Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Entwicklung eines bioartifiziellen Trachealersatzes: Charakterisierung humaner respiratorischer Epithelzellen in Expansions- und Differenzierungskulturen

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor rerum medicarum (Dr. rer. medic)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité-
Universitätsmedizin Berlin

von
Michaela Endres
aus Leverkusen

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Priv.-Doz. Dr. rer. nat. M. Sittinger
2. Prof. Dr. med. Th. Skutella
3. Priv.-Doz. Dr. med N. Rotter

Datum der Promotion: 26.09.2005

Kurzfassung:

Verschiedene Ursachen erfordern rekonstruktive Maßnahmen an der Trachea zur Erhaltung eines suffizienten Luftweges. Häufig treten im Rahmen dieser Eingriffe Infektionen und Schädigungen auf, die die Bildung von Granulationsgewebe nach sich ziehen und zu Stenosen führen können. Der Einsatz von epithelialisierten autogenen oder auch allogenen Transplantaten, die mit der Methode des Tissue Engineering hergestellt werden, bietet einen neuen Lösungsansatz, um Stenosen zu vermeiden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von humanem respiratorischen Epithelzellen (hREC), sowie deren Einsatz in Co-Kulturen mit humanen Chondrozyten als einen ersten Schritt zur Transplantatherstellung. Die hREC wurden sowohl in nativem Gewebe als auch in Monolayerkultur und in verschiedenen Differenzierungkulturen histologisch und immunhistochemisch analysiert. Zusätzlich wurde die Ziliogenense mit der Elektronenmikroskop untersucht. Eine weitere Charakterisierung erfolgte durch die Genexpressionsanalyse einiger Cytokeratine auf RNA-Ebene mit der semiquantitativen real-time RT-PCR. Mittels Durchflusszytometrie konnten Basalzellen, die auch als Vorläuferzellen des humanen respiratorischen Epithels gelten, mit den Antikörpern CD49f und CD104 detektiert und analysiert und unter Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) separiert werden.

Es zeigte sich, dass die hREC in den Proliferationskulturen dedifferenzierten und durch spezielle Basalzellmarker angefärbt wurden. Die Differenzierungskulturen und ALI-Kulturen gaben erste Hinweise auf die Differenzierung der Zellen. In den Co-Kulturen konnte unter dem Einfluß eines Air-Liquid-Inteface ebenfalls eine Re-differenzierung der Zellen beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, eine Epithelialisierung von kollagenbeschichteten Biomaterialien oder auch autologem Knorpel zu erreichen, um diese Konstrukte für das Trachea Tissue Engineering einzusetzen.

Schlagworte: Gewebezüchtung, Trachealersatz, Respiratorische Epithelzellen, Luftröhre, Co-Kulturen, Zellkultur

Abstract

The replacement of extensive tracheal defects resulting from intensive care medicine, trauma, or large resections is still challenged by the re-epithelialization of an autologous or alloplastic trachea replacement. Therefore, this thesis was performed to investigate the potential of culture expanded human respiratory epithelial cells (hREC) to regenerate a functional epithelium for trachea tissue engineering.

hREC from nasal turbinates were freshly isolated, expanded and subsequently cultured in high-density multilayers to allow epithelial differentiation. Composition of epithelial cells in native respiratory epithelial tissue and culture expanded hREC were analyzed by histological staining and by immunohistochemical staining with the specific antibodies. Differentiation of culture expanded hREC was further characterized by gene expression analysis of a cytokeratin pattern using semi-quantitative real-time RT-PCR technique. Furthermore, basal cells known as progenitors of the respiratory epithelium were seperated by Fluorescense Activated Cell Sorting with the basal cell specific antibodies CD49f and CD104. Co-cultures of hREC and human chondrocytes (hCHO) or human cartilage respectively were compared to Air-Liquid-Interface cultures containing hREC and hCHO.

Histological and immunohistochemical staining and Scanning Electron Microscopy pictures of hREC in differentiation cultures demonstrated basal cells covering the collagenous matrix. These cells formed a cellular multilayer, which is composed of a basal layer of undifferentiated basal cells and an upper layer of cells differentiating along the squamous metaplasia and ciliated cell lineage. Lineage development of cultured hREC was further documented by the induction of specific cytokeratins. Our results suggest that culture expanded hREC have the potential to colonize collagen coated biomaterials as well as autologous cartilage grafts and to regenerate epithelial cell types for trachea tissue engineering.

Keywords: Tissue Engineering, Tracheal replacement, Respiratory Epithelial Cells, Trachea, Co-Cultures, Cell Culture

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Tabellen

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23.11.2005