Material und Methoden

3.1  Gewinnung von Endothelzellen humaner Nabelschnurvenen (HUVEC)

▼ 11 (fortgesetzt)

Die Nabelschnüre, aus denen die Endothelzellen abgelöst wurden, wurden freundlicherweise von den Hebammen der Geburtskliniken der Charité, Campus Virchow-Klinikum (Direktor: Prof. Dr. J. W. Dudenhausen), und Campus Benjamin Franklin (damaliger Direktor: Prof. Dr. H. Weitzel) zur Verfügung gestellt. Die Gewinnung von Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) erfolgte in modifizierter Form nach einer publizierten Methode (46;75). Die Nabelschnüre wurden unverzüglich nach der Geburt an beiden Enden mit einer Nabelschnurklemme abgeklemmt und in 500ml-Gefäße gelegt, in sich de-nen ca. 100 ml einer phosphatgepufferten Salzlösung (Phosphate Buffered Saline, PBS) mit Ca2+, Mg2+, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) zur Aufbewahrung der Nabelschnüre befanden. Dort wurden sie nicht länger als drei Tage bis zur Präparation aufbewahrt. Die Präparation fand unter sterilen Bedingungen statt, d.h. es wurde Schutzkleidung getragen und die Nabelschnur wurde auf einer keimarmen Unterlage mit sterilen Instrumenten bearbeitet. Soweit nicht anders erwähnt wurden die Endothelzellen mit einem standardisierten Kulturmedium bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Das Kulturmedium bestand aus Medium 199 Earle, das mit 20 % fetalem Kälberserum (FKS), 1 % L-Glutamin-Lösung (200 mM), Penicillin (100 U/l), Streptomycin (100 µg/ml), HEPES-Puffer (10 mM) und acidic Fibroblast Growth Factor (aFGF, 10 ng/ml) angereichert war.

Die Nabelschnur wurde mit einer Pinzette aus dem Glas geholt. Auf der Unterlage wurden die abgeklemmten Enden mit einem sterilen Einmalskalpell abgeschnitten und das restliche Blut aus der Nabelschnur gedrückt. Abschließend wurde eine Venenverweilkanüle (Durchmesser 1,0 bzw. 1,4 mm) in die Vene eingeführt, an dieser Stelle mit einer Klemme abgeklemmt und in einen Stativständer eingehakt. Um das restliche Blut aus der Vene zu spülen, wurde die Nabelschnur mit 40 ml PBS (mit Ca2+ und Mg2+) durchgespült, das in eine Nierenschale ablaufen konnte. Dann wurde das untere Ende abgeklemmt und durch den Venenverweilkatheter am oberen Ende 10 ml einer Dispase-II-Lösung (2,4 U/ml) in die Vene gegeben. Nachdem der Venenverweilkatheter anschließend mit einem Verschlusskonus verschlossen worden war, wurde die Nabelschnur für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Nabelschnur auf der Unterlage mit 70% Propanol abgesprüht und mit den Händen vorsichtig durchgeknetet, damit sich möglichst alle Endothelzellen von der Gefäßwand lösten. Die Nabelschnur wurde erneut in den Ständer eingehakt, das untere Ende mit dem Skalpell abgeschnitten und der Inhalt, d.h. die
Dispase-II-Lösung mit den abgelösten Endothelzellen, konnte in ein steriles 50ml-Röhrchen von Falcon® ablaufen. Die Nabelschnur wurde dann mit 10 ml Kulturmedium gespült, die ebenfalls in das 50 ml-Röhrchen abliefen. Die frisch gewonnenen Zellen wurden für 5 Minuten bei 1200 U/min (entspricht 250 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgesaugt, das Pellet wurde mit 10 ml Kulturmedium resuspendiert und in eine mit 0,2% Gelatine beschichtete, sterile Kulturflasche T 75 (75 cm2) überführt. Der erste Mediumwechsel mit 8 ml Kulturmedium erfolgte nicht später als nach 24 Stunden.

3.2 Zellpflege und Zellpassage

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Nach dem ersten Mediumwechsel am Tag nach der Gewinnung der Primärkultur wurde das Medium regelmäßig all zwei Tage gewechselt, d.h. das alte Medium wurde abgesaugt und neues Medium wurde in die Kulturflasche pipettiert. Bei Konfluenz der Zellen wurde die Kultur 1:3 passagiert. Dazu wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen wurden zwei mal mit PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) + 0,02% EDTA (Ethylenediamine Tetra-acetic Acid) gespült. Dann wurden die Zellen mit 2 ml Trypsin + EDTA vom Gelatine-Boden der Kulturflasche abgelöst. Wenn sich nach Überprüfung unter dem Mikroskop zeigte, dass alle Zellen vom Boden abgelöst waren, wurden 2 ml Kulturmedium in die Flasche gegeben, und mit einer sterilen gestopften Pipette wurden die Zellen in ein 15ml-Gefäß überführt. Dann wurden die Zellen für 5 Minuten mit 1200 U/min zentrifugiert, mit 3 ml Kulturmedium resuspendiert und zu gleichen Anteilen (3 x 1 ml) in drei neue Kulturflaschen (75 cm2) gegeben, die mit 7 ml Kulturmedium gefüllt waren. Für die Experimente wurden Kulturen bis zur dritten Passage verwendet.

3.3 Migrationsassay

Mit dem Versuch sollte der Einfluss der PPAR-Liganden auf das Migrationsverhalten von Endothelzellen untersucht werden. Das Prinzip ist dabei folgendes (siehe Abb. 2): Die Endothelzellen werden auf einem Polycarbonat-Filter mit 8 µm großen Poren ausgesät und für 30 Minuten mit den PPAR-Liganden inkubiert. Dann wird VEGF (10 ng/ml) in die untere Kammer gegeben, und nach fünf Stunden werden die durch den Filter migrierten Zellen unter dem Mikroskop standardisiert gezählt.

Zur Vorbereitung des Versuches wurde die innere Kammer mit 200 µl, die äußere Kammer mit 700 µl 0,2%iger Gelatine beschichtet und für 24 Stunden bei 4°C gelagert. Unmittelbar vor dem Versuch wurde die Gelatine mit 1%igem bovinen Serumalbumin (BSA) für eine Stunde bei 37°C geblockt (innen 200 µl, außen 700 µl), um unspezifische Wechselwirkungen, die eventuell durch

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Abbildung 2: Prinzip des Migrationsassays
In der Abbildung ist schematisch ein Well einer Multiwell-Platte mit einem Membraneinsatz (Filter mit 8 µm großen Poren) dargestellt.
Die Endothelzellen werden auf dem Boden des einsetzbaren Filters (innere Kammer) ausgesät. Durch Stimulation mit Zytokinen wie z.B. VEGF, die sich in der äußeren Kammer befinden, migrieren die Zellen durch die Poren der inneren Kammer hindurch und bleiben an der Unterseite haften. Nach dem Entfernen der nichtmigrierten Zellen von der Innenseite der Kammer und dem Fixieren der an der Unterseite haftenden Zellen kann die Anzahl der durch den Filter migrierten Zellen unter dem Mikroskop gezählt werden.

freie Reste der Gelatine zustande kommen und die Migration stören könnten, zu verhindern. In der Zwischenzeit wurden die Zellen einer konfluenten Kulturflasche trypsinisiert, abgelöst und für fünf Minuten mit 1200 U/min zentrifugiert. Um das Trypsin so gut wie möglich von den Zellen zu entfernen, wurden sie in Kulturmedium resuspendiert und noch einmal in gleicher Weise zentrifugiert. Anschließend wurden sie in 5%igem FKS-Medium (Medium 199 Earle + 5% FKS) resuspendiert. Da Serum selbst als Migrations-Stimulus wirken kann, wurde der Serumanteil im Medium so gering wie möglich gehalten. In Vorversuchen hatte sich gezeigt, dass ein Serumanteil von 5% für das Überleben der Zellen notwendig ist. 50 µl der Zellsuspension wurden in einer Neubauer-Kammer gezählt und die gesamte Resuspension anschließend so verdünnt, dass in 1 ml Medium 250.000 Zellen enthalten waren. In die äußere Kammer wurden 700 µl 5%-FKS-Medium gegeben, in der inneren Kammer wurden 50.000 Zellen (200 µl der Zellsuspension) ausgesät. Zur Adhäsion auf der Gelatine-Matrix wurden die Zellen für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Das sichere Haften auf der Matrix wurde anschließend unter dem Mikroskop durch leichtes Schütteln der Platte kontrolliert. Dann wurden die Zellen mit den PPAR-Liganden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dazu wurde das Medium aus der äußeren und der inneren Kammer abgesaugt, und neues 5%-FKS-Medium, das die Liganden in den jeweils zu testenden Konzentrationen enthielt, wurde außen und innen wieder dazugegeben. Die Zellen wurden dann mit VEGF (10 ng/ml) stimuliert, indem das Medium aus der äußeren Kammer abgesaugt und neues Medium mit den Liganden und VEGF wieder dazugegeben wurde. Als Negativkontrollen dienten Zellen, die nicht mit VEGF stimuliert und nicht mit den Liganden vorinkubiert wurden. Die Zellen der Positivkontrolle wurden ebenfalls nicht mit den Liganden vorinkubiert, sondern nur mit VEGF stimuliert.

Nach fünf Stunden Stimulation bei 37°C wurde das Medium innen und außen vorsichtig abgesaugt, und die Zellen wurden einmal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült, um nicht durch den Filter migrierte Zellen zu entfernen. Die Innenseite des Membran-Einsatzes wurde vorsichtig mit einem Q-Tip gereinigt. Nach nochmaligem Spülen mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) wurden die Zellen mit 100% Methanol für 20 Minuten bei -20°C fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit Wasser gespült und mit Mayer’s Hämalaun für 15 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Dann wurde der Farbstoff mit Wasser abgespült, bis sich keine Farbwolken mehr lösten. Die durch den Filter migrierten Zellen wurden dann unter dem Mikroskop in einer zehnfachen Vergrößerung gezählt. Dabei wurde fast die gesamte Membran erfasst, so dass keine standardisierten Gesichtsfelder ausgewählt werden mussten.

3.4 Western Blot

3.4.1  Gewinnung der Zellextrakte

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Die Endothelzellen wurden auf mittelgroßen Petrischalen (Durchmesser 5 cm) ausgesät. Bei ca. 95 % Konfluenz wurden sie mit 5 % Serum enthaltenden Medium 199 Earle für 18 Stunden vorinkubiert, anschließend analog zu den Migrationsassays für 30 Minuten mit den PPARα- und PPARγ-Liganden in den Konzentrationen 10 und 20 µM inkubiert und dann für 10 Minuten mit VEGF (10 ng/ml) stimuliert.

Nach der Stimulation wurden die Zellen mit eisgekühltem PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült (ca. 3 ml). Dazu wurde das PBS zu dem Medium in die Kulturschalen gegeben, abgesaugt und anschließend noch einmal nur mit PBS gespült und abgesaugt. Zum Stoppen der Zellaktivität wurden 150 µl eines Cocktails aus Proteinase-Inhibitoren (RIPA-Puffer + PMSF + PIC I + PIC II) pro Petrischale auf die Zellen gegeben und die Schalen für 10 Minuten auf Eis gestellt (RIPA = Radioimmunoprecipitation Assay, PMSF = Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid, PIC I und II = Proteinase Inhibitor Cocktail for General Use bzw. No. 2 [von Sigma]). Anschließend wurden die Zellen mit einem Zellschaber zerstört und der Zellextrakt in Eppendorf-Cups pipettiert. Je nachdem, ob nach dem Gewinn der Zellextrakte mit der Verarbeitung fortgefahren oder erst später weitergearbeitet wurde, wurden die Extrakte in den Cups bei –20°C eingefroren.

RIPA-Puffer:

PBS (ohne Ca2+ und Mg2+)

 
 

Igepal

1 %

 

Natrium-Deoxycholat

0,5 %

 

SDS (Dodecylsulfat-Natriumsalz)

0,1 %

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Proteinase-Inhibitoren:

pro ml RIPA:

 

10 µl PMSF (10 mg/ml)

 

2,5 µl PIC I (for general use)

 

2,5 µl PIC II (No. 2)

3.4.2 Proteinbestimmung mit der BCA-Methode

Waren die Zellextrakte vorher eingefroren, so wurden die Proben langsam auf Eis wieder aufgetaut. Ansonsten wurde sofort mit dem Homogenisieren des Extraktes begonnen, indem der Inhalt der Cups mit einer Pipette mit dünner, ausgezogener Spitze durchgemischt und somit homogenisiert wurde. (Zur weiteren Blockierung der Proteasen wurden noch einmal ca. 10 µl PMSF zu den Proben gegeben und diese für 30 Minuten auf Eis geschüttelt.) Anschließend wurde das Homogenisat für 10 Minuten bei 4°C mit 11.000 U/min (entspricht 11.500 x g) zentrifugiert. Dadurch wurden die schwereren Zellanteile wie Membranen von den Proteinen, die nun im Überstand enthalten sind, getrennt. Der Überstand wurde in neue Eppendorf-Cups überführt, ca. 10 µl wurden für die Proteinbestimmung verwendet.

Die anschließende Proteinbestimmung erfolgte nach dem BCA-Protein Assay von Pierce (BCA = Bicinchoninic acid). Dazu wurden alle Proben 1:10 mit Wasser verdünnt. Für die Standardreihe mit bekannter Proteinkonzentration wurde BSA in 1:2-Schritten von der höchsten Konzentration 2 mg/ml bis auf 62,5 µg/ml mit Wasser verdünnt. Als Nullprobe diente reines Wasser. Sowohl von den Referenzproben, als auch von den zu bestimmenden Proben wurden je zwei mal 20 µl + 300 µl BCA-Lösung ( 50 Teile Reagens A + 1 Teil Reagens B des BCA-Protein Assays) pro Well auf die Mikrotiterplatte gegeben und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Jede Konzentration wurde also zweifach angesetzt. Anschließend wurden die Proben im ELISA-Reader bei 550 nm gemessen. Als Ergebnis wurden automatisch die Proteinkonzentrationen in µg/ml anhand der Standardkurve errechnet.

3.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

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Zur Vorbereitung für das Herstellen der Gele wurden zuerst eine 10%ige Ammoniumpersulfat-Lösung (APS, kristallines Pulver in Wasser gelöst), als auch die beiden Gelpuffer (Sammelgelpuffer und Trenngelpuffer) frisch angesetzt.

Sammelgelpuffer:

Tris-HCl

1 M

(pH 6,8)

Trenngelpuffer:

Tris-HCl

1,5 M

(pH 8,8)

Danach wurde das Trenngel angesetzt (10 %ig, 1,5 mm Dicke). Die Menge des benötigten Acrylamid/Bisacrylamid-Anteils wurde nach einer standardisierten Formel für die Prozentigkeit der Gele ausgerechnet. Durch Radikalketten-Polymerisation von Acrylamid und dem vernetzenden Bisacrylamid wird eine poröse Gelmatrix erzeugt. Die Porengröße kann durch Veränderung der Konzentrationen der beiden Monomere variiert werden. Der Polymerisierungsstart erfolgt durch die Zugabe von Ammoniumpersulfat (APS) und N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylen-Diamin (TEMED), das die gebildeten Radikale stabilisiert und so eine gleichmäßige Polymerisation bewirkt. Damit das Gel nicht austrocknet und die Ränder des Gels sich wegen der Kapillarwirkung nicht nach oben ziehen, wurde Wasser bis zum oberen Rand über das Trenngel gegossen. Anschließend wurde das Sammelgel angesetzt (5 %ig, 1,5 mm Dicke). Sobald das Trenngel auspolymerisiert war, wurde die Wasserphase vom Trenngel abgegossen, und das Sammelgel wurde vorsichtig, damit keine Luftblasen entstanden, auf das Trenngel pipettiert. Dann wurden Kämme auf das Sammelgel gesteckt, die die Taschen für die Proteinproben vorformten.

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Trenngel:

Trenngelpuffer

1,5 M

 

SDS-Lösung

10 %

 

APS-Lösung

10 %

 

Acrylamid / Bisacrylamid

(30% / 0,8 % Stammlösung)

(richtet sich nach Gel-Prozentigkeit)

 

TEMED

(richtet sich nach Gel-Prozentigkeit)

 

H2O

(richtet sich nach Gel-Prozentigkeit)

Sammelgel:

Sammelpuffer

1 M

 

SDS-Lösung

10 %

 

APS-Lösung

10 %

 

Acrylamid / Bisacrylamid

(30% / 0,8 % Stammlösung)

(richtet sich nach Gel-Prozentigkeit)

 

TEMED

(richtet sich nach Gel-Prozentigkeit)

 

H2O

(richtet sich nach Gel-Prozentigkeit)

Zur Vorbereitung der Elektrophorese wurden zuerst ein Elektrophorese-Puffer und -wenn nötig- ein Proben-Puffer frisch angesetzt. Die Proben in den Eppendorf-Cups wurden mit Proben-Puffer (5-fach konzentriert) 1:5 verdünnt und für 5 Minuten bei 95°C gekocht. Das im Probenpuffer enthaltene SDS bewirkt ein Denaturieren der Proteine, und ebenfalls enthaltenes 2-Mercapto-Ethanol reduziert die vorhandenen Disulfid-Brücken. Anschließend wurde das Kondensat (Wasser) einige Sekunden lang abzentrifugiert. Sobald das Sammelgel auspolymerisiert war, wurden die Kämme aus dem Gel genommen. Die Slots wurden mit Wasser ausgespült, und das Gel wurde in die Elektrophorese-Kammer eingesetzt, in die der Elektrophorese-Puffer gefüllt worden war. Dann wurden die Proben und die Marker mit definierten Proteinbanden (Prestained SDS-PAGE Standard Broad Range und Kaleidoskop Prestained SDS-PAGE Standard, beide von Biorad) in die Slots gegeben (je ein Marker ganz rechts und ganz links, die Proben-Reihe in der Mitte). Zum Auftrennen der Proteine wurde für 2 Stunden eine Spannung von 80 V an das Gel angelegt. Anhand von im Probenpuffer enthaltenem Bromphenol-Blau konnte das Fortschreiten der Proteinauftrennung während der Elektrophorese verfolgt werden.

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Elektrophorese-Puffer

nach Maniatis:

Tris-Base

25 mM

 

Glycin

250 mM

 

SDS

0,1 %

Proben-Puffer (einfach):

Tris-Base

312,5 mM

 

SDS

10 %

 

Glycerol

50 %

 

2-Mercapto-Ethanol

25 %

 

Bromphenol-Blau

0,25 %

3.4.4 Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran

Nachdem anhand der Marker kontrolliert worden war, dass die Elektrophorese abgeschlossen war, wurde das Gel aus der Kammer genommen und für 10 Minuten zum Äquilibrieren in einen Transferpuffer nach Bio-Rad gelegt. Eine Nitrocellulose-Membran (Hybond ECL) wurde mit Wasser benetzt und ebenfalls in Transferpuffer gelegt, allerdings in einer anderen Schale, damit der Farbstoff der Marker aus dem Gel nicht die Nitrocellulose anfärbt. Der Tankblotter wurde gemäß Herstellerangaben zusammengebaut. Für den Transfer der Proteine aus dem Gel auf die Membran wurden das Gel und die Membran mit einem Filter und einem Filter pad in dieser Reihenfolge in der Transferkassette an die Elektroden angelegt:

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Kathode – Filter pad / Filter / Gel / Membran / Filter / Filter pad – Anode. Bei 100 V und 400 mA wurden die Proteine für etwa eine Stunde im Tankblotter auf die Membran transferiert.

Transferpuffer nach Bio-Rad:

Glycin

192 mM

 

Tris-Base

25 mM

 

Methanol

20 %

 

pH 8,8

 

Nach dem Transfer der Proteine wurde die Membran aus der Kassette genommen. Um zu prüfen, ob die Proteine sich nun tatsächlich auf der Nitrocellulose befinden, wurden die Proteine mit dem Farbstoff Ponceau S (20 %), der 1:100 verdünnt wurde, angefärbt. Dazu wurde die Membran in die Färbelösung gelegt und für fünf Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Anfärbung der Proteinbanden zeigte den erfolgreichen Proteintransfer. Anschließend wurde die Membran mit Wasser wieder entfärbt.

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Um eine spätere unspezifische Bindung der Antikörper an andere Proteine oder Reste der Nitrocellulose zu verhindern, wurden diese so gut wie möglich blockiert, um dieser Bindung vorzubeugen. Als Blocking Reagenz eignet sich Magermilchpulver sehr gut. Es wurde eine Pufferlösung aus Tris-gepufferter Salzlösung (Tris Buffered Saline, TBS) und Tween 20 (pH 7,6) + 5% Magermilchpulver angesetzt, in die die Nitrocellulose-Membran für eine Stunde gegeben und leicht geschüttelt wurde. Nach dem Absaugen wurde die Membran noch zweimal in dem Puffer für fünf Minuten gewaschen.

TBS / Tween 20:

Tris-Base

20 mM

 

NaCl

137 mM

 

Tween 20

0,05 %

3.4.5 Detektion der geblotten Proteine

Je nachdem, welches Enzym untersucht werden sollte, Phospho-MAP-Kinase oder Phospho-Akt, wurde ein spezifisch gegen dieses Antigen gerichteter Primärantikörper auf die Nitrocellulose-Membran gegeben. Für Phospho-MAP-Kinase wurde der Antikörper Anti-Active-MAP-Kinase von Promega verwendet, für Phospho-Akt Anti-Phospho-Akt von Cell Signalling. Die Antikörper Anti-Active-MAP-Kinase und Anti-Phospho-Akt wurden gemäß Herstellerangaben 1:5000 bzw. 1:1000 verdünnt. Die Membran wurde aus dem Puffer genommen und in ein neues Gefäß mit der verdünnten Antikörper-Lösung gelegt. Über Nacht (bei 4°C) wurde die Membran vorsichtig hin und her geschüttelt, damit der Antikörper effektiv binden konnte. Danach wurde die Membran drei mal für 15 Minuten mit TBS / Tween-Puffer gewaschen. Währenddessen wurde der den Primärantikörper bindende, enzymgekoppelte Sekundärantikörper (Anti-Rabbit IgG Peroxidase-konjugiert, Sigma) 1:10.000 mit TBS / Tween verdünnt und nach Beendigung der Waschvorgänge auf die Nitrocellulose-Membran gegeben, die eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Anschließend wurde die Membran erneut unter sanftem Schütteln für 15 Minuten in TBS-Tween-Puffer gewaschen.

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Als Substrat für das Enzym des Sekundärantikörpers wurden die Reagenzien 1 und 2 des Enhanced Chemiluminescence (ECL)-Kits 1:2 angesetzt (ca. 3 ml pro Blot). Die Membran wurde aus dem Spülbad genommen und mit der Proteinseite nach oben auf eine Folie gelegt. Nach dem vorsichtigen Abstreifen der Flüssigkeit wurde das Substrat (Nachweisreagenz des ECL-Kits) auf die Membran gegeben und für eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Membran vorsichtig abgetupft, mit Folie nun auch auf der Proteinseite zugedeckt und in der Dunkelkammer zusammen mit einem Röntgenfilm in eine Filmkassette eingelegt, wo das vom Enzym umgewandelte Substrat mit seiner Lumineszenz den Film belichtete. Dann wurde der Film in den Entwickler gegeben und das belichtete Negativ beurteilt.

3.5 Adhäsionsassay

Dieser Versuch wurde durchgeführt, um zu testen, ob die Adhäsion von Endothelzellen auf einer Gelatine-Matrix durch die PPAR-Liganden beeinflusst wird. Er beruht auf folgendem Prinzip: Eine Endothelzell-Suspension wird mit den PPAR-Liganden in den jeweiligen Konzentrationen für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend auf einer 0,2%igen Gelatine-Matrix ausgesät. Dort können die Zellen bei 37°C eine Stunde lang adhärieren. Danach werden die nichtadhärenten Zellen abgespült, die adhärierten Zellen werden fixiert und gefärbt. Nach Zerstörung der Zellmembran durch ein Detergenz verteilt sich der von den Zellen aufgenommene Farbstoff gleichmäßig, und die Extinktion kann gemessen werden. Die Extinktion ist proportional zur Zahl der adhärierten Zellen.

Zur Vorbereitung des Versuchs wurden 96-Well Mikrotiterplatten mit 0,2% Gelatine beschichtet (100 µl/Well) und für mindestens 12 Stunden bei 4°C aufbewahrt. Vor der Durchführung des Versuches wurde die Gelatine abgesaugt. Um unspezifische Wechselwirkungen der Zellen mit der zurückbleibenden Gelatine-Matrix zu vermeiden, wurden 100 µl einer 1%igen bovinen Serumalbumin (BSA)-Lösung in die Wells gegeben und die Mikrotiterplatte für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Währenddessen wurden die Zellen einer konfluenten Kulturflasche (75 cm2) wie zur Passage trypsinisiert und mit 0,02% EDTA-haltigem PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) vom Gelatine-Boden abgelöst. Nach Zentrifugieren der Zellen mit 1200 U/min, Absaugen des Überstandes und Resuspension mit Kulturmedium, wurden die Zellen noch ein Mal zentrifugiert und in 5 % FKS enthaltendem Medium 199 Earle resuspendiert. 50 µl der Resuspension wurden für das Zählen der Zellen in einer Neubauer-Kammer verwendet. Anschließend wurde die Resuspension durch Verdünnung mit 5%-FKS-Medium auf eine Konzentration von 250.000 Zellen / ml gebracht. Dann wurden die Zellen mit den PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat und den PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon in Konzentrationen von 0,1 µM bis 20 µM für 30 Minuten in Eppendorf-Cups vorinkubiert. Als Kontrolle dienten Zellen, die ohne die Liganden inkubiert wurden. Danach wurde das BSA aus den Wells der Mikrotiterplatte abgesaugt. Die mit den PPAR-Liganden vorinkubierten Zellen wurden auf der Platte ausgesät (100µl/Well) und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.

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Nach der Inkubation wurde die Flüssigkeit aus den Wells gegossen, die Wells einmal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült (100 µl/Well) und noch einmal ausgegossen. Danach wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert (100 µl/Well). Im Anschluss daran wurden die Zellen mit 0,05% Toluidinblau in 4% Paraformaldehyd (100 µl/Well) für 10 Minuten bei Raumtemperatur angefärbt. Nach dreimaligem Waschen mit destilliertem Wasser (100 µl/Well) wurden die Zellen mit 1%igem SDS lysiert (100 µl/Well). Nach frühestens fünf Minuten, in denen sich der von den Zellen zuvor aufgenommene Farbstoff gleichmäßig verteilen konnte, wurde die Extinktion im ELISA-Reader bei 630 nm gemessen. Als Referenzwert dienten die Werte für leere Wells, die nur mit PBS (ohne Ca2+ und Mg2+) gefüllt waren.

3.6 Zell-ELISA

Mit diesem Versuch sollten die Wirkungen der PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 untersucht werden. Er beruht auf folgendem Prinzip (siehe Abb. 3): Auf stimulierte Zellen wird ein spezifischer Primärantikörper gegen das nachzuweisende Adhäsionsmolekül gegeben, der an dieses fest bindet. Ein Enzym-gekoppelter Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper. Durch Zugabe eines Substrates, das durch das Enzym des Sekundärantikörpers umgewandelt wird, erfolgt ein Farbumschlag, dessen Intensität der Menge des exprimierten Adhäsionsmoleküls entspricht.

Für den Versuch wurden die Zellen einer Kulturflasche (75 cm2) wie zum Passagieren trypsinisiert und abgelöst. Nach dem Zentrifugieren und Resuspendieren in 30 ml Kulturmedium wurden die Zellen auf drei 96-Well Mikrotiterplatten ausgesät (100 µl/Well). Präkonfluenz

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Abbildung 3: Prinzip des Zell-ELISAs
In dieser Abbildung ist schematisch ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte dargestellt. Am Boden ist der Endothelzell-Monolayer zu erkennen.
Auf die durch Zytokine wie z.B. TNFα stimulierten Zellen wird ein Primärantikörper (1) gegeben, der spezifisch an das nachzuweisende Adhäsionsmolekül bindet. Ein Enzym-gekoppelter (in diesem Falle Alkalische Phosphatase, AP) Sekundärantikörper (2) bindet an den Primärantikörper. Durch Zugabe eines Substrates (z.B. p-Nitrophenyl-Phosphat), das durch das Enzym des Sekundärantikörpers umgesetzt wird, erfolgt ein Farbumschlag, dessen Extinktion im ELISA-Reader gemessen wird, und dessen Intensität der Menge an nachgewiesenen Adhäsionsmolekülen proportional ist.

wurde nach zwei Tagen, Konfluenz drei Tage nach der Passage erreicht. Es wurden sowohl Zellen am zweiten Tag für 24 Stunden, als auch Zellen am dritten Tag für 30 Minuten mit den Liganden vorinkubiert und anschließend mit TNFα (500 U/ml) unter Zugabe der Liganden für vier Stunden stimuliert. Die Konzentration der Liganden reichte von 0,01 µM bis 100 µM. Als Negativkontrolle dienten Zellen, die nicht mit TNFα stimuliert waren. Die Zellen der Positivkontrolle wurden nur mit TNFα ohne die Liganden stimuliert.

Nach Ablauf der vier Stunden wurden die Zellen zwei Mal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült. Dann wurden die Primärantikörper gegen die Adhäsionsmoleküle E-Selectin (1:400), VCAM-1 (1:50) und ICAM-1 (1:50) auf die Zellen gegeben (50 µl/Well) und diese bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Nach anschließendem dreimaligen Waschen mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) wurde der Sekundärantikörper, an den das Enzym Alkalische Phosphatase gekoppelt war, in einer Verdünnung von 1:3000 zu den Zellen gegeben (100 µl/Well) und diese nochmals für eine halbe Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden erneut drei Mal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült, und das Substrat p-Nitrophenyl-Phosphat wurde zu den Zellen gegeben, die bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wurden, bis ein Farbumschlag zu sehen war. Danach wurde Extinktion im ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen. Als endgültige Daten wurden jene Extinktionswerte verwendet, die zu dem Zeitpunkt erreicht worden waren, an dem der Wert für E-Selectin der nur mit TNFα stimulierten Positivkontrolle 1 bis 1,5 betrug.

3.7 Apoptose-Assay

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Für diesen Versuch wurde das Test-Kit „In Situ Cell Death Detection, POD“ der Firma Roche verwendet. Alle Lösungen und Reagenzien wurden so hergestellt, wie es in der Anleitung geschrieben stand.

Im Rahmen von Apoptosevorgängen entstandene DNA-Strangbrüche können identifiziert werden, indem die freien 3‘-OH-Gruppen mit Fluoreszein-markierten Nukleotiden in einer enzymatischen Reaktion gekennzeichnet werden. Diese Reaktion wird durch das Enzym Terminal deoxynucledityl Transferase (TdT) katalysiert. Ein Anti-Fluoreszein-Antikörper, an den das Enzym Peroxidase (POD) gekoppelt ist, bindet an das Fluoreszein. Als Substrat für POD dient  3,3‘-Diaminobenzidin (DAB), das durch Verwertung von Kobaltchlorid und Nickelchlorid ein dunkelbraunes Präzipitat bildet. Zur Herstellung der DAB-Lösung wurde das „DAB, Metal Enhanced Substrate Set“ der Firma Roche verwendet und gemäß der Gebrauchsanweisung angesetzt. Nach Beendigung des Experiments wurde die Anzahl der angefärbten Kerne bestimmt.

3.7.1  Vorbereitung der Zellen

Für den Versuch wurden die Zellen einer konfluenten Kulturflasche (75 cm2) trypsinisiert, abgelöst und in der gleichen Konzentration wie für den Zell-ELISA, also resuspendiert in 30 ml Kulturmedium, auf 16-Well-Slides ausgesät (100 µl/Well). Der Boden dieser Slides ist ein Glas-Objektträger, auf den eine Schablone in Form von 16 Wells aufgeklebt ist. Die Slides waren zuvor mit Fibronectin (1µg/cm2) beschichtet worden, das 45 Minuten bei Raumtemperatur einwirken konnte und dann wieder abgesaugt wurde. Es konnte diesmal keine 0,2%ige Gelatine verwendet werden, da die Zellen auf gelatine-beschichtetem Glas nicht hafteten. Bei Konfluenz der Zellen in den Wells wurde der Versuch durchgeführt. Die Zellen wurden dazu für 24 Stunden mit den PPARα- und PPARγ-Liganden in einer Konzentration von 100 µM vorinkubiert und anschließend für vier Stunden mit TNFα (500 U/ml) und den Liganden stimuliert.

3.7.2 Durchführung und Auswertung

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Nach Ablauf der Zeit wurden die Zellen mit frisch angesetztem Paraformaldehyd (4%) in PBS (ohne Ca2+ und Mg2+), dessen pH-Wert 7,4 betrug, für eine Stunde bei Raumtemperatur fixiert. Danach wurden die Zellen einmal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült und für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit frisch angesetzter Blocking Solution (3% H2O2 in Methanol) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen noch einmal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült und mit Permeabilisation Solution (0,1% Triton® X-100 in 0,1% Natrium-Citrat) für zwei Minuten auf Eis inkubiert. Nach zweimaligem Spülen mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) wurde das TUNEL-Reagens (ca. 12µl) gleichmäßig in jedes Well gegeben und die Zellen für eine Stunde bei 37°C inkubiert (TUNEL= TdT-mediated dUTP [deoxy-Uridin-Tri-Phosphat] Nick End Labeling). Anschließend wurden die Zellen drei Mal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gewaschen. Der Anti-Fluoreszein-Antikörper wurde in die Wells gegeben (ca. 20 µl der Converter-POD-Lösung des Test-Kits) und die Zellen wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen erneut dreimal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gewaschen. Anschließend wurden ca. 20 µl der DAB-Substrat-Lösung in die Wells gegeben und die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Zellen wiederum dreimal mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) gespült. Zur besseren Identifizierung der Präzipitate in den Zellkernen wurden nach dem Umsetzen des Substrats die Zellkerne mit 0,05% Toluidinblau in 4% Paraformaldehyd angefärbt. Dazu wurden 100 µl der Toluidinblau-Lösung für 15 Sekunden in die Wells zu den Zellen gegeben. Anschließend wurden die Slides in ein Wasserbad getaucht, um die überschüssige Farbe von den Zellen zu waschen. Nach dem Waschen der Slides wurde der Well-Aufsatz vom Objektträger entfernt und die Präzipitate konnten unter dem Lichtmikroskop beurteilt werden. Durch das Anfärben der Zellkerne konnte sehr gut unterschieden werden, ob es sich bei den Präzipitaten tatsächlich um angefärbte Kerne oder lediglich um mitangefärbten Zelldetritus handelte. Bei der Beurteilung der Zellen wurde auf dunkelbraun angefärbte intrazelluläre Strukturen geachtet, die markierten, durch Apoptose entstandenen DNA-Strangbrüchen entsprächen. Außerdem wurde die Homogenität der einzelnen Zellen und des Zellverbandes beurteilt.

3.8 Statistik

Für die Errechnung der Ergebnisse wurden die Daten von mindestens drei Versuchen zusammengefasst und in den einzelnen Gruppen als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Nach Testung der Daten auf Normalverteilung mittels Kolmogorov-Smirnov-Test für kontinuierliche Variablen erfolgte die Überprüfung der statistischen Signifikanz mit dem einseitigen Student-t-Test für nicht gepaarte Stichproben. Bei den Migrationsassays wurde die Gruppe der nur mit VEGF stimulierten Zellen, die als Positivkontrolle diente, mit der Gruppe verglichen, in der die Zellen zusätzlich zur Stimulation mit VEGF auch noch mit den PPAR-Liganden vorinkubiert wurden. Der Wert „n“ steht für die Anzahl der verwendeten Multiwell-Platten, wobei bei den Migrationsassays jede Konzentration der verwendeten Substanzen (inklusive Positiv- und Negativ-Kontrolle) in zwei Wells, bei den Zell-ELISAs in vier Wells, bei den Adhäsionsassays in drei Wells und bei den Apoptose-Assays in je einem Well untersucht wurde. Bei den Adhäsionsassays wurde die Gruppe der nicht vorbehandelten Zellen mit der der mit den PPAR-Liganden inkubierten Gruppe verglichen. Für den Vergleich der Expression der Adhäsionsmoleküle wurde bei den Zell-ELISAs die nur mit TNFα stimulierte Positivkontrolle mit der Datengruppe verglichen, bei der die Zellen zusätzlich zur Stimulation mit TNFα mit den PPAR-Liganden stimuliert und inkubiert worden waren. Als statistisch signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von unter 5% angenommen (p < 0.05).


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11.08.2006