Aus der Klinik für Innere Medizin / Kardiologie
Deutsches Herzzentrum Berlin
Stiftung des bürgerlichen Rechts

Dissertation

Wirkungen von Liganden der “Peroxisome Proliferator-Activated Receptors” auf die Migration von Endothelzellen und die Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1

zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von
Friedrich Eilers
aus Berlin

Gutachter:
1. Prof. Dr. E. Fleck
2. Priv.-Doz. Dr. S. Rosenkranz
3. Prof. Dr. J. Waltenberger

Datum der Promotion: 23.03.2006

Zusammenfassung

In atherosklerotischen Gefäßabschnitten kommt es durch Migration von Endothelzellen zur Neovaskularisation atherosklerotischer Plaques. Die Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1, die sowohl von luminalen, als auch von neovaskulären Endothelzellen exprimiert werden, vermitteln die Adhäsion von Leukozyten, die so durch die Endothel-Barriere hindurch an den Entzündungsort migrieren können.

Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) sind ligand-aktivierte Kernrezeptoren, die als Transkriptionsfaktoren hauptsächlich an der Genregulation im Fett- und Glukosestoffwechsel beteiligt sind und zudem Wirkungen im kardiovaskulären System haben. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte der PPAR-alpha-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat und der PPAR-gamma-Liganden Troglitazon und Ciglitazon auf die Migration von Endothelzellen sowie die Beeinflussung der dabei involvierten Komponenten der Signaltransduktion und die Wirkung der PPAR-Liganden auf die Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 untersucht.

PPAR-alpha- und PPAR-gamma-Liganden hemmten signifikant und konzentrationsabhängig die VEGF-induzierte Endothelzellmigration. Der Migrationsprozess wird sowohl durch die MAP-Kinase, als auch durch die Serin/Threonin-Kinase Akt vermittelt und ist durch pharmakologische Inhibitoren dieser Enzyme hemmbar. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, das die PPAR-Liganden den Migrationsprozess durch eine Inhibition der Phosphorylierung von Akt hemmen, während die Phosphorylierung der MAP-Kinase durch die PPAR-Liganden unbeeinflusst blieb.

Die PPAR-alpha-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat hemmten signifikant zeit- und konzentrationsabhängig die TNF-alpha-stimulierte Expression von VCAM-1. Fenofibrat hemmte außerdem die Expression von E-Selectin und ICAM-1. Die PPAR-gamma-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hatten keine Wirkung auf die Expression der Adhäsionsmoleküle.

Eigene Schlagworte: PPAR-Liganden, Endothelzellen, Migration, Adhäsionsmoleküle

Abstract

In atherosclerotic blood vessels migration of endothelial cells leads to neovascularisation of atherosclerotic Plaques. The adhesion molecules E-Selectin, VCAM-1 and ICAM-1, being expressed by luminal endothelial cells as well as by neovascular endothelial cells, mediate leucocyte-adhesion and transmigration through the endothelial-barrier to the atherosclerotic lesion.

Peroxisome Proliferator-Acticated Receptors (PPARs) are ligand-activated nuclear receptors, which regulate gene expression in lipid and glucose metabolism and also exert several vascular effects. It was the aim of this study to examine the effect of the PPAR-alpha-ligands WY-14,643 and fenofibrate and the PPAR-gamma-ligands troglitazone and ciglitazone on endothelial migration and the involved signal transduction components and to examine the effect on the expression of the endothelial adhesion molecules E-Selectin, VCAM-1 and ICAM-1. PPAR-alpha- and PPAR-gamma-ligands significantly inhibited VEGF-induced endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. This migratory process is MAP-Kinase- and Akt-dependent and can be blocked by pharmacologic inhibitors of these enzymes. This study is the first to show that PPAR-ligands inhibit endothelial cell migration by targeting Akt whereas MAP-Kinase phosphorylation was not affected by the PPAR-ligands.

PPAR-alpha-ligands WY-14,643 and fenofibrate significantly inhibited TNF-alpha-induced expression of VCAM-1 in a time- and concentration-dependent manner. Furthermore, fenofibrate also inhibited the expression of E-Selectin and ICAM-1. PPAR-gamma-ligands troglitazone and coglitazone did not affect the expression of any of these adhesion molecules.

Keywords: PPAR-ligands, endothelial cells, migration, adhesion molecules

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
• 2  Endothelzellen und PPAR-Liganden in der Atherosklerose
  • 2.1  Pathophysiologische Aspekte der Endothelzellfunktion in der Atherosklerose
    • 2.1.1  Migration von Endothelzellen
    • 2.1.2 Endotheliale Adhäsionsmoleküle
  • 2.2 Funktion der PPARs und die Rolle der PPAR-Liganden  im kardiovaskulären System
  • 2.3 Fragestellung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1  Gewinnung von Endothelzellen humaner Nabelschnurvenen (HUVEC)
  • 3.2 Zellpflege und Zellpassage
  • 3.3 Migrationsassay
  • 3.4 Western Blot
    • 3.4.1  Gewinnung der Zellextrakte
    • 3.4.2 Proteinbestimmung mit der BCA-Methode
    • 3.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
    • 3.4.4 Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran
    • 3.4.5 Detektion der geblotten Proteine
  • 3.5 Adhäsionsassay
  • 3.6 Zell-ELISA
  • 3.7 Apoptose-Assay
    • 3.7.1  Vorbereitung der Zellen
    • 3.7.2 Durchführung und Auswertung
  • 3.8 Statistik
• 4  Ergebnisse
  • 4.1  Wirkungen von PPAR-Liganden auf die VEGF-induzierte Endothelzellmigration
    • 4.1.1  Migrationsassays mit PPARγ-Liganden
    • 4.1.2 Migrationsassays mit PPARα-Liganden
    • 4.1.3  Migrationsassays mit Hemmstoffen der Enzyme MEK und PI(3)-Kinase
    • 4.1.4  Wirkung der PPAR-Liganden auf die Phosphorylierung  der Enzyme ERK 1/2 und Akt
    • 4.1.5  Wirkungen der PPAR-Liganden auf die Adhäsion von Endothelzellen
  • 4.2  Wirkungen der PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle  E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in vaskulären Endothelzellen
    • 4.2.1  Zell-ELISAs mit PPARα-Liganden
    • 4.2.2  Zell-ELISAs mit PPARγ-Liganden
  • 4.3  Apoptose-Assay
• 5  Diskussion
  • 5.1  Zusammenfassung der Ergebnisse
  • 5.2 Diskussion der Ergebnisse
    • 5.2.1  Wirkung der PPAR-Liganden auf den Prozess der Migration von Endothelzellen
      • 5.2.1.1  Migration
      • 5.2.1.2 Signaltransduktion
    • 5.2.2 Wirkung der PPAR-Liganden auf die Expression der endothelialen  Adhäsionsmoleküle
  • 5.3 Diskussion der verwendeten Methoden
    • 5.3.1  Untersuchungsgut
    • 5.3.2 Untersuchung des Migrationsprozesses in Endothelzellen
    • 5.3.3 Messung der Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle
• 6  Zusammenfassung
• 7 Abkürzungsverzeichnis
• 8 Herstellerverzeichnis
• 9 Literaturverzeichnis
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung
• Lebenslauf

Tabellen

• Tabelle 1:  Hemmung der Migration durch pharmakologische Enzyminhibitoren PD 98059, das die Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2) durch MEK verhindert und Wortmannin, das spezifisch die PI(3)-Kinase hemmt und so die Phosphorylierung von Akt inhibiert, hemmten konzentrationsabhängig die VEGF-induzierte Endothelzellmigration. Damit konnte gezeigt werden, dass die VEGF-induzierte Endothelzellmigration sowohl MAP-Kinase-, als auch Akt-abhängig ist.

Bilder

• Abbildung 1: Schematische Darstellung von zwei möglichen Signaltransduktionskaskaden, über die die Stimulation der Endothelzellen mit VEGF zur Migration führen kann (1): Der MEK-MAP-Kinase-Pathway: Stimulation der Zellen mit VEGF führt über die Aktivierung von MEK zur Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2). Über einen zytosolischen Weg (1a) und einen nukleärenWeg (1b) vermittelt die MAP-Kinase die Endothelzellmigration. (2): Der PI(3)-Kinase-Akt-Pathway: Die PI(3)-Kinase, die durch VEGF aktiviert wird, phosphoryliert Akt. Dadurch stimuliert Akt die Reorganisation des Aktin/Myosin-Zytoskeletts und anschließend die Zellbewegung (2a). Zusätzlich phosphoryliert Akt eNOS am Serin-Rest 1177 (humane Zellen) und aktiviert damit die NO-Produktion, wodurch ebenfalls die Zellmigration stimuliert wird (2b).
• Abbildung 2: Prinzip des Migrationsassays In der Abbildung ist schematisch ein Well einer Multiwell-Platte mit einem Membraneinsatz (Filter mit 8 µm großen Poren) dargestellt. Die Endothelzellen werden auf dem Boden des einsetzbaren Filters (innere Kammer) ausgesät. Durch Stimulation mit Zytokinen wie z.B. VEGF, die sich in der äußeren Kammer befinden, migrieren die Zellen durch die Poren der inneren Kammer hindurch und bleiben an der Unterseite haften. Nach dem Entfernen der nichtmigrierten Zellen von der Innenseite der Kammer und dem Fixieren der an der Unterseite haftenden Zellen kann die Anzahl der durch den Filter migrierten Zellen unter dem Mikroskop gezählt werden.
• Abbildung 3: Prinzip des Zell-ELISAs In dieser Abbildung ist schematisch ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte dargestellt. Am Boden ist der Endothelzell-Monolayer zu erkennen. Auf die durch Zytokine wie z.B. TNFα stimulierten Zellen wird ein Primärantikörper (1) gegeben, der spezifisch an das nachzuweisende Adhäsionsmolekül bindet. Ein Enzym-gekoppelter (in diesem Falle Alkalische Phosphatase, AP) Sekundärantikörper (2) bindet an den Primärantikörper. Durch Zugabe eines Substrates (z.B. p-Nitrophenyl-Phosphat), das durch das Enzym des Sekundärantikörpers umgesetzt wird, erfolgt ein Farbumschlag, dessen Extinktion im ELISA-Reader gemessen wird, und dessen Intensität der Menge an nachgewiesenen Adhäsionsmolekülen proportional ist.
• Abbildung 4:  Wirkung der PPAR-Liganden auf die VEGF (10 ng/ml)-induzierte Endothelzellmigration Die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon (A) und die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat (B) hemmen signifikant und konzentrationsabhängig die Migration von HUVECs.
• Abbildung 5: VEGF und MAP-Kinase Es ist sowohl der phosphorylierte, aktivierte Anteil der MAP-Kinase (I) dargestellt, als auch der Gesamtteil (II). „Ko“ steht für Kontrolle. A: VEGF (10 ng/ml) stimuliert zeitabhängig die Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase (ERK 1/2). B: Die VEGF-induzierte Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase (ERK 1/2) wird durch PD 98059 konzentrationsabhängig gehemmt.
• Abbildung 6:  Wirkung von PPARα- und PPARγ-Liganden auf die Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase (ERK 1/2). „Ko“ steht für Kontrolle. Es ist nur der phosphorylierte Anteil der MAP-Kinase zu sehen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde hier auf die Darstellung des Gesamtanteils verzichtet. Weder die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat (A), noch die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon (B) haben in ihren verschiedenen Konzentrationen einen Einfluß auf die Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2).
• Abbildung 7: VEGF und Akt Es ist sowohl der aktivierte, phosphorylierte Anteil von Akt (I), als auch Gesamt-Akt (II) dargestellt. „Ko“ steht für Kontrolle. A: VEGF (10 ng/ml) stimuliert zeitabhängig die Phosphorylierung von Akt. B: Wortmannin hemmt konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Akt.
• Abbildung 8:  Wirkung der PPAR-Liganden auf die Phosphorylierung von Akt Es ist sowohl der phosphorylierte Akt-Anteil (I), als auch der Gesamt-Akt-Anteil (II) zu sehen. „Ko“ steht für Kontrolle. Sowohl die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon (A), als auch die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat (B) hemmen konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Akt.
• Abbildung 9:  Einfluß der PPAR-Liganden auf die Adhäsion von HUVECs auf einer Gelatine-Matrix „K“ steht für Kontrolle. A: Die PPARα-Liganden haben keinen Einfluss auf die Adhäsion der Endothelzellen. B:Die PPARγ-Liganden hemmen die Adhäsion der Zellen in der höchsten untersuchten Konzentration von 20 µM.
• Abbildung 10:  Wirkung der PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat auf die TNFα-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach einer Vorinkubation der Zellen für 30 MinutenA: WY-14,643 hat nach 30 min. Vorinkubation keinen Einfluss auf die TNFα-stimulierte Expression der Adhäsionsmoleküle. B: Fenofibrat hemmt nach einer Vorinkubation von 30 min. die TNFα-stimulierte Expression von VCAM-1 (p < 0.01) und ICAM-1 (p < 0.05).
• Abbildung 11:  Wirkung der PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat auf die TNFα-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach einer Vorinkubation von 24 StundenA: WY-14,643 hemmt geringfügig aber signifikant die Expression von VCAM-1 (p < 0.05) in einer Konzentration von 100 µM. B: Fenofibrat hemmt die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle (alle p < 0.01) in einer Konzentration von 100 µM.
• Abbildung 12:  Wirkungen der PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon auf die TNFα-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach einer Vorinkubation der Zellen für 30 Minuten bzw. 24 StundenAund B: Die Zellen wurden für 30 min. mit den PPARγ-Liganden vorinkubiert und anschließend mit TNFα stimuliert. Weder Troglitazon, noch Ciglitazon hat einen Effekt auf die Expression der Moleküle. C und D: Auch nach 24-stündiger Vorinkubation der Zellen mit den PPARγ-Liganden und anschließender TNFα-Stimulation zeigen Troglitazon und Ciglitazon keinerlei Effekte auf die Expression von E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1.
• Abbildung 13: Überprüfung einer möglichen Apoptose-Induktion durch PPARα- und PPARγ-Liganden in Endothelzellen. Die Präparate zeigen die Zellen in einer 30-fachen Vergrößerung. Bis auf die unbehandelte Kontrolle (A) wurden die Zellen für 24 Stunden mit Troglitazon (B), Ciglitazon (C), Fenofibrat (D) und WY-14,643 (E) vorinkubiert und für 4 Stunden mit TNFα stimuliert. Die Pfeile kennzeichnen exemplarisch angefärbte Zellkerne (Blockpfeile) bzw. mitangefärbten Zelldetritus (Kopfpfeile). Der Gesamtaspekt der Präparate zeigt ein ruhiges und homogenes Zellgefüge. Es sind nur wenig dunkel gefärbte Zellkerne zu erkennen, so dass eine Apoptose-Induktion durch die PPAR-Liganden in relevantem Ausmaß unwahrscheinlich ist.
• Abbildung 14:  Schematische Darstellung von zwei möglichen Signaltransduktionskaskaden, über die die Stimulation mit VEGF zur Endothelzellmigration führen kann, und ihre Beeinflussung durch spezifische Enzyminhibitoren und PPAR-Liganden (vgl. auch Abb. 1) (1): Der MEK-MAP-Kinase-Pathway: Eine Blockade von MEK mit dem pharmakologischen Hemmstoff PD 98059 hat eine Inhibition der Endothelzellmigration durch Hemmung der Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2) zur Folge. Die PPAR-Liganden, die ebenfalls die Migration hemmten, hatten jedoch keinen Einfluss auf die Phosphorylierung der MAP-Kinase. Möglicherweise wirken die PPAR-Liganden downstream der MAP-Kinase, z.B. durch Beeinflussung der Myosin-Leichtketten-Kinase MLCK (1a) oder durch Hemmung der Produktion von Matrix-Metalloproteinasen MMPs (1b). (2): Der PI(3)-Kinase-Akt-Pathway: Die spezifischen Hemmstoffe der PI(3)-Kinase Wortmannin und LY 294002 hemmen die Endothelzellmigration durch Inhibition der Akt-Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass PPAR-Liganden die Phosphorylierung von Akt hemmen und wahrscheinlich über diesen Mechanismus migrationsinhibierend wirken.