ERGEBNISSE

4.1 Kultivierung von humanen respiratorischen Epithelzellen

↓46

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Isolation und Vermehrung von humanen respiratorischen Epithelzellen (hREC) in der Arbeitsgruppe etabliert. Das respiratorische Epithel der Nasenmuschel konnte durch den enzymatischen Verdau gezielt von der darunter liegenden Basalmembran abgelöst werden. Die Basalmembran blieb dabei intakt auf der Submukosa zurück (Abb .9).

Abb. 9 : Gewebeschnitt einer Nasenmuschel; A vor dem Verdau; B nach dem Verdau; Hämatoxylin Färbung; 400fach vergrößert

↓47

Die humanen respiratorischen Epithelzellen lagen nach dem Verdau jedoch nicht ausschließlich einzeln vor. Vielmehr enthielt die Zellsuspension noch einige Zellaggregate, die nicht vollständig enzymatisch verdaut worden sind und aufgrund der Porengröße der verwendeten Filter nicht herausgefiltert werden konnten.

Die Zilienzellen zeigten auch nach dem Verdau noch teilweise Aktivität, die sich am Phasenkontrastmikroskop als rotierende Zellen mit Zilienschlag darstellte. Dagegen waren die Becherzellen von den Basalzellen im Phasenkontrastmikroskop nicht zu unterscheiden (keine Abbildung).

Die Zellvermehrung erfolgte in Kollagen A beschichteten Zellkulturflaschen. Bereits nach ca. 8h Stunden zeigten die hREC ein typisches Adhäsions- und Proliferationsverhalten (Abb. 10A). Die Adhäsion der Zellen war nach ca. 20h abgeschlossen (Abb. 10B). Die Zellen wiesen eine kleine runde Form auf und wuchsen zunächst in Inseln (Abb. 10C). Während der Proliferation kam es zu einer eher gleichmäßigen Ausbreitung der Zellen auf der Kulturoberfläche (Abb. 10D). Da nach ca. 20h die Adhäsion an der Kulturoberfläche beendet war, konnte somit ein erster Mediumwechsel nach 24h durchgeführt werden, ohne einen Verlust von hREC befürchten zu müssen. Nur die nicht-adhärenten Zellen, Zelldebris und Erythrozyten wurden bei dem Mediumwechsel entfernt.

↓48

Abb. 10 : Proliferationsverhalten der primären humanen respiratorischen Epithelzellen; A 8h; B 20h; C 1 Tag; D 4 Tage in Kultur

Im Gegensatz zu Chondrozyten wurden die hREC bereits beim Erreichen einer 70%igen Konfluenz passagiert (Abb. 10D). Zu diesem Zeitpunkt war noch ein Ablösen der Zellen vom Kulturflaschenboden mit Trypsin/EDTA und damit eine Vermehrung der Zellen durch weitere Passagen möglich. In diesem Stadium hatten die hREC noch keinen ausgeprägten Zell-Zellkontakt und wuchsen als einschichtige Monolayer Kultur. Bei 100%iger Konfluenz der hREC kam es nicht zu einer Kontaktinhibition und die Zellen begannen mehrschichtige Multilayer zu bilden, was ein Trypsinieren und nachfolgendes Vereinzeln der Zellen erschwerte. Durch wiederholtes Passagieren der hREC nach 70%iger Konfluenz zeigte sich, dass die Zellen nur begrenzt kultivierbar sind.

Abb. 11 : Morphologie der humanen respiratorischen Epithelzellen, 5 Tage in Kultur; A P0; B P1; C P2; D P3

↓49

Neben einer morphologischen Veränderung, wie die Zunahme der Zellgröße über mehrere Passagen, nahm die Vitalität der Zellen über die Passagen ab, sodass die Kultivierung nach der fünften Passage abgebrochen wurde (Abb. 11 A-D).

4.2 Durchflusszytometrie

Die Methode der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) wurde im Rahmen dieser Arbeit für humane respiratorische Epithelzellen etabliert.

Frisch isolierte humane respiratorische Epithelzellen wurden zunächst mittels der FACS Analyse auf ihren Gehalt an Basalzellen, die als teilungs- und differenzierungsfähig gelten, untersucht. Im ersten Schritt erfolgte die Auswahl der zu untersuchenden Zellpopulation in einer Propidiumiodid gefärbten Zellsuspension in einem Dot-Plot-Diagramm. Ein grundlegendes Problem besteht darin, dass avitale Zellen Antikörper durch die gestörte Membranschranke in ihr Zytoplasma aufnehmen. Ein Lösungsansatz schafft die Gegenfärbung der avitalen Zellen mit PI (Propidiumiodid). Durch den Zusatz von PI zu der Zellsuspension wurden avitale Zellen markiert und konnten deshalb neben den vitalen Zellen dargestellt werden, da dieser Farbstoff durch die beschädigte Plasmamembran nekrotischer Zellen diffundiert und sich in die DNA einlagert. Die untersuchte Zellsuspension bestanden aus einer kleinzelligen und einer großzelligen Population, wobei der FSC-Kanal des Density Plots die relative Größe der Zellen darstellt (Abb. 12A). Um Debris von der Analyse auszugrenzen, wurde die großzellige Population durch Setzten des Gates R1 eingegrenzt. Nur Zellen aus diesem abgegrenzten Bereich wurden zur weiteren Auswertung verwendet. Mit Hilfe der Quadrantenstatistik konnte die Vitalität der Zellen im Gate R1 errechnet werden, sie lag bei 78%.

↓50

Die vitalen Zellen wurden durch ein weiteres Gate (Gate R2) eingegrenzt und der Dot-Plot durch das Setzen eines Fadenkreuzes in 4 Quadranten zur Unterscheidung positiver und negativer Antikörperbindungen unterteilt. Die vitalen Zellen der PI gefärbten Zellsuspension lagen in dem Quadranten, der hinsichtlich beider Bindungsmerkmale negativ war (Abb. 12B, Quadrant links unten). Die toten Zellen des Gates R1 lagen im PI positiven Quadranten (Abb. 12B, Quadrant links oben). Mit diesem Dot-Plot wurden anschließend die mit den Antikörpern CD104 (Abb. 12C) und CD49f (Abb. 12D) gefärbten Zellen ausgewertet.

Abb. 12 : FACS Analyse primärer hREC. A Gesamtpopulation mit Gate R1, B mit PI gefärbte Zellen aus Gate R1, vitale Zellen (78%) im Gate R2, C Färbung der vitalen Zellen mit CD104-PE, D Färbung der vitalen Zellen mit CD49f-PE

Insgesamt 9% der mit CD49f-PE markierten Zellen zeigten im Dot-Plot eine vitale gefärbte Zellpopulation im rechten unteren Quadranten. Hingegen wurden 67% der Zellen nicht von dem Antikörper markiert. Weitere 2% der Zellen wurden nicht nur von dem Antikörper gebunden, sondern auch PI markiert. 20% der Zellen wurden PI markiert und haben nicht an den Antikörper gebunden. Der CD104-PE Antikörper zeigte ein ähnliches Bild wie der CD49f-PE. Auch hier konnten in allen 4 Quadranten Zellen detektiert werden: 9% vitale gefärbte und 68% vitale ungefärbte Zellen sowie 20% avitale ungefärbte Zellen und 2% tote gefärbte Zellen (Abb. 12 C-D).

↓51

Für die Isotypenkontrolle wurde der blutzellenspezifische Antikörper CD3-PE ausgewählt, der nicht auf respiratorischen Epithelzellen exprimiert wird. Wie erwartet, färbten sich nur vereinzelt Zellen an (<0,8%; Daten nicht abgebildet).

In einer weiteren Analyse wurden primäre hREC unter Verwendung des AK CD104 mittels FACS (Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung) sortiert. Dafür wurde zunächst eine DAPI/PI (4',6-Diamidino-2-phenylindol/Propidiumiodid) gefärbte Zellsuspension analysiert und um die vitalen Zellen das Gate P1 gelegt (Abb. 13A). Als nächstes wurden die mit dem AK CD104 markierten Zellen untersucht. Um die vitalen CD104 markierten Zellen wurde das Gate P2 gelegt und die Zellen innerhalb des Gates in ein Eppendorf Reaktionsgefäß überführt. Die ungefärbten vitalen Zellen wurden durch das Gate P3 eingegrenzt und diese Zellen in ein weiteres Reaktionsgefäß überführt (Abb. 13B).

Abb. 13 : FACS von primären hREC. A Setzen des Gates P1 um vitale Zellen der PI/DAPI gefärbten Zellpopulation (P1), B vitale CD104-PE positiv markierte Zellen im Gate P2 und unmarkierte Zellen im Gate P3

↓52

Die so gewonnenen Zellen wurden in Zellkulturflaschen ausgesät und im Inkubator mit AECG-Medium kultiviert. Die Zellen adhärierten nur sehr vereinzelt an der Kulturoberfläche und proliferierten nicht (Abbildungen nicht gezeigt). Eine Kultivierung dieser Zellen gelang somit nicht.

4.3 Differenzierung und Charakterisierung von humanen respiratorischen Epithelzellen in Zellkulturflaschen

Voraussetzung für eine Zilienbildung ist die Differenzierung der Epithelzelle. Als Nachweis wurden zunächst einfache Differenzierungskulturen in Zellkulturflaschen ohne spezielle Differenzierungsfaktoren angesetzt. Wie bereit beschrieben, bildeten die hREC nach Erreichen einer 70%igen Konfluenz eine für die Epithelzellen typische kopfsteinpflasterartige Morphologie und hatten Zell-Zellkontakt. Die Zellen wuchsen nach 100%iger Konfluenz mit zunehmender Kulturdauer in mehreren netzartigen Schichten als Multilayer übereinander. In diesem Stadium lag die Vermutung nahe, dass die hREC zu differenzieren begannen.

Für die Differenzierungskulturen wurden Zellen aus erster Passage (P1) in die mit Kollagen A beschichteten Zelllkulturflaschen ausgesät und bis zur 100%igen Konfluenz kultiviert (Abb. 14A). Dieser Zeitpunkt wurde als Tag 0 definiert.

↓53

Der Zellrasen wurde ab Tag 4 dichter, die Größe der einzelnen Zelle nahm zu (Abb. 14B/C) und ab Tag 12 bildete sich ein Multilayer aus (Abb. 14D). Da die obere Zellschicht netzartig auf der unteren wuchs, war eine histologische und immunhistochemische Beurteilung bis hin zur unteren Zellschicht möglich.

Abb. 14 : Differenzierungskulturen in Zellkulturflaschen; A 100%ige Konfluenz (Tag 0); B Tag 4 nach Konfluenz; C Tag 8 nach Konfluenz; D Tag 12 nach Konfluenz

4.3.1 Histologie

Die Hämatoxilin/Eosin- und Masson-Goldner-Färbung dienten als Übersichtsfärbungen am nativen Nasenmuschelgewebe. Insbesondere konnten mit der Masson-Goldner-Trichromfärbung die Basalmembran und das respiratorische Epithelgewebe mit dem Ziliensaum prägnant dargestellt werden (Abb. 2A). Auch zeigten die Hämatoxilin/Eosin Färbungen, dass das respiratorische Epithel der Nasenmuscheln bei der OP und auch durch den enzymatischen Verdau weitgehend unversehrt blieb (Abb. 2B und Abb. 9).

↓54

Für die Darstellung der Becherzellen sowohl im nativen Nasenmuschelgewebe als auch in den Differenzierungskulturen (100% Konfluenz) wurde die Alcian-Blau-Färbung gewählt. Mit dieser wurden die sauren Polysaccharide innerhalb der Becherzellen nachgewiesen (Abb. 15A). Der Mucus färbte sich leuchtend blau und die Zellkerne durch die Gegenfärbung mit Kernechtrot-Aluminiumsulfat hellrot an. Der Hintergrund erschien hellrosa.

Der Nachweis der sauren Polysaccharide in der Differenzierungskultur konnte nur in der Primärkultur und vereinzelt in Passage 1 erbracht werden. In höheren Passagen nahm die Anzahl der mit Mucus-Substanzen gefüllten Becherzellen stetig ab (Abb. 15B-15D) Ab Passage 2 war keine Blaufärbung mehr zu verzeichnen (Abb. 15D).

Abb. 15 : Alcian-Blau Färbung des respiratorischen Epithels von humanen Nasenmuscheln; A Becherzellen mit Zilien; B Differenzierungskultur P0; C Differenzierungskultur P1; D Differenzierungskultur P2

4.3.2 3.3.2. Immunhistochemie

↓55

Für eine weitere Charakterisierung der Differenzierungskulturen aus humanen respiratorischen Epithelzellen wurden folgende vier monoklonale Antikörper eingesetzt: Bei dem Basalzellmarker CD44v6 handelt es sich um ein Cytokeratin, das ein Oberflächenantigen der Basalzelle erkennt. Der ebenfalls als Basdalzellmarker beschriebene 34ßE12 ist ein intrazellulärer Marker, es handelt sich ebenfalls um ein Cytokeratin.

Die Antikörper CD49f und CD104 reagieren mit speziellen Integrinen (Hemidesmosomen), die auf Basalzellen exprimiert werden und zwar an der Kontaktfläche zwischen Basalmembran und Basalzelle. Die Aufgabe dieser Integrine ist es, eine Verbindung der Proteine aus der Basalmembran mit dem Keratinfilamentnetzwerk der Basalzellen herzustellen [82]. Der CD49f Antikörper bindet an das α6-Integrin, das mit dem von CD104 Antikörper gebundenen β4-Integrin den α6-β4-Komplex bildet.

Alle Antikörper wurden zunächst am nativen Nasenmuschelgewebe getestet. Dieses Gewebe diente als positive Gewebekontrolle, um die Anwesenheit des gesuchten Antigens zu überwachen.

↓56

Der als Basalzellmarker beschriebene 34ßE12 Antikörper färbte neben den Basalzellen auch die intraepithelialen Becherzellen und die Drüsenzellen im subepithelialen Gewebe rötlich bis braun an (Abb. 16A/B). Daraus kann gefolgert werden, dass der AK 34ßE12 keine spezifische Bindung für das Basalzell-Antigen hat, weil er auch andere Antigene bindet. Die parallel gefärbte Kontrolle (Maus IgG1) war negativ (Abb. 16C/D).

Abb. 16 : Immunhistochemische Färbung des humanen respiratorischen Epithels von Nasenmuscheln mit dem 34βE12 AK; A Übersicht; B Basalzellen (→), Becherzellen (BZ); C und D Negativkontrolle

Der Basalzellmarker 34ßE12 färbte alle Zellen der in vitro Primärzellkultur sowie alle Zellen der Passagen 1-3 gleichmäßig rötlich braun an (Abb. 17A-D). Eine Unterscheidung der Basal- und Becherzellen war mit diesem AK nicht möglich, d.h. sowohl Basalzellen als auch Becherzellen konnten in der Kultur vorhanden gewesen sein. Die parallel gefärbte Kontrolle (Maus IgG1) war negativ (nicht abgebildet).

↓57

Abb. 17 : Immunhistochemische Färbung von Zellkulturen des humanen respiratorischen Epithels aus Nasenmuscheln mit dem AK 34βE12; A primäre Zellen; B P1; C P2; D P3

Die Bindungsspezifität des Antikörpers CD44v6 an die hREC-Antigene wurde ebenfalls an nativen Nasenmuschel-Gewebeschnitten nachgewiesen (Abb. 18A). Ausschließlich respiratorische Epithelzellen, die als verhältnismäßig kleine Zellen auf der Basalmembran zu erkennen sind, wurden rötlich braun angefärbt.

Ein gleichzeitig mit dem Maus IgG1 Antikörper gefärbter Gewebeschnitt (Negativkontrolle) zeigte keine Färbung (Abb. 18B).

↓58

Abb. 18 : Immunhistochemische Färbung des humanen respiratorischen Epithels aus Nasenmuscheln mit dem CD44v6 AK (A); Negativkontrolle (B).

Die Färbung der hREC-Kulturen in Passage 0 und Passage 1 zeigte, dass alle hREC, die direkten Kontakt zum mit Kollagen A beschichten Flaschenboden hatten, sich mit dem CD44v6 AK braun angefärbt haben (Abb. 19A/B). Zellen, die sich in den oberen Schichten befanden, zeigten dagegen keine Anfärbung mit dem AK (Abb. 19B/D). Die parallel gefärbte Kontrolle (Maus IgG1) war negativ (nicht abgebildet).

Abb. 19 : Immunhistochemische Färbung von hREC-Kulturen mit dem AK CD44v6; A Übersicht P0; B Ausschnitt P0; C Übersicht P1; D Ausschnitt P1

↓59

Der CD49f Basalzellmarker wurde zunächst an Gewebeschnitten der Nasenmuschel getestet. Die Färbung zeigte eine deutlich rötlich-braun gefärbte Linie, die zwischen den Basalzellen und der Basalmembran verlief. Dabei handelte es sich um angefärbte Intergrine, die spezifisch mit dem CD49f AK reagierten (Abb. 20A). Ein gleichzeitig mit dem Maus IgG1 Antikörper gefärbter Gewebeschnitt (Negativkontrolle) zeigte keine Färbung (Abb. 20B).

Da sich im Gewebeschnitt keine anderen Zellen angefärbt hatten, wird der CD 49f AK als spezifisch erachtet und ist für die Markierung von Basalzellen aus dem humanen respiratorischen Epithel geeignet.

Abb. 20 : A Färbung des humanen respiratorischen Epithels der Nasenmuschel mit dem CD49f Antikörper. B Negativkontrolle

↓60

Auch der Antikörper CD104 wurde an nativen Gewebeschnitten der Nasenmuschel auf seine Spezifität hin überprüft. Dieser Antikörper färbte, ähnlich dem AK CD49f, die Bindungsstellen zwischen Basalzellen und Basalmembran rötlich braun an (Abb. 21A). Die Negativkontrolle zeigte keine Färbung des Gewebes (Abb. 21B).

Abb. 21 : A Färbung des humanen respiratorischen Gewebes der Nasenmuschel mit dem CD104 Antikörper. B Negativkontrolle

4.4 Differenzierung und Charakterisierung von humanen respiratorischen Epithelzellen im Air Liquid Interface

Das Differenzierungspotential der hREC wurde in der Air-Liquid-Interface Kultur (ALI) untersucht. Dazu wurden die hREC wie in Punkt 3.8 beschrieben auf Kollagenmembranen ausgesät. Da die Membranen transparent sind, konnten das Wachstum und die Morphologie der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Kulturdauer mit dem Phasenkontrastmikroskop beurteilt werden.

↓61

Die ausgesäten hREC erreichten bereits nach ca. vier Tagen eine 100%ige Konfluenz (Abb. 22A), wobei auch in der ALI-Kultur die typische kopfsteinpflasterartige Morphologie zu erkennen war. Ab Tag 4 nach Konfluenz bildeten sich Multilayer aus (Abb. 22B und Abb. 22C), die am Tag 12 nach Konfluenz nahezu die gesamte Kultur überwuchsen (Abb. 22D). In der Betrachtung der ALI-Kulturen im Phasenkontrastmikroskop zeigte sich im Vergleich zu den Differenzierungskulturen in den Kulturflaschen, dass die hREC verstärkt Multilayer bildeten.

Abb. 22 : hREC-Kultur P1 im Air-Liquid-Interface; A 100%ige Konfluenz Tag 0; B 4 Tage nach Konfluenz; C 8 Tage nach Konfluenz; D 12 Tage nach Konfluenz

Die im Air-Liquid-Interface kultivierten hREC färbten sich zum Zeitpunkt einer 100%igen Konfluenz (Tag 0) mehr als 50% mit dem Antikörper 34ßE12 und dem Antikörper CD44v6 rötlich braun an (Abb. 23A/24A), es handelte sich also um eine Kultur mit hoher Basalzelldichte. Die Negativkontrolle blieb ungefärbt (ohne Abbildung).

↓62

Wie bei den hREC-Kulturen in Zellkulturflaschen bildeten sich mit zunehmender Kulturdauer (Tag 4-12 nach Konfluenz) Multilayer aus. Basalzellen konnten nur noch in der Zellschicht beobachtet werden, die direkten Kontakt zur Kollagenmembran hatte (Abb. 23B-D/24B-D). Ein deutliches Zeichen für die Differenzierung der Basalzellen ist die Ausbildung von Zilien an der Oberseite von Zilienzellen. Diese waren im Elektronenmikroskop eindeutig nachweisbar.

Abb. 23 : Immunhistochemische Färbung der hREC im ALI mit dem 34ßE12 AK A 100%ige Konfluenz (Tag 0); B 4 Tage nach Konfluenz; C 8 Tage nach Konfluenz; D 12 Tage nach Konfluenz

Abb. 24 : Immunhistochemische Färbung von hREC mit dem AK CD44v6 im ALI; A 100%ige Konfluenz; B 4 Tage nach Konfluenz; C 8 Tage nach Konfluenz; D 12 Tage nach Konfluenz

4.5 Nachweis von Zilien im Rasterelektronenmikroskop

↓63

Zum Nachweis der Neubildung von Zilien bei der Kultivierung der hREC im ALI wurde die Rasterelektronenmikroskopie (REM) gewählt. Mit dieser Methode ist eine hohe Auflösung und damit verbunden eine starke Vergrößerung der darzustellenden Zilien möglich.

Zunächst wurde natives Nasenmuschel-Gewebe auf Zilien hin untersucht. Dabei konnten Zilien auf der Oberfläche des nativen respiratorischen Epithels der verwendeten Nasenmuscheln rasterelektronenmikroskopisch eindeutig dargestellt werden (Abb. 25A/B).

In der Abb.25A sind auch Erythrozyten zu sehen, die zwischen oder auf den hREC liegen. Da die Länge der Zilien nur ca. 5-12µm beträgt, der Durchmesser der Erythrozyten aber ca. 20µm, verdecken diese an einigen Stellen die Zilien. In Abb. 25B ist ein Zellareal mit dicht aneinender liegenden Flimmerzellen zu erkennen.

↓64

Abb. 25 : REM-Aufnahmen von nativen Nasenmuscheln; A respiratorisches Epithel mit Flimmerzellen und Erythrozyten (Übersicht); B Oberfläche des Gewebes mit Zilien bedeckt

Die Auswertung der human respiratorischen Epithelzellen in ALI-Kulturen am Tag 0 (100% Konfluenz) ergab zunächst kein Wachstum von Zilien. Lediglich eine sehr raue Zelloberfläche mit Zellausläufern, die dem Zell-Zellkontakt dienen, konnten beobachtet werden (Abb. 26A). Am vierten Tag nach Konfluenz bildete sich ein Multilayer aus, in dem vereinzelt Zellen zu erkennen waren, die Ansätze von Mikrovilli zeigten (Abb. 26B). Acht Tage nach Konfluenz konnten weder Mikrovilli noch Zilien beobachtet werden. Einige Zellen lagen kugelförmig vor (Abb. 26C).

Erst zwölf Tage nach Konfluenz zeigten sich zum ersten Mal Zilien (Abb. 26D), jedoch konnte diese Beobachtung nur vereinzelt gemacht werden. Ein Zellareal vergleichbar zu den Aufnahmen in Abbildung 25B konnte nicht beobachtet werden.

↓65

Abb. 26 : REM- Aufnahmen von hREC (P1) im ALI; A 100% Konfluenz (d0) Zell-Zellkontakte, B 4 Tage Mikrovilli, C 8 Tage kugelförmige hREC, D 12 Tage Zilien

4.6 Genexpressionsanalysen

4.6.1 Auswahl und Design von Oligonukleotiden

Die Methode der real-time RT-PCR wurde im Rahmen dieser Arbeit in der Arbeitsgruppe am iCykler etabliert. Diese Methode wurde ausgewählt, um eine Änderung der Expression bestimmter Gene über einen definierten Zeitraum semiquantitativ nachweisen zu können.

Für die Genexpressionsanalyse wurden vier Markergene ausgewählt, um deren Genexpression im Verlauf von Differenzierungskulturen der hREC in Zellkulturflaschen und von hREC Kulturen im ALI zu beschreiben. Für diese Markergene wurden Oligonukleotide mit Hilfe der Computerprogramme „PrimerSelect“ und „MegAlign“ erstellt. Die zugrunde liegenden humanen Gensequenzen wurden dem Internet entnommen [83]. Dabei wurden ausschließlich kodierende Gensequenzen verwendet. Die ermittelten Primer wurden anschliessend über den Internetdienst NCBI-BLAST [84] auf ihre Spezifität hin überprüft.

↓66

Weiterhin wurden folgende Kriterien verwendet:

Im Fall des Primers für Zytokeratin 14 (CK14) konnten die Vorgaben nicht eingehalten werden. Die Produktgröße beträgt 407bp. Zugunsten einer höheren Spezifität des Primers, musste der Kompromiss zum größeren Produkt eingegangen werden.

↓67

Zunächst wurde über Verdünnungsreihen die Effektivität der Primer bestimmt. Eine optimale PCR Reaktion führt in jedem Zyklus zu einer Verdoppelung der DNA-Moleküle. Die Effektivität dieser optimalen PCR ist größtenteils von der Primereffektivität abhängig, so dass bei der Primerauswahl darauf geachtet wurde, dass die Effektivität ähnlich der optimalen Effektivität von 2 lag.

4.6.2 Quantifizierung und Reinheitsbestimmung der Gesamt-RNA und cDNA Synthese

Aus den humanen respiratorischen Zellen konnte die Gesamt-RNA isoliert werden. Die Überprüfung der Reinheit und Konzentration der RNA wurde über photometrische Messungen im Absorptionsmaximum der Nukleinsäuren (260nm) und Proteine (280nm) durchgeführt. Der OD-Wert (optische Dichte) bei 260nm wurde zur Quantifizierung herangezogen, unter der Annahme, dass eine Absorption von eins einer Menge von 40µg/ml einzelsträngiger RNA entspricht. Die Absorption der Probenverdünnung lag hierbei im linearen Messbereich des Photometers. Als Nullwert wurde das Lösungsmittel (DEPC-Wasser) verwendet. Zur cDNA Synthese wurden nur Proben einbezogen, deren Menge an Gesamt-RNA 5µg nicht unterschritt. Aus dem Verhältnis der OD-Werte von 260nm zu 280nm wurde die Reinheit der RNA (Verunreinigung mit Proteinen) bestimmt. Hochreine RNA besitzt ein OD-Verhältnis von zwei. Die zur cDNA Synthese eingesetzten Proben wiesen alle ein OD-Verhältnis größer 1,4 auf.

Wie in 3.12 beschrieben wurde die cDNA Synthese durchgeführt, wobei die in der Gesamt-RNA enthaltene mRNA durch die Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben wurde. Die so erhaltene cDNA wurde anschließend bei –20°C gelagert.

4.6.3 Real time RT-PCR Analysen

↓68

Um von allen Proben die gleiche Ausgangsmenge an cDNA für die PCR einsetzen zu können, wurde über die ΔCT-Werte ein Abgleich aller Proben mit dem Haushaltsgen GAPDH durchgeführt. Die Expression von GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase) der abgeglichenen Proben wurde definitionsgemäß gleich eins gesetzt.

Zur Berechnung der relativen Genexpression wurde folgende Formel angewendet:

↓69

Die Referenz kann dabei jede beliebige Bezugsprobe sein, die definitionsgemäß eine relative Genexpression von eins erhält.

Mit den abgeglichenen Proben wurde die PCR für die Differenzierungskulturen in Zellkulturflaschen sowie für Differenzierungskulturen im ALI mit den spezifischen Primern für CK5 (Zytokeratin 5), CK13 (Zytokeratin 13), CK14 (Zytokeratin 14) und CK18 (Zytokeratin 18) durchgeführt. Die Auswertung erfolgte über den erläuterten Weg, der von Winer 1999 publiziert wurde [74].

4.6.4 hREC Differenzierungskulturen im Monolayer

↓70

Die molekularbiologische Untersuchung auf RNA Ebene wurde mit einzelnen Proben von 6 Patienten (44,5 Jahre im Durchschnitt; 5 männlich; 1 weiblich; 4 Nichtallergiker; 2 Allergiker; alle Nichtraucher) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden in einem weiteren Schritt gemittelt und als Box-Wisker-Plot dargestellt. Alle im weiteren Verlauf beschriebenen Werte beziehen sich auf den Tag 0 und auf die Expression des Haushaltsgens GAPDH. Somit ergibt sich für den Tag 0 der Wert 1.

Der Basalzellmarker CK5 zeigte einen Anstieg in der Expression um das 2-fache am Tag 4 (Abb. 27A). Nach dem Tag 4 nimmt die Expression tendenziell bis zum Tag 12 ab. Die Expression von CK5 bei 70% Konfluenz der Zellen ist in etwa vergleichbar mit dem Tag 0, der wie beschrieben 100% Konfluenz der Zellen darstellt.

CK13, ein Marker des Plattenepithels, zeigt dagegen eine Abnahme der Genexpression vom Zeitpunkt der 70%igen Konfluenz bis zum Tag 4 (Abb. 27B). Nach Tag 4 nahm jedoch die Genexpression bis einschließlich Tag 12 deutlich zu.

↓71

CK14, auch ein Basalzellmarker, zeigte einen ähnlichen Verlauf, wie CK5 (Abb. 27C). Auch hier war ein Anstieg der Genexpression von Tag 0 zu Tag 4 erkennbar. Von Tag 4 zu Tag 12 nach Konfluenz der Zellen nahm die Genexpression tendenziell ab. Der Wert für 70% Konfluenz lag im Bereich der Expression am Tag 0.

Cytokeratin 18 (CK18), ein epithelialer Marker der frühen Embryonalphase, zeigte nur eine geringe Expression bei 70% und 100% Konfluenz der Zellen (Abb. 27D). Ab Tag 4 stieg dieser Wert jedoch um das 10-fache an und gipfelte am Tag 8, wobei eine 20fach erhöhte Expression im Vergleich zu GAPDH zu verzeichnen war.

Abb. 27 : Differenzierungskultur; Darstellung der relativen Genexpression als Vielfaches von GAPDH (fold change) über die Kulturdauer in Tagen (day) als Box-Wisker-Plot; A CK5; B CK13; C CK14; D CK18

4.6.5 REC Differenzierungskulturen im Air-Liquid-Interface

↓72

Die molekularbiologische Untersuchung auf RNA Ebene wurde mit einzelnen Proben von 6 Patienten (39,5 Jahre im Durchschnitt; männlich; Nichtallergiker; 5 Nichtraucher; 1 Raucher) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden in einem weiteren Schritt gemittelt und ebenfalls als Box-Wisker-Plot dargestellt. Auch hier beziehen sich alle im weiteren Verlauf beschriebenen Werte auf die Expression des Haushaltsgens GAPDH.

Die Expression von CK5 war über den Kulturzeitraum von 12 Tagen im ALI relativ konstant (Abb. 28A). Lediglich kleinere Abweichungen waren zu erkennen, die jedoch wegen der großen Fehlerbalken nicht interpretiert werden konnten.

Die hREC im ALI zeigten einen 5-10fachen Anstieg der Expression von CK13 von Tag 0 bis Tag 8 (Abb. 28B). Von Tag 8 zu Tag 12 nahm die Expression von CK13 leicht ab.

↓73

CK 14 zeigte wiederum kaum Unterschiede in der Genexpression. Lediglich von Tag 4 zu Tag 8 konnte man einen tendenziellen Anstieg der Expression von CK14 erkennen (Abb. 28C).

Die Expression von CK18 stieg von Tag 0 bis Tag 8 auf das 2,5Fache an, fiel jedoch von Tag 8 zu Tag 12 wieder auf ungefähr den Ausgangswert am Tag 0 ab (Abb. 28D).

Abb. 28 : Differenzierungskultur im ALI; Darstellung der relativen Genexpression als Vielfaches von GAPDH (fold change) über der Kulturdauer in Tagen (day) als Box-Wisker-Plot; A CK5; B CK13;
C CK14; D CK18

4.7 Co-Kulturen

4.7.1 Co-Kulturen aus Epithelzellen und in vitro hergestellten Hochdichte- Chondrozytenpellets

↓74

Die Hochdichte-Kulturen bestehend aus humanen Nasenseptum-Chondrozyten wurden nach sieben Tagen im Differenzierungsmedium qualitativ auf ihren Matrixgehalt untersucht. In beiden Pelletkulturen (mit und ohne TGF-ß1) konnte Proteoglykanen deutlich nachgewiesen werden (Abb. 29A/B). Die Menge an gebildeten Proteglykan ist in den TGF-ß1 supplementierten Knorpelpellets etwas höher als in den nicht supplementierten Pellets.

Abb. 29 : Alcian-Blau-Färbung von humanen Chondrozyten-pellets nach 7 Tagen Differenzierungskultur. A mit TGF-ß1, B ohne TGF-ß1

Nach 21 Tagen der Chondrozytendifferenzierung in Hochdichte-Pelletkulturen wurden humane respiratorische Epithelzellen auf die Oberfläche der Pellets gesät und in AECG-Medium bzw. konditioniertem Medium für 7 und 14 Tage kultiviert. Die Wahl des Mediums zeigte bei diesem Versuch keine Auswirkung auf das Adhäsionsverhalten, die Epithelschichtdicke oder das Differenzierungsverhalten. Nach sieben Tagen konnte bei beiden Versuchsgruppen eine dünne Epithelzellschicht mit dem AK CD44v6 bzw. 34ßE12 angefärbt werden, wobei es sich nicht um eine zusammenhängende Schicht handelte (Abb. 30A-C). Große Teile der Pellets wurden nicht besiedelt. Die Kultivierung der Pellets über 14 Tage zeigte keine Veränderungen. Auch hier konnte eine dünne Epithelschicht auf den Pellets beobachtet werden (Abb. 30D). Die Epithelschicht breitete sich nicht über die gesamten Pelletoberfläche aus. Allgemein nahm jedoch über den Zeitraum der Kultivierung der hREC/Knorpelpelletkonstrukte die Proteoglykanmenge in der Chondrozytenmatrix leicht ab.

↓75

Abb. 30 : Humane Chondrozytenpellets mit hREC besiedelt. A 7 Tage in AECG-Medium 34ßE12 gefärbt, B 7 Tage in AECG-Medium, CD44v6 gefärbt, C 7 Tage in konditioniertem Medium, 34ßE12 gefärbt, D 14 Tage in konditioniertem Medium, 34ßE12 gefärbt. Gegenfärbung Alcian-Blau

4.7.2 Co-Kulturen aus Epithelzellen und nativen humanem Gelenkknorpel

Die ausgesäten humanen respiratorischen Epithelzellen adhärierten auf den nativen Gelenkknorpelchips. Sie bildeten einen dünnen Multilayer, der fest mit der Knorpelmatrix verbunden war, wobei zwischen Tag 7 und Tag 14 der Kultivierung kein Unterschied in der Dicke der Zellschicht zu erkennen war. Bedingt durch die hohe Zahl an ausgesäten Epithelzellen, konnte sich schnell ein Multilayer bilden. Eine Zunahme der Schichtdicke durch Proliferation konnte über den Kultivierungszeitraum nicht beobachtet werden (Abb. 31 A-D)

Abb. 31 : Immunhistochemische Färbung von humanen respiratorischen Epithelzellen auf nativem Knorpelchips. A 34βE12 AK Tag 7; B CD44v6 AK Tag 7; C 34βE12 AK Tag 14; D CD44v6 AK Tag 14

↓76

Da die immunhistochemische Färbung nur einen Hinweis auf die Existenz von Basalzellen bzw. Becherzellen gibt, wurde am Tag 14 die Oberfläche der Epithelzellschicht zusätzlich am Rasterelektronenmikroskop auf Ziliogenese untersucht.

Auf der Oberfläche des mit Epithelzellen besiedelten Knorpelchips zeigte sich ein dichter Zellrasen mit einer kopfsteinpflasterartigen Struktur (Abb. 32B), wobei zusätzlich eine Multilayerbildung beobachtet werden konnte. In einigen Arealen traten vermehrt kugelförmige, nicht adhärente Zellen auf, die außerdem unterschiedliche Oberflächenstrukturen und Größen aufwiesen (Abb. 32A). Bei den Oberflächenstrukturen handelte es sich neben sehr glatten, mit einzelnen Poren durchsetzten Formen, um besonders häufig auftretende, feine lamellenartige Strukturen (Abb. 31C/D). Die abgekugelten Zellen befanden sich immer auf einer adhärenten Zellschicht, zellfreie Areale traten nicht auf. Zilien konnten in keiner Probe nachgewiesen werden.

Abb. 32 : REM- Aufnahmen von Knorpelchips besiedelt mit humanen respiratorischen Epithelzellen Tag 14. A Übersicht mit abgekugelten Zellen, B Mulitlayerwachstum; C/D Zellen mit glatter und lamellenartiger Oberfläche

4.7.3 Co-Kultivierung von respiratorischen Epithelzellen und humanen Knorpelzellen im Air-Liquid-Interface

↓77

Die durch enzymatischen Verdau gewonnenen humanen Gelenkchondrozyten zeigten eine für sie typische fibroblastenartige Morphologie und ein netzartiges Wachstumsmuster in Monolayerkulturen, die bereits in zahlreichen Arbeiten und Veröffentlichungen unserer Arbeitsgruppe beschrieben worden sind [85]. Im Gegensatz zu den hREC erfolgte die erste Passage bei einer nahezu 100%igen Konfluenz.

Die humanen Chondrozyten wurden in einer Zelldichte von 5x104 Zellen/cm2 auf die Unterseite der Kollagenmembran gesät und in RPMI Kulturmedium bis zur Konfluenz (nach ca. 24h) kultiviert. Anschließend wurden 5x106 respiratorische Epithelzellen pro cm2 auf der Kollagenmembran ausgesät. Das Medium wurde zu diesem Zeitpunkt durch AECG-Medium ersetzt und die Co-Kulturen bis zur Konfluenz der respiratorischen Epithelzellen (nach ca. 24h) kultiviert. Dabei zeigten beide Zellarten die für sie typische Morphologie (Chondrozyten fibroblastoid, Epithelzellen kopfsteinplasterartig).

Die weitere Kultivierung erfolgte in zwei unterschiedlichen Kultursystemen: in einer Immersionskultur und in einer Air Liquid Interface Kultur. Nach acht Tagen in Kultur wurden beide Systeme hinsichtlich Proliferations- und Differenzierungsverhalten der respiratorischen Epithelzellen miteinander verglichen.

4.7.3.1 Immersionskultur

↓78

In diesem Kultursystem wurden sowohl die Zellen auf der Unterseite der Kollagenmembran (Chondrozyten), als auch die Zellen auf der Kollagenmembran (hREC) über eine Kulturdauer von acht Tagen mit dem AECG-Medium versorgt.

Im Vergleich zu Tag 0 zeigten die hREC im Phasenkontrastmikroskop am Tag 4 eine höhere Zelldichte, vereinzelt konnte die Bildung von Bilayern beobachtet werden (Abbildung nicht gezeigt). Nach 8 Tagen konnte bei den hREC im Phasenkontrastmikroskop ein nahezu komplettes Multilayerwachstum (Abbildung nicht gezeigt) mit irregulärem Wachstum an der Oberfläche beobachtet werden, das durch Anfärbung mit den Antikörpern 34ßE12 und CD44v6 bestätigt wurde (Abb. 33A/B). Unterschiede in den beiden verwendeten AK-Färbungen konnten nicht beobachtet werden. Die Chondrozyten auf der Unterseite zeigten eine starke Proliferation bis zur Konfluenz, stellten aber ihre Proliferation nach Erreichen der Konfluenz ein und hafteten als Monolayer an der Membran.

Abb. 33 : Immersionskultur von hREC und humanen Chondrozyten auf einer Kollagenmembran, A hREC mit 34ßE12 gefärbt, B hREC mit CD44v6 gefärbt

4.7.3.2 Air-Liquid Interface Kulturen

↓79

Im Unterschied zu der Immersionskultur wurden nur die an der Unterseite wachsenden Chondrozyten in der Air-Liquid-Interface-Kultur mit AECG- Medium versorgt.

Oberhalb der hREC bildete sich deshalb eine Gasphase, die aus der Umgebungsluft bestand. Mit diesem ALI System sollte der Einfluss von flüssiger und gasförmiger Phase auf die Entwicklung der hREC untersucht werden.

Es zeigte sich, dass in dem beschriebenen System die Ausbildung eines Bilayers bzw. Multilayers schon deutlich ab Tag 4 zu erkennen war. Am Tag 8 konnte der Multilayer noch verstärkt beobachten werden (keine Abbildung). Auch die positiven immunhistochemischen Färbungen mit den Antikörpern 34ßE12 und CD44v6 nach 8 Tagen Kultudauer im ALI, waren die Bestätigung für einen Multilayer mit irregulärer Oberfläche. Hier ist ebenfalls kein Unterschied in den beiden verwendeten Antikörperfärbungen zu erkennen (Abb. 34 A/B).

↓80

Abb. 34 : Air-Liquid-Interface Kultur von hREC und humanen Chondrozyten auf einer Kollagenmembran Tag 8. A hREC mit 34ßE12 gefärbt, B hREC mit CD44v6 gefärbt

4.7.3.3 Immersions- und Air-Liquid Interface Kultur unter Verwendung von konditioniertem Medium

Im Gegensatz zu den zuvor aufgezeigten Versuchen wurde das AECG-Medium durch ein Gemisch aus konditioniertem Medium und AECG-Medium im Verhältnis 1:1 (v/v) ersetzt. Es handelte sich bei dem konditionierten Medium um RPMI Medium, das nach 48h Inkubation einer humanen Fibroblastenkultur entnommen wurde.

Die Co-Kultivierung von hREC und von Chondrozyten in der Immersionskultur auf der Kollagenmembran ergab einen dichten konfluenten Epitelzellrasen. Die Morphologie der hREC änderte sich über den Beobachtungszeitraum von zwölf Tagen nicht (Abb. 35A-F). Im Gegensatz zu der Immersionskultur zeigten die hREC im Air-Liquid-Interface, d.h. wenn sie der Umgebungsluft ausgesetzt waren, nach zwölf Tagen ein Anwachsen der Zellschichten bis hin zur Multilayerbildung. Die immunhistochemische Färbung der Co-Kulturen nach 4, 8 und 12 Tagen mit den Antikörpern 34βE12 und CD44v6 zeigten deutlich den Zuwachs an Zellschichten auf der Kollagenmembran, dagegen waren die Chondrozyten als einschichtiger konfluenter Layer an der Unterseite der Membran zu erkennen.

↓81

Abb. 35 : Air-Liquid-Interface Kultur von hREC und humanen Chondrozyten auf einer Kollagenmembran mit konditioniertem Medium; mit 34ßE12 gefärbt: A Tag 4, C Tag 8, E Tag 12; mit CD44v6 gefärbt: B Tag 4, D Tag 8, F Tag 12.

Eine Anfärbung einzelner Zellen bzw. einzelner Layer mit dem basalzellspezifischen Antikörper CD44v6 konnte nur an einem schmalen Streifen auf der Membran beobachtet werden. Am Tag 8 erschien die oberste Zellschicht farblos bis bläulich (Hämatoxilin), was am Tag 12 ebenfalls zu erkennen war. Dies könnte ein Hinweis auf eine Differenzierung der auf der oberen Schicht wachsenden, der Gasphase zugewandten hREC sein.

Ein unerwünschtes Phänomen zeigte sich bei den Co-Kulturen bei zunehmender Kulturdauer. Die Chondrozytenschicht lösten sich bei der Prozedur der Kryokonservierung leicht von der Kollagenmembran ab. Daher sind in einigen Abbildungen, die Chondrozyten nicht mehr vorhanden (Abb. 35A/C/D). Auch die Epithelschicht löste sich in eingen wenigen Fällen durch die Prozedur des Kryokonservierens von der Kollagenmembran ab (Abb. 35B/F).

↓82

Um die Oberflächenbeschaffenheit der Epithelzellen im Air-Liquid-Interface zu analysieren, wurden rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von den mit konditioniertem Medium ernährten Kulturen am Tag 12 hergestellt.

Abb. 36 : Elektronenmikroskopische Aufnahmen von hREC auf Kollagenmembranen kultiviert mit konditioniertem Medium
Tag 12

Die hREC Kultur zeigte auch hier eindeutig einen Multilayer, wobei die Zellen nahe der Kollagenmembran als dicht aneinander liegende, adhärente Zellen mit der typischen „pflastersteinartigen“ Morphologie zu erkennen waren (Abb. 36 C/D). Die oberen Zellschichten dagegen lagen in einem lockeren Zellverbund vor, der aus nahezu rundlich geformten Zellen bestand (Abb. 36 A-C) Eine Zilienbildung, die auf eine Differenzierung der Zellen zu Zilienzellen hinweisen würde, wurde nicht beobachtet.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
23.11.2005