Aus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Untersuchungen zum Rekrutierungsmechanismus und zur funktionellen Rolle des atypischen Myr5 bei der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
Universitätsmedizin Berlin

von
Christian Böwe
aus Parchim

Dekan:
Prof. Dr. J. W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Dr. U. Göbel
2. Prof. Dr. M. A. Schmidt
3. PD Dr. W. Heise

Datum der Promotion: 19.04.2004

Veröffentlichung: Graf, B., Bähler, M., Hilpelä, P., Böwe, C., Adam, T. 2000. Functional role for the class IX myosin myr5 in epithelial cell infection by Shigella flexneri.Cellular Microbiology 2: 601-616

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Bakterien
  • 1.2. Shigellen
  • 1.3. Problemstellung
• 2.  Materialien und Methoden
  • 2.1. Materialien
  • 2.2. Verwendete Myr5- und Rho-Konstrukte
  • 2.3. Bakterienstämme
  • 2.4. Zellkultur
  • 2.5.  Transfektion von HeLa-Zellen
  • 2.6.  Infektion
    • 2.6.1. Infektion mit Shigella flexneri SC301 oder SC300
    • 2.6.2. Infektion mit Shigella flexneriM90T, BS176 oder SC560
  • 2.7. Färbungen
    • 2.7.1. Immunfluoreszenzfärbung
    • 2.7.2. GIEMSA-Färbung
  • 2.8. Mikroskopieren
  • 2.9. DNA-Transformation, -Gewinnung, -Reinigung und -Präzipitation
    • 2.9.1.  Herstellung kompetenter E.coli-Zellen
    • 2.9.2. DNA-Transformation in E.coli-DH_{5 α -Zellen}
    • 2.9.3. DNA-Gewinnung
    • 2.9.4.  DNA-Reinigung mittels Phenol-Chloroform-Extraktion
    • 2.9.5.  Ethanolpräzipitation
  • 2.10. Herstellung des Myr5-VSV-tag-Konstruktes
    • 2.10.1. Schema der Vorgehensweise
    • 2.10.2. Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
    • 2.10.3. Gelelektrophorese
    • 2.10.4. Gelextraktion, Dephosphorylierung, Präzipitation kleiner DNA-Fragmente
    • 2.10.5.  Oligonukleotidhybridisierung
    • 2.10.6. Ligation
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1.  Änderung der Zellmorphologie durch Überexpression von Myr5
  • 3.2.  Rekrutierung von Myr5 in die Invasionszone und Kolokalisation von Myr5 und Aktin an der bakteriellen Eintrittsstelle
  • 3.3.  Von der Myosin-Funktion unabhängige Myr5-Rekrutierung in die bakterielle Invasionszone
    • 3.3.1.  Myr5-Rekrutierung ist unabhängig von der ATP-Bindung
    • 3.3.2. Myr5-Rekrutierung ist unabhängig von der ATPase-Aktivität
  • 3.4.  Rekrutierungsverhalten von Myr5 und Rho
  • 3.5. Von der GAP-Funktion unabhängige Myr5-Rekrutierung in die bakterielle Invasionszone
  • 3.6.  Einheitliche Rekrutierung von Myr5 und Myr5-GAP^—
  • 3.7.  Verringerung der Infektionseffizienz durch Myr5
  • 3.8.  Steigerung der Infektionseffizienz durch Myr5-GAP^—
• 4.  Diskussion
  • 4.1. Diskussion der Methoden
    • 4.1.1. Verwendete Zelllinie
    • 4.1.2. Transfektionsmethode
    • 4.1.3. Auswahl der Bakterienstämme
    • 4.1.4.  Quantitative Invasionsexperimente
    • 4.1.5. Konstrukt Myr5-VSV-tag
  • 4.2.  Untersuchungen zum Rekrutierungsmechanismus von Myr5 während der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri
  • 4.3. Untersuchungen zur funktionellen Rolle von Myr5 während der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri
• 5.  Zusammenfassung
• 6. Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Lebenslauf
• Danksagung
• Selbständigkeitserklärung

Tabellen

• Tab. 1: Klassifikation der Gattung Shigella, die neueren Nomenklaturen zufolge der Spezies Escherichia coli angehört (15, 16, 17, 18).
• Tab. 2: Übersicht der verwendeten Sekundärantikörper und Fluoreszenzfarbstoffe.
• Tab. 3: Pipettierschema des 1. Restriktionsansatzes.
• Tab. 4: Ansätze für die Gelelektrophorese.
• Tab. 5: Pipettierschema des 2. Restriktionsansatzes.
• Tab. 6: Pipettierschema der Ligationsansätze.
• Tab. 7: Verwendete Oligohybridverdünnungen für die Ligationsansätze.
• Tab. 8: Dargestellt sind die Ergebnisse aus 3 quantitativen Invasionsexperimenten (8A-8C). Dabei wurden HeLa-Zellen mit Myr5 transfiziert, anschließend mit dem Shigellenstamm SC560 (siehe 4.1.4) infiziert und auf die Eigenschaften Transfektionseffizienz von Myr5 (nicht transfiziert, schwach transfiziert, mittelstark transfiziert, stark transfiziert) und Infektion (infiziert, nicht infiziert) untersucht. Die Anzahl der infizierten Zellen in Prozent wurde auf 100 % normalisiert. Aus diesen Werten wurden für die unterschiedlichen Transfektionseffizienzen der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet (8D, s entspricht der Standardabweichung).
• Tab. 9: Dargestellt sind die Ergebnisse aus 3 quantitativen Invasionsexperimenten (9A-9C). Dabei wurden HeLa-Zellen mit GAP-negativem Myr5-250 transfiziert, anschließend mit dem Shigellenstamm SC560 (siehe 4.1.4) infiziert und auf die Eigenschaften Transfektionseffizienz von Myr5-250 (nicht transfiziert, schwach transfiziert, mittelstark transfiziert, stark transfiziert) und Infektion (infiziert, nicht infiziert) untersucht. Die Anzahl der infizierten Zellen in Prozent wurde auf 100% normalisiert. Aus diesen Werten wurden für die unterschiedlichen Transfek­tions­effizienzen der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet (9D; s ent­spricht der Standardabweichung).

Bilder

• Abb. 1: Rho-Zyklus zwischen dem GDP-gebundenen, inaktiven Zustand und dem GTP-gebundenen, aktiven Zustand. GEF-Proteine aktivieren Rho, GAP-Proteine inaktivieren Rho. GDI-Protein stabilisiert GDP-gebundenes, inaktives Rho.
• Abb. 2: Schematische Darstellung des Myr5-Moleküls (63). Die hervorgehobenen Sequenzen sind für Myr5 spezifisch und werden im konventionellen Myosin des Muskels nicht gefunden.
• Abb. 3: Neuronen-ähnliches Aussehen einer Myr5 (rot) überexprimierenden HeLa-Zelle in der Doppelfluoreszenzmikroskopie; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt, nur transfizierte Zellen sind sichtbar; B: Aktin- Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 4: Kolokalisation von Myr5 (rot) und Aktin (grün) in den Protrusionen der blüten­artigen Membranstruktur (A und B: identische Bildausschnitte, Seitansicht; C und D: identische Bildausschnitte, Aufsicht) während der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A und C: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B und D: Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 5: Die parallele Darstellung von Myr5 (rot) und Shigella flexneri M90T (grün) zeigte, dass Myr5 während der bakteriellen Invasion von HeLa-Zellen um Shigella (Pfeil) herum akkumuliert; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundär­antikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, Shigella flexneri M90T wurde mit LPS-Antikörpern markiert und mittels Fluoreszein-gekoppelten Sekundäranti­körpern gefärbt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 6: Negativkontrolle; bei einer Inkubation der HeLa-Zellen mit dem apathogenem Stamm Shigella flexneri SC300 konnte keine Rekrutierung von Myr5 (rot) und Aktin (grün) beobachtet werden; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt, nur transfizierte Zellen sichtbar; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 7: Schematische Darstellung der Mutante Myr5-248; Farbkodierung der Domänen: siehe Abb. 2
• Abb. 8: Kolokalisation der ATP-Bindungsstelle negativen Mutante Myr5-248 (rot) mit Aktin (grün) an der bakteriellen Eintrittsstelle (Pfeil) bei der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5-248 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 9: Schematische Darstellung von Myr5-225; Farbkodierung der Domänen: siehe Abb. 2
• Abb. 10: Kolokalisation der ATPase-negativen Mutante Myr5-225 (rot) mit Aktin (grün) an der bakteriellen Eintrittsstelle bei der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5-225 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; nur transfizierte Zellen sichtbar; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 11: Kolokalisation von Myr5 (grün) und RhoB (rot) in den Protrusionen der bakteriellen Eintrittsstelle während der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, RhoB wurde mit einem gegen sein VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 12: Kolokalisation von Myr5 (grün) und RhoC (rot) in den Protrusionen der bakteriellen Eintrittsstelle während der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, RhoC wurde mit einem gegen sein VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 13: Parallele Darstellung von Myr5 und RhoA auf einer Ebene. Während RhoA (rot) bei der Epithelzellinvasion von Shigella flexneri um das Bakterium herum akkumuliert (Pfeil), reichert sich Myr5 (grün) in den zellulären Protrusionen (Pfeil) an; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, RhoA wurde mit einem gegen sein VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 14: Schematische Darstellung der Mutante Myr5-250; Farbkodierung der Domänen: siehe Abb. 2
• Abb. 15: Kolokalisation der GAP-negativen Mutante Myr5-250 (rot) mit Aktin (grün) an der bakteriellen Eintrittsstelle (Pfeil) bei der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5-250 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 16: Darstellung der Methode zur Herstellung des Konstruktes Myr5-VSV-tag in pUHD 310/311.
• Abb. 17: Sequenzen der VSV-tag-Oligonukleotide
• Abb. 18: Zweifach belichtete Aufnahme einer mit Myr5 und Myr5-250 doppeltransfizierten HeLa-Zelle; Kolokalisation der beiden Proteine am Invasionsort (Pfeil) von Shigella flexneri SC301; Myr5 (rot) wurde mit einem gegen das VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; Myr5-250 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.
• Abb. 19: Dargestellt ist die Effizienz der Infektion von HeLa-Zellen durch Shigella flexneri in Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz von Myr5. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte, die aus 3 voneinander unabhängigen Experimenten gewonnen wurden (siehe Tab. 8; s entspricht der Standardabweichung).
• Abb. 20: Dargestellt ist die Effizienz der Infektion von HeLa-Zellen durch Shigella flexneri in Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz von GAP-negativem Myr5-250. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte, die aus 3 voneinander unabhängigen Experimenten gewonnen wurden (siehe Tab.; s entspricht der Standardab­weichung).