EINLEITUNG

1.1 Tissue Engineering

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Das Tissue Engineering beruht auf der Herstellung von bioartifiziellen Konstrukten oder Geweben, die aus vitalen Zellen bzw. einer Zellmatrix und biokompatiblen Trägermaterialien bestehen [1].

Das Prinzip des Tissue Engineerings beinhaltet zunächst die Entnahme einer kleinen Gewebeprobe, die nur geringe Mengen an Ausgangszellen liefert, die aus dem Gewebeverband herausgelöst und in vitro vermehrt werden. Diese Primärzellen können in geeignete Trägermaterialien eingebracht werden, indem sie durch Zugabe einer Gelkomponente im Trägermaterial immobilisiert werden [2]. Als Gelkomponenten kommen folgende Hydrogele in Frage: Agarose [3], Fibrin [4], Alginat [4], Hyaluronsäure [4] sowie Chitosan [5]. Für den Einsatz von Hydrogelen im Tissue Engineering ist in erster Linie die Resorptionszeit von großer Bedeutung. Eine zu schnelle Resorption führt dazu, dass Hydrogel, welches als temporäre Matrix und zur homogenen Verteilung der Zellen im Trägermaterial dient, seine Funktion nicht über einen ausreichend langen Zeitraum beibehält. Die Folge könnte eine inhomogene Verteilung der Zellen im Trägermaterial sein, da die Schwerkraft die Zellen in den unteren Teil des Trägermaterials zieht [1]. Zudem ist die klinische Zulassung des verwendeten Hydrogels im Hinblick auf eine spätere klinische Anwendung unerlässlich.

Eine Vielzahl von resorbierbaren und auch nichtresorbierbaren Biomaterialien bieten sich als Trägermaterialien an. Als Standard beim Herstellen von Knorpelgeweben mit Hilfe des Tissue Engineering gilt zur Zeit die Verwendung von resorbierbaren Polymeren wie z.B. Polyglycolic Acid (PGA) [6], Polylactid Acid (PLA) [7], einem Gemisch aus PGA und PLA in verschiedenen Anteilen [8], das Copolymer (PGLA) [9] sowie Poly(ε-caprolacton) (PCL) [10], wobei auch natürliche, resorbierbare Trägermaterialien wie z.B. das Kollagen [11] Verwendung finden.

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Mit der Methode des Tissue Engineering wurde im Laufe der letzten 18 Jahre versucht, eine Vielzahl von menschlichen Geweben zu rekonstruieren. Herausragende Resultate sind im Bereich des Hautersatzes sowie bei der Knochen- und Knorpelrekonstruktion erzielt worden, sodass in den genannten Arbeitsfeldern bereits die klinische Anwendung erfolgt. Die Herstellung von anderen Organen, z.B. die der Leber [12], der Niere [13], die schon allein durch ihren diffizilen Aufbau als eher schwierige Forschungsobjekte anzusehen sind, befindet sich noch in einer experimentellen Phase.

Die Anwendung des Tissue Engineering bei der Rekonstruktion des Trachealgewebes ist noch ein junges Forschungsfeld. Nach wie vor existieren verhältnismäßig wenige Studien, die Methoden des Tissue Engineering zur Herstellung eines Trachealersatzes in vitro oder in vivo anwenden. Die 1994 von Vacanti et al. vorgestellten Studien, in denen Konstrukte aus bovinen Chondrozyten und Trachealzellen mit einem mechanisch stabilisierenden Material aus PGA hergestellt, bzw. zirkumferente Trachealdefekte bei Ratten mit in vitro hergestellten Konstrukten geschlossen wurden, sind weiterhin wegweisend [14]. In einer anschließenden Studie wurden respiratorische Epithelzellen isoliert und in gezüchtete Knorpelzylinder gespritzt [15]. Untersuchungen an diesen Konstrukten ergaben reifes Knorpelgewebe sowie epitheliale Strukturen mit submukosalem Bindegewebe. Das Lumen wies vereinzelt verschiedene Stufen eines mehrreihigen hochprismatischen Epithels mit einigen Flimmerzellen auf, die nach 3 Wochen Kultur beobachtet werden konnten [15]. In einem weiterführenden Versuch dieser Arbeitsgruppe ist es gelungen, einen Trachealersatz bestehend aus Chondrozyten und Fibroblasten in Schafe zu transplantieren, die nach dem Eingriff zwei bis sieben Tage überlebten [16]. Eine Funktionalität der generierten Trachea hinsichtlich der Ausbildung von Kinozilien innerhalb des respiratorischen Epithels konnte nicht gezeigt werden.

Bücheler et al. untersuchten 2000 die Besiedelung von Kollagenvliesen mit humanen respiratorischen Epithelzellen. Durch das Auswachsen von Epithelzellen aus humanen Nasenschleimhautexplantaten konnte eine vollständige Epithelisierung nach fünf bis zehn Tagen beobachtet werden. Des Weiteren fanden sich aktive Zilien, die auch bis zum Versuchsende (acht Wochen) aktiv blieben. Jedoch gibt es keinen Anhaltspunkt dafür, dass funktionelle vitale Trachealprothesen mit ausreichender Stabilität für den klinischen Bereich hergestellt werden konnten [17].

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Die Studien von Vacanti und Sakata zeigten, dass in Tierversuchen die Trachealrekonstruktion über Tage hinweg funktionierte. Dagegen konnte im humanen Bereich bisher nicht gezeigt werden, dass eine Trachealröhre mit genügenden biomechanischen Eigenschaften und mit einem funktionellen respiratorischen Epithel ausgekleidet, hergestellt werden konnte. Es fehlt an ausreichender Charakterisierung der humanen respiratorischen Zellen während der Reepithelialisierung von Transplantaten. Bisher wurden nur wenige Untersuchungen zu möglichen Mechanismen der Differenzierung und Regeneration des respiratorischen Epithels im Zusammenhang mit dem Tissue Engineering durchgeführt. Die bereits durchgeführten Untersuchungen zu den Differenzierungsmechanismen des respiratorischen Epithels gehen von anderen Fragestellungen aus, wie die der Differenzierung in der Embryonalphase [18;19] und der Differenzierung der respiratorischen Epithelzellen aus Vorläuferzellen [20;21;22].

Untersuchungsergebnisse haben ergeben, dass humane tracheale Basalzellen die möglichen Vorläuferzellen des respiratorischen Gewebes sind [20]. Mit spezifischen Lectin-Markern [23;24] und mit Hilfe der Durchlusszytometrie [25] können Basalzellen von den differenzierten Zellen unterschieden werden. Zytokeratine spielen hierbei eine wichtige Rolle als Differenzierungsmarker und als Tumormarker. Weiterhin konnte die Charakterisierung der Zytokeratine mittels Immunhistochemie und der 2D-Gelelektrophorese [26;27] wichtige Aufschlüsse über die Entwicklung des humanen respiratorischen Epithels geben.

1.2 Aufbau der humanen Trachea

Unter dem Larynx setzt sich der Respirationstrakt als Luftröhre (Trachea) fort. Die Trachea ist eine 10-13cm lange, steife, schlauchartige Struktur mit einem Durchmesser von 2-3cm. Sie tritt in der Medianebene in den Thorax ein und teilt sich dort in die beiden Bronchi principales (Hauptbronchien), die die rechte bzw. linke Lunge mit Luft versorgen [28].

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Die elastische Trachealwand wird durch 15-20 hufeisenförmige Knorpelspangen aus hyalinem Knorpel stabilisiert, sodass sie nicht kollabieren oder überdehnt werden kann. Auf einem schmalen Streifen sind die Knorpelspangen offen. Der dorsale Spalt zwischen den einzelnen Knorpelenden wird durch ein stabiles, kollagenfaserhaltiges Band mit vielen elastischen Fasern und Bündeln glatter Muskulatur geschlossen, wodurch eine gewisse Verengung des Trachealvolumens möglich ist. Die einzelnen Knorpelspangen sind durch Bindegewebszüge (Ligamenta annularia), die ebenfalls reich an Kollagen und elastischen Fasern sind, miteinander verbunden (Abb. 1). Diese Konstruktion erlaubt Schwankungen in der Länge der Trachea von 2-3cm, wie sie durch die Anhebung des Kehlkopfes mitsamt des kranialen Trachealendes beim Schluckvorgang notwendig sind [29].

Abb. 1 : Konstruktiver Bau des Trachealrohrs [30]

Das Lumen der Trachea wird von einer Schleimhaut ausgekleidet, die aus einem hochprismatischen Epithel mit Becherzellen, Flimmerzellen und Basalzellen besteht. Die Zellen sind alle mit der gut ausgebildeten Basalmembran verbunden. Unterhalb der Basalmembran schließt sich die Lamina propria mit elastischen Fasern und darunter die Submukosa mit zahlreichen seromukösen Drüsen an [29].

1.3 Das humane respiratorische Epithel

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Das respiratorische Epithel der Trachea besitzt einen ähnlichen histologischen Aufbau wie das Epithel der Nasenschleimhaut [31]. Die zelluläre Zusammensetzung und die Funktionen der einzelnen Zellarten des mehrreihigen Flimmerepithels wurden weitestgehend geklärt. Das respiratorische Epithel der Trachea setzt sich aus Basalzellen, die durch Hemidesmosomen an die kollagenreiche Basalmembran geheftet sind (Abb .2A), den Zilienzellen (Transport von Partikeln und Schleim) und den Becherzellen (Schleimproduktion) zusammen (Abb .2B). Von den drei Zellarten des tracheobronchialen Epithels sind die Basalzellen und die sekretorischen Zellen in der Lage sich zu teilen, während die ziliären Zellen als terminal differenziert und teilungsinaktiv gelten [25]. Das die Trachea auskleidende mehrreihige Flimmerpithel ist dadurch gekennzeichnet, dass alle Zellen im Zellverband Kontakt zur Basalmembran besitzen, wobei Zilienzellen und Becherzellen nur eine minimale Kontaktfläche aufweisen [21] und mit Desmosomen an benachbarte Zellen binden können [32;33]. Es erreichen jedoch nicht alle Zellen die Oberfläche, wie die Basalzellen, die neben ihrer Rolle als Progenitorzellen auch die Verankerung des respiratorischen Epithels an die Basalmembran stabilisieren [20]. Basalzellen bilden eine Stammzellpopulation für die anderen Zellarten und besitzen eine eher runde Morphologie. Ihr Zellkern befindet sich in unmittelbarer Nähe zur Basalmembran [28].

Die Flimmerzellen stellen bis zu 60% der im respiratorischen Epithel enthaltenen Zellen [29]. Jede dieser Flimmerzellen trägt ca. 200-300 Zilien und interponierte Mikrovilli [34]. Die Kinozilien sind mit einem Basalkörperchen verankert und bestehen aus neun Mikrotubuluspaaren, die zwei eigenständige Mikrotubuli in der Mitte umgeben. Zusammen mit einigen weiteren Proteinen dienen die Mikrotubuli dazu, aus chemischer Energie durch Hydrolyse von ATP mechanische Energie zu gewinnen. Die Frequenz des Zilienschlags beträgt ca. 12-15 Schläge
pro Sekunde [29].

Becherzellen sind vereinzelt zwischen den Flimmerepithelzellen lokalisiert. Sie enthalten polysaccharidhaltige Schleimtröpfchen, die nach Absonderung einen zusammenhängenden Mukus Film über den Zilien bilden [34].

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Abb. 2 : Humanes respiratorisches Epithel; A Masson-Goldner Färbung; B HE- Färbung. (*) Basalmembran, (#) Basalzellen

Das respiratorische Epithel spielt eine wichtige Rolle bei der mukozilliären Clearence. Inhalierte Partikel werden in dem bis zu 10µm dicken Schleimfilm gebunden und von dem kehlkopfgerichteten Flimmerschlag der Zilien abtransportiert. Dabei erreicht der Mukus eine Fließgeschwindigkeit von bis zu 200µm pro Sekunde. Zusätzlich werden vom Gewebe antibakterielle und entzündungshemmende Substanzen freigesetzt, die zusammen als Schutzsystem fungieren [35].

1.4 Pathologie der Trachea und Ansätze zur Tracheal-rekonstruktion

Verschiedene Ursachen erfordern rekonstruktive Maßnahmen an der Trachea zur Erhaltung eines suffizienten Luftweges. Trachealdefekte können kongenitaler, traumatischer, entzündlicher oder tumoröser Natur sein. Dabei sind langstreckige Trachealdefekte mit einer Vielzahl von chirurgischen und postoperativen Problemen behaftet. Häufig treten im Rahmen dieser Eingriffe Infektionen und Schädigungen auf, die zu Stenosen führen können. Sie sind unter anderem auf die exzessive Bildung von Granulationsgewebe bei fehlender Epithelialisierung zurückzuführen [36;37].

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Die End-zu-End-Anastomose nach Resektion ist die Methode der Wahl und kann normalerweise erfolgreich bei 50% aller Defekte bis zu einer Länge von 8cm durchgeführt werden [38]. Bei allen weiteren Fällen, in denen die primäre Anastomose nur erschwert durchgeführt werden kann, z.B. nach langstreckigen Resektionen, Inhalationsverbrennungen, Traumata, Tumorresektionen oder Langzeitintubationen [39], bieten sich Trachealprothesen an. Auch hier können jedoch Stenosen und Infektionen auftreten [40].

An eine Trachealprothese werden folgende Anforderungen gestellt: Sie muss ein bewegliches, druckstabiles Rohr sein, das mit einem funktionellen respiratorischen Epithel ausgekleidet ist [41]. Dabei ist eine vollständige Epithelialisierung die Hauptvoraussetzung, um einen zuverlässigen Infektionsschutz, eine Barriere gegen einwachsendes Bindegewebe sowie die mukoziliäre Clearence zu gewährleisten.

In den letzten 50 Jahren wurden sowohl klinische als auch experimentelle Versuche zur Trachealrekonstruktion mit Prothesen, Autografts, Homografts und Allografts durchgeführt [15]. Prothesen aus Dracon-Polyurethan Netzen, PTFE (Polytretrafluoroethylen), Polypropylen Netze, Gummi, Silikon und sogar Glasröhrchen [42] wurden verwendet, wobei der Einsatz einiger dieser Materialien risikobehaftet ist und mit Komplikationen wie Infektionen, Extrusionen und Stenosen einhergeht [38]. Autologe und alloplastische Gewebe verschiedenen Ursprunges wie z.B. Faszie, Haut, Knochen, Periost, Knorpel, Perichondrium, tracheale Allografts, Muskel, Ösophagus, Pericardium und Dura Mater [38;43;44;45;46] wurden verwendet. Aber auch hier traten Stenosen als Komplikationen auf.

1.5 Conchae nasales (Nasenmuscheln)

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Die Nasenmuscheln befinden sich in den zwei Nasenhaupthöhlen, die ventral durch ein knorpeliges, und dorsal durch ein knöchernes Septum unterteilt sind. Je drei Nasenmuscheln liegen übereinander angeordnet vor und unterteilen die Nasenhöhlen in je drei Nasengänge; einen oberen, mittleren und unteren Nasengang [29]. Die oberste und kleinste Nasenmuschel wird als Concha nasalis suprema, die mittlere als Concha nasalis media und die größte untere Nasenmuschel als Concha nasalis inferior bezeichnet (Abb .3).

Abb. 3: Nasenhöhle im Sagitalschnitt [47]

Die Unterteilung der Nasenmuscheln dient zur Bildung eines laminaren Luftstroms, was zu einer Verringerung des Luftwiderstandes beim Atmen führt [29]. Die Nasenmuscheln bestehen aus einem schwellungsfähigen Gewebe, auf dem sich durch die Basalmembran vom Bindegewebe getrennt, das respiratorische Epithel befindet. Das respiratorische Epithel besteht aus dem charakteristischen mehrreihigen Zylinderepithel mit Flimmerbesatz, in das vereinzelte schleimproduzierende Becherzellen eingestreut sind [30]. Diese Form des Epithels kommt mit kleineren Abweichungen nahezu in den gesamten oberen Atemwegen und in Teilen der unteren Atemwege vor und wird daher respiratorisches Epithel genannt [29].

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Eine Aufgabe der Conchae nasalis besteht in einer Vergrößerung der Oberfläche der Nasenhaupthöhle, wodurch eine effizientere Aufbereitung der Atemluft durch Reinigung, Befeuchtung und Erwärmung gegeben ist. Liegt eine übermäßige Vergrößerung der Nasenmuscheln (Muschelhyperplasie) vor, so kann eine Operation zur Verkleinerung der Nasenmuscheln (Konchotomie) durchgeführt werden. Diese Operation trägt zur Verbesserung der Nasenatmung bei [48].

1.6 Zellkultursysteme für respiratorische Zellen

Ein grundlegender Prozess in der regulären Funktion des respiratorischen Epithels ist neben der Proliferation die Sekretion von Schleim. Eine gesteigerte Schleimproduktion spielt bei der Pathogenese von vielen Erkrankungen der unteren Atemwege, wie z.B. Asthma [49] ebenfalls eine wichtige Rolle. Diese essenziellen Prozesse wurden in vielen verschiedenen in vitro und in vivo Ansätzen untersucht. Diese Untersuchungen beschränkten sich jedoch größtenteils auf Monolayer-Zellkultursysteme [50]. Monolayer-Zellkultursysteme sind durch den Mangel an komplexen Zell-Zell Verbindungen und Zell-Matrix Interaktionen nur limitiert einsetzbar. Die extrazelluläre Matrix beeinflusst die Zellmorphologie und Funktion durch indirekte physikalische Kommunikation. Des Weiteren sind die Zellen in vivo mechanischen, elektrischen, strukturellen und chemischen Signalen ausgesetzt [51]. Daher wurden auch biphasische Organkulturen [52;53] und Explantkulturen [17;54] für Analysen von Interaktionen verschiedener Zelltypen untereinander sowie Proliferations- und Differenzierungsstudien verwendet.

Die Etablierung von organähnlichen Zellkulturen durch die Einführung der Air-Liquid-Interface Technik [55;56] ermöglicht seit einiger Zeit reproduzierbare Untersuchungen zur Differenzierung und Regeneration von respiratorischem Epithel. Die Mehrheit der Autoren verwendete das System bisher für Untersuchungen am Bronchialepithel und zur Studie der Pathogenese von chronischen Atemwegserkrankungen sowie deren Therapie [57;58;59].

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Eine Transduktion der Kulturen ist ebenso möglich, wie z.B. die Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Produkten sowie Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus pharmakologischer Substanzen [60].

1.7 Genexpressionsmarker für respiratorische Epithelzellen

Neben der Kultivierung des respiratorischen Epithels in vitro wurden Genexpressionsanalysen von relevanten Proteinen durchgeführt, die die Zellen produzieren oder auch sezernieren können. So wurde die Genexpression von Muzinen in verschiedenen sekretorischen Zellen (Becherzellen, submuköse Drüsen etc.) bei asthmatischen Erkrankungen untersucht, wobei eine erhöhte Anzahl der sekretbildenden Zellen und damit einhergehend eine Änderung an gespeicherten und sezernierten Mucinen festgestellt wurde [49].

Der Nachweis von verschiedenen Zelltypen innerhalb der Epithelien wurde durch Glykohistochemie erbracht. Dabei wurden Lektine als spezifische Marker für die Lokalisation und Charakterisierung der Glykanprofile von Zellen und Geweben eingesetzt [24]. Seit längerem ist auch die Funktion von Zytokeratinen aus dem Zytoskelett als Zell- und Gewebemarker beschrieben [61].

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Die Zytokeratin-Multigen-Familie besteht aus 20 verwandten Polypeptiden (CK1-20), die sich in 2 Subklassen untergliedern. Zytokeratine des Typ-I (CK9-20) und Typ-II (CK1-8) werden in verschiedenen Kombinationen, abhängig vom Epitheltyp und dem Differentiationsgrad, exprimiert [27;62]. Jeder respiratorische Epitheltyp zeigt charakteristische, differenzierungsabhängige Kombinationen von zwei oder mehreren Zytokeratinen, wobei Zytokeratine des Typ-I und des Typ-II in stöchiometrischen Mengen (also als Paare) vorkommen und eine Spezialisierung oder pathologische Veränderung widerspiegeln [26;63].

Die Zytokeratine können somit zur Charakterisierung von verschiedenen Zellarten innerhalb des Epithels verwendet werden. Die Zytokeratine CK5 und CK14 werden zur immunhistochemischen Identifizierung und Quantifizierung von Basal- und Parabasalzellen verwendet [64] [65]. Dagegen fungiert CK18 als Marker bei der Reifung des Epithels in der embryonalen Phase und CK13 ist ein Marker für Plattenepithelien [65;66;67].

1.8 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Eine der wichtigsten Instrumente zur Untersuchung der Genexpression ist die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction; PCR). Mittels dieses molekulargenetischen Verfahrens ist es möglich, selektiv bestimmte DNA-Abschnitte (Desoxyribonukleinsäure-Abschnitte) zu amplifizieren. Die Neusynthese von DNA-Sequenzen, die von zwei kurzen synthetischen Oligonukleotiden (Primer) eingerahmt werden, erfolgt mittels DNA-Polymerasen durch eine exponentielle Anreicherung. Ausgehend von geringen DNA Mengen können nach mehrmaliger Wiederholung des Vorgangs (20-40 Zyklen) die DNA-Abschnitte nachweisbar gemacht oder für andere gentechnische Zwecke benutzt werden.

1.8.1 Grundlagen der PCR

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Die PCR gliedert sich in drei Hauptschritte, die hier beschrieben werden sollen: Im ersten Schritt wird bei ca. 90°C die als Doppelstrang vorliegende DNA denaturiert. Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren aufgebrochen und die DNA liegt somit einzelsträngig vor. Im zweiten Schritt erfolgt das so genannte Primer Annealing. Bei Temperaturen zwischen 55°C und 72°C lagern sich die Oligonukleotide spezifisch an die komplementären Sequenzen der DNA-Einzelstränge an. Die thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) verlängert in einem dritten Schritt, der Elongation genannt wird, bei ca. 72°C das
3’ terminale Ende des Oligonukleotidess und synthetisiert einen neuen, zum Template (DNA Abschnitt, der zur Vorlage dient) komplementären Strang aus Desoxyribonukleotiden [68]. Die genannten Temperaturbereiche sind jedoch von vielen Faktoren abhängig (z.B. Länge der Primer, GC Gehalt). Daher muss für jeden PCR Lauf die optimalen Bedingungen gefunden und in einem PCR-Programm am Gerät eingestellt werden (Abb. 4).

Die Polymerasen gehören zur Gruppe der Transferasen, die mit einzelsträngiger DNA als Matrize die dazu komplementäre DNA synthetisieren, indem sie Desoxyribonukleotidtriphosphate (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) unter Pyrophosphatabspaltung an die wachsende Kette anlagern. Sie sind auch an der Reparatur von DNA (z.B. UV-Schäden) beteiligt. Die Taq-Polymerase wird aus dem Bakterium Thermophilus Aquaticus isoliert. Von diesem Namen leitet sich die Bezeichnung "Taq"-Polymerase ab. Thermophilus Aquaticus bewohnt heiße Quellen und viele seiner Enzyme wie die DNA-Polymerase weisen eine hohe Toleranz gegenüber starker Hitze auf [69].

Die amplifizierten Produkte werden anschließend über eine gelelektrophoretische Auftrennung hinsichtlich ihrer Größe charakterisiert. Dazu werden in Abhängigkeit von der zu erwartenden Größe der DNA-Amplifikate 1-2%ige Agarose-Gele verwendet. Nach der Auftrennung erfolgt die Einfärbung des Gels mit einem fluoreszierenden Farbstoff (z.B. Ethidiumbromid), der spezifisch an DNA bindet. Die DNA wird dann unter UV-Licht sichtbar. Zur Größenbestimmung der PCR-Produkte werden geeignete DNA-Molekulargewichtsmarker im gleichen Gel mit aufgetrennt [68].

1.8.2 Genexpressionsanalysen auf RNA Ebene

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Zum Nachweis von mRNA-Abschnitten muss die mRNA (Boten-Ribonukleinsäure) mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in eine DNA transkribiert werden. Die mRNA dient dabei der reversen Transkriptase (RT) als Vorlage zur Erzeugung einzelsträngiger cDNA (copy-DNA). Zum gezielten Umschreiben der mRNA wird ein Oligo-(dT)-Primer verwendet, der komplementär zu dem 3’PolyA-Ende der mRNA ist und als Startsequenz fungiert. Die erhaltene cDNA kann für Genexpressionsanalysen mittels PCR eingesetzt werden. Die mRNA ist Bestandteil der Gesamt-RNA. Ihr Anteil beträgt nur 5%, wobei der Anteil an tRNA (Transport-RNA) 15% und rRNA (ribosomale RNA) 80% an der Gesamt-RNA beträgt [70].

1.8.3 Quantitative und semiquantitative real-time RT-PCR

Bei vielen Fragestellungen ist eine Quantifizierung der DNA notwendig. Die Quantifizierung mittels der normalen PCR ist aber nur möglich, solange die PCR- Reaktion sich im linearen Bereich der Amplifikationseffizienz befindet. Dies ist bei jeder PCR-Reaktion verschieden und kann nur sehr schwer überprüft werden, z.B. indem nach jedem PCR-Zyklus ein Aliquot aus der Reaktion entfernt und auf ein Gel aufgetragen wird. Diese Überprüfung entfällt, wenn die gebildete DNA-Menge während des PCR-Laufs im Reaktionsgefäß gemessen werden könnte [71]. Dies ist mit Hilfe der real-time RT-PCR möglich. Die real-time RT-PCR ermöglicht es im Gegensatz zur Standard PCR, die eine Endpunktbestimmung darstellt, die PCR Reaktion zu allen Zeitpunkten zu verfolgen.

Abb. 4: Programmschema eines PCR Laufs (i-Cykler, BioRad)

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Das zugrunde liegende Prinzip ist die kontinuierliche Messung eines Fluoreszenzsignals, das während der PCR proportional mit der Menge des Amplifikationsprodukts ansteigt.

Abb. 5: Beispiel für aufgenommene real-time PCR Daten

Im weiteren Verlauf sollen zwei Prinzipien der quantitativen real-time RT-PCR erklärt werden: das TaqMan™-Prinzip und der Einsatz von SYBR-Green I.

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Zusätzlich zu den beiden Primern, die in jeder PCR vorhanden sind, kann eine Gensonde zugesetzt werden, die spezifisch an eine Gensequenz zwischen den beiden Primern bindet und mit einem Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher (Verstärker) markiert ist (TaqMan™-Prinzip) [72]. Sind diese beiden Moleküle an das Oligonukleotid gebunden, erhält man keine Fluoreszenz, da diese durch das ”Quenching-Molekül” abgefangen wird. Zum Zeitpunkt des PCR-Primer Annealings bindet auch die TaqMan™ Probe an die Ziel-DNA. Die Polymerase synthetisiert nun den zweiten Strang und kommt zur gebundenen TaqMan™ Probe. Da die Polymerase eine 5’ Exonukleaseaktivität besitzt, löst sie die TaqMan™ Probe nicht von der Ziel-DNA ab, sondern baut die Probe ab. Das ”Quenching-Molekül” wird vom Fluoreszenzfarbstoff getrennt, dieser emittiert somit Fluoreszenz definierter Wellenlänge, deren Intensität in der Summe direkt proportional der Zahl der neu gebildeten DNA-Stränge ist (Quantifizierung). Der Zeitpunkt der Messung im Zyklus ist nicht kritisch, da eine einmal abgebaute TaqMan™ Probe permanent fluoresziert. Innerhalb der PCR-Kurve kann dann ein geeigneter Punkt für die Quantifizierung gewählt werden. Die TaqMan™ Sonden reagieren jedoch relativ sensibel auf einzelne Fehlbasen. Das ist bei der Analyse von beispielsweise virologischen Proben von Bedeutung, bei denen eine solche genetische Varianz zu erwarten ist nämlich das Fehlen des Signals trotz erfolgreicher Amplifikation. Somit kann die Sensitivität der Methode auch ein Nachteil sein [73]. Neben dem
TaqMan™ -System sind noch andere Sondensysteme kommerziell erhältlich.

Eine weitere Möglichkeit für die Quantifizierung besteht in der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die an die DNA binden können, wie zum Beispiel der Fluoreszenzfarbstoff SYBR-Green I. Dieser Fluorophor hat die Eigenschaft, unspezifisch in die Doppelstrang-DNA zu interkalieren (Abb .6). Dies führt mit fortschreitender PCR-Reaktion zu einem Anstieg des Fluoreszenzsignals (Abb .5) [72].

Abb. 6 : Schematische Darstellung eines PCR Zyklus bei Verwendung von SYBR Green. A Denaturierung; B Annealing; C Elongation; D PCR Produkt [73] (modifiziert)

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Bei der Verwendung von SYBR-Green I fehlt allerdings die Spezifität hinsichtlich des zu untersuchenden Templates, da auch Primer-Dimere oder Nebenprodukte, die sich während der Reaktion bilden, einen Fluoreszenzanstieg verursachen. Dieser ist zunächst nicht von dem Signal des spezifischen Produkts zu unterscheiden. Eine Differenzierung zwischen spezifischem Produkt und Primer-Dimeren oder Nebenprodukten kann erst nach Abschluss der PCR-Reaktion mittels einer Schmelzkurvenanalyse erfolgen (Abb. 7). Bei dieser werden die PCR-Produkte kontinuierlich über einen bestimmten Temperaturbereich aufgeheizt, bis sie ihrem Schmelzpunkt entsprechend nur noch als Einzelstrang vorliegen. Die damit verbundene Fluoreszenzabnahme wird aufgezeichnet. Kleinere Fragmente wie z.B. Primer-Dimere weisen einen niedrigeren Schmelzpunkt auf als die spezifischen PCR-Produkte [72].

Abb. 7 : Darstellung einer Schmelzkurvenanalyse; A ein Produkt; B zwei Produkte

Als Referenzmaterial für die Bestimmung der absoluten Menge der Genkopien können Plasmide dienen, die ein spezifisches Fragment der gesuchten Gensequenz enthalten, das durch die jeweiligen Primer und Sonden nachgewiesen werden kann. Plasmide können im Gegensatz zu genomischer DNA einfach in reiner Form dargestellt und danach mittels UV-Spektroskopie quantifiziert werden.

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Eine semiquantitative Analyse der Genexpression reicht dann aus, wenn eine Genregulation nachgewiesen werden soll und absolute Werte nicht im primären Interesse liegen. Dabei wird die gesuchte DNA-Menge zu der konstanten DNA-Menge, die durch ein nicht reguliertes Haushaltsgen exprimiert wird, ins Verhältnis gesetzt. Hierbei ist jedoch darauf zu achten, dass die Effektivität der jeweiligen Primer annähernd gleich ist.

Ein weiterer großer Vorteil der real-time PCR-Methode ist, dass die Reaktionsgefäße nach der PCR-Reaktion nicht mehr geöffnet werden müssen, da die Messung und Quantifizierung nach Beendigung der PCR-Reaktion abgeschlossen ist. Es entfällt somit die teilweise aufwendige Gelauftrennung der PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese, weiterhin ist grundlegend, dass das Risiko einer Kontamination durch wiederholtes Öffnen der Reaktionsgefäße entfällt [74].

1.9 Durchflußzytometrie

Das Prinzip der Durchflußzytometrie beruht auf einer Messung von physikalischen Eigenschaften der Zellen. Die Zellen passieren einen Laserstrahl und einzelne Detektoren messen anschließend die Lichtstreuung und das Fluoreszenzlicht. Man unterscheidet dabei die Messung der Streuung in Vorwärtsrichtung (Aufwärtsstreulicht) und Streuung im rechten Winkel zum einfallenden Lichtstrahl (Orthogonalstreulicht). Die Lichtstreuung einer Zelle ist abhängig von ihrer Größe und der Oberflächen- und Zytoplasmabeschaffenheit. Dabei gibt das Vorwärtsstreulicht (Forward-Scatter; FSC) Auskunft über die Größe einer Zelle, während das Orthogonalstreulicht (Side-Scatter; SSC) etwas über die Granularität der Zelle aussagt [75].

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Zur Untersuchung verschiedener Zellpopulationen können Zellen mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen bestimmte Oberflächenantigene gerichtet sind, markiert werden. Durch Fluoreszenzfarbstoffe, die an die Antikörper gekoppelt sind, werden diese durch Anregung der Fluoreszenz sichtbar gemacht. Die Durchflusszytometrie ermöglicht neben der Analyse auch die Separation von Zellfraktionen mittels Fluoreszenzfarbstoffen (FACS Fluorescence Activated Cell Sorting) [76].

Aus den zahlreichen in der Literatur beschriebenen Fluoreszenzfarbstoffen haben sich für die Antikörpermarkierung im Routineeinsatz bei den heute in der Klinik üblichen Argonlasergeräten folgende bewährt:

1.9.1 Polyklonale Antikörper

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Immunisiert man ein Tier oder infiziert sich der Mensch mit einer körperfremden Substanz (ausreichender Molekülgröße), so wird vom Immunsystem eine Antikörperantwort in Gang gesetzt. Da ein Antigen meist viele Epitope, sprich antigene Determinanten besitzt, werden unterschiedliche Antikörper gebildet (polyklonale Immunantwort), wobei die Antikörper von jeweils anderen
B-Lymphozyten gebildet werden. Wiederholte Impfungen des Tieres führen zu einer schnelleren Antikörperproduktion und einer höheren Konzentration (Titer). Das Serum dieses Tieres enthält bei einer wiederholten Immunisierung Antikörper verschiedenster Epitopspezifität, welche unterschiedlichen Immunglobulin-Subklassen angehört. Polyklonale Antikörper haben agglutinierende Eigenschaften im Gegensatz zu monoklonalen. Sie enthalten oft unbekannte und unerwünschte Spezifitäten, da das Serum auch Antikörper gegen nicht bekannte Antigene enthält (z.B. Infektionserreger). Abhilfe schaffen hier die Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie oder eine Präabsorption, die unerwünschte Kreuzreaktionen (z.B. Immunglobuline verschiedener Spezies) eliminiert [78].

1.9.2 Monoklonare Antikörper

Isoliert man solche nur begrenzt kultivierbaren antikörperproduzierenden B-Lymphozyten z.B. aus der Milz einer immunisierten Maus und fusioniert diese mit leicht in Kultur wachsenden Tumorzellen, so entstehen einerseits Hybridomazellen, welche unsterblich sind und andererseits solche, die den gewünschten Antikörper produzieren. Erst durch wiederholte Vereinzelung per Verdünnung (limiting dilution) oder „cell sorting“ (FACS = fluorescence activated cell sorting) entstehen Kulturen, die aus einer Zelle hervorgegangen sind (Klone). Liegt die gewünschte Spezifität vor, so werden diese Klone in Massenkulturen überführt, deren Überstände geerntet und teilweise auch gereinigt [78].

1.10 Aufgabenstellung und Ziel der Arbeit

Aufgabe der vorliegenden Arbeit war:

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  1. Die Isolierung und Kultivierung von humanen respiratorischen Epithelzellen
  2. Die Charakterisierung der humanen respiratorischen Epithelzellen unter proliferativen und differenzierenden Bedingungen
  3. Die Separation von möglichen Vorläuferzellen aus dem humanen respiratorischen Epithel
  4. Die Entwicklung von Co-Kulturen aus humanem Knorpel bzw. Knorpelzellen und respiratorischen Epithelzellen in vitro

mit dem Ziel, grundlegende Kenntnisse über die humanen respiratorischen Epithelzellen in Hinblick auf eine neue Möglichkeit zur Herstellung eines bioartifiziellen Trachealersatzes zu erhalten.


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23.11.2005