Endothelzellen und PPAR-Liganden in der Atherosklerose

2.1  Pathophysiologische Aspekte der Endothelzellfunktion in der Atherosklerose

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Bei der Entstehung der Atherosklerose kommt dem Endothel eine besondere Bedeutung zu, da hier die ersten Veränderungen stattfinden (131), die bei Fortschreiten des Prozesses in der Bil-dung atherosklerotischer Plaques und unter Umständen in der Ruptur solcher Plaques münden (64;151), die dann zu thrombembolischen Ereignissen führen können (50). Unter physiologi-schen Bedingungen erfüllt das Endothel eine Reihe von Schutzfunktionen. Dazu gehören bei-spielsweise die Regulierung des Gefäßtonus, der durch die Produktion und Sekretion bestimmter Moleküle wie Stickstoffmonoxid (NO), Prostaglandin I2 (PGI2 = Prostazyklin) oder Endothelin in einem Gleichgewicht gehalten wird (130). Die glatte und antithrombogene Oberfläche des Endothels verhindert eine Thrombozytenaggregation und sorgt für einen gleichmäßigen Blutfluss (94). Außerdem können keine Leukozyten adhärieren, da Adhäsionsmoleküle unter physiologi-schen Bedingungen nicht in ausreichendem Maße exprimiert werden (7;12;125). Das Endothel ist eine durchlässige Barriere, durch die der Austausch von Stoffen zwischen Gefäßlumen und Gefäßwand gewährleistet wird (130). Es besitzt ferner die Fähigkeit, Lipoproteine beim Trans-port durch die Gefäßwand zu modifizieren, z. B. durch Oxidation (50). Die Bildung und Sekreti-on von Wachstumsfaktoren und Zytokinen sowie die Aufrechterhaltung der Basalmembran aus Kollagen und Proteoglykanen gehören ebenfalls zu den physiologischen Endothelzellfunktionen (130).

Unter pathologischen Bedingungen werden Endothelfunktionen verändert, die das Fortschreiten des Entzündungsprozesses fördern und deren mögliche Beeinflussung durch PPAR-Liganden in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde. Zu diesen Funktionen zählen neben der Migration von Endothelzellen auch die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1.

Die Migrationsfähigkeit der Endothelzellen ist ein entscheidender Faktor, durch den es zur Neovaskularisation der Gefäßwand und der atherosklerotischen Plaque kommt (30;73;113;131;149;163). Diese Gefäßneubildung trägt zur Vergrößerung und zur Destabilisie-rung der Plaque bei, so dass es schließlich zur Plaqueruptur und Plaqueeinblutung kommen kann (50). Die Untersuchung der Wirkung der PPAR-Liganden auf die Migration von Endothelzellen bildete den einen Schwerpunkt dieser Arbeit. Dazu wurde sowohl die Migration selbst unter-sucht, als auch die Adhäsion der Endothelzellen und Komponenten der Signaltransduktion, durch die die Migration der Endothelzellen vermittelt wird.

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Die Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle gestattet es Monozyten und Lymphozy-ten, am Endothel zu adhärieren, in die Intima zu transmigrieren und dort Entzündungsprozesse voranzutreiben (8;11). Die Beeinflussung der Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 durch PPARα- und PPARγ-Liganden war der andere Schwerpunkt dieser Arbeit.

2.1.1  Migration von Endothelzellen

Normalerweise ist das Vorkommen von Vasa vasorum in Blutgefäßen auf die Adventitia und die äußere Media beschränkt (107;113). In fortgeschrittenen atherosklerotischen Läsionen finden sich jedoch Mikrogefäße auch in der Intima und in den atherosklerotischen Plaques (113;114). Es konnte nachgewiesen werden, dass diese Gefäße durch Angiogenese hauptsächlich aus den adventitiellen Vasa vasorum hervorgehen (163). Sie dienen höchstwahrscheinlich der Versor-gung des atherosklerotischen Gefäßabschnittes mit Entzündungszellen, Sauerstoff und anderen Nährstoffen. Eine solche Funktion wird durch die Beobachtungen unterstützt, dass die Endothel-zellen dieser neu gebildeten Gefäße vermehrt Adhäsionsmoleküle wie E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 exprimieren (30) und dass die Verteilung von Entzündungszellen wie Makrophagen und T-Zellen um die Mikrogefäße mit der Stärke der Expression der Adhäsionsmoleküle korre-liert (114). Makrophagen und T-Zellen können selbst durch Sekretion bestimmter Mediatoren wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF) und basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Angiogenese induzieren (94;130). Diese Fähigkeit wird durch oxidiertes Low Densitiy Lipoprotein (oxLDL) noch weiter verstärkt (127). Ferner ist da-von auszugehen, dass die Gefäßwand ab einer bestimmten Dicke nicht mehr ausreichend mit Sauerstoff versorgt wird und somit den Bedarf nur durch Bildung neuer Gefäße decken kann (73;107;113). Verschiedene Untersuchungen belegen, dass tatsächlich eine Neubildung von Ge-fäßen innerhalb der atherosklerotischen Gefäße und der atheromatösen Plaques stattfindet: In atherosklerotischen Gefäßen und atherosklerotischen Läsionen wurde sowohl die Existenz dieser Gefäße nachgewiesen (82;113;149), als auch das Vorhandensein von VEGF, einem etablierten Migrationsfaktor für Endothelzellen (6;41;161), gefunden (16;26;72;127). Die durch VEGF in-duzierte Endothelzellmigration ist eine entscheidende Komponente im Prozess dieser Neoangio-genese. Der Prozess der Migration selbst beinhaltet wichtige Komponenten wie Invasion, Fort-bewegung und Adhäsion der Zellen (1;161). Die große klinische Bedeutung der Plaque-Neovaskularisation besteht darin, dass durch die Größenzunahme, den Abbau extrazellulärer Matrix und der daraus folgenden Durchsetzung der Plaque mit Mikrogefäßen die Stabilität ab- 9 nimmt und die Gefahr einer Plaqueruptur oder Einblutung zunimmt (50;64;151). Tenaglia et al. konnten zeigen, dass die Prävalenz einer instabilen Angina pectoris mit der Stärke der Neovaskularisation atherosklerotischer Plaques in den Koronargefäßen der untersuchten Patienten korrelierte (149).

Den Endothelzellen kommt bei der Migration bzw. der Neovaskularisation atherosklerotischer Gefäßabschnitte insofern eine große Bedeutung zu, da sie die Zellen sind, die als erste auf die migrationsfördernden Stimuli wie (VEGF) mit Aussprossungen aus dem bestehenden Gefäß reagieren (25). Es sind bislang drei Rezeptoren für VEGF bekannt. Im Gegensatz zu VEGF-Rezeptor-3 (VEGFR3, auch Flk-4) besitzen VEGFR1 (Flt-1) und VEGFR2 (KDR/Flk-1) Tyrosinkinase-Aktivität. Nahezu alle biologisch relevanten Wirkungen von VEGF werden durch VEGFR2 vermittelt (161). Die migrationsfördernde Wirkung von VEGF auf Endothelzellen ist inzwischen gut belegt, und einige Signaltransduktionsmechanismen, die schließlich zur Migration der Zellen führen, sind z.T. recht genau untersucht worden (1;13;25;38). Wenn man die Signaltransduktionskaskade von der Induktion der Migration bis zur Fortbewegung der Zellen betrachtet, so werden in der Literatur im wesentlichen zwei Signalwege postuliert, die höchstwahrscheinlich unabhängig voneinander zur Migration der Zellen führen (siehe Abb. 1). Dies ist zum einen ein Weg, der über die extrazellulär-regulierten Kinasen 1/2 (ERK 1/2), die zur Familie der Mitogen-aktivierten Protein-Kinasen (MAP-Kinasen) gehören, zur Migration führt(139) und zum anderen ein Weg, in den die Phosphatidylinositol-3-OH-Kinase (PI[3]-Kinase), die Serin/Threonin-Kinase „Akt“ (Proteinkinase B) und die endotheliale Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase (eNOS) in Form einer Signaltransduktionskaskade involviert sind (38).

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Sowohl in der vorliegenden Arbeit (siehe Ergebnisse, Kap. 4), als auch in anderen Studien konnte gezeigt werden, dass VEGF über das Enzym MEK (Mitogen-activated, ERK-activating Kinase) die Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase induziert (2;155). Diese Signalmoleküle vermitteln die Migration von vaskulären und nicht-vaskulären Zellen über einen zytosolischen und einen nukleären Signalweg. Der zytosolische Weg beinhaltet die Phosphorylierung und Aktivierung von Myosin-Leichtketten (MLC)-Kinasen (MLCK) . Diese Signalmoleküle vermitteln die Migration von vaskulären und nicht-vaskulären Zellen über einen zytosolischen und einen nukleären Signalweg. Der zytosolische Weg beinhaltet die Phosphorylierung und Aktivierung von Myosin-Leichtketten (MLC)-Kinasen (MLCK) . Diese Signalmoleküle vermitteln die Migration von vaskulären und nicht-vaskulären Zellen über einen zytosolischen und einen nukleären Signalweg. Der zytosolische Weg beinhaltet die Phosphorylierung und Aktivierung von Myosin-Leichtketten (MLC)-Kinasen (MLCK) (17;21). MLC sind essentiell für die Migration von Zellen, indem sie das Aktin/Myosin-Zusammenspiel koordinieren und so die geordnete Fortbewegung der Zellen gewährleisten. Am Ende des nukleären Weges steht die Produktion und Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Nach ihrer Induktion in den Zellen durch Migrations-Faktoren erleichtern diese Enzyme durch Abbau extrazellulärer Matrix die Invasion der Zellen in ein neues Territorium. Lamoreaux et al. konnten nachweisen, dass in Endothelzellen nach Stimulation durch VEGF die Sekretion von . MLC sind essentiell für die Migration von Zellen, indem sie das Aktin/Myosin-Zusammenspiel koordinieren und so die geordnete Fortbewegung der Zellen gewährleisten. Am Ende des nukleären Weges steht die Produktion und Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Nach ihrer Induktion in den Zellen durch Migrations-Faktoren erleichtern diese Enzyme durch Abbau extrazellulärer Matrix die Invasion der Zellen in ein neues Territorium. Lamoreaux et al. konnten nachweisen, dass in Endothelzellen nach Stimulation durch VEGF die Sekretion von . MLC sind essentiell für die Migration von Zellen, indem sie das Aktin/Myosin-Zusammenspiel koordinieren und so die geordnete Fortbewegung der Zellen gewährleisten. Am Ende des nukleären Weges steht die Produktion und Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Nach ihrer Induktion in den Zellen durch Migrations-Faktoren erleichtern diese Enzyme durch Abbau extrazellulärer Matrix die Invasion der Zellen in ein neues Territorium. Lamoreaux et al. konnten nachweisen, dass in Endothelzellen nach Stimulation durch VEGF die Sekretion von

Abbildung 1: Schematische Darstellung von zwei möglichen Signaltransduktionskaskaden, über die die Stimulation der Endothelzellen mit VEGF zur Migration führen kann
(1): Der MEK-MAP-Kinase-Pathway:
Stimulation der Zellen mit VEGF führt über die Aktivierung von MEK zur Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2). Über einen zytosolischen Weg (1a) und einen nukleärenWeg (1b) vermittelt die MAP-Kinase die Endothelzellmigration.
(2): Der PI(3)-Kinase-Akt-Pathway:
Die PI(3)-Kinase, die durch VEGF aktiviert wird, phosphoryliert Akt. Dadurch stimuliert
Akt die Reorganisation des Aktin/Myosin-Zytoskeletts und anschließend die Zellbewegung (2a). Zusätzlich phosphoryliert Akt eNOS am Serin-Rest 1177 (humane Zellen) und aktiviert damit die NO-Produktion, wodurch ebenfalls die Zellmigration stimuliert wird (2b).

Gelatinase A (MMP-9) zunimmt und die Produktion von MMP-Inhibitoren wie TIMP
(tissue-inhibitor of metalloproteinases) abnimmt (83). Auch in Gefäßmuskelzellen und Monozyten ist die Migration MMP-abhängig (80;120;162). Die Expression und Sekretion von MMPs wird über ERK 1/2 vermittelt . Die Expression und Sekretion von MMPs wird über ERK 1/2 vermittelt . Die Expression und Sekretion von MMPs wird über ERK 1/2 vermittelt . Die Expression und Sekretion von MMPs wird über ERK 1/2 vermittelt . Die Expression und Sekretion von MMPs wird über ERK 1/2 vermittelt (20) und zwar vermutlich durch die Involvierung bestimmter Transkriptionsfaktoren wie Ets-1 (142), der die Expression von MMPs induziert (115). Somit lässt sich der MAP-Kinase-Pathway folgendermaßen zusammenfassen: VEGF induziert die Phosphorylierung und Aktivierung von ERK 1/2. Diese beiden Signalmoleküle induzieren über einen zytosolischen Signalweg die Aktivierung von MLCKs und über einen nukleären Signalweg, in den u.a. der Transkriptionsfaktor Ets-1 involviert ist, die Expression und Sekretion von MMPs. Diese beiden Downstream-Effekte sind wesentliche Komponenten, die zur Zellmigration beitragen.

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In den anderen möglichen Signaltransduktionsweg der VEGF-induzierten Endothelzell-migration sind die Phosphatidylinositol-3-OH-Kinase (PI[3]-Kinase) und die Serin/Threonin-Kinase Akt (Proteinkinase B) involviert (38) (siehe auch Abb. 1). Akt wird durch VEGF über die PI(3)-Kinase aktiviert (157) und stimuliert in vaskulären und nicht-vaskulären Zellen die Ak-tin/Myosin-Zytoskelett-Reorganisation und anschließend die Zellbewegung (105;106). Ferner aktiviert Akt die endotheliale NO-Synthase eNOS durch Phosphorylierung am Serin-Rest 1177 in humanen Endothelzellen (37) und am Serin-Rest 1179 in bovinen Endothelzellen (49). Nach ihrer Aktivierung produziert eNOS aus L-Arginin NO, das proangiogenetisch wirkt (118). Die Bedeutung des PI(3)-Kinase-Akt-eNOS-Pathways wird dadurch unterstrichen, dass eine selekti-ve Hemmung der einzelnen Komponenten der Signaltransduktionskaskade eine Inhibition der VEGF-induzierten Endothelzellmigration zur Folge hatte: Die Hemmung der PI(3)-Kinase mit Inhibitoren wie Wortmannin oder LY294002 führte ebenso wie die Transfektion der Zellen mit einer inaktiven Form der Akt und eine Hemmung von eNOS durch die eNOS-Inhibitoren Nω-Mono-Methyl-L-Arginin (L-NMMA) und Nω-Nitro-L-Arginin Methyl Ester (L-NAME) bzw. die Transfektion der Zellen mit einer nicht-phosphorylierbaren Mutante der eNOS zu einer Hemmung der VEGF-induzierten Migration (36;106;164). Dieser zweite Signaltransduktions-weg lässt sich wie folgt zusammenfassen: VEGF aktiviert die PI(3)-Kinase, wodurch wiederum die Serin/Threonin-Kinase Akt aktiviert wird. Daraufhin stimuliert Akt zum einen die Reorgani-sation des Aktin/Myosin-Zytoskeletts und wirkt dadurch migrationsfördernd, zum anderen phos-phoryliert und aktiviert Akt die endotheliale NO-Synthase eNOS, was in der Bildung von NO resultiert, das ebenfalls promigratorisch wirkt. Eine Hemmung der einzelnen Signaltransduk-tionskomponenten hat eine Inhibition der VEGF-induzierten Endothelzellmigration zur Folge.

2.1.2 Endotheliale Adhäsionsmoleküle

Es gibt vier Klassen von Adhäsionsmolekülen: Cadherine, Integrine, Selectine und jene Molekü-le, die zur Superfamilie der Immunglobuline (Ig) gehören (123). Am Prozess der Atherosklerose sind hauptsächlich das Selectin E-Selectin, das die leukozytären Glykokonjugate erkennt, und die Mitglieder der Ig-Superfamilie, VCAM-1 und ICAM-1, die mit Leukozyten-Integrinen interagieren, beteiligt (8).

E-Selectin ist ein endotheliales Glykoprotein. Liganden sind das Tetrasaccharid sialyl Lewis x (sLex) und verwandte Zucker (8;12). An E-Selectin binden Neutrophile, Eosinophile, Mo-nozyten und einige Lymphozyten. Es wird nur in Reaktion auf Stimuli durch Zytokine wie z. B. Tumor Nekrose Faktor α (TNFα) oder Interleukin-1 (IL-1) synthetisiert und exprimiert. Die Expression erreicht nach vier bis sechs Stunden ein Maximum und erreicht den Ausgangspunkt nach über 24 Stunden (7).

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ICAM-1 ist ein transmembranäres Glykoprotein, das fünf Ig-Domänen enthält. Es ist in ge-ringem Maße auch unter physiologischen Bedingungen exprimiert und ist durch Endotoxin, TNFα und IL-1 stark hochregulierbar (8). Unter Kulturbedingungen hält die Expression über mehrere Tage an, in vivo ist sie ein Zeichen eines chronischen Entzündungsprozesses (7;126). Liganden für ICAM-1 sind leukozytäre β2-Integrine (CD11a/CD18 = LFA-1; CD11b/CD18 = Mac-1; CD11c/CD18 = p150,95), die maßgeblich die Adhäsion und Transmigration der Leuko-zyten durch das Endothel vermitteln (8;12).

VCAM-1, das mit ICAM-1 zur Ig-Superfamilie der Adhäsionsmoleküle gehört, ist eben-falls ein transmembranäres Glykoprotein, das sieben Ig-Domänen enthält. Es ist ebenfalls durch Endotoxin, TNFα und IL-1 induzierbar und zeigt im Zeitverlauf ein ähnliches Expressionsmus-ter wie ICAM-1, es wird allerdings unter Ruhebedingungen nicht exprimiert (7). Der Ligand für VCAM-1 ist das Integrin α4β1 (VLA-4, very late antigen-4), das auf Lymphozyten, Monozyten und Eosinophilen exprimiert wird (12). Neutrophile haben kein α4β1-Integrin und binden daher nicht an VCAM-1 (8).

Die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 wird durch eine Reihe von möglichen Noxen induziert. Zu diesen Noxen zählen LDL bzw. oxLDL (50;59;63), sowie mechanische Faktoren wie Ballondilatationen oder Gefäßoperationen und immunologi-sche Faktoren wie Endotoxine, Viren (Herpesvirus) und Chlamydia pneumoniae (131). Hyperto-nie, Diabetes mellitus und freie Radikale durch Zigarettenrauch schädigen ebenfalls das Endo-thel (68;69;131;144). In Gefäßabschnitten wie Gabelungen oder Kurven, an denen der Blutfluss durch Wirbelbildung unregelmäßig ist, sind die Endothelzellen nicht mehr eng aneinanderlie- 13 gend in ellipsoider Form in Richtung des laminaren Blutstroms ausgerichtet, sondern polygonal geformt und in keine bestimmte Richtung ausgerichtet (94). Dort besteht eine erhöhte Permeabi-lität für Makromoleküle wie z.B. LDL. Es kann sich zum Teil durch einfache Diffusion in der subendothelialen Matrix ablagern, zum Teil wird es auch aktiv durch die Endothelmembran transportiert (94) und dabei durch endotheliale Lipoxygenasen oxidiert (50). Diese subendotheli-ale Lipideinlagerung ist ein Stimulus für Endothelzellen. Sie reagieren darauf mit der Expression von Adhäsionsmolekülen wie E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 und setzen vasoaktive Moleküle, Zytokine (z.B. monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) und Wachstumsfaktoren frei, die Monozyten und Lymphozyten dazu veranlassen, am Endothel zu adhärieren und in die Intima zu transmigrieren (50;60;94;130). Ein wichtiger zugrunde liegender Mechanismus, durch den in den Endothelzellen die Reaktion auf die angeführten Stimuli vermittelt wird, ist die Aktivierung von NF-κB: Er ist als Transktiptionsfaktor wesentlich an der Aktivierung der Genexpression der genannten endothelialen Adhäsionsmoleküle beteiligt (24;50). Eine frühe Stufe der Leukozyten-Adhäsion bildet das sogenannte „Rolling“, das Rollen der Leukozyten entlang des Endothels, geleitet durch die Interaktion mit den Adhäsionsmolekülen (11). Dieser Prozess wird vorwiegend durch Selectine wie E-Selectin, das an die leukozytären Carbohydratliganden wie sLewisX bindet, vermittelt, aber auch ICAM-1 ist daran beteiligt (94). Die feste Adhäsion wird maßgeblich durch VCAM-1 und ICAM-1 vermittelt, an die Monozyten und T-Zellen mit dem β1-Integrin VLA-4 bzw. Mac-1 binden (94). Es ist durch histologische Untersuchungen atherosklerotischer Läsionen bekannt, dass Adhäsionsmoleküle in den Endothelzellen solcher atherosklerotischer Plaques vermehrt exprimiert werden (27;81;89-91;126;152). Die Bedeutung dieser Adhäsions-moleküle für das Rekrutieren der Leukozyten in das Entzündungsgebiet in vivo wird durch folgende Tatsache unterstrichen: Es wurde tierexperimentell nachgewiesen, dass ein Fehlen dieser Adhäsionsmoleküle in Knock-out-Mäusen ein Fortschreiten der Atherosklerose signifikant vermindern konnte (23;39;140).

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Nach der Migration durch die Endothel-Barriere differenzieren die Monozyten zu Makrophagen und phagozytieren subendotheliale Lipide. Die nach der reichlichen Phagozytose von Lipiden und Cholesterol-Estern als „Schaumzellen“ bezeichneten Makrophagen (131) sind jedoch nicht in der Lage, die phagozytierten Lipide vollständig abzubauen. Die bei der Phagozytose entstandenen Peroxide schädigen die Schaumzellen und führen schließlich zu deren Untergang (131). Die dadurch freigesetzten oxidierten und unlöslichen Lipide (50) locken weitere Monozyten an und aktivieren Makrophagen (131). Der auf diese Weise in Gang gesetzte Entzündungsprozess schreitet durch die Rekrutierung weiterer Leukozyten fort. Die Entzündungsreaktion, die eigentlich dazu dienen soll, Noxen wie proinflammatorische oxLDL-Partikel zu beseitigen und den Ausgangszustand wiederherzustellen, wird durch die Produktion von Zytokinen wie Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Transforming Growth Factor β (TGFβ) und durch die Produktion von Wachstumsfaktoren wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Monocyte Colony Stimulating Factor (M-CSF) oder Platelet Derived Growth Factor (PDGF) und die Einbeziehung anderer Zellen wie glatter Gefäßmuskelzellen in den Entzündungsprozess noch weiter vorangetrieben. So entwickeln sich die als „fatty streaks“ bezeichneten Läsionen, die hauptsächlich aus subendothelialem oxLDL, Schaumzellen und T-Lymphozyten bestehen (131), zu „fibrösen Plaques“. Deren Kerne setzen sich aus Lipiden und Zelldetritus zusammen und werden von fibrösen Kappen, die aus glatten Gefäßmuskelzellen und der von ihnen produzierten extrazellulären Matrix bestehen, bedeckt (130). Aus diesen Plaques kann sich dann durch weitere Vergrößerung eine sogenannte „advanced lesion“ weiterentwickeln. Eine „complicated lesion“ liegt vor, wenn durch zelluläre Proteinasen die extrazelluläre Matrix weiter aufgeweicht und eine Plaqueruptur aufgetreten ist (50). Eine wichtige Komponente, die zusätzlich zum Wachstum und zur Instabilität der Plaque beiträgt, ist die Neovaskularisation des Gefäßes durch intimale und adventitielle Gefäße (30;50;113;163). In den Endothelzellen dieser Gefäße konnte ebenfalls die Expression von E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nachgewiesen werden (28;114). Dadurch besteht eine weitere Möglichkeit der Rekrutierung von Leukozyten in das Entzündungsgebiet (30). Durch weitere Zytokin-Freisetzung und Abbau extrazellulärer Matrix durch die in den Entzündungsprozess involvierten Zellen wird das Atherom aufgeweicht und die Plaque kann rupturieren (50;64;151). Die Neovaskularisation der Plaque trägt so maßgeblich zur Instabilität bei.

Die Bedeutung der Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle lässt sich nun folgendermaßen zusammenfassen: Wird das vaskuläre Endothel durch eine Noxe wie z.B. oxLDL (oxidativen Stress) geschädigt, reagiert es früh mit der vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen. Die Monozyten und Lymphozyten aus dem Blut können adhärieren und durch das Endothel in die Intima migrieren. Dort wird der Entzündungsprozess durch die Aktivierung anderer Zelltypen wie glatter Gefäßmuskelzellen weiter vorangetrieben. Aus der frühen Läsion (fatty streak) entwickelt sich über eine vorwiegend fibröse Läsion (fibrous plaque) eine fortgeschrittene Läsion (advanced lesion) und schließlich die komplizierte Läsion (complicated lesion). Neben dem Hauptrekrutierungsweg der Leukozyten durch das luminale Endothel gibt es Alternativwege, über die die Monozyten und Lymphozyten an den Entzündungsort gelangen können: In den atherosklerotischen Gefäßabschnitten kommt es durch Migration von Endothelzellen zur Gefäßneubildung innerhalb der Gefäßwand. Die Endothelzellen dieser intimalen und adventitiellen Gefäße exprimieren ebenfalls die Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1. Somit besteht für die Leukozyten neben dem Weg über das luminale Endothel eine weitere Möglichkeit, in das Entzündungsgebiet zu gelangen. Das Atherom wird größer, und durch die Neovaskularisation, die weiteren Entzündungsvorgänge wie den Abbau extrazellulärer Matrix und den Zerfall lipidbeladener Makrophagen weicht die Plaque auf, wird instabil und kann rupturieren.

2.2 Funktion der PPARs und die Rolle der PPAR-Liganden
im kardiovaskulären System

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Die Bezeichnung Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) leitet sich von der Beo-bachtung her, dass bestimmte Stoffe, durch die diese Rezeptoren aktiviert werden, in Nagetieren die Proliferation von Peroxisomen (Zellorganellen in der Leber, die u. a. an der β-Oxidation von Fettsäuren beteiligt sind) und Hepatomegalie verursachen können (156). Obwohl diese Phänomene beim Menschen nicht nachweisbar sind (156), hat diese Rezeptor-Gruppe dennoch diesen Namen behalten. Es sind bisher die Subtypen PPARα, PPARγ und PPARδ (oft auch PPARβ genannt) bekannt. Die Berichte über PPARδ sind nicht einheitlich und seine Funktion ist noch sehr unklar, weshalb im folgenden nur auf PPARα und PPARγ genauer eingegangen wird. PPARα wird im wesentlichen in der Leber, im Herzen, in den Nieren, im braunen Fettgewebe und in der Darmmukosa exprimiert. PPARγ wird hauptsächlich im Fettgewebe exprimiert, es kommt aber auch im Darm und im Herzen vor (18;156). Wie bereits in Kapitel 1 erwähnt, gibt es endogene und exogene Liganden für die PPARs. Sie besitzen wie andere nukleäre Hormonrezep-toren eine DNA-bindende Domäne (DBD) und eine Ligand-bindende Domäne (LBD) (156). Bindet ein Ligand an die LBD, so transloziert der Komplex aus PPAR und Ligand in den Zell-kern, wo er mit dem Retinoid X Rezeptor (RXR), der u.a. durch 9-cis-retinoic acid aktiviert wird, ein Heterodimer bildet (9;31;156). Dieses PPAR:RXR Heterodimer bindet mit der DBD an ein DNA-Stück, das PPAR response element (PPRE) genannt wird, und aktiviert die Transkrip-tion des zu dem PPRE gehörenden Gens (111;138;156). PPARα und PPARγ beeinflussen den Fett- und Glukosestoffwechsel (79;138). PPARα wirkt hauptsächlich beim Abbau von Fettsäuren in der Leber mit (79). Die Zielgene von PPARα sind daher Gene, die eine Rolle im Lipidka-tabolismus spielen. So fördert PPARα die Aufnahme von Fettsäuren in die Leberzelle und die Oxidation dieser Fettsäuren in Zellorganellen wie Mikrosomen, Peroxisomen und Mitochondrien (79). PPARγ wirkt an der Differenzierung von Präadipozyten in Fettzellen mit und erfüllt in diesen Zellen eher eine anabole Aufgabe (31;146). Es stimuliert die Lipolyse zirkulierender Fettsäuren, die nachfolgende Aufnahme dieser Fettsäuren in die Zelle und deren Aktivierung, wodurch die Synthese von Triglyzeriden gefördert wird (79).

In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass auch vaskuläre Zellen wie Endothelzellen, glatte Gefäßmuskelzellen und Monozyten bzw. Makrophagen PPARα und PPARγ enthalten (15;71;84;97;101;103;104). Dies lässt auf eine Funktion von PPARs im kardiovaskulären Sys-tem schließen. Tatsächlich sind neben den Wirkungen der PPARα- und PPARγ-Liganden im Fett- und Glukosestoffwechsel inzwischen eine Vielzahl von Wirkungen im kardiovaskulären System bekannt (9;18;111;124;129). Neben einer Wirkung auf den Gefäßtonus beeinflussen PPAR-Liganden Mechanismen, die der Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blut in athe-rosklerotisch veränderte Gefäßabschnitte dienen. Ferner zeigen die Liganden Effekte auf die Blutgerinnung und auf das Migrationsverhalten von vaskulären Zellen. Auf diese Wirkungen soll im Folgenden näher eingegangen werden:

Endothelin-1 (ET-1) reguliert als potenter Vasokonstriktor den Gefäßtonus. Die Produktion von ET-1 wird in Endothelzellen durch PPARα- und PPARγ-Liganden gehemmt (34;136). In Patienten mit Bluthochdruck, Adipositas und Typ-II-Diabetes sind erhöhte ET-1-Werte im Blut messbar (42), und Hyperinsulinämie kann die Expression von ET-1 in vitro und in vivo stimulieren (43;70). Dieser Aspekt ist deshalb besonders interessant, da Typ-II-Diabetes und Hyperinsulinämie häufig mit Adipositas und Bluthochdruck vergesellschaftet sind (68;69) und PPARα-Liganden wie Fenofibrat zur Therapie der Hyperlipidämie und PPARγ-Liganden wie die Thiazo-lidindione zur Behandlung eines NIDDM eingesetzt werden. Neben einer Verbesserung der Stoffwechsellage haben PPAR-Liganden möglicherweise zusätzliche, günstige Wirkungen auf den Gefäßtonus von Patienten, deren Atheroskleroserisiko durch das Vorhandensein von Risikofaktoren wie Adipositas, Hyperlipidämie und Insulinresistenz erhöht ist.

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PPARγ-Liganden, nicht aber PPARα-Liganden hemmen in Endothelzellen außerdem die Expression der Chemokine IP-10 (Interferon [IFN]-inducible Protein-10), Mig (Monokine indu-ced by IFN-γ), I-TAC (IFN-inducible T-cell α-chemoattractant) und Monocyte Chemotactic Pro-tein-1 (MCP-1) (100;108). Diese Chemokine dienen der Aktivierung und Anlockung von Leukozyten, damit sie durch das Endothel migrieren (50). Die Wirkung von MCP-1 auf Monozyten und Makrophagen wird ebenfalls durch PPAR-Liganden beeinflusst. Kintscher et al. (80) konnten zeigen, dass die MCP-1-induzierte Migration von Monozyten durch PPAR-Liganden gehemmt wird. MCP-1 wird von vaskulären Endothelzellen produziert und vermittelt die Migration der Monozyten durch die Endothel-Barriere (50;94). Der Effekt von MCP-1, das zu der sogenannten CC-Familie der Chemokine gehört, wird in den Monozyten durch den transmembranären, G-Protein-gekoppelten Rezeptor CCR2 vermittelt (95). Die Expression dieses Rezeptors in den Monozyten wird ebenfalls durch PPARγ-Liganden gehemmt (65). Außerdem wird in Mono-zyten die Interferon-γ-induzierte Produktion wichtiger proinflammatorischer Zytokine wie TNFα, IL-6, IL-1β, IL-2 (76) und die Aktivierung der Monozyten durch Inhibition der induzier-baren NO-Synthase (iNOS)-Bildung und der Expression von Gelatinase B (einer Matrix-Metalloproteinase) und von scavenger-receptor-A gehemmt (128). PPAR-Liganden können also durch verschiedene Effekte auf Endothelzellen und Leukozyten die Interaktionen zwischen die-sen Zellen beeinflussen und dadurch möglicherweise eine Progression der Atherosklerose vermindern.

In weiter fortgeschrittenen atherosklerotischen Läsionen ist die Aktivierung der Blutgerin-nung mit nachfolgender Thrombosierung eine wichtige Komplikation (50). Die hierbei involvierten Mechanismen werden ebenfalls durch PPAR-Liganden beeinflusst, wobei sowohl antithrom-bogene, als auch prothrombogene Effekte beschrieben werden. Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 (PAI-1), der in vaskulären Endothelzellen synthetisiert wird, gehört zur Familie der Serin-Protease-Inhibitoren und vermindert durch seine hemmende Wirkung auf Gewebe-Plasminogen-Aktivator und Urokinase die Fibrinolyse (92). Die PAI-1-Plasma-Werte sind in Patienten mit Insulinresistenz erhöht (143) und korrelieren mit der Schwere der Atherosklerose in diesen Patienten (137). Marx et al. (97) und Xin et al. (159) berichten, dass PPARγ-Liganden die Expression von PAI-1 in Endothelzellen erhöhen. Dies würde in vivo eine Herabsetzung der fibrinolytischen Aktivität des Blutes bedeuten und könnte in Patienten mit Typ II-Diabetes und die an atherosklerotischen Gefäßabschnitten ohnehin vorhandene Gerinnungsneigung verstärken und somit prothrombotisch wirken. Kato et al. (77) berichten demgegenüber jedoch, dass durch den PPARγ-Ligand Troglitazon die Expression von PAI-1 in Endothelzellen herabreguliert wird. In vivo-Untersuchungen an Patientinnen mit Polyzystischem Ovar Syndrom, das u.a. durch Insu-linresistenz, Hyperinsulinämie und verschlechterte Fibinolyse-Aktivität charakterisiert ist, erga-ben, dass nach Behandlung mit Troglitazon die Plasma-Spiegel von PAI-1 reduziert waren (143). Ebenfalls nicht ganz einheitlich sind die Wirkungen von PPARα-Liganden auf die PAI-1-Sekretion in Endothelzellen. So verstärkten niedrige Dosen Clofibrat und Bezafibrat die PAI-1-Sekretion, wohingegen Fenofibrat und Gemfibrozil die PAI-1-Sekretion verminderten (112). Bezüglich der Wirkung der PPAR-Liganden auf die Expression von PAI-1 in Endothelzellen besteht also noch keine einheitliche Meinung.

Ein anderer Aspekt, der ebenfalls die Koagulation des Blutes an atherosklerotisch verändertem Endothel betrifft, ist die Produktion von Tissue Factor in Monozyten. Tissue Factor ist ein Protein, das an die Gerinnungsfaktoren VII/VIIa bindet und die Koagulationskaskade in Gang setzt (4). Es wird auf der Oberfläche von Lipid-beladenen Monozyten, Makrophagen und Schaumzellen in atherosklerotischen Läsionen exprimiert und verstärkt dort die Gerinnungsnei-gung des Blutes (3). Die Expression und Aktivität von Tissue Factor in Monozyten wird durch PPARα-Liganden inhibiert, nicht jedoch durch PPARγ-Liganden (101).

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Die Migration von Zellen wie Monozyten, glatten Gefäßmuskelzellen und Endothelzellen ist in allen Phasen der Atherosklerose von Bedeutung (50;94;131). In einigen Studien wurde berichtet, dass PPAR-Liganden die Migration von Zellen beeinflussen können. Wie oben er-wähnt, hemmen PPARγ-Liganden die MCP-1-induzierte Migration von Monozyten (80). Einige Studien zeigen, dass PPARγ-Liganden die Migration von glatten Gefäßmuskelzellen hemmen, die durch verschiedene Stoffe wie PDGF (55;84;85;102), TNFα (56), Thrombin oder Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) (55) induziert wird. Die antimigratorische Wirkung konnte im Tierexperiment bestätigt werden, wo PPARγ-Liganden signifikant die neointimale Verdickung von Arterien nach Ballon-Verletzung gegenüber unbehandelten Tieren verminderten (85;160). Die klinische Relevanz dieses Effektes wird dadurch unterstrichen, dass auch an Patienten mit Typ II-Diabetes gezeigt werden konnte, dass Troglitazon nach koronarer Stent-Implantation die Proliferation neointimalen Gewebes verminderte (148).

Weniger genau untersucht wurden die antimigratorischen Effekte bisher in Endothelzellen. Hierzu gibt es drei Arbeiten, in denen an Pigmentepithelzellen der Retina und bovinen choroidalen Endothelzellen die Wirkungen der PPARγ-Liganden auf die Neovaskularisation der Kornea untersucht wurden (109;110;159). In diesen Studien konnte gezeigt werden, dass PPARγ-Liganden die Neovaskularisation der Kornea in vitro und in vivo hemmen. Diese Beobachtung ist deshalb interessant, weil die in der Therapie des NIDDM eingesetzten Thiazolidindione PPARγ-Liganden sind und die Entwicklung einer diabetischen Retinopathie eine gefürchtete Spätfolge bei Diabetikern ist. Neben einer Verbesserung des Glukosestoffwechsels würden diese TZDs zusätzlich der Entwicklung einer diabetischen Retinopathie entgegenwirken.

In einigen wenigen Studien wird den PPAR-Liganden jedoch auch eine proatherogene Wirkung zugeschrieben. Tontonoz et al. (150) beschreiben in ihrer Studie, dass Monozyten bzw. Makrophagen (HL 60- und THP-1-Zellen) in Reaktion auf PPARγ-Liganden den Scavenger Re-ceptor CD 36 vermehrt exprimieren und als Folge davon vermehrt oxLDL phagozytieren, was schließlich in der Bildung von Schaumzellen mündet. Aus der gleichen Arbeitsgruppe zeigt die Studie von Lee et al. (86), dass in Endothelzellen, vermittelt durch PPARα, vermehrt MCP-1 und IL-8 produziert wird. Nach diesen Arbeiten käme den PPAR-Liganden auch eine proathero-gene Wirkung zu. Li et al. (88) zeigen jedoch, dass in LDL-Rezeptor-defizienten Mäusen unter der Gabe von PPARγ-Liganden trotz einer vermehrten Expression von CD 36 in atherosklerotischen Läsionen der antiatherogene Effekt überwiegt und eine Abnahme der Größe der atherosklerotischen Plaques bewirkt. Insgesamt scheinen also die antiatherogenen Effekte stärker zu sein als putative proatherogene Wirkungen.

2.3 Fragestellung

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Vor dem Hintergrund der bekannten, zumeist antiinflammatorischen Wirkungen der PPAR-Liganden sollte in der vorliegenden Arbeit der Effekt der PPAR-Liganden auf die beiden Endothelzellfunktionen Migration und Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 getestet werden. In einem ersten Schwerpunkt sollte die Wirkung der Liganden auf den Prozess der Migration von Endothelzellen untersucht werden. Hierbei sollte sowohl der Migrationsvorgang selbst mit einem Migrationsassay, in dem die Zahl der durch einen Filter migrierten Zellen gemessen wird, untersucht werden. In Ergänzung dazu sollte mit einem Adhäsionsassay der Einfluss der Liganden auf die Adhäsion der Endothelzellen auf einer extrazellulären Matrix beurteilt werden. Im Falle eines Effektes der PPAR-Liganden auf die Endothelzellmigration sollten Komponenten der Signaltransduktionskaskade, die die Migration von Zellen vermitteln, hinsichtlich ihrer Beeinflussung durch PPAR-Liganden überprüft werden. Mittels Western Blot-Analyse sollte die Wirkung von PPARα- und PPARγ-Liganden auf die Phosphorylierung von in den Signaltransduktionsprozess involvierten Enzymen (siehe Abb. 1) untersucht werden. In einem zweiten Schwerpunkt sollte unter Verwendung eines Zell-ELISAs (ELISA = Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) der Effekt der PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in Endothelzellen getestet werden.


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11.08.2006