Ergebnisse

4.1  Wirkungen von PPAR-Liganden auf die VEGF-induzierte Endothelzellmigration

4.1.1  Migrationsassays mit PPARγ-Liganden

▼ 25 (fortgesetzt)

Abbildung 4 A zeigt die Ergebnisse der Migrationsassays, bei denen die Wirkung der PPARγ-Liganden auf die Migration der Endothelzellen getestet wurde. Die Zahl der durch VEGF stimulierten und migrierten Zellen ist als x-fache Induktion der Migration gegenüber der unstimulierten Negativkontrolle wiedergegeben. Es zeigte sich eine ca. 4,6-fache Steigerung der Migration nach Stimulation durch VEGF (4,62 ± 0,36). Die PPARγ-Liganden hemmten die Migration signifikant und konzentrationsabhängig. Schon 10 µM Troglitazon und Ciglitazon hemmten die Migration um mehr als die Hälfte (10 µM Troglitazon: 85,52 ± 5,25%, p < 0.01; 10 µM Ciglitazon 74,81 ± 8,1%, p < 0.01, n = 4). Unter dem Einfluss von 20 µM Troglitazon und Ciglitazon wurde die Migration z.T. vollständig aufgehoben (20 µM Troglitazon 101,01 ± 4,5%, p < 0.01; 20 µM Ciglitazon 98,84 ± 4,13%, p < 0.01, n = 4).

4.1.2 Migrationsassays mit PPARα-Liganden

▼ 26 

Ähnliche Ergebnisse ließen sich mit den PPARα-Liganden erzielen (s. Abb. 4 B). Hier zeigte sich eine fünffache Stimulation der Migration, verglichen mit der unstimulierten Negativkontrolle (5,3 ± 0,35). Unter dem Einfluss von 10 µM WY-14,643 zeigte sich eine leichte Hemmung der Migration, die allerdings keine statistische Signifikanz erreichte. 20 µM WY-14,643 hemmten die Migration signifikant (67,23 ± 6,45%, p < 0.01, n = 4). Fenofibrat hemmte die Migration konzentrationsabhängig sowohl bei 10 µM (54,01 ± 5,67%, p < 0.01, n = 4), als auch bei 20 µM (86,05 ± 4,15%, p < 0.01, n = 4).

Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass sowohl PPARα-Liganden, als auch PPARγ-Liganden signifikant und konzentrationsabhängig die VEGF-induzierte Migration von HUVECs hemmen.

Abbildung 4:
Wirkung der PPAR-Liganden auf die VEGF (10 ng/ml)-induzierte Endothelzellmigration
Die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon (A) und die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat (B) hemmen signifikant und konzentrationsabhängig die Migration von HUVECs.

4.1.3  Migrationsassays mit Hemmstoffen der Enzyme MEK und PI(3)-Kinase

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Nachdem die PPAR-Liganden eine starke inhibitorische Wirkung auf die Migration der Endothelzellen gezeigt hatten, stellte sich die Frage nach dem Mechanismus der Hemmung. Wie bereits in Kapitel 2 erwähnt, ist bekannt, dass ERK 1/2 die Migration von glatten Gefäßmuskelzellen und anderen Zelltypen reguliert und auch die bFGF-induzierte Endothelzellmigration vermittelt. In der Literatur ist die Rolle der MAP-Kinase in der VEGF-induzierten Endothelzellmigration bisher nicht dezidiert beschrieben worden. Deshalb wurde geprüft, ob die MAP-Kinase in den VEGF-induzierten Migrationsprozess involviert ist. Es wurden daher Migrationsassays durchgeführt, bei denen zusätzlich zu VEGF der pharmakologische MEK-Inhibitor PD 98059 in den Konzentrationen 10 µM und 30 µM zu den Zellen gegeben wurde. Tabelle 1 ist zu entnehmen, dass der Inhibitor die Migration signifikant hemmt (10 µM 70,0 ± 13,27 %, p < 0.05; 30 µM 89,24 ± 8,08 %, p < 0.01, n = 3). Dies bedeutet, das die VEGF-induzierte Endothelzellmigration MAP-Kinase abhängig ist. Ein möglicher Mechanismus, durch den der hemmende Effekt der PPAR-Liganden vermittelt werden könnte, wäre also die Hemmung der MAP-Kinase.

Ein anderer möglicher Mechanismus, der die migrationsfördernde Wirkung von VEGF innerhalb der Zelle vermitteln könnte, wäre die PI3-K – Akt – NO-Kaskade. Es wurden daher Migrationsassays durchgeführt, bei denen die Zellen zusätzlich zu VEGF mit dem PI3-Kinase-Inhibitor Wortmannin in den Konzentrationen 50 nM und 100 nM inkubiert wurden. Tabelle 1 zeigt, dass Wortmannin in einer Konzentration von 50 nM die migrationsstimulierende Wirkung von VEGF stark inhibiert (86,74 ± 3,69%, p < 0.01, n = 3). 100 nM Wortmannin heben die Migration fast vollständig auf (98,33 ± 2,67%, p < 0,01, n = 3). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die VEGF-induzierte Endothelzellmigration außer der MAP-Kinase-Abhängigkeit eine PI3-Kinase-Abhängigkeit zeigt.

Tabelle 1:
Hemmung der Migration durch pharmakologische Enzyminhibitoren
PD 98059, das die Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2) durch MEK verhindert und Wortmannin, das spezifisch die PI(3)-Kinase hemmt und so die Phosphorylierung von Akt inhibiert, hemmten konzentrationsabhängig die VEGF-induzierte Endothelzellmigration. Damit konnte gezeigt werden, dass die VEGF-induzierte Endothelzellmigration sowohl MAP-Kinase-, als auch Akt-abhängig ist.

Migrationshemmung durch:

PD 98059

Konzentrationen:

10 µM

30 µM

Hemmung:

70,0 ± 13,27%

89,24 ± 8,08%

Wortmannin

Konzentrationen:

50 nM

100 nM

Hemmung:

86,74 ± 3,69%

98,33 ± 2,67%

4.1.4  Wirkung der PPAR-Liganden auf die Phosphorylierung
der Enzyme ERK 1/2 und Akt

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Da mittels Migrationsassay gezeigt werden konnte, dass eine Hemmung der MEK, die die Aktivierung und Phosphorylierung von ERK 1/2 vermittelt, eine Inhibition der Endothelzellmigration zur Folge hat, wurde mit Western Blot-Analyse überprüft, ob die PPAR-Liganden die Phosphorylierung von ERK 1/2 beeinflussen. Stellvertretend für drei unabhängig voneinander durchgeführte Western Blots sind die Ergebnisse eines dieser Versuche in den Abbildungen 5 und 6 dargestellt.

In den Abbildungen 5 A und B ist sowohl der Gesamtanteil (II) und der aktivierte, phosphorylierte Anteil (I) der MAP-Kinase zu sehen.

Abbildung 5 A zeigt die Zeitabhängigkeit der VEGF-induzierten Phosphorylierung von ERK 1/2. Nach 10 Minuten Inkubation mit VEGF ist die Phosphorylierung von ERK 1/2 am stärksten ausgeprägt und nimmt im Laufe der Zeit wieder ab.

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Wie in Abb. 5 B dargestellt, hemmt der pharmakologische MEK-Inhibitor PD 98059 signifikant und konzentrationsabhängig sowohl bei 10 µM, als auch bei 30 µM die Phosphorylierung von ERK 1/2. Dies bestätigt die Ergebnisse der Migrationsassays, in denen nachgewiesen werden konnte, dass die VEGF-induzierte Endothelzellmigration durch MEK-Inhibition mit nachfolgender Hemmung der Phosphorylierung von ERK 1/2 inhibiert werden konnte.

In Abbildung 6 ist die Wirkung der PPAR-Liganden auf die Phosphorylierung der MAP-Kinase dargestellt. Im Vergleich zur unstimulierten Negativkontrolle zeigte sich eine deutliche Zunahme des phosphorylierten Anteils der MAP-Kinase nach Stimulation mit VEGF. Allerdings hatten die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat in den verschiedenen getesteten Konzentrationen keinen Einfluss auf die Phosphorylierung der MAP-Kinase. Das gleiche Ergebnis wurde mit den PPARγ-Liganden erzielt. Auch hier zeigte sich im Vergleich zur nur mit VEGF stimulierten Positivkontrolle durch Troglitazon und Ciglitazon in den verwendeten Konzentrationen keine signifikante Hemmung der Aktivierung der MAP-Kinase.

Obwohl also die Migration der Endothelzellen durch die PPARα- und PPARγ-Liganden gehemmt wird, bleibt die Phosphorylierung von ERK 1/2 durch die Liganden unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Wirkungen der PPAR-Liganden entweder downstream der MAP-Kinase oder über andere Signaltransduktionswege vermittelt werden.

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Abbildung 5: VEGF und MAP-Kinase
Es ist sowohl der phosphorylierte, aktivierte Anteil der MAP-Kinase (I) dargestellt, als auch der Gesamtteil (II). „Ko“ steht für Kontrolle.
A: VEGF (10 ng/ml) stimuliert zeitabhängig die Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase (ERK 1/2).
B: Die VEGF-induzierte Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase (ERK 1/2) wird durch PD 98059 konzentrationsabhängig gehemmt.

Abbildung 6:
Wirkung von PPARα- und PPARγ-Liganden auf die Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase (ERK 1/2). „Ko“ steht für Kontrolle.
Es ist nur der phosphorylierte Anteil der MAP-Kinase zu sehen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde hier auf die Darstellung des Gesamtanteils verzichtet.
Weder die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat (A), noch die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon (B) haben in ihren verschiedenen Konzentrationen einen Einfluß auf die Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2).

Ein möglicher anderer Signalweg, der die Migration von Zellen vermittelt, und der durch die PPAR-Liganden beeinflusst werden könnte, ist der PI(3)-Kinase-Akt-Pathway. Da sowohl in dieser Arbeit (siehe Kap. 4.1.3), als auch in anderen Studien (36;106) nachgewiesen werden konnte, dass die VEGF-induzierte Endothelzellmigration durch Blockierung der PI(3)-Kinase, die die Serin/Threonin-Kinase Akt aktiviert und phosphoryliert, gehemmt werden konnte, wurde mittels Western Blot überprüft, ob die PPAR-Liganden die Phosphorylierung von Akt beeinflus-sen.

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Stellvertretend für drei unabhängig voneinander durchgeführte Western Blots sind die Ergebnisse eines dieser Versuche in den Abbildungen 7 und 8 dargestellt. Zu sehen ist sowohl der Gesamtanteil (II), als auch der aktivierte, phosphorylierte Anteil (I) von Akt.

Den zeitlichen Verlauf der durch VEGF induzierten Phosphorylierung von Akt zeigt Abb. 7 A. Nach 10 bzw. nach 20 Minuten ist der phosphorylierte Anteil von Akt am höchsten. Danach nimmt er erst langsam wieder ab.

Abb. 7 B zeigt die Wirkung des PI(3)-Kinase-Hemmstoffs Wortmannin auf die Phosphorylierung von Akt. Wortmannin hemmte konzentrationsabhängig bei 50 nM und 100 nM die durch VEGF induzierte Akt-Phosphorylierung. Dies bestätigt die Ergebnisse der Migrationsassays, in denen die VEGF-induzierte Migration der Endothelzellen ebenfalls durch 50 nM und 100 nM Wortmannin gehemmt werden konnte.

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Der Einfluss der PPAR-Liganden auf die Phosphorylierung von Akt ist in Abb. 8 zu sehen. Es wurden mit 10 µM und 20 µM die gleichen Konzentrationen verwendet, die auch die Migration hemmten. Sowohl die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat, als auch die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hemmen signifikant und konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Akt.

Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass der Mechanismus der beobachteten Hemmung der Endothelzellmigration durch PPAR-Liganden sehr wahrscheinlich in einer Hemmung der Phosphorylierung von Akt, nicht aber in einer Hemmung der Phosphorylierung von ERK 1/2 besteht.

Abbildung 7: VEGF und Akt
Es ist sowohl der aktivierte, phosphorylierte Anteil von Akt (I), als auch Gesamt-Akt (II) dargestellt. „Ko“ steht für Kontrolle.
A: VEGF (10 ng/ml) stimuliert zeitabhängig die Phosphorylierung von Akt.
B: Wortmannin hemmt konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Akt.

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Abbildung 8:
Wirkung der PPAR-Liganden auf die Phosphorylierung von Akt
Es ist sowohl der phosphorylierte Akt-Anteil (I), als auch der Gesamt-Akt-Anteil (II) zu sehen. „Ko“ steht für Kontrolle.
Sowohl die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon (A), als auch die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat (B) hemmen konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Akt.

4.1.5  Wirkungen der PPAR-Liganden auf die Adhäsion von Endothelzellen

Da in den Migrationsassays die hemmende Wirkung der PPAR-Liganden stark ausgeprägt war, wurde mit einem einfachen Assay untersucht, ob die Liganden auch eine Wirkung auf die Adhäsion der Endothelzellen auf einer Gelatine-Matrix haben. Die Zellen wurden vorbehandelt wie in Kapitel 3 beschrieben. Danach konnten sie eine Stunde an einer Gelatine-Matrix bei 37°C adhärieren.

In den Abbildungen 9 A und B sind die Ergebnisse dargestellt. Auf der X-Achse sind die verwendeten Konzentrationen der PPAR-Liganden angegeben. Es wurden nur die Konzentrationen von 1 µM bis 20 µM untersucht, da die Liganden in niedrigeren Konzentrationen keine Effekte in den Experimenten gezeigt hatten. Auf der Y-Achse ist die optische Dichte (O.D.) angegeben, die mit einem Filter der Wellenlänge 630 nm gemessen wurde. Die Stärke der Extinktion entspricht der Menge des in den Wells enthaltenen Farbstoffs, die um so höher ist, je mehr Zellen auf der Matrix adhärieren konnten. Der einzelne Wert links in den Diagrammen ist der Kontrollwert, der ermittelt wurde, indem Zellen ohne die PPAR-Liganden inkubiert wurden. Er lag etwa bei 0,4 (0,43 ± 0,02).

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Abbildung 9 A zeigt die Ergebnisse der Adhäsionsassays mit den PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat. Im Vergleich zur Kontrolle hatte die Inkubation der Zellen mit den beiden PPARα-Liganden keinen Effekt auf die Adhäsion (n = 3).

Die Wirkung der PPARγ-Liganden auf die Adhäsion der Endothelzellen ist in Abb. 9 B dargestellt. Während 10 µM Troglitazon und Ciglitazon keinen Effekt hatten, bewirkten 20 µM eine geringe aber dennoch signifikante Hemmung der Adhäsion (Troglitazon: 18,75 ± 2,95, p < 0.01; Ciglitazon: 35,2 ± 3,4%, p < 0.01, n = 3).

PPARγ-Liganden, nicht aber PPARα-Liganden hemmen also geringfügig die Adhäsion von Endothelzellen auf einer Gelatine-Matrix in einer Konzentration von 20 µM. Für die Migrationsassays wurden nur Konzentrationen bis 20 µM und nicht höher verwendet. Da die Adhäsionshemmung bei dieser Konzentration eher gering ausgeprägt ist, kann geschlussfolgert werden, dass die Ergebnisse der Migrationsassays hauptsächlich durch direkte Effekte der PPAR-Liganden auf die Migration und nicht durch die geringen Effekte auf die Adhäsion zu erklären sind.

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Abbildung 9:
Einfluß der PPAR-Liganden auf die Adhäsion von HUVECs auf einer Gelatine-Matrix
„K“ steht für Kontrolle.
A: Die PPARα-Liganden haben keinen Einfluss auf die Adhäsion der Endothelzellen.
B:Die PPARγ-Liganden hemmen die Adhäsion der Zellen in der höchsten untersuchten Konzentration von 20 µM.

4.2  Wirkungen der PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle
E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in vaskulären Endothelzellen

Nachdem im ersten Schwerpunkt dieser Arbeit die Wirkungen der PPAR-Liganden auf die Migration von Endothelzellen untersucht wurde, sollte im zweiten Schwerpunkt überprüft werden, welche Effekte die PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 haben.

Die Abbildungen 10 – 12 zeigen die Ergebnisse der Zell-ELISAs, bei denen der Einfluss der PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle untersucht wurde. Auf der X-Achse sind die Konzentrationen der Liganden dargestellt, mit denen die Experimente durchgeführt wurden. Auf der Y-Achse ist die optische Dichte angegeben, die mit einem Filter der Wellenlänge 405 nm gemessen wurde und die proportional zur Stärke der Expression der Adhäsionsmoleküle ist. Links in den Diagrammen sind die beiden Kontrollen dargestellt: die unstimu-lierte Negativkontrolle und die nur mit TNFα (500 U/ml) ohne PPAR-Liganden stimulierte Positivkontrolle. Da die Moleküle E-Selectin und VCAM-1 so gut wie nicht konstitutiv exprimiert werden (7;8), war der Wert der Negativkontrolle für diese beiden Adhäsionsmoleküle fast Null. ICAM-1 wird dagegen in geringem Umfang konstitutiv exprimiert (7;12), weshalb der Kontrollwert für ICAM-1 auch ohne Stimulation etwas höher liegt. Anhand der Positivkontrolle sieht man, dass sich die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle durch Stimulation mit 500 U/ml TNFα deutlich steigern ließ. Die Werte zum Zeitpunkt der Messung lagen zwischen 1 und 1,5, wobei ICAM-1 meistens die stärkste Expression erreichte, gefolgt von E-Selectin und VCAM-1.

4.2.1  Zell-ELISAs mit PPARα-Liganden

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Die Abbildungen 10 A und B zeigen das Ergebnis der Zell-ELISAs, bei denen die Zellen für 30 Minuten mit den PPARα-Liganden vorinkubiert und anschließend für vier Stunden mit TNFα unter Zugabe der Liganden stimuliert wurden (n = 3). Im Vergleich zu den nur mit TNFα stimulierten Positivkontrollen blieb die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle durch WY-14,643 unbeeinflusst (s. Abb. 10 A).

Fenofibrat hemmte bei einer Konzentration von 100 µM signifikant die Expression von VCAM-1 (53,12 ± 3,7%, p < 0.01) und ICAM-1 (30,78 ± 4,4%, p < 0.05), nicht jedoch von E-Selectin (s. Abb. 10 B). Geringere Konzentrationen der Liganden hatten keinen Einfluss auf die Expression der Adhäsionsmoleküle.

Abbildung 10:
Wirkung der PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat auf die TNFα-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach einer Vorinkubation der Zellen für 30 MinutenA: WY-14,643 hat nach 30 min. Vorinkubation keinen Einfluss auf die TNFα-stimulierte Expression der Adhäsionsmoleküle.
B: Fenofibrat hemmt nach einer Vorinkubation von 30 min. die TNFα-stimulierte Expression von VCAM-1 (p < 0.01) und ICAM-1 (p < 0.05).

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Das Ergebnis der 24-stündigen Vorinkubation mit den Liganden und der anschließenden Stimulation ist in den Abbildungen 11 A und B wiedergegeben (n = 3). Unter dem Einfluss von WY-14,643 wurde hier die Expression von VCAM-1 bei einer Konzentration von 100 µM signifikant gehemmt (30,45 ± 8,14%, p < 0.05; s. Abb. 11 A). Fenofibrat hemmte ebenfalls signifikant die Expression von VCAM-1 (54,49 ± 5,43%, p < 0.01) und außerdem die Expression von E-Selectin und ICAM-1 (23,2 ± 5,15%, p < 0.01 bzw. 37,7 ± 3,24%, p < 0.01; s. Abb. 11 B).

Es ließ sich also für die PPARα-Liganden ein hemmender Effekt beobachten, der sowohl konzentrationsabhängig, als auch zeitabhängig war, denn eine Vorinkubation mit WY-14,643 für 30 Minuten zeigte keinen Effekt, 30 Minuten Vorinkubation mit Fenofibrat hatten nur eine Hemmung von VCAM-1 und ICAM-1 zur Folge, nicht aber eine Hemmung von E-Selectin. Nach 24 Stunden Vorinkubation hemmte WY-14,643 signifikant die Expression von VCAM-1, Fenofibrat hemmte die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle. Außerdem war die Hemmung von ICAM-1 durch Fenofibrat nach einer Vorinkubation für 24 Stunden stärker ausgeprägt als nach einer Vorinkubation für 30 Minuten. Die Konzentrationsabhängigkeit zeigte sich dadurch, dass trotz der verschiedenen Zeiten der Vorinkubation geringere Konzentrationen als 100 µM keinen Effekt auf die Expression der Adhäsionsmoleküle hatten.

Abbildung 11:
Wirkung der PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat auf die TNFα-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach einer Vorinkubation von 24 StundenA: WY-14,643 hemmt geringfügig aber signifikant die Expression von VCAM-1 (p < 0.05) in einer Konzentration von 100 µM.
B: Fenofibrat hemmt die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle (alle p < 0.01) in einer Konzentration von 100 µM.

4.2.2  Zell-ELISAs mit PPARγ-Liganden

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Das Ergebnis der Zell-ELISAs, bei denen die Zellen für 30 Minuten mit den PPARγ-Liganden vorinkubiert und anschließend mit TNFα (500 U/ml) für vier Stunden stimuliert wurden, ist in den Abbildungen 12 A und B dargestellt (n = 3). Weder durch Troglitazon, noch durch Ciglitazon war ein hemmender Effekt auf die Expression der Adhäsionsmoleküle zu beobachten. Ihre Expression blieb durch die Liganden in den verschiedenen Konzentrationen unbeeinflusst.

Die Vorinkubation der Zellen für 24 Stunden mit den PPARγ-Liganden und anschließender Stimulation mit TNFα (s. Abb. 12 C und D, n = 3) zeigte ein nahezu gleiches Ergebnis: Im Vergleich zur nur mit TNFα stimulierten Positivkontrolle blieb die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle unter dem Einfluss von Troglitazon und Ciglitazon abgesehen von einer geringen Schwankungsbreite unverändert.

Dies zeigte, dass PPARγ-Liganden weder in Abhängigkeit von der Konzentration, noch in Abhängigkeit von der Vorinkubationszeit einen Einfluss auf die Expression der Adhäsionsmoleküle hatten.

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Abbildung 12:
Wirkungen der PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon auf die TNFα-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 nach einer Vorinkubation der Zellen für 30 Minuten bzw. 24 StundenAund B: Die Zellen wurden für 30 min. mit den PPARγ-Liganden vorinkubiert und anschließend mit TNFα stimuliert. Weder Troglitazon, noch Ciglitazon hat einen Effekt auf die Expression der Moleküle.
C und D: Auch nach 24-stündiger Vorinkubation der Zellen mit den PPARγ-Liganden und anschließender TNFα-Stimulation zeigen Troglitazon und Ciglitazon keinerlei Effekte auf die Expression von E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1.

4.3  Apoptose-Assay

Die PPAR-Liganden hatten in den Migrationsassays eine relativ starke hemmende Wirkung gezeigt und bewirkten in den Zell-ELISAs erst in hohen Konzentrationen einen Effekt auf die Expression der Adhäsionsmoleküle. Um auszuschließen, dass die beobachteten Effekte durch Apoptose-Induktion in den Zellen zustande kommen, wurde in einem Apoptose-Assay mit der TUNEL-Methode überprüft, ob und in welchem Umfang die PPAR-Liganden in Endothelzellen Apoptose induzieren.

Abbildung 13 zeigt exemplarisch eine Auswahl der Zell-Präparate, mit denen die Prüfung einer möglichen Apoptose-Induktion durch PPAR-Liganden durchgeführt wurde. In drei unabhängigen Versuchen wurden die Zellen mit den PPAR-Liganden in den höchsten verwendeten Konzentrationen von 100 µM für 24 Stunden inkubiert und anschließend mit TNFα (500 U/ml) für vier Stunden stimuliert. Anschließend wurde das Ausmaß der Apoptose in den Zellen gemessen. Da die Zellen außerdem kurz mit Toluidinblau angefärbt wurden, konnten die Zellgrenzen gut voneinander unterschieden und die Zellkerne gut erkannt werden. Die Ergebnisse zeigten keine Apoptose in nennenswertem Umfang. Die Zellen sahen unabhängig von der Substanz, mit der sie inkubiert wurden, homogen und normal aus. In den Zellkernen und auch im Zytosol waren keine dunkelbraun gefärbten Strukturen erkennbar, die der Markierung von durch Apoptose entstandenen DNA-Strangbrüchen entsprochen hätten. Dies lässt den Schluss zu, dass die PPAR-Liganden in Endothelzellen keine Apoptose in relevantem Ausmaß induziert haben. Toxische Effekte scheiden daher als Erklärung für die beobachteten hemmenden Effekte der Liganden auf die Migration und die Expression der Adhäsionsmoleküle in Endothelzellen aus.

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Abbildung 13: Überprüfung einer möglichen Apoptose-Induktion durch PPARα- und PPARγ-Liganden in Endothelzellen. Die Präparate zeigen die Zellen in einer 30-fachen Vergrößerung. Bis auf die unbehandelte Kontrolle (A) wurden die Zellen für 24 Stunden mit Troglitazon (B), Ciglitazon (C), Fenofibrat (D) und WY-14,643 (E) vorinkubiert und für 4 Stunden mit TNFα stimuliert. Die Pfeile kennzeichnen exemplarisch angefärbte Zellkerne (Blockpfeile) bzw. mitangefärbten Zelldetritus (Kopfpfeile).
Der Gesamtaspekt der Präparate zeigt ein ruhiges und homogenes Zellgefüge. Es sind nur wenig dunkel gefärbte Zellkerne zu erkennen, so dass eine Apoptose-Induktion durch die PPAR-Liganden in relevantem Ausmaß unwahrscheinlich ist.


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HTML-Version erstellt am:
11.08.2006