Diskussion

5.1  Zusammenfassung der Ergebnisse

▼ 40 (fortgesetzt)

In der vorliegenden Arbeit sollte in einem ersten Schwerpunkt der Effekt von PPAR-Liganden auf die VEGF-induzierte Endothelzellmigration untersucht werden. Dabei sollte im Falle einer Beeinflussung der Migration geprüft werden, welche Komponenten der Signaltransduktionskaskade die beobachteten Effekte vermitteln. In einem zweiten Schwerpunkt sollte die Wirkung der PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in Endothelzellen untersucht werden.

Die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat und die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hemmten signifikant und konzentrationsabhängig die VEGF-induzierte Endothelzellmigration. Die Migration war sowohl MAP-Kinase-abhängig, als auch Akt-abhängig. Während die PPAR-Liganden auf die Phosphorylierung von ERK 1/2 keinen Einfluss hatten, hemmten sie die Phosphorylierung von Akt. Die Adhäsion der Zellen wurde nur durch PPARγ-Liganden in der höchsten verwendeten Konzentration, nicht aber durch PPARα-Liganden beeinflusst.

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Nach einer Vorinkubation der Zellen für 24 Stunden und einer anschließenden Stimulation der Endothelzellen mit TNFα (500 U/ml) für vier Stunden hemmten die PPARα-Liganden die Expression von VCAM-1, wobei Fenofibrat zusätzlich die Expression von E-Selectin und ICAM-1 hemmte. Die hemmenden Effekte waren bei einer Vorinkubation von 30 Minuten wesentlich geringer ausgeprägt. Die PPARγ-Liganden hatten keinen Einfluss auf die Expression der Adhäsionsmoleküle.

5.2 Diskussion der Ergebnisse

5.2.1  Wirkung der PPAR-Liganden auf den Prozess der Migration von Endothelzellen

Den einen Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit bildete die Untersuchung der Effekte von PPAR-Liganden auf die VEGF-induzierte Migration von vaskulären Endothelzellen. Hierbei wurde sowohl der eigentliche Migrationsvorgang untersucht, als auch der Einfluss der PPAR-Liganden auf die Adhäsion von Endothelzellen, da die Adhäsion und De-Adhäsion auf extrazellulärer Matrix ein Teil des Migrationsvorganges ist. Ferner wurden Teile des Signaltransduktionsweges untersucht, durch den die Stimulation der Zellen mit VEGF zur Migration führt.

5.2.1.1  Migration

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen zum ersten Mal, dass PPARα- und PPARγ-Liganden die VEGF-induzierte Migration von Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen (HUVECs) hemmen. Ferner konnte erstmals der Mechanismus dieser Migrationshemmung identifiziert werden, der in einer Inhibition der Phosphorylierung der Serin/Threonin-Kinase Akt durch die PPAR-Liganden besteht.

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Die Ergebnisse der Migrationsversuche mit den HUVECs korrelieren gut mit den Ergeb-nissen anderer Arbeitsgruppen, die migrationshemmende Effekte von PPAR-Liganden in ande-ren Zelltypen wie glatten Gefäßmuskelzellen (55;56;84;85;102), Monozyten (80) und retinalen Pigmentepithelzellen bzw. bovinen choroidalen Endothelzellen (109;110) nachweisen konnten. In diesen Arbeiten wurden jedoch ausschließlich PPARγ-Liganden verwendet. Somit gelang in dieser Arbeit auch der erste Nachweis dafür, dass PPARα-Liganden ebenfalls in der Lage sind, die gerichtete Migration von Zellen zu inhibieren. Die verwendeten Konzentrationen der PPAR-Liganden entsprechen denen, die in anderen Studien verwendet wurden. Da in Vorversuchen eine maximale Endothelzellmigration mit 10 ng/ml VEGF induziert werden konnte, wurde diese Konzentration für die Migrationsassays mit den PPAR-Liganden verwendet. Diese Dosierung wurde unabhängig davon auch von anderen Arbeitsgruppen gewählt (106;110).

Bei einem Vergleich der Wirkstärke von PPARα- und PPARγ-Liganden fällt auf, dass PPARγ-Liganden bei gleichen Konzentrationen eine größere Wirkstärke haben als PPARα-Liganden. Dieser Effekt ist möglicherweise durch eine unterschiedliche Beeinflussung der Adhä-sion der Endothelzellen auf der Gelatine-Matrix zu erklären. In den Adhäsionsassays der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass PPARγ-Liganden, nicht hingegen PPARα-Liganden schwach aber signifikant die Adhäsion der Zellen hemmen. Da der Prozess der Migration der Zellen mit Adhäsion und De-Adhäsion auf extrazellulärer Matrix verbunden ist, haben die PPARγ-Liganden möglicherweise zusätzliche Wirkungen auf dieser Ebene, die letztendlich die migrationshemmende Wirkungen verstärken. Als eine andere Erklärungsmöglichkeit kann die unterschiedliche Affinität der Liganden zu den Rezeptoren dienen. Mittels Transactivation Assays wurde analysiert, dass PPARγ-Liganden ihren Rezeptor in niedrigeren Konzentrationen aktivieren als PPARα-Liganden (156). Die Verwendung gleicher Konzentrationen hätte somit eine stärkere Aktivierung von PPARγ im Vergleich zu PPARα zur Folge.

Insgesamt zeigen die PPAR-Liganden eine starke migrationshemmende Wirkung. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass sowohl PPARα-Liganden, als auch PPARγ-Liganden die VEGF-induzierte Migration von HUVECs hemmen.

5.2.1.2 Signaltransduktion

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Für die Wachstumsfaktor-induzierte Migration von vaskulären Zellen sind bisher hauptsächlich zwei Signaltransduktionswege beschrieben worden, die diese Migration vermitteln. Dies ist zum einen der PI(3)-Kinase-Akt-Pathway und der MEK-MAP-Kinase-Pathway. Im folgenden soll nun auf eine mögliche Involvierung der beiden Wege in die Signaltransduktion der VEGF-induzierten Endothelzellmigration und deren mögliche Beeinflussung durch die PPAR-Liganden eingegangen werden.

Die p42/p44 Mitogen-aktivierten Protein-Kinasen, auch extrazellulär-regulierte Kina-sen 1/2 (ERK 1/2) genannt, sind zwei Isoformen der MAP-Kinase (MAP-K). Ihre Aktivierung wird in verschiedenen Zelltypen wie glatten Gefäßmuskelzellen, Monozyten und Endothelzellen durch Migrations-Faktoren induziert (2;56;67;80;121;155). Es wurde gezeigt, dass sowohl die PDGF- und TNFα-induzierte Migration von glatten Gefäßmuskelzellen, als auch die MCP-1-induzierte Migration von Monozyten MAP-Kinase-abhängig ist, denn durch Hemmung der MAP-Kinase-Aktivierung durch den pharmakologischen MEK-Hemmstoff PD 98059 konnte die Migration dieser Zellen aufgehoben werden (56;67;80). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch die VEGF-induzierte Endothelzellmigration MAP-Kinase abhängig ist, da auch hier PD 98059 die Migration der Zellen vollständig inhibierte (siehe Kap. 4.1.3).

Die MAP-Kinase ist in der Lage, die Migration über zytosolische und nukleäre Signalwege zu vermitteln. Einen zytosolischen Weg stellt die Phosphorylierung von Myosin-Leichtketten (MLC)-Kinasen (MLCK) durch MAP-K dar, wie er in glatten Gefäßmuskelzellen nachgewiesen werden konnte (17;21). MLC sind essentiell für die Migration von Zellen, indem sie das Aktin-Myosin-Zusammenspiel koordinieren und so die geordnete Fortbewegung der Zellen gewährleis-ten.

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Für den Abbau von extrazellulärer Matrix, der die Invasion von Zellen in neues Territorium ermöglicht, ist die Expression und Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) notwendig. Dies wird in Endothelzellen über einen nukleären Signalweg vermittelt. Nach ihrer Aktivierung transloziert die MAP-Kinase in den Nukleus, wo sie Transkriptionsfaktoren phosphoryliert und so die Transkription von Genen reguliert (139). In diesen nukleären Weg ist u.a. der Transkriptionsfaktor Ets-1 involviert, der die Expression von MMP-1, MMP-3 und MMP-9 reguliert (115). Seine Expression wird durch VEGF und andere Zytokine über die MAP-Kinase induziert (52;142). Lamoreaux et al. (83) konnten nachweisen, dass in Endothelzellen nach Stimulation durch VEGF die Sekretion von Gelatinase A (MMP-9) zunimmt und die Produktion von MMP-Inhibitoren wie TIMP (tissue-inhibitor of metalloproteinases) abnimmt. In Gefäßmuskelzellen wird die Expression und Sekretion von MMPs ebenfalls durch die MAP-Kinase vermittelt (20), und die Migration dieser Zellen ist MMP-abhängig (120;162).

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen eine Hemmung der Endothelzellmigration durch PPARα- und PPARγ-Liganden. Da die MAP-Kinase an der Vermittlung des Migrationsvorgangs beteiligt ist, wurde untersucht, ob die PPAR-Liganden möglicherweise über eine Hemmung der MAP-Kinase durch Beeinflussung zytosolischer oder nukleärer Signaltransduktionswege antimigratorisch wirken. Im Western Blot bestätigte sich zwar die MAP-Kinase-Abhängigkeit der Endothelzellmigration, denn ihre Phosphorylierung und Aktivierung wurde durch VEGF im Vergleich zur unstimulierten Negativkontrolle stark erhöht und konnte durch den pharmakologischen MEK-Inhibitor PD 98059 gehemmt werden. Jedoch hatten weder die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat, noch die PPARγ-Liganden Troglitazon und Cigli-tazon einen Einfluss auf die Phosphorylierung der MAP-Kinase. Die Hemmung der Migration der Endothelzellen durch PPAR-Liganden wird also nicht über eine Inhibition der MAP-K-Phosphorylierung vermittelt. Dieses Ergebnis ist im Einklang mit Untersuchungen, die an Gefäßmuskelzellen und Monozyten eine MAP-Kinase-abhängige Migration beobachteten, die durch PPAR-Liganden gehemmt werden konnte, bei denen die Hemmung jedoch ebenfalls nicht durch eine Hemmung der Aktivierung der MAP-Kinase vermittelt wurde (55;56;80). Möglicherweise beeinflussen also die PPAR-Liganden den zytosolischen oder den nukleären Weg erst downstream der MAP-Kinase. Hinweise für eine Beeinflussung des nukleären Weges liefern Arbeiten, in denen gezeigt werden konnte, dass PPARγ-Liganden und z.T. auch PPARα-Liganden in glatten Gefäßmuskelzellen und in Monozyten die Expression und Aktivität von MMP-9 inhibieren (102;103;141). Goetze et al. (53;54) konnten zeigen, dass Troglitazon nach Stimulation von Gefäßmuskelzellen mit Angiotensin II, das ebenfalls als Migrationsfaktor über den MAP-Kinase-Pathway wirkt, zwar nicht die Aktivierung und Phosphorylierung der MAP-Kinase hemmt, wohl aber deren Translokation in den Nukleus und vermutlich auf diese Weise migrationsinhibierend wirkt (54). Darüber hinaus konnten sie nachweisen, dass PPAR-Liganden die PDGF-induzierte Expression des Transkriptionsfaktors Ets-1, der die Transkription von MMP-2 und MMP-9 reguliert, in glatten Gefäßmuskelzellen in vitro und in vivo nach Ballon-Verletzung der Gefäßwand hemmen (53). Die zytosolische Aktivierung der MLCK blieb durch die PPARγ-Liganden unbeeinflusst. Die Wirkungen der PPAR-Liganden auf die Myosin-Leichtketten-Kinasen sind in der Literatur noch unzureichend bekannt. Somit ist nicht ausgeschlossen, dass nicht auch der zytosolische Weg durch die Liganden beeinflusst werden kann.

Im Mittelpunkt des anderen in Frage kommenden Signaltransduktionsweges für die VEGF-vermittelte Endothelzellmigration steht die Serin/Threonin-Kinase Akt (Proteinkinase B) (38). Sie wird durch VEGF über die Phosphatidylinositol-3-OH-Kinase (PI[3]-Kinase) aktiviert (157) und entfaltet ihre Wirkung über zwei Mechanismen: Sie stimuliert erstens in vaskulären und nicht-vaskulären Zellen die Aktin/Myosin-Zytoskelett-Reorganisation und anschließend die Zellbewegung (105;106). Zweitens aktiviert Akt die endotheliale NO-Synthase (eNOS) durch Phosphorylierung am Serin-Rest 1177 in humanen Endothelzellen (37) und am Serin-Rest 1179 in bovinen Endothelzellen (49). Dadurch wird in den Zellen aus L-Arginin NO produziert, das promigratorisch wirkt (36;118). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die VEGF-induzierte Endothelzellmigration PI(3)-Kinase-Akt-abhängig ist, denn eine Hemmung des Signaltransduktionsweges durch den PI(3)-Kinase-Inhibitor Wortmannin hatte eine Hemmung der VEGF-induzierten Endothelzellmigration zur Folge (siehe Kap. 4.1.3). Dieses Ergebnis korreliert mit den Ergebnissen anderer Studien, in denen nachgewiesen werden konnte, dass Wortmannin und LY 294002 (ebenfalls ein PI[3]-Hemmstoff) Teile der Transduktionskaskade (37;49) und die gesamte VEGF-induzierte Migration hemmen (36;106). Da die PPAR-Liganden in den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ebenfalls die Migration der Endothelzellen hemmten, diese Hemmung jedoch nicht durch Inhibition der MAP-Kinase-Aktivierung zu erklären war, und da der ebenfalls migrationshemmend wirkende Stoff Wortmannin die Phosphorylierung von Akt inhibierte, wurde mit Western Blots der Einfluss der Liganden auf die Phosphorylierung von Akt untersucht. Sowohl die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat, als auch die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hemmten die Phosphorylierung der Serin/Threonin-Kinase Akt. Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die durch die PPAR-Liganden induzierte Hemmung der VEGF-induzierten Endothelzellmigration über eine Inhibition der Phosphorylierung von Akt vermittelt wird. In Analogie zu Abbildung 1 in Kapitel 2 kann das Schaubild nun vervollständigt werden (siehe Abb. 15): Die migrationshemmende Wirkung der PPAR-Liganden wird über eine Inhibition der Phosphorylierung von Akt vermittelt. Die Phosphorylierung der MAP-Kinase bleibt durch die Liganden unbeeinflusst. Diese Hypothese wird durch eine Arbeit von Goetze et al. unterstützt, die nachweisen konnte, dass auch die Leptin-induzierte Endothelzellmigration über Akt vermittelt und durch PPARγ-Liganden gehemmt wird (51).

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Abbildung 14:
Schematische Darstellung von zwei möglichen Signaltransduktionskaskaden, über die die Stimulation mit VEGF zur Endothelzellmigration führen kann, und ihre Beeinflussung durch spezifische Enzyminhibitoren und PPAR-Liganden (vgl. auch Abb. 1)
(1): Der MEK-MAP-Kinase-Pathway:
Eine Blockade von MEK mit dem pharmakologischen Hemmstoff PD 98059 hat eine Inhibition der Endothelzellmigration durch Hemmung der Phosphorylierung der MAP-Kinase (ERK 1/2) zur Folge. Die PPAR-Liganden, die ebenfalls die Migration hemmten, hatten jedoch keinen Einfluss auf die Phosphorylierung der MAP-Kinase. Möglicherweise wirken die PPAR-Liganden downstream der MAP-Kinase, z.B. durch Beeinflussung der Myosin-Leichtketten-Kinase MLCK (1a) oder durch Hemmung der Produktion von Matrix-Metalloproteinasen MMPs (1b).
(2): Der PI(3)-Kinase-Akt-Pathway:
Die spezifischen Hemmstoffe der PI(3)-Kinase Wortmannin und LY 294002 hemmen die Endothelzellmigration durch Inhibition der Akt-Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass PPAR-Liganden die Phosphorylierung von Akt hemmen und wahrscheinlich über diesen Mechanismus migrationsinhibierend wirken.

Die Untersuchung der Effekte von PPARα- und PPARγ-Liganden auf die Migration von Endothelzellen und der dabei beteiligten Komponenten der Signaltransduktion bildeten den ersten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl PPARα-, als auch PPARγ-Liganden die VEGF-induzierte Endothelzellmigration hemmen, und dass diese Migrationshemmung durch eine Inhibition der Phosphorylierung der Serin/Threonin-Kinase Akt vermittelt wird.

Den Ausgangspunkt für die Untersuchungen der Effekte der PPAR-Liganden auf die Mig-ration von Endothelzellen bildeten die Erkenntnisse, dass die PPAR-Liganden verschiedene protektive Effekte im kardiovaskulären System und in Endothelzellen haben (9;18), und dass die Neovaskularisierung atherosklerotischer Gefäße einen maßgeblicher Faktor beim Fortschreiten der Atherosklerose, der Bildung und Größenzunahme atherosklerotischer Plaques und schließlich der Ruptur solcher Plaques darstellt (30;113;124). Da in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die PPAR-Liganden die Migration von Endothelzellen stark hemmen, lässt sich schlussfolgern, dass PPAR-Liganden als potente Hemmstoffe der Neovaskularisation eingesetzt werden könnten und dass sich damit zumindest eine von vielen Komponenten, die das Fortschreiten oder sogar die Entwicklung der Atherosklerose begünstigen, verhindern ließe. Da metabolische Erkrankungen wie Hyperlipidämie und Diabetes mellitus zu den Hauptrisikofaktoren für die Entstehung der Atherosklerose zählen, hätte die Verordnung von PPAR-Liganden an solche Patienten einen dualen Effekt: Zum einen würde durch die Gabe von PPARα-Liganden wie Fenofibrat an Patienten mit Hyperlipidämie und die Gabe von PPARγ-Liganden wie Ciglitazon an Patienten mit NIDDM die Grundkrankheit dieser Patienten behandelt werden, zum anderen könnte durch die direkten vaskuloprotektiven Effekte der PPARα- und PPARγ-Liganden das Risiko dieser Patienten, eine Atherosklerose zu entwickeln, zusätzlich gesenkt und eine bereits bestehende Atherosklerose eventuell sogar rückgängig gemacht werden, denn die frühen Stadien der Athe-rosklerose sind potentiell reversibel (130). Die klinische Relevanz der hier erhobenen Ergebnisse wird durch eine Arbeit unterstrichen, in der nachgewiesen wurde, dass Hemmstoffe der Angio-genese wie Endostatin und das Fumagillin-Analogon TNP-470 in der Lage sind, intimale Neo-vaskularisation und die Größenzunahme atherosklerotischer Plaques zu inhibieren und damit das Fortschreiten der Atherosklerose aufzuhalten (107). Wenn die PPAR-Liganden unter in vivo-Bedingungen ebenso starke Migrationshemmstoffe sind wie unter in vitro-Bedingungen, würde das neue therapeutische Möglichkeiten für die Behandlung der Atherosklerose eröffnen. Dass sich PPAR-Liganden positiv auf den Verlauf einer Atherosklerose auswirken, wird durch die Ergebnisse zweier Arbeiten unterstützt, die belegen, dass PPARγ-Liganden in LDL-Rezeptor-defizienten, z.T. diabetischen Mäusen das Ausmaß atherosklerotischer Läsionen vermindern (22;88). Collins et al. (22) verabreichten den Tieren 400 mg/kg KG/d Troglitazon. In einer frühe-ren Studie aus der gleichen Arbeitsgruppe konnte mit dieser Dosierung die Verdickung der Neointima nach Ballonverletzung vermindert werden (85). Diese Dosis ist recht hoch, Patienten erhalten bisher therapeutische Dosen von maximal 800 mg pro Tag. Nimmt man der Anschaulichkeit halber ein Durchschnittsgewicht eines Typ II-Diabetikers von etwa 80 kg an, so entspräche das einer Tagesdosis von 10 mg/kg KG. Allerdings senken schon 200 mg am Tag den Insu-linspiegel, 600 mg senken den Spiegel von freien Fettsäuren im Blut (96). Li et al. (88) konnten an LDL-Rezeptor-defizienten Mäusen zeigen, dass auch 20 mg/kg KG/d der PPARγ-Liganden Rosiglitazon und GW7845 die Entwicklung einer Atherosklerose in männlichen Tieren verhindern. Es existieren bisher keine Studien, die gezielt den Effekt von PPAR-Liganden auf die Ent-wicklung atherosklerotischer Plaques oder die Anzahl kardiovaskulärer Ereignisse unter PPAR-Medikation am Menschen untersuchen, daher ist bislang unklar, ob die bisher verwendeten Dosierungen auch antiatherogen wirken, oder ob dazu höhere Gaben notwendig sind. Erste Hinweise für eine realistische und effektive antiatherogene Tagesdosis von PPARγ-Liganden zeigen zwei Studien von Marx et al. (98;99), in denen bei Typ II-Diabetikern die Serumspiegel bestimmter Parameter, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer koronaren Herzerkrankung (KHE) assoziiert sind (löslicher CD 40-Ligand [sCD40L], MMP-9, Serum-Amyloid A [SAA] und TNFα), gemessen wurden und in denen gegenüber einer unbehandelten Kontrollgruppe eine signifikante Senkung der Serumkonzentrationen dieser Parameter bei Patienten erreicht werden konnte, die zwei mal täglich 4 mg Rosiglitazon bekamen. Weitere Untersuchungen, vor allem auch mit PPARα-Liganden, sind erforderlich, um erstens das Ausmaß der antiatherogenen Wirkung der PPAR-Liganden am Menschen zu untersuchen und zweitens herauszufinden, ob diese Wirkung durch eine Hemmung der Neovaskularisation in atherosklerotischen Gefäßabschnitten oder durch eine Senkung der Risikofaktoren wie Hyperinsulinämie und Hyperlipidämie vermittelt wird.

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Es lassen sich jedoch auch Nachteile einer Migrationshemmung und damit einer Hemmung der Angiogenese erkennen. In atherosklerotischen Gefäßen kann die Perfusion des durch das Gefäß versorgten Gebietes ab einem gewissen Stenosierungsgrad nicht mehr gewährleistet werden. In solchen Fällen kommt es durch Angiogenese zur Entwicklung von Umgehungskreisläufen, mit denen oft eine wieder ausreichende Perfusion erreicht werden kann. Eine Hemmung der Angiogenese würde in diesem Fall die Bildung von Kollateralen verhindern und damit die Gewebeversorgung mit Sauerstoff und anderen Nährstoffen verschlechtern. Gerade bei einer diabetischen Stoffwechsellage ist die Fähigkeit zur Kollateralisierung noch geringer ausgeprägt (153). Ein angiogenesehemmender Effekt der zur Behandlung des Typ II-Diabetes eingesetzten PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hätte so eine zusätzliche Verschlechterung des Gefäßstatus in diesen Patienten zur Folge. Es lassen sich jedoch auch Vorteile einer Hemmung der Angiogenese gerade bei Patienten mit Diabetes mellitus erkennen. Bei ihnen ist die Entwicklung einer diabetischen Retinopathie eine gefürchtete Komplikation. Hierbei sind die Netzhautgefäße durch Verdickung der Basalmembran des Endothels sklerotisch und führen dadurch zu Kapillarverschlüssen und Ischämie. Die dadurch ausgelösten Gefäßneubildungen sollen die minderversorgte Netzhaut revaskularisieren, führen jedoch nur zu Netzhautödemen und exsudativer Parenchymzerstörung (44;87). Sowohl in vitro, als auch in vivo konnte jedoch ein protektiver Effekt der PPARγ-Liganden auf die Entwicklung und das Fortschreiten einer solchen Retinopathie nachgewiesen werden (109;110). Es überwiegen also offensichtlich insgesamt die Vorteile einer Hemmung der Angiogenese durch PPAR-Liganden bei diesen Patienten.

5.2.2 Wirkung der PPAR-Liganden auf die Expression der endothelialen
Adhäsionsmoleküle

Der andere Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses der PPAR-Liganden auf die Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1. Stellvertretend für andere, ebenfalls in den Prozess der Atherosklerose involvierten Zytokine, wurde TNFα als Induktor der Adhäsionsmolekülexpression verwendet, da er ein guter NF-κB-Aktivator ist (24;33) und in atherosklerotischen Plaques zu finden ist und in atherosklerotischen Plaques zu finden ist und in atherosklerotischen Plaques zu finden ist (94;130). Die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hatten auch in hohen Konzentrationen von 100 µM keinen Einfluss auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1, weder nach 30-minütiger, noch nach 24-stündiger Vorinkubation. Die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat zeigten einen hemmenden Effekt auf die Expression von VCAM-1, wobei Fenofibrat außerdem die Expression von E-Selectin und ICAM-1 hemmte. Die beobachtete Hemmung war zeitabhängig: Eine Vorinkubation der Zellen mit den PPARα-Liganden für 30 Minuten ergab einen hemmenden Effekt auf die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 durch Fenofibrat in einer Konzentration von 100 µM. Nach einer Vorinkubation von 24 Stunden hemmte WY-14,643 die Expression von VCAM-1 und Fenofibrat die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle. Die Hemmung war außerdem konzentrationsabhängig, denn Konzentrationen von 0,01 µM bis 20 µM hatten keinen Effekt, erst bei 100 µM konnte eine Hemmung der Expression durch die PPARα-Liganden Fenofibrat und WY-14,643 beobachtet werden. Da erst bei solch hohen Konzentrationen hemmende Effekte beobachtet werden konnten und es zudem Berichte gibt, nach denen vor allem PPARγ-Liganden, aber auch PPARα-Liganden in Endothelzellen . Die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hatten auch in hohen Konzentrationen von 100 µM keinen Einfluss auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1, weder nach 30-minütiger, noch nach 24-stündiger Vorinkubation. Die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat zeigten einen hemmenden Effekt auf die Expression von VCAM-1, wobei Fenofibrat außerdem die Expression von E-Selectin und ICAM-1 hemmte. Die beobachtete Hemmung war zeitabhängig: Eine Vorinkubation der Zellen mit den PPARα-Liganden für 30 Minuten ergab einen hemmenden Effekt auf die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 durch Fenofibrat in einer Konzentration von 100 µM. Nach einer Vorinkubation von 24 Stunden hemmte WY-14,643 die Expression von VCAM-1 und Fenofibrat die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle. Die Hemmung war außerdem konzentrationsabhängig, denn Konzentrationen von 0,01 µM bis 20 µM hatten keinen Effekt, erst bei 100 µM konnte eine Hemmung der Expression durch die PPARα-Liganden Fenofibrat und WY-14,643 beobachtet werden. Da erst bei solch hohen Konzentrationen hemmende Effekte beobachtet werden konnten und es zudem Berichte gibt, nach denen vor allem PPARγ-Liganden, aber auch PPARα-Liganden in Endothelzellen . Die PPARγ-Liganden Troglitazon und Ciglitazon hatten auch in hohen Konzentrationen von 100 µM keinen Einfluss auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1, weder nach 30-minütiger, noch nach 24-stündiger Vorinkubation. Die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat zeigten einen hemmenden Effekt auf die Expression von VCAM-1, wobei Fenofibrat außerdem die Expression von E-Selectin und ICAM-1 hemmte. Die beobachtete Hemmung war zeitabhängig: Eine Vorinkubation der Zellen mit den PPARα-Liganden für 30 Minuten ergab einen hemmenden Effekt auf die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 durch Fenofibrat in einer Konzentration von 100 µM. Nach einer Vorinkubation von 24 Stunden hemmte WY-14,643 die Expression von VCAM-1 und Fenofibrat die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle. Die Hemmung war außerdem konzentrationsabhängig, denn Konzentrationen von 0,01 µM bis 20 µM hatten keinen Effekt, erst bei 100 µM konnte eine Hemmung der Expression durch die PPARα-Liganden Fenofibrat und WY-14,643 beobachtet werden. Da erst bei solch hohen Konzentrationen hemmende Effekte beobachtet werden konnten und es zudem Berichte gibt, nach denen vor allem PPARγ-Liganden, aber auch PPARα-Liganden in Endothelzellen (10), glatten Gefäßmuskelzellen (57;116) und Monozyten und Monozyten und Monozyten (19) Apoptose induzieren können, war nicht auszuschließen, dass die beobachteten Effekte durch Apoptose der Endothelzellen hervorgerufen wurden (62). Deshalb wurde mit einem TUNEL-Assay gemessen, ob die PPAR-Liganden in den Zellen Apoptose induzieren. Nach der Inkubation der Zellen für die Höchstdauer der für die Experimente verwendeten Inkubationszeit von 24 Stunden und der höchsten verwendeten Konzentration von 100 µM und anschließender Stimulation mit TNFα für vier Stunden waren jedoch keinerlei Anzeichen für eine Apoptose-Induktion zu beobachten. In den meisten Untersuchungen von anderen Arbeitsgruppen, die mit PPARα-Liganden wie Fenofibrat und WY-14,643 arbeiten, werden ebenfalls diese und z.T. noch höhere Konzentration verwendet (32;33;74;104). Ferner sind die verwendeten Konzentrationen von Fenofibrat denen vergleichbar, die in Patienten erreicht werden . Ferner sind die verwendeten Konzentrationen von Fenofibrat denen vergleichbar, die in Patienten erreicht werden . Ferner sind die verwendeten Konzentrationen von Fenofibrat denen vergleichbar, die in Patienten erreicht werden . Ferner sind die verwendeten Konzentrationen von Fenofibrat denen vergleichbar, die in Patienten erreicht werden . Ferner sind die verwendeten Konzentrationen von Fenofibrat denen vergleichbar, die in Patienten erreicht werden . Ferner sind die verwendeten Konzentrationen von Fenofibrat denen vergleichbar, die in Patienten erreicht werden . Ferner sind die verwendeten Konzentrationen von Fenofibrat denen vergleichbar, die in Patienten erreicht werden (154). Im Vergleich zu den Troglitazon-Konzentrationen von bis zu 5 µM, die bei therapeutischer Dosierung im Menschen erreicht werden (116;145), waren die für die Zell-ELISAs verwendeten Konzentrationen von bis zu 100 µM zwar z.T. wesentlich höher; da jedoch auch bei solch hohen Konzentrationen die Expression der Adhäsionsmoleküle gleich blieb, Ciglitazon und Troglitazon also keinerlei Wirkung zeigen, erscheint ein toxischer Effekt der PPARγ-Liganden auf die Endothelzellen unwahrscheinlich. Obwohl also eine Induktion des programmierten Zelltodes nicht für die beobachtete Hemmung der Expression der Adhäsionsmoleküle durch PPARα-Liganden verantwortlich ist, muss der hemmende Effekt der Liganden dennoch kritisch beurteilt werden: Die inhibitorische Wirkung von WY-14,643 und Fenofibrat war erst bei der verwendeten Höchstkonzentration von 100 µM zu beobachten. Es ist fraglich, ob solch hohe Konzentrationen auch in vivo erreicht werden können., waren die für die Zell-ELISAs verwendeten Konzentrationen von bis zu 100 µM zwar z.T. wesentlich höher; da jedoch auch bei solch hohen Konzentrationen die Expression der Adhäsionsmoleküle gleich blieb, Ciglitazon und Troglitazon also keinerlei Wirkung zeigen, erscheint ein toxischer Effekt der PPARγ-Liganden auf die Endothelzellen unwahrscheinlich. Obwohl also eine Induktion des programmierten Zelltodes nicht für die beobachtete Hemmung der Expression der Adhäsionsmoleküle durch PPARα-Liganden verantwortlich ist, muss der hemmende Effekt der Liganden dennoch kritisch beurteilt werden: Die inhibitorische Wirkung von WY-14,643 und Fenofibrat war erst bei der verwendeten Höchstkonzentration von 100 µM zu beobachten. Es ist fraglich, ob solch hohe Konzentrationen auch in vivo erreicht werden können., waren die für die Zell-ELISAs verwendeten Konzentrationen von bis zu 100 µM zwar z.T. wesentlich höher; da jedoch auch bei solch hohen Konzentrationen die Expression der Adhäsionsmoleküle gleich blieb, Ciglitazon und Troglitazon also keinerlei Wirkung zeigen, erscheint ein toxischer Effekt der PPARγ-Liganden auf die Endothelzellen unwahrscheinlich. Obwohl also eine Induktion des programmierten Zelltodes nicht für die beobachtete Hemmung der Expression der Adhäsionsmoleküle durch PPARα-Liganden verantwortlich ist, muss der hemmende Effekt der Liganden dennoch kritisch beurteilt werden: Die inhibitorische Wirkung von WY-14,643 und Fenofibrat war erst bei der verwendeten Höchstkonzentration von 100 µM zu beobachten. Es ist fraglich, ob solch hohe Konzentrationen auch in vivo erreicht werden können.

Während der eigenen Untersuchung der Wirkungen von PPAR-Liganden auf die Expressi-on der endothelialen Adhäsionsmoleküle erschienen einige Artikel, die ebenfalls den Einfluss der PPAR-Liganden auf diese Moleküle untersuchten (15;74;104;119). Die Ergebnisse sind zum Teil recht widersprüchlich. Marx et al. (104) haben die Expression der Adhäsionsmoleküle in den Endothelzellen menschlicher Vv. saphenae mittels Zell-ELISA gemessen. Die Zellen wur-den für 24 Stunden mit den PPARα-Liganden Fenofibrat (100 μM) und WY-14,643 (250 μM) und mit den PPARγ-Liganden Troglitazon, 15-deoxy-Δ 12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) und Rosiglitazon (BRL 49653) (alle 10 µM) vorinkubiert und danach für acht Stunden mit TNFα (10 µg/l) stimuliert. Die PPARα-Liganden hemmten die Expression von VCAM-1, nicht aber die Expression von ICAM-1 und E-Selectin. In einer Extramessung mit Fenofibrat wurde die TNFα-stimulierte VCAM-1-Expression in einer Konzentration von 10 µM und 100 µM gehemmt, die IL-1β-stimulierte Expression wurde erst ab 100 µM gehemmt. Es wurde außerdem eine zeitabhängige Messung der VCAM-1-Expressionshemmung mit steigenden Fenofibrat-Vorinkubationszeiten durchgeführt, die zeigte, dass die VCAM-1-Expression mit steigender Vorinkubationszeit abnimmt. PPARγ-Liganden hatten keinerlei Wirkung auf die Expression aller drei Adhäsionsmoleküle.

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Nach den Ergebnissen von Jackson et al. (74) haben sowohl PPARα-, als auch PPARγ-Liganden eine hemmende Wirkung auf die Expression der Adhäsionsmoleküle. Es wurde ein leicht modifizierter Zell-ELISA für die Messung der Adhäsionsmolekülexpression verwendet; die Endothelzellen, die aus menschlichen Aorten gewonnen wurden, wurden nach der Vorinku-bation und Stimulation mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Als Stimulanzien wurden Lipopolysac-charid (LPS, 1 ng/ml) und Phorbol 12-Myristat 13-Azetat (PMA, 1 und 5 ng/ml) verwendet. Die Expression von VCAM-1 wurde partiell durch den PPARα-Liganden WY-14,643 (andere wur-den nicht getestet) und einige PPARγ-Liganden (15d-PGJ2, Ciglitazon, Rosiglitazon) gehemmt, wobei einzig der PPARγ-Ligand Rosiglitazon keine Wirkung zeigte. Auf die Expression von ICAM-1 hatte keiner der Liganden einen Einfluss. Die Expression von E-Selectin wurde nur durch 15d-PGJ2 gehemmt, alle anderen PPAR-Liganden blieben wirkungslos.

Für die Versuche von Pasceri et al. (119) wurden HUVEC mit den PPARγ-Liganden Troglitazon (20 und 100 µM), Ciglitazon (100 und 200 µM) und 15d-PGJ2 (5, 10 und 20 µM) und mit dem PPARα-Liganden Fenofibrat (100 µM) für zwei Stunden vorinkubiert und danach für 12 Stunden mit TNFα (10 ng/ml) stimuliert. Anschließend wurde die Expression von VCAM-1, ICAM-1 und E-Selectin mittels FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) gemessen. Die PPARγ-Liganden hemmten die Expression von VCAM-1 und ICAM-1, wohingegen E-Selectin unbeeinflusst blieb. Der getestete PPARα-Ligand Fenofibrat hatte außer einer minimalen Hemmwirkung auf die Expression von VCAM-1 keine Effekte auf die Expression von ICAM-1 und E-Selectin. Um die hemmenden Effekte der PPARγ-Liganden auf die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 tierexperimentell zu bestätigen, haben Pasceri et al. apoE-defizienten Mäusen, die jeweils für sieben Tage entweder mit 400 mg/kg/d Troglitazon (900 µmol/kg/d) oder mit 3200 mg/kg/d Troglitazon (7200 µmol/kg/d) vorbehandelt wurden, markierte Makrophagen gespritzt und nach 48 Stunden die Adhäsion dieser Makrophagen an atherosklerotischen Plaques untersucht. Sie beschreiben eine signifikant verminderte Adhäsion an den Plaques der Troglitazon-Tiere im Gegensatz zu den unbehandelten und führen als Erklärung die Troglitazonwirkung auf die Adhäsionsmoleküle an (119). Es ist jedoch durchaus auch möglich, dass die Makrophagen, auf die das Troglitazon der Tiere 48 Stunden lang wirken konnte, für diesen Effekt verantwortlich sind, denn es konnte gezeigt werden, dass PPARγ-Liganden in Endothelzellen die Produktion von MCP-1, das die Makrophagen anlockt, und in Makrophagen die Expression des MCP-1-Rezeprors, CCR2, gehemmt wird (65;100). Ferner handelt es sich bei den verwendeten Troglitazon-Dosen um ungewöhnlich hohe Konzentrationen. Ferner handelt es sich bei den verwendeten Troglitazon-Dosen um ungewöhnlich hohe Konzentrationen. Ferner handelt es sich bei den verwendeten Troglitazon-Dosen um ungewöhnlich hohe Konzentrationen.

Chen et al. (15) haben gezeigt, dass durch PPARγ-Liganden wie Troglitazon, oxLDL und 13-hydoxy-(S)-octadecadienoic acid (13-(S)-HODE) die Expression von ICAM-1 in der Endothelzellinie ECV 304 verstärkt wird. Gemessen wurde sowohl die Proteinmenge von ICAM-1 mittels ELISA, als auch die Adhäsion von Monozyten an den Endothelzellen. Als Positivkontrollen wurden mit TNFα oder LPS stimulierte Zellen herangezogen. PPARα-Liganden wurden in dieser Studie nicht verwendet.

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Die Ergebnisse dieser Studien lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: Marx et al. (104) beobachteten eine Hemmung von VCAM-1 durch PPARα-Liganden, PPARγ-Liganden hatten keinen Effekt. In der Arbeit von Jackson et al. (74) hatten PPARα-Liganden wie WY-14,643 ebenfalls einen hemmenden Effekt auf die Expression von VCAM-1, die mit Ausnahme von Rosiglitazon auch durch PPARγ-Liganden wie Ciglitazon und 15d-PGJ2 gehemmt wurde. Als einziger PPARγ-Ligand verminderte 15d-PGJ2 auch die Expression von E-Selectin. Die Expression von ICAM-1 wurde durch die Liganden nicht beeinflusst. An dieser Stelle muss jedoch bemerkt werden, dass 15d-PGJ2 kein besonders selektiver PPARγ-Ligand ist (18) und seine starken antiinflammatorischen Wirkungen in seiner Eigenschaft als Prostaglandin auch über PPAR-unabhängige Mechanismen entfaltet (14;122;132). Es ist also nicht davon auszugehen, dass die Wirkungen von 15d-PGJ2 selektiv über PPARγ vermittelt werden. Daher sind Berichte über Effekte von 15d-PGJ2 als PPARγ-Ligand immer mit Vorsicht zu werten.

In der Arbeit von Pasceri et al. (119) hatten PPARα-Liganden so gut wie keinen Effekt auf die Expression der Adhäsionsmoleküle, PPARγ-Liganden hemmten die Expression von VCAM-1 und ICAM-1. Chen et al. (15) haben keine PPARα-Liganden verwendet. Sie beobachteten eine Zunahme der Expression von ICAM-1 unter dem Einfluss von PPAR-Liganden. Bemerkenswert ist, dass in allen zitierten Arbeiten ähnlich hohe Konzentrationen der PPAR-Liganden verwendet wurden. Zum Teil lagen die Konzentrationen mit 250 µM sogar um mehr als das doppelte höher als in der vorliegenden Arbeit.

Im Vergleich zu all diesen Daten kommen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit denen von Marx et al. (104) am nächsten. In beiden Untersuchungen zeigten PPARγ-Liganden keine Wirkung auf die Expression der Adhäsionsmoleküle, wohingegen PPARα-Liganden eine hemmende Wirkung auf die Expression der Moleküle hatten. Bei Marx et al. (104) blieb diese Hemmung auf VCAM-1 beschränkt, wobei in den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit auch die Expression von ICAM-1 und E-Selectin gehemmt wurde. Die Tatsache, dass die Ergebnisse in den erwähnten Arbeiten zum Teil sehr unterschiedlich ausfallen, ist möglicherweise durch folgende Aspekte mitbedingt: In allen Studien wurden zwar etablierte, aber dennoch verschiedene Verfahren angewandt, um die Expression der Adhäsionsmoleküle zu messen. Außerdem wurden unterschiedliche Zellarten verwendet, wie beispielsweise arterielle Endothelzellen menschlicher Aorten, venöse Endothelzellen menschlicher Vv. saphenae und menschlicher Nabelschnurvenen und anderer Endothelzell-Reihen. In der vorliegenden Arbeit wurde auf unphysiologisch hohe Konzentrationen verzichtet. Mögliche beeinflussende Effekte, seien sie toxisch bedingt oder tatsächlich PPAR-vermittelt, sind dadurch möglicherweise noch nicht zum Tragen gekommen.

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Da PPAR-Liganden als Transkriptionsfaktoren fungieren (79;111), liegt es nahe, als Mechanismus für die beobachteten Wirkungen eine Beeinflussung der Regulation bestimmter Gene zu vermuten. Diese Beeinflussung könnte z.B. durch Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren vermittelt werden. Erste Hinweise hierfür lieferte die Arbeit von Ricote et al. (128), in der in Makrophagen eine Hemmung der Expression bestimmter Gene durch eine Antagonisierung der Aktivität von Transkriptionsfaktoren wie Activating Protein-1 (AP-1), Signal Transdu-cer And Activator Of Transcription (STAT) und Nuclear Factor κB (NF-κB) durch PPARγ-Liganden nachgewiesen wurde. NF-κB, der aus den beiden Untereinheiten p50 und p65 besteht, ist im inaktiven Zustand im Zytoplasma an das inhibitorische Protein IκB-α gebunden (24). Aktivatoren von NF-κB, zu denen inflammatorische Zytokine wie TNFα und IL-1β gehören, aktivieren einen IκB-Kinase-Komplex (IKK), der IκB-α an Serin-32 und Serin-36 phosphoryliert (33). Diese Phosphorylierung bewirkt einen Abbau von IκB-α und die Freigabe des p50-p65-Komplexes. Auf diese Weise aktivierter NF-κB transloziert in den Nukleus, bindet an sein Erkennungs-DNA-Element und reguliert so die Transkription des Ziel-Gens (24). Interessanterwei-se aktiviert NF-κB auch die Transkription des IκB-α-Gens und sorgt so für die Wiederherstel-lung seines eigenen Inaktivators (24). Da die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in Endothelzellen maßgeblich durch den Transkriptionsfaktor NF-κB reguliert wird (24), liegt es nahe, eine Beeinflussung dieser Regulation durch PPARα-Liganden als Mechanismus für die beobachtete Hemmung der Expression der Moleküle zu vermuten. Marx et al. (104) weisen in ihrer Arbeit mit einem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) eine Hemmung der TNFα-induzierten NF-κB-Aktivität nach, die eine Hemmung der VCAM-1-Promotor-Aktivität zur Folge hat und somit die Expression von VCAM-1 vermindert. Als mögliche Mechanismen der verminderten NF-κB-Aktivität werden in der Arbeit die folgenden Möglichkeiten diskutiert: Es könnte z.B. eine Konkurrenz zwischen PPARα und NF-κB um die Bindung am VCAM-1-Promotor, oder die kompetitive Bindung von Transkriptions-Koaktivatoren durch PPARα bzw. durch PPARα-induzierte Transkriptionsfaktoren für die beobachteten Effekte verantwortlich sein. Ferner schließen Marx et al. einen direkten Effekt von PPARα auf IκB oder die NF-κB-Untereinheiten p50 und p65 nicht aus. Hinweise in diese Richtung liefern Delerive et al. (32;33), die in zwei Arbeiten zeigen, dass PPARα seine antiinflammatorische Wirkung wahrscheinlich über mindestens folgende zwei Mechanismen entfaltet: In der einen Arbeit wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktionen zwischen PPARα und der NF-κB-Untereinheit p65 beschrieben, die in glatten Gefäßmuskelzellen nach Stimulation mit Interleukin-1 (IL-1) zu einer verminderten Expression eines Ziel-Gens, in diesem Fall von IL-6, führten (32). In der an-deren Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass PPARα in Gefäßmuskelzellen die Expression von IκB-α induziert und dadurch die IL-1β-induzierte NF-κB-Aktivität hemmt (33). Damit bestätigen Delerive et al. die von Marx et al. geäußerte Vermutung, dass PPARα einen direkten Ef-fekt auf IκB und eine der Untereinheiten von NF-κB, in diesem Falle p65, haben kann. Obwohl dieser Mechanismus bisher nicht dezidiert für die hemmende Wirkung von PPARα-Liganden auf die Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle nachgewiesen wurde, ist es dennoch gut vorstellbar, dass die Beeinflussung der TNFα-induzierten NF-κB-Aktivität durch PPARα, die nachfolgend in einer Hemmung der VCAM-1-Promotor-Aktivität und verminderten Expression von VCAM-1 resultiert (104), über mindestens einen der beiden von Delerive et al. (32;33) beschriebenen Mechanismen vermittelt wird. Da in der vorliegenden Arbeit auch eine Hemmung der Expression von E-Selectin und ICAM-1 durch den PPARα-Liganden Fenofibrat beschrieben wurde, und da die Expression dieser beiden Adhäsionsmoleküle ebenfalls durch NF-κB reguliert wird (24), kann als Erklärung für die beobachtete Hemmung ebenfalls die Inhibition der Aktivität von NF-κB herangezogen werden.

In den zitierten Studien und in der vorliegenden Arbeit wurde überwiegend eine Hemmung der Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 beschrie-ben (74;104;119). Obwohl die Ergebnisse nicht einheitlich sind, ist es dennoch wahrscheinlich, dass PPAR-Liganden einen inhibitorischen Effekt auf die Expression dieser Adhäsionsmoleküle haben. Inwiefern diese Ergebnisse in vivo von Bedeutung sind, kann noch nicht abschließend beurteilt werden. Es gibt jedoch überzeugende Hinweise, die auf die klinische Relevanz der Ergebnisse dieser Arbeit hinweisen. Es konnte in zwei Studien gezeigt werden, dass Knock-out-Mäuse, die kein E-Selectin oder ICAM-1 als Antwort auf eine proatherogene, cholesterinreiche Diät exprimieren, signifikant weniger atherosklerotische Läsionen entwickeln als ihre Artgenos-sen, bei denen E-Selectin und ICAM-1 exprimiert wurden (23;39). In einer anderen Untersuchung wurde in Mäusen der Ligand für VCAM-1 auf Monozyten, Very Late Antigen-4 (VLA-4), blockiert. Allein dadurch war die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen in diesen Tieren ebenfalls signifikant vermindert gegenüber jenen Tieren, in denen das monozytäre VLA-4 an VCAM-1 binden konnte (140). Da in der vorliegenden Arbeit beschrieben wurde, dass die PPARα-Liganden WY-14,643 und Fenofibrat die endotheliale Expression von VCAM-1 hemmen, und dass Fenofibrat darüber hinaus auch die Expression von E-Selectin und ICAM-1 hemmt, lässt sich schlussfolgern, dass die PPARα-Liganden auch in vivo einen protektiven Ef-fekt auf die Entwicklung atherosklerotischer Plaques haben können. Es wurde in klinischen Stu-dien am Menschen gezeigt, dass unter einer Therapie mit dem PPARα-Liganden Fenofibrat und verwandten Substanzen wie Gemfibrozil und Bezafibrat die Komplikationsrate nach kardiochirurgischen Eingriffen und das Fortschreiten atherosklerotischer Läsionen in vivo reduziert werden konnte (40;48;133). Auch mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die als Liganden von PPARα und PPARγ identifiziert wurden (78), konnten nachweislich die Inzidenz kardiovaskulärer Er-eignisse vermindern (66). Es lässt sich spekulieren, ob die beobachteten vaskuloprotektiven Effekte der PPARα-Liganden über eine Hemmung der Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle vermittelt werden, oder ob die erwähnten günstigen Effekte durch Beeinflussung des Lipidmetabolismus oder der Migration zustande kommen. Hinweise auf eine direkte vaskuloprotektive Wirkung der PPARα-Liganden liefern Saitoh et al., indem sie beschreiben, dass Fenofibrat im Tierversuch eine antiatheromatöse Wirkung habe und dass diese Wirkung von den lipidsenkenden Eigenschaften dieses PPARα-Ligands unabhängig sei (134;135). Um zu beurteilen, ob der in der vorliegenden Arbeit und in anderen Studien in vitro beobachtete Effekt der PPARα-Liganden auch in vivo von Bedeutung ist, wie es die Studien von Saitoh et al. nahe legen, wäre es sicherlich sinnvoll, mithilfe von Tierversuchen oder pathologisch-anatomischen Studien von explantierten atherosklerotischen Gefäßabschnitten von Patienten, die mit PPARα-Liganden therapiert wurden, den Einfluss dieser Liganden auf die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen und die Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle zu untersuchen.

5.3 Diskussion der verwendeten Methoden

5.3.1  Untersuchungsgut

Für die Experimente wurden ausschließlich Endothelzellen menschlicher Nabelschnurvenen (HUVEC) verwendet. Das hat sowohl Nachteile, als auch Vorteile. Als Nachteil kann angeführt werden, dass der Prozess der Atherosklerose ausschließlich in Arterien stattfindet und nicht in Venen. Ergebnisse, die mit venösen Endothelzellen gewonnen werden, sind daher möglicherweise nicht ohne Einschränkungen auf arterielle Zellen übertragbar. Beispielsweise reagieren venöse Endothelzellen anders auf Stimulation durch Zytokine als arterielle Endothelzellen (71). Dieser Nachteil wird jedoch durch die Tatsache gemildert, dass in Nabelschnurvenen arterielles Blut fließt. Allerdings handelt es sich bei HUVEC um embryonales Gewebe, was eine weitere Einschränkung der Übertragungsmöglichkeiten bedeutet. In der gegenwärtigen Literatur werden jedoch sehr häufig HUVEC für Untersuchungen an Endothelzellen verwendet, da sie ein etabliertes und gut charakterisiertes Modell darstellen (46;58;61;75), aber auch andere venöse Zellen, wie die der V. saphena finden Verwendung , aber auch andere venöse Zellen, wie die der V. saphena finden Verwendung , aber auch andere venöse Zellen, wie die der V. saphena finden Verwendung , aber auch andere venöse Zellen, wie die der V. saphena finden Verwendung , aber auch andere venöse Zellen, wie die der V. saphena finden Verwendung , aber auch andere venöse Zellen, wie die der V. saphena finden Verwendung , aber auch andere venöse Zellen, wie die der V. saphena finden Verwendung (104). Ein weiterer Nachteil ist die Tatsache, dass die gewonnenen Erkenntnisse auf Versuchen in vitro beruhen. Die äußeren Bedingungen wurden zwar durch die Zusammensetzung des Kulturmediums, das menschliches Plasma imitiert, und durch die Kultivierung der Zellen in Brutschränken bei einer Temperatur von 37°C, die der Temperatur des menschlichen Körpers entspricht, so nah wie möglich den physiologischen Bedingungen angepasst, entsprachen ihnen aber letztlich nicht. So ist es vorstellbar, dass bestimmte Bestandteile des Kulturmediums wie z.B. das fetale Kälberserum oder der Wachstumsfaktor aFGF Wirkungen haben, die Zellfunktionen durch Enzyminduktion oder Stimulation der Proliferationsrate beeinträchtigen. Diesem Nachteil des In-vitro-Versuchs kann jedoch gegenüber gestellt werden, dass In-vitro-Versuche unter definierten und gut reproduzierbaren Bedingungen stattfinden können, aus denen Störfaktoren relativ gut eliminiert werden können. Dies ist bei In-vivo-Versuchen oft schwierig.

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Ein Vorteil der Verwendung von HUVECs ist sicherlich die Tatsache, dass es sich dabei um menschliche und nicht um tierische Zellen handelt. So groß die Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Tier auch auf zellulärer Ebene sein mögen, eine Übertragung der Verhältnisse eins zu eins ist dennoch nicht möglich. Ein weiterer Vorteil von HUVECs ist ihre schnelle und nahezu komplikationslose Verfügbarkeit. Ferner ist zu berücksichtigen, dass die Endothelzellen in den meisten Fällen aus Nabelschnüren von gesunden Kindern stammen. Eine Präparation von arteriellen Zellen aus explantierten Herzen hätte zwar den Vorteil, dass so direkt an den Zellen, an denen in vivo die Veränderungen stattfinden, nun in vitro die Untersuchungen durchgeführt werden können. Solche Zellen stammen jedoch in den meisten Fällen aus Herzen von Menschen, die medikamentös therapiert werden. Die Zellen sind also vorbehandelt, was die Aussagefähigkeit von Experimenten mit solchen Zellen einschränkt. Dies ist bei HUVECs nicht der Fall.

5.3.2 Untersuchung des Migrationsprozesses in Endothelzellen

Mit Hilfe des sogenannten „Boyden-Kammer-Versuchs“, der in Kapitel 3 ausführlich beschrieben wurde, kann sehr genau die Migration von Zellen entlang des Konzentrationsgradienten eines Wachstumsfaktors oder Zytokins gemessen werden. Es wurden nur Zellen der zweiten und dritten Passage benutzt. Die Bedingungen wurden so weit wie möglich den physiologischen Bedingungen angepasst: Der Boden des Filters, durch den die Zellen migrieren sollten, war mit Gelatine (0,2 %) beschichtet, um die extrazelluläre Matrix in der Gefäßwand zu imitieren. Die Zellen konnten dann fünf Stunden bei 37°C migrieren. Der große Vorteil dieses Versuches, unter relativ isolierten Bedingungen die Migration von Zellen messen zu können, ist zugleich aber auch ein Nachteil, denn die extrazelluläre Matrix in Gefäßen besteht nicht nur aus Gelatine, sondern ist aus vielen Bestandteilen wie Fibronectin, Kollagenen und Proteoglykanen zusammengesetzt, die durch Proteolyse abgebaut und überwunden werden müssen. Während der Neovaskularisation in der Atherosklerose sind die Endothelzellen auch nicht nur einem Migrations-Stimulus ausgesetzt. Vielmehr produzieren andere vaskuläre Zellen wie Makrophagen und glatte Gefäßmuskelzellen ebenfalls Zytokine und Wachstumsfaktoren, die promigratorisch und antimigratorisch wirken können (130). Letztendlich sind es viele Umgebungsbedingungen, die die Endothelzellen schließlich zur Migration veranlassen, und die in diesem Versuch nicht simuliert werden können. Das Ausschalten von anderen Einflüssen auf die Zellen war auf der anderen Seite auch beabsichtigt, denn es sollte gezielt der Effekt der PPAR-Liganden auf die Migration der Zellen untersucht und beurteilt werden, ohne andere Einflussgrößen in der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigen zu müssen. Das Verfahren ist inzwischen insbesondere durch Untersuchungen an glatten Gefäßmuskelzellen, Monozyten und Fibrozyten etabliert (55;80;85). Für die Aussagekraft dieser Methode spricht die Tatsache, dass Ergebnisse, die von anderen Autoren in vitro mit dieser Methode gewonnen wurden, durch In-vivo-Versuche im Tierexperiment bestätigt werden konnten . Für die Aussagekraft dieser Methode spricht die Tatsache, dass Ergebnisse, die von anderen Autoren in vitro mit dieser Methode gewonnen wurden, durch In-vivo-Versuche im Tierexperiment bestätigt werden konnten . Für die Aussagekraft dieser Methode spricht die Tatsache, dass Ergebnisse, die von anderen Autoren in vitro mit dieser Methode gewonnen wurden, durch In-vivo-Versuche im Tierexperiment bestätigt werden konnten . Für die Aussagekraft dieser Methode spricht die Tatsache, dass Ergebnisse, die von anderen Autoren in vitro mit dieser Methode gewonnen wurden, durch In-vivo-Versuche im Tierexperiment bestätigt werden konnten . Für die Aussagekraft dieser Methode spricht die Tatsache, dass Ergebnisse, die von anderen Autoren in vitro mit dieser Methode gewonnen wurden, durch In-vivo-Versuche im Tierexperiment bestätigt werden konnten (22;80;85;110)

Der relativ einfach durchzuführende Adhäsionsassay diente als Ergänzung zum Migrationsassay, indem mit dieser Methode die Komponente Adhäsion bei der Migration von Zellen auf einer extrazellulären Matrix während des Migrationsvorganges beurteilt werden sollte. Das verwendete Verfahren zur Messung der Adhäsion entspricht nicht den physiologischen Bedingungen, denn Endothelzellen liegen während des Migrationsvorganges niemals als Zellsuspension vor. Es sollte hier lediglich getestet werden, ob die Adhäsion von Endothelzellen während des Migrationsvorganges durch die PPAR-Liganden beeinflusst wird. Wie in Kapitel 4.1.5 ausführlich beschrieben, ist dieser Einfluss nur sehr gering ausgeprägt. PPARα-Liganden hatten in den relevanten Konzentrationen keinerlei Wirkung auf die Adhäsion, PPARγ-Liganden hemmten die Adhäsion nur geringfügig bei 20 µM. Aus diesem Befund kann geschlussfolgert werden, dass die Adhäsion der Endothelzellen auf einer Gelatine-Matrix durch PPAR-Liganden so gut wie nicht beeinflusst wird, die hemmende Wirkung also über eine direkte Hemmung der Migration zu erklären ist, und dass möglicherweise an der stärkeren migrationshemmenden Wirkung der PPARγ-Liganden eine geringfügige Adhäsionshemmung bei 20 µM beteiligt ist.

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Die migrationshemmende Wirkung von PPARα- und PPARγ-Liganden auf bestimmte in den Migrationsprozess involvierte Enzyme wurde mit Western Blot-Analyse untersucht. Diese Methode ist sehr aufwendig und technisch anspruchsvoll, so dass gute und valide Kontrollen notwendig sind. Im Western Blot kann nicht die eigentliche Aktivierung, sondern nur die Phosphorylierung mittels Antikörper gemessen werden. Insofern ist die Beantwortung der Frage, ob der Grad der Phosphorylierung mit dem Grad der Aktivierung gleichgesetzt werden kann, von zentraler Bedeutung, denn nur dann sind die Ergebnisse dieser Methode aussagekräftig. Es konnte in einigen Studien gezeigt werden, dass die enzymatische Aktivität sowohl von ERK 1/2 (54;158), als auch von Akt , als auch von Akt , als auch von Akt (35;47) mit dem Phosphorylierungsgrad korreliert. Somit kann davon ausgegangen werden, dass Phosphorylierung gleichbedeutend mit Aktivierung ist. mit dem Phosphorylierungsgrad korreliert. Somit kann davon ausgegangen werden, dass Phosphorylierung gleichbedeutend mit Aktivierung ist. mit dem Phosphorylierungsgrad korreliert. Somit kann davon ausgegangen werden, dass Phosphorylierung gleichbedeutend mit Aktivierung ist.

5.3.3 Messung der Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle

Die Wirkungen von PPAR-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in Endothelzellen wurden mittels Zell-ELISA ermittelt. Diese Methode wurde anderen Methoden, wie der FACS-Analyse oder dem „klassischen“ ELISA, bei dem die Proteinmenge des jeweils interessierenden Adhäsionsmoleküls gemessen wird, vorgezogen, weil die Bedingungen bei einem Zell-ELISA am ehesten die physiologischen Bedingungen imitieren. Für diesen Versuch werden die Endothelzellen in einer definierten Menge pro Well auf einer Mikrotiterplatte ausgesät. Sie adhärierten und wuchsen am Boden der Wells. Diese Situation ist der des Monolayers vergleichbar, den die Endothelzellen in der Blutgefäßwand bilden und so die Intima bedecken und schützen. Die Zellen befanden sich also in einem Ruhezustand und wurden dann durch die Zugabe eines Zytokins wie TNFα stimuliert und zur Expression der Adhäsionsmoleküle angeregt. Für die Stimulation mit TNFα wurde eine Dauer von vier Stunden festgelegt. Dieses Zeitintervall trägt den unterschiedlichen Kinetiken der Expression der einzelnen Adhäsionsmoleküle in Endothelzellen am besten Rechnung, denn nach vier Stunden ist die Expression auch von E-Selectin, dessen Expression am schnellsten wieder rückläufig ist, am stärksten ausgeprägt (8). VCAM-1 und ICAM-1, deren Expressionskinetik ähnlich ist, haben zu diesem Zeitpunkt ihre maximale Expressionsstärke noch nicht ganz erreicht (8).

Das regelrechte Binden der kommerziell erwerbbaren Primär- und Sekundärantikörper vorausgesetzt, wird die Funktionstüchtigkeit des Zell-ELISAs dadurch deutlich, dass beim Messen im ELISA-Reader die Wells mit den stimulierten Zellen eine deutlich höhere Extinktion hatten als Wells, in denen unstimulierte Zellen waren. Die Extinktionswerte der unstimulierten Negativkontrolle waren regelmäßig gleich bzw. annähernd Null. Dies legt nahe, dass erstens TNFα zuverlässig die Expression der Adhäsionsmoleküle in den Endothelzellen induziert und dass zweitens die in Wells mit stimulierten Zellen gemessene hohe Extinktion auch tatsächlich die vermehrte Adhäsionsmolekülexpression widerspiegelt. Durch häufiges Spülen mit PBS (mit Ca2+ und Mg2+) wurde sichergestellt, dass nur jene Antikörper in den Wells blieben, die fest gebunden hatten. Nach jedem Spülvorgang wurde die Intaktheit des Zellverbandes in den Wells unter dem Mikroskop überprüft, da ein Ablösen der Zellen durch das Spülen falsch-negative Ergebnisse zur Folge gehabt hätte. Das Binden der Antikörper und das Umwandeln des Substrats ließen sich gut dadurch demonstrieren, dass als eine Art interne Positivkontrolle in jedem Versuch unstimulierte Zellen mit Platelet-Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 (PECAM-1, CD 31), einem in Endothelzellen konstitutiv exprimierten Adhäsionsmolekül (7), markiert wurden. Einem Aktivitätsverlust von TNFα wurde vorgebeugt, indem der relativ instabile TNFα nach dem Aliquotieren nur noch zwei mal aufgetaut und dann verworfen wurde.

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Obwohl die gesamte Versuchsdurchführung bis zur Zugabe der Primärantikörper unter sterilen Bedingungen stattfand, war trotzdem nicht immer auszuschließen, dass es in dieser sterilen Phase oder in der darauffolgenden unsterilen Phase zur Kontamination der Zellen kam. Da Endotoxine ebenfalls potente Stimulatoren für die Expression der Adhäsionsmoleküle sind (8), könnte eine solche Kontamination zur Verfälschung der Ergebnisse führen. Etwaige Veränderungen hätten sich jedoch auch in den Kontrollen bemerkbar machen müssen. Da endotoxinfreies Wasser verwendet wurde und bei allen Versuchen die Kontrollen gleich waren, konnte eine Verfälschung der Ergebnisse durch andere Stimulatoren außer TNFα ausgeschlossen werden.

Da die Zellen einer Kulturflasche in Analogie zur normalen Passage auch für den Zell-ELISA 1:3 passagiert, also auf drei Mikrotiterplatten ausgesät wurden, konnten mehrere Wells für die Kontrollen und die stimulierten Zellen verwendet werden. Das hatte den Vorteil, dass pro Versuch eine größere Anzahl von Daten innerhalb der interessierenden Gruppe erhoben werden konnte.

Insgesamt erwies sich der Zell-ELISA als zuverlässige Methode, um die TNFα-stimulierte Expression der Adhäsionsmoleküle unter dem Einfluss der PPAR-Liganden zu messen. Wie jedoch schon für den Migrationsassay erläutert, sind an In-vivo-Bedingungen noch sehr viel mehr Zellen und Zytokine beteiligt, die einen stimulierenden Einfluss auf die Endothelzellen ausüben können (130). Ob der hemmende Einfluss der PPARα-Liganden auf die Expression der Adhäsionsmoleküle unter pathophysiologischen Bedingungen so stark ist, dass er die Leukozyten-Adhäsion und Transmigration vermindert, kann nicht abschließend beurteilt werden. Für die Beantwortung dieser Frage sind weitere Untersuchungen notwendig, in denen z.B. die Adhäsion von Leukozyten an einem Endothel-Monolayer gemessen oder sogar mittels Tierversuch getestet wird, ob histologisch ein verändertes Expressionsmuster oder eine veränderte Leukozyten-Verteilung in mit PPARα-Liganden behandelten Gefäßen nachzuweisen ist.


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11.08.2006