.4.1.2 Einfrieren und Auftauen von Bakterien

    • C.4.2 Transformation von Bakterien

    • C.4.3 Aufreinigung der Plasmide

      • C.4.3.1 Plasmid-DNA Mini-Präparation

      • C.4.3.2 Plasmid-DNA Maxi-Präparation

    • C.4.4 Konzentrationsbestimmung und Reinheitsgrad aufgereinigter DNA

    • C.4.5 Klonierung der Plasmid-DNA

  • C.5 Expression rekombinanter Proteine im eukaryotischen Zellsystem

    • C.5.1 Transfektion eukaryotischer Zellen

    • C.5.2 Expression, Isolierung und Analyse der Proteine 

      • C.5.2.1 Isolierung der Volllängenvarianten

      • C.5.2.2 Isolierung sezernierter Proteinvarianten

      • C.5.2.3 Aufreinigung der Proteinvarianten mit (His)₆-Tag

      • C.5.2.4 Aufreinigung der Proteinvarianten ohne Tag

    • C.5.3 SDS-PAGE und Native Gelelektrophorese

    • C.5.4 Westernblotanalyse

  • C.6 Viruszucht

    • C.6.1 Zucht von Influenzaviren

    • C.6.2 Zucht von MHV

    • C.6.3 Zucht von VSV

  • C.7 Virusaufreinigung

    • C.7.1 Aufreinigung des Influenzavirus

    • C.7.2 Aufreinigung der Maushepatitisviren und Isolierung des S-Proteins

  • C.8 Herstellung von SUV mit Ni-Lipiden

  • C.9 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

    • C.9.1 Kryoelektronenmikroskopie

    • C.9.2 Elektronenmikroskopie an negativkontrastierten Proben

    • C.9.3 Rechnergestützte Bildverarbeitung nach der Einzelpartikelmethode

  • C.10 Plaqueassay und Plaquereduktionsassay

  • C.11 Charakterisierung und Analyse der Fusion von Coronaviren

    • C.11.1 Herstellung von Erythrozytenghost

    • C.11.2 Markierung der Viren

    • C.11.3 Fusionsmessungen

  • C.12 Mikroskopie

    • C.12.1 Epifluoreszenzmikroskopie

    • C.12.2 Konfokalmikroskopie

  • C.13 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Fusion von SARS-CoV

    • C.13.1 Überprüfung der Oberflächenexpression des S-Proteins von SARS-CoV und des humanen Rezeptors hACE2

    • C.13.2 Kultur der Zellen

    • C.13.3 Markierung der Zellen

    • C.13.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung zur Fusion

  • C.14 Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59

• D Ergebnisse

  • D.1 Expression und Isolierung des S-Proteins von SARS-CoV und des humanen Rezeptors hACE2

    • D.1.1 Optimierung der Expressionsbedingungen

    • D.1.2 Expression und Aufreinigung des S-Proteins von SARS-CoV

    • D.1.3 Klonierung und Expression der Volllängenvariante des S-Proteins von SARS-CoV mit myc-(His)₆-Tag

    • D.1.4 Expression verschiedener Varianten des ACE2-Rezeptorproteins

  • D.2 Isolierung und Aufreinigung von MHV-A59

  • D.3 Elektronenmikroskopische Untersuchungen des S-Proteins von Coronaviren

    • D.3.1 Elektronenmikroskopische Untersuchungen des S-Proteins von SARS-CoV

    • D.3.2 Elektronenmikroskopische Analyse des S-Proteins von MHV-A59 

      • D.3.2.1 Charakterisierung der Konformationsänderung des S-Proteins von MHV-A59

      • D.3.2.2 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59

  • D.4 Identifizierung des Infektionsweges von MHV-A59 

    • D.4.1 Die Infektivität von MHV-A59 kann durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren der Endozytose gehemmt werden

    • D.4.2 Proteaseinhibitoren haben keinen Einfluss auf die Infektivität von MHV-A59

  • D.5 Charakterisierung der Fusionsaktivität von MHV-A59 und SARS-CoV

    • D.5.1 Fluoreszenzspektroskopische Untersuchung der Fusion von MHV-A59

    • D.5.2 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Fusion von MHV-A59 

    • D.5.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Fusionseigenschaften von SARS-CoV

  • D.6 Irreversibilität der Konformationsumwandlung des S-Proteins von MHV-A59 

  • D.7 Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59

    • D.7.1 Die Sequenz und Primärstruktur des Spikeproteins von MHV-A59

    • D.7.2 Analyse der Aminosäuresequenz des S-Proteins von MHV-A59

      • D.7.2.1 Hydrophobizitätsplots des S-Proteins von MHV-A59

    • D.7.3 Die Lage der möglichen Fusionspeptide im S-Protein von MHV-A59

• E Diskussion

  • E.1 Identifizierung des Infektionsweges von Coronaviren

  • E.2 Die Struktur des S-Proteins von Coronaviren

    • E.2.1 Das S-Protein von SARS-CoV

    • E.2.2 Die S-Protein-vermittelte Fusion von SARS-CoV

  • E.3 Das S-Protein von MHV-A59

    • E.3.1 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59

    • E.3.2 Konformationen des S-Proteins von MHV-A59

  • E.4 Identifizierung des Fusionspeptids von MHV-A59

  • E.5 Ausblick

• Abkürzungen

• Literaturverzeichnis

• Tabelle 1: Wege des viralen Eintritts

• Tabelle 2: Inhibitoren der Endozytose und andere Substanzen

• Tabelle 3: Virale Fusionsproteine

• Tabelle 4: Eigenschaften viraler Fusionsproteine der Klassen I und II [62]

• Tabelle 5: Virale Fusionspeptide

• Tabelle 6: Strukturproteine der Coronaviren

• Tabelle 7: Viren

• Tabelle 8: Eukaryotische Zellen

• Tabelle 9: Bakterien

• Tabelle 10: Vektoren und Plasmide

• Tabelle 11: Restriktionsenzyme

• Tabelle 12: Verwendete Plasmide und exprimierte Proteine

• Tabelle 13: Verwendete Antikörper

• Tabelle 14: Verwendete Lipide für die Liposomen-Herstellung

• Tabelle 15: Inhibitoren der Endozytose und andere Substanzen

• Tabelle 16: Antikörper für die IFM

• Tabelle 17: Bedingungen der Zell-Zell-Fusion

• Tabelle 18: Physikalische Eigenschaften von Coronaviren

• Tabelle 19: Titerbestimmung der einzelnen Fraktionen nach der Virusaufreinigung

• Tabelle 20: Domänenstruktur des S-Proteins von MHV-A59.

• Tabelle 21: Fusionspeptidkandidaten von MHV-A59.

• Abbildung 1: Wege des viralen Eintritts [1]. (A) Makropinozytose. (B) Clathrin-unabhängiger, direkter Eintritt nach Fusion mit der Plasmamembran (PM). (C) Clathrin-abhängiger Weg über frühe und späte Endosomen zu Lysosomen. (D) Caveolin-abhängiger, Cholesterol-abhängiger Weg mit anschließendem Transport zum Caveosom und ER. (E) Cholesterol-abhängiger, Caveolin- und Clathrin-unabhängiger Weg mit anschließendem Transport zum Caveosom und ER. (F) Dynamin-2-abhängiger, Caveolin-abhängiger Weg mit Transport zum Caveosom und ER.

• Abbildung 2: Der endozytotische virale Eintritt in die Zelle [1]. Neun Schritte des viralen Eintritts werden bis zur Freisetzung des Nukleokapsids durchlaufen. In diesem Beispiel wird das virale Nukleokapsid in den Nukleus transportiert.

• Abbildung 3: Die Wirkungsweise lysosomotroper Substanzen und anderer Inhibitoren (modifiziert, [1].Lysosomotrope Substanzen wie Ammoniumchlorid (A), Monensin (B), Bafilomycin A1 und Concanamycin A (B) führen zur Neutralisierung des sauren Lumens von Endosomen und verhindern so die Auslösung des pH-abhängigen Fusionsprozesses. (C) Chlorpromazin verhindert die Bildung Clathrin-haltiger Vesikel und somit den endozytotischen Transport der Zelle. (D) MβCD und Filipin III führen zur Cholesterolverarmung der Plasmamembran der Zielzelle. (E) Proteaseinhibitoren wie Leupeptin und E-64 inhibieren Cysteinproteasen im Lumen von Endosomen.

• Abbildung 4 : Modell der HA-vermittelten Membranfusion (A. Herrmann). (A) HA liegt zunächst im metastabilen Zustand vor. (B) Nach Bindung und pH-Erniedrigung kommt es zu Konformationsumwandlungen innerhalb des Proteins. Die Fusionspeptide tauchen in die Zielmembran ein. (C) Durch einen als „Spring-Loaded“ Mechanismus bezeichneten Vorgang kommt es zur Verkürzung der HA-Moleküle, durch die eine Annäherung der N-teminalen Fusionspeptide und der C-terminalen Transmembrandomänen erfolgt, was schließlich zur Annäherung der Membranen und zur Ausbildung der „Sechs-Helix-Bündel“-Struktur führt. (D) Zunächst wird die Hemifusion ausgelöst. Die äußeren Lipidschichten verschmelzen miteinander. (E) Nachdem die Membranen fusioniert sind, kommt es zur Ausbildung der Fusionspore. (F) Die Weitung der Fusionspore ermöglicht die Entlassung des viralen Nukleokapsids. 

• Abbildung 5 : Coronaviren. (A) EM-Micrograph und (B) schematische Darstellung des SARS-CoV [ 144 ] . (C) EM-Micrograph von MHV-A59 (K. Ludwig und C. Böttcher, FU- Berlin). Balken: (A) 100 nm, (C) 200 Å.

• Abbildung 6: Replikationszyklus von Coronaviren [144]). (1) Bindung und Eintritt des Virus in die Zelle. (2) Fusion des Virus mit der zellulären Membran und Freisetzung des Nukleokapsids in die Wirtszelle (Uncoating). (3) Replikation und Transkription der viralen Proteine. (4) Assemblierung neuer Viruspartikel und (5) Freisetzung dieser. Zur Vereinfachung wurde nur eine Variante des Eintritts gezeigt.

• Abbildung 7: Das S-Protein der Coronaviren [165,171]. (A) Dreidimensionale (3D)-Rekonstruktion von SARS-CoV. Orange – S-Protein, blau/pink – virale Hüllmembran, rot - Nukleokapsid. (B) Das S-Protein mit den möglichen Rezeptorbindungsdomänen für ACE2 und der Stammdomäne mit den mutmaßlichen Fusionspeptiden. (C) „Top-View“ auf das S-Protein mit gebundenem ACE2-Rezeptor (lila). (D) Lage des Fusionskerns aus HR1 und HR2 (PDB-2FXP [172]) im Inneren der Proteinstruktur. Bindung des ACE2-Rezeptors (lila) an die Rezeptorbindungsdomäne (PDB-2AJF [166]) (rot) des S-Proteins. Kolorierung nach zylindrischer Tiefe. (E) Lineares Schema der S-Proteine von SARS-CoV und MHV. Pfeil: Proteolytische Spaltungsstelle zwischen S1 und S2-Untereinheit [171]. SP- Signalpeptid, RBD - Rezeptorbindungsdomäne, HR - Heptad-Repeat, TM - Transmembrandomäne, CT - cytoplasmatische Domäne.

• Abbildung 8 : Optimierung der Transfektionsbedingungen für die Expression von S- und ACE2-Protein. (A und B) Vergleich der Transfektionsbedingungen von S-Ekto. Expression in zwei verschiedenen Zellsystemen mit verschiedenen Transfektionsreagenzien (PF und DF) und unterschiedlichen Infektionsbedingungen (+VV/-VV). Abkürzungen: VV-rekombinantes Vakziniavirus - VTF7.3; +VV-mit Infektion; -VV – ohne Infektion, PF – PolyFect; DF – DreamFect (siehe Material und Methoden und Text).

• Abbildung 9: Proteinanalyse der S-Ektodomäne von SARS-CoV. (A) Westernblot des Elutionsprofils des exprimierten S-Proteins von SARS-CoV nach NiNTA-Aufreinigung. M–Marker, B–Bindungsfraktion, W–Waschfraktion, E–Eluatfraktion, 1 - 5: 100–500 mM Imidazol. (B und C) SDS-PAGE: S-Proteinbanden unter reduzierenden (B) und nicht-reduzierenden (C) Bedingungen (siehe Material und Methoden, sowie Text). (C) Native Gelelektrophorese. HMW – High Molecular Weight Marker (Hochmolekulargewichtsmarker). Die Proteine im 10%igen Polyacrylamidgel wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht.

• Abbildung 10: Expression der Volllängenvariante des S-Proteins von SARS-CoV. Nach Lyse der transfizierten Zellen wurden die Proteine zunächst über eine SDS-PAGE aufgetrennt, anschließend über Westernblot und nachfolgender Detektion mit dem polyklonalen anti-S-Full #IMG542 Antikörper analysiert (Details in Material und Methoden). NC - Negativkontrolle, S - Spike, C-100 – Centricon-100 

• Abbildung 11: Klonierung der Volllängenvariante des S-Proteins von SARS-CoV mit myc-His-Tag. (A) Verdau des pcDNA3.1/myc-His A Vektors mit BamHI und XbaI (Spur 2, Größe ~5.5 kb). Verdau der S-Full beinhaltenden pcDNA3.1 mit BamHI und XbaI (Spur 3, ~3.9 kb) und die anschließende Überprüfung der Ligationsansätze #2-#9. (B) Zur Verifizierung der Ergebnisse wurde nach Amplifikation der pcDNA3.1 myc-His S-Full (Maxipräparation, siehe Material und Methoden) die DNA mit BamHI und XbaI verdaut (Spur 2). Zum Vergleich wurde das unverdaute Plasmid aufgetragen (Spur 1). 

• Abbildung 12: Expression der Volllängenvariante des S-Proteins von SARS-CoV mit myc-His-Tag. Inkubation der Westernblots mit dem anti-myc Antikörper (A) und dem anti-S-Full #IMG-542 Antikörper (B) (siehe Material und Methoden). NC – Negativkontrolle; PC – Positivkontrolle.

• Abbildung 13: Nachweis des ACE2-Rezeptors in VeroE6 Zellen und Expression von ACE2 in HEK293T-Zellen. (A) VeroE6 Zellen exprimieren den ACE2-Rezeptor endogen. Mit einem detergenzhaltigen Solubilisierungspuffer inkubierte Zellen wurden nach differentieller Dichtezentrifugation mittels Westernblot und nach Inkubation mit einem gegen ACE2 gerichteten monoklonalen Antiköper analysiert (siehe Material und Methoden). Die entsprechende Proteinbande wurde im Bereich von 110 kDa detektiert. (B) Expression der ACE2-Varianten in HEK293T Zellen. Verdünnungsfaktor 10 bei transfizierten HEK293T-Zellen.

• Abbildung 14 : Isolierung und Charakterisierung von MHV-A59. SDS-PAGE (10%), Silberfärbung einer MHV-A59 Virusaufreinigung. Die Virusüberstande P1 und P2 48 h p.i. zeigen zahlreiche Proteinbanden. Das PEG-Präzipitat weist deutlich weniger und schwächere Proteinbanden auf. MHV-A59 Virusaufreinigung über einen diskontinuierlichen Saccharosestufengradienten mit 30 und 50% Saccharose 16 h nach Ultrazentrifugation bei 110,000 x g. Die Virusbande ist nach Zentrifugation an der Phasengrenze zwischen 30 und 50% Saccharose als weißlich, milchig zu erkennen. Das am stärksten exprimierte N-Protein ist in hoher Konzentration vertreten (MHV-Bande bei 45-55 kDa). Ü1 (höchstens 30% Saccharose) und Ü2 (höchstens 50% Saccharose).

• Abbildung 15 : Isolierung des S-Proteins aus intakten MHV-A59. (A) Isolierung von MHV-A59 (Spur 1), Lyse der isolierten Viren mit NP-40-Lysepuffer (Spur 2 und 3). Fraktionen 20-23 eines kontinuierlichen Saccharosedichtegradienten von MHV-A59 mit den einzelnen Strukturproteinen S, M und N (Spuren 4-7) (siehe Material und Methoden sowie Text). (B) Fraktionen 12-28 eines kontinuierlichen Saccharosedichtegradienten lysierter Virionen. Die einzelnen Strukturproteine von MHV-A59 mit den jeweiligen Molekulargewichten sind rechts aufgeführt. 10%ige SDS-PAGE, Silberfärbung. S - Spikeprotein, M – Matrixprotein, N – Nukleokapsidprotein.

• Abbildung 16 : Elektronenmikroskopische Analyse des S-Proteins von SARS-CoV. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme aufgereinigter S-Proteinpartikel (S-Ekto). (B) S-Proteine (S-Full) mit Transmembrandomäne bilden Proteinaggregate. (B-1) S-Protein in Vergrößerung. Balken: 200 nm (A) und 200 Ǻ (B-1).

• Abbildung 17 : Die Ausrichtung des S-Proteins von SARS-CoV an Ni-lipidhaltigen SUVs. Die exprimierte S-Proteinvariante – S-Ekto besitzt am C-Terminus einen (His)₆-Tag, der mit Ni-Ionen chelatiert. Ni-lipidhaltige Liposomen sollten den C-Terminus des S-Proteins binden und somit orientiert werden. (A) Ni-lipidhaltige Liposomen (SUV). (B) Aufgereinigtes S-Protein (S-Ekto) in Lösung. (C) Ni-lipidhaltige SUVs im Gemisch mit der Ektodomäne des S-Proteins. Balken: 100 nm.

• Abbildung 18: Elektronenmikroskopische Untersuchung von MHV-A59. (A) Bei neutralem pH (7.4) und RT inkubierte MHV-A59 Partikel. Zur detaillierten Betrachtung wurden zwei S-Proteine (Pfeile) ausgewählt und entsprechend vergrößert. (B-E) Inkubation bei saurem pH (5.0) und 37°C. (F) Inkubation bei neutralem pH (7.4) und 37°C. Balken: 200 Ǻ, 100 nm. (Details siehe Material und Methoden und Text) 

• Abbildung 19 : 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59. (A) Auswahl der Klassensummenbilder nach Einzelpartikelmethode (siehe Material und Methoden, Text). (B) Isosurface-Darstellung der 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 in Seitenansicht (Side-View). (C) Isosurface-Darstellung der 3D-Rekonstruktion des S-Proteins von MHV-A59 als „Top“-View. Mögliche Rezeptorbindungsstellen sind pink gekennzeichnet.

• Abbildung 20: Einfluss inhibitorischer Substanzen auf die Infektivität von MHV-A59. Die Infektivität von MHV-A59 wurde über den Plaqueassay analysiert. (A) Inkubation der Zellen mit Chlorpromazin-HCl (Chlorpr, 15 μM, grau), Bafilomycin A1 (Baf A1, 100 nM, dunkelgrau), Monensin (Mon, 10 μM, schwarz), Concanamycin A (Con, 10 nM, graugestreift) und Ammoniumchlorid (NH₄Cl, breit graugestreift). (B) Die Zellen wurden mit 20 mM Ammoniumchlorid (NH₄Cl) oder 100 nM Bafilomycin A1 (Baf A1) behandelt und anschließend mit MHV-A59 (schwarz) oder MHV-S4 (grau) infiziert. (C) Einfluss der Cholesterolverarmung von 17Cl-1 Zellen auf die Infektivität von MHV-A59. Grau - MβCD, dunkelgrau - Filipin III. Als Kontrolle wurde VSV (schwarz) verwendet. (D) Einfluss der Proteaseinhibitoren E-64 und Leupeptin (Leu) auf die Infektivität von 17Cl-1 Zellen durch MHV-A59 (grau) und MHV-A59 FI (schwarz). Soweit nicht anders vermerkt, entsprechen die Daten dem Mittelwert des Standardfehlers von wenigstens drei unabhängigen Experimenten. (* - n=1; ** - n=2; # - n=4)

• Abbildung 21: Die Fusion von MHV-A59 mit 17Cl-1 Zellen kann durch Erniedrigung des pH-Wertes ausgelöst werden. Nach Bindung R₁₈-markierter Viren an 17Cl-1 Zellen wurde das Fluoreszenzdequenching (FDQ) der Virus-Zell-Komplexe in Suspension verfolgt (siehe Material und Methoden). (A) Zeitverlauf des R₁₈ Fluoreszenzdequenching gemessen bei neutralem (pH 7.0) und niedrigem pH-Wert (pH 5.0). Um den pH-Wert auf 5.0 zu erniedrigen, wurde Zitronensäure (250 mM) zugegeben (Pfeil). Am Ende des Experiments wurde Triton X-100 hinzugefügt, um ein vollständiges Dequenching zu erreichen (+Triton, Pfeil). (B) Ausmaß des Fluoreszenzdequenching (FDQ) nach Messung für 30 min unter den beschriebenen Bedingungen. Die Daten repräsentieren den Mittelwert des Standardfehlers von mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 22: Niedriger pH-Wert induziert die Fusion von MHV-A59 mit der Plasmamembran von 17Cl-1 Zellen. R₁₈-markierte Viren wurden bei 4°C an die entsprechenden Zielzellen gebunden. Anschließend wurden die Virus-Zell-Komplexe bei 37°C entweder bei neutralem (pH 7.0, A-C) oder niedrigem pH-Wert (pH 5.0, D-F) inkubiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Mild saure Bedingungen (pH 5.0, D-F) simulieren das Milieu des endosomalen Kompartiments und ermöglichen dem Virus die direkte Fusion mit der Plasmamembran der Zielzelle (E). Fusion der Viren mit der Plasmamembran konnte bei neutralem pH nicht beobachtet werden (A und B). Nach 15 min wurde lediglich eine schwache intrazelluläre Färbung festgestellt (C).

• Abbildung 23 : Konfokalmikroskopische Analyse der Fusionseigenschaften von MHV-A59. (A und B) Inkubation der Virus-Zell-Komplexe bei neutralem pH-Wert. Analyse des 3D-Stacks konfokaler Bilder. (C und D) Nach Simulation des endosomalen/lysosomalen Milieus durch Inkubation der Virus-Zell-Komplexe bei pH 5.0. Analyse der 3D-Stacks konfokaler Fluoreszenzbilder (siehe Material und Methoden). Balken: 10 μm. Sterne entsprechen der Position des Zellkerns.

• Abbildung 24: Die Inkubation der Zellen mit Ammoniumchlorid verhindert die intrazelluläre Markierung bei neutralem pH. 17Cl-1 Zellen wurden mit Ammoniumchlorid vorinkubiert (A und B – 20 mM NH₄Cl) oder bleiben unbehandelt (C und D – Kontrolle) (siehe Material und Methoden). Anschließend werden R₁₈-markierte MHV-A59 an die Zielzellen gebunden und die Virus-Zell-Komplexe bei 37°C für die angegebenen Zeiten inkubiert (siehe Material und Methoden). Ammoniumchlorid ist während der gesamten Infektions- und der Inkubationszeit zugegen.

• Abbildung 25: Die Lokalisierung des S-Proteins von SARS-CoV und des ACE2-Rezeptors in HEK293T-Zellen. Die Detektion der Volllängenvarianten des S- und ACE2-Proteins erfolgte durch Inkubation mit den entsprechenden Primärantikörpern anti-S-Full #IMG-542 gegen das S-Protein und anti-hACE2 gegen den ACE2-Rezeptor. Die Sekundärantikörper waren jeweils mit verschiedenen Fluorophoren gekoppelt (siehe Material und Methoden). Die Aufnahmen erfolgten mittels Fluoreszenzmikroskopie. 

• Abbildung 26 : Fusion von HEK293T-S Zellen mit VeroE6-ACE2 Zellen. Die Inkubation der Zell-Zell-Komplexe erfolgt entweder bei pH 5.0 (A und B - obere Zeile) oder bei pH 7.0 (C und D) mit (+) oder ohne (-) Trypsinbehandlung und 37°C. S-Protein exprimierende HEK293T-S Zellen wurden zusätzlich mit dem cytosolischen Protein pEYFP transfiziert (grün). ACE2-Rezeptor exprimierende VeroE6-ACE2 werden mit R₁₈ markiert (rot). Nach Überlagerung der Fluoreszenzbilder sind fusionierte Zellen/Zellbereiche gelb (Co-Lokalisierung). Zur Überprüfung der Proteinexpression wurde ein Westernblot angefertigt (rechte Spalte), (siehe Material und Methoden). K - untransfizierte Kontrolle.

• Abbildung 27 : Untersuchung der Fusion S-Protein und ACE2-Rezeptor exprimierender Zellen. (A-D) Zur Untersuchung der Zell-Zell-Fusion wird die Membran der VeroE6-ACE2 Zellen mit R₁₈ markiert (rot). Das Cytosol der HEK293T-S Zellen wird mit dem cytosolischen Marker Calcein-AM markiert (grün) (siehe Material und Methoden). Die Inkubation der Zellen erfolgt bei niedrigem (pH 5.0) oder bei neutralem pH-Wert (pH 7.4) mit (+) oder ohne (-) die Zugabe von Trypsin. (F-H) Untersuchung der Zell-Zell-Fusion von Calcein-AM – HEK293T-S Zellen (grün) und CMTMR-VeroE6-ACE2 Zellen (rot) unter niedrigen oder neutralen pH-Bedingungen ohne Inkubation mit Trypsin (-). Als Kontrollen (K) werden nicht-transfizierte HEK293T-Zellen mit VeroE6-Zellen unter niedrigen pH-Bedingungen und 37°C analysiert.

• Abbildung 28: Die Fusionsaktivität und Infektivität von MHV-A59 kann durch Vorinkubation bei niedrigem pH-Wert beeinträchtigt werden. R₁₈-markierte Viren werden bei niedrigem pH-Wert für 15 min bei 37°C (A) oder 4°C (B) inkubiert. Nach Neutralisierung werden die so behandelten Viren an 17Cl-1 Zellen gebunden. Die Virus-Zell-Komplexe werden anschließend bei pH 5.0 und 37°C inkubiert. (A und B) Links – Phasenkontrast, Rechts – Fluoreszenzbilder. (C) Quantifizierung der Zellen, die eine Fusion zwischen R₁₈-markiertem Virus und der Plasmamembran zeigen. Schwarze Balken – Inkubation bei pH 7.0, graue Balken – Inkubation bei pH 5.0. (D) Plaqueassay und FDQ-Assay vorinkubierter MHV-A59 Viren (siehe Material und Methoden). Die Werte entsprechen dem Mittelwert des Standardfehlers von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 29: Primäre Aminosäuresequenz und lineares Schema des S-Proteins von MHV-A59. (A) Sequenz des S-Proteins von MHV-A59 im FASTA-Format. Das S-Protein besitzt eine Länge von 1324 Aminosäuren (AS). Das Signalpeptid befindet sich am N-Terminus der S1-Domäne. S1 (AS 17–717 - fett) und S2 (AS 718 – 1324) Untereinheiten bleiben während der Fusion nicht-kovalent assoziiert. Im Bereich der AS 713 – 717 liegt die mögliche Trypsinspaltungsstelle mit der Sequenz RRAHR (blau). Weiter C-terminal liegt die Transmembrandomäne, die aus 20 Aminosäureresten besteht. Der cytoplasmatische C-terminale Teil umfasst 38 AS und beinhaltet zahlreiche Cysteinreste (grün). (B) Schematische lineare Darstellung des S-Proteins von MHV-A59 (modifiziert nach Xu et al. [159]). Die HR-Regionen: HR1 (AS 947-1082) und HR2 (AS 1214-1261) befinden sich in der S2-Untereinheit des Proteins. SP – Signalpeptid, TM – Transmembrandomäne.

• Abbildung 30: Hydrophobizitätsplots des S-Proteins von MHV-A59. (A) Hydrophobizitätsplot des S-Proteins von MHV-A59. Am N-Terminus der Proteinsequenz befindet sich eine hydrophobe Region, das Signalpeptid aus 16 AS. Die Transmembrandomäne befindet sich am C-Terminus. (B) Hydrophobizitätsplot der S2-Domäne von MHV-A59. Die S2-Untereinheit des S-Proteins weist vier mögliche Fusionspeptidkandidaten (FP1 – FP4) auf. TM – rot; Hydrophobizität – schwarz; neutralisierte AS-Reste: D (Asp), E (Glu), H (His); FP – Fusionspeptid.

• Abbildung 31: Hydrophobizitätsplots der Sequenzen des gp41 von HIV-1, des GP2 von EboV und der FP1-4 von MHV-A59. Die Hydrophobizitätsplots der Glykoproteine von (A) HIV-1 gp41, (B) EboV GP2, (C) der S2-Untereinheit von MHV-A59 FP1 und FP2 und (D) FP3 und FP4. Die roten Balken markieren sowohl die Lage der Fusionspeptide der bekannten Fusionsproteine gp41 und GP2 als auch der Fusionspeptidkandidaten der S2-Domäne von MHV-A59. GP – Glykoprotein.

• Abbildung 32 : Lokalisierung der möglichen Fusionspeptide im S-Protein von MHV-A59. (A) Primäre Aminosäuresequenz der S2-Untereinheit (AS 717-1324). Im Bereich der AS 947-1082 liegt die HR1-Region (hellgrau). Die HR2-Region liegt im Bereich der AS 1214-1261 (dunkelgrau). Die möglichen Fusionspeptide FP1-4 sind farblich unterlegt. Die Transmembrandomäne (TM (AS 1266-1286 rot)) liegt C-terminal. (B) Lineares Schema der S2-Untereinheit (modifiziert nach Xu et al. [159]). Maßstabsgetreue Darstellung der Lage der Fusionspeptide (FP1-FP4). Lage der HR1-, HR2- und TM-Region. HR–Heptad-Repaet, TM –Transmembrandomäne. Balken: 50 AS.

• Abbildung 33: Die Fusionspeptidkandidaten FP1-1 und FP1-2. (A) Hydrophobizitätsplot des FP1 Fusionspeptids und der daraus resultierenden Varianten: FP1-1 und FP1-2. (B) Lineares Schema der S2-Untereinheit. Lage der Fusionspeptide in der S2-Untereinheit. (C) Sekundärstruktur von FP1 (rot).

• Abbildung 34 : Modell des Infektionsweges von MHV-A59. Nach Bindung des Virus an den Rezeptor CEACAM1a erfolgt die endozytotische Aufnahme. Clathrin assembliert um das endozytotische Vesikel und es kommt zu dessen Abschnürung. Die virusbeladenen Vesikel werden zu frühen Endosomen transportiert und reifen dann weiter zu späten Endosomen. Ausgelöst durch einen niedrigen pH-Wert (pH 5.5 – 5.0) wird das virale Nukleokapsid in das Cytoplasma der Zelle entlassen und die eigentliche Fusion von viraler und zellulärer Membran erfolgt („Uncoating“).

• Abbildung 35: Das S-Protein von SARS-CoV [218]. (A-D) Schematische Darstellung und elektronenmikroskopische Aufnahmen aufgereinigter S-Proteine. (A) S-e Monomere weisen eine L-förmige Gestalt mit einer Länge von 160 Å auf. (B) Durch pH-Erniedrigung kommt es zur Trimerisierung der S-Proteine, die eine nelkenförmige Konformation einnehmen. (C) Die S-Trimere sind sehr stabil und behalten nach Trypsinspaltung ihre Struktur bei. (D) Nach Inkubation mit 1M Harnstoff bilden gespaltene S-Proteintrimere Rosetten aus. (E) Die Bindung der katalytischen Untereinheit des ACE2-Rezeptors erfolgt sowohl mit S-e Monomeren als auch mit S-e Trimeren. 

• Abbildung 36 : Die Struktur des S-Proteins von MHV-A59. (A) Einzelmoleküle der membranverankerten S-Proteine. Balken: 100 Å. (B) Klassensummenbilder 189-191 aus 440 extrahierten Klassensummenbildern des S-Proteins. Balken: 200 Å. (C und D) 3D-Rekonstruktion des S-Proteins in Isosurface-Darstellung als Seitenansicht und „Top-View“. 

• Abbildung 37 : Vergleich der Struktur der S-Proteine von SARS-CoV und MHV-A59. (A) Trimere SARS-CoV S-Proteine nach Trypsinspaltung [218]. (B) Monomere der S-Ektodomäne von SARS-CoV [218]. (C) Vergrößerung eines Monomers der S-Ektodomäne. (D) Mögliche Anordnung des S-Monomers von SARS-CoV im 3D-Modell von MHV-A59. Balken: 500 Å.

• Abbildung 38: Vergleich der 3D-Struktur der S-Proteine von MHV-A59 (A-C) (K. Ludwig) und SARS-CoV (E-G) [165]. (A) Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme von MHV-A59 (ohne Kontrastmittelzusatz). (B und C) Isosurface-Darstellung des S-Proteins von MHV-A59. (D und H) Überlagerung der S-Proteine von MHV-A59 und SARS-CoV (durchscheinend). (E) Kryoelektronenmikroskopische Aufnahme von SARS-CoV. (F und G) Isosurface-Darstellung des S-Proteins von SARS-CoV.

• Abbildung 39 : Konformationszustände des S-Proteins von SARS-CoV (A-D) [218] und MHV-A59 (A’-D’, siehe Ergebnisse).