DISKUSSION

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Zwei Hauptgebiete in der Trachealforschung sind von besonderem Interesse: Die Trachealrekonstruktion und die Trachealfixation. Die Trachealrekonstruktion ermöglicht die Entfernung von Teilen der Trachea durch anschließendes Ersetzen von Trachealgewebe durch Implantations- oder Transplantationstechniken. Die bisher angewendeten Techniken, wie z.B. die Trachealanastomose sind jedoch limitiert durch die Größe des Defektes, der überbrückt werden muss [42;86]. Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte auf dem Gebiet der Trachealrekonstruktion zu verzeichnen sind und neue Techniken wie z.B. Prosthetik/Implantate oder autologe und allogene Transplantationen beschrieben wurden, erreichte keine Methode in größerem Umfang die klinischen Anwendung [16;87;88;89;90]. Das Tissue Engineering bietet hier neue Lösungsmöglichkeiten für die Rekonstruktion von trachealen Defekten. Trotzdem ist die Entwicklung von funktionellem Trachealgewebe aus den verschiedenen kultivierten Zelltypen immer noch eine Herausforderung [86]. Im Bereich der Trachealrekonstruktion stellt sowohl die Zusammensetzung des Gewebes aus vielen unterschiedlichen Zellarten, wie Knorpelzellen, Bindegewebszellen und respiratorischen Epithelzellen, als auch die Kombination und Anordnung dieser Gewebeteile zu einem funktionellen Organ eine große Herausforderung dar. Dies ist besonders gut im Bereich der Literatur zu beobachten. Die Forschergruppen, die sich mit der Problematik der Trachealrekonstruktion mittels Tissue Engineering beschäftigen, können grob in zwei Gruppen mit unterschiedlichen Herangehensweisen unterteilt werden: Die eine Gruppe beschäftigt sich überwiegend mit der Rekonstruktion des Knorpelgerüsts, das die Trachea stabilisiert [14;39]. Zu diesem Zweck werden vermehrt in vivo Versuche an Hunden [91], Schweinen [92] und Schafen [93] durchgeführt, die über den Beobachtungszeitraum auch viel versprechende Ergebnisse zeigen. Der Funktionalität des respiratorischen Epithels wurde aber kaum Beachtung geschenkt.

Die andere Gruppe beschäftigt sich eher mit dem Aufbau, der Funktion und der Regeneration des respiratorischen Epithels, welches das Lumen der Trachea auskleidet
[17;23;94], wobei es im Jahr 2004 gelungen ist, embryonalen Stammzellen der Maus in respiratorische Epithelzellen zu differenzieren [95].

Dieser Bereich gewinnt immer mehr an Bedeutung, da klar wird, dass Transplantate ohne respiratorisches Epithel nur eingeschränkte Funktionen übernehmen können und somit keine oder nur eine temporäre Verbesserung erreicht werden kann [96]. Die Kombination von funktionellen respiratorischen Epithelzellen und einem Knorpelstützgerüst stellt ein neues, scheinbar unüberwindbares Problem dar [97]. Dennoch zeigten einige Tierversuche viel versprechende Ergebnisse sowohl mit Gerüststrukturen aus Knorpel [15] als auch mit biokompartiblen Gerüststrukturen aus ePTFE (expandiertes Polytetrafluorethylen) [37]. Erfolg versprechende Studien im klinischen Bereich stehen jedoch noch aus.

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Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst die Isolierung, Kultivierung, sowie die Charakterisierung von humanen respiratorischen Epithelzellen in der Arbeitsgruppe etabliert und die Zellen unter speziellen Kulturbedingungen in vitro differenziert werden. Anschließend sollten isolierte respiratorische Epithelzellen mit Knorpelzellen und Knorpelgeweben kombiniert und co-kultiviert werden.

Für diese Arbeit wurden humane Nasenmuscheln als Spendergewebe gewählt, da das auf den Nasenmuscheln befindliche respiratorische Epithel dem Epithel in der Trachea gleicht. Für die Isolation der Zellen aus dem Gewebeverband wurde das Enzym Dispase gewählt. Dieses Enzym wirkt im Vergleich zu Trypsin weniger aggressiv auf die Zellen, ist aber gleichzeitig effektiver als Collagenase oder andere proteolytisch wirkende Enzyme. Die Dispase spaltet Fibronectin, Kollagen IV und zu einem geringeren Anteil Kollagen I, welches die Hauptbestandteile der Basalmembran unterhalb des respiratorischen Epithels sind. [98].

Zur Optimierung der Adhäsion von respiratorischen Epithelzellen wurden Zellkulturflaschen mit Kollagen beschichtet. Die Kollagenbeschichtung simuliert in vitro die Basalmembran, die ebenfalls zu einem großen Teil aus Kollagen besteht und die Adhäsion der respiratorischen Epithelzellen begünstigt.

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Es zeigte sich, dass humane respiratorische Epithelzellen auf ein Medium mit einem „Cocktail“ aus spezifischen Wachstumsfaktoren angewiesen sind. Jedoch führen diese mitogenen Stimuli beispielsweise bei anderen Zellarten zu einer Dedifferenzierung der Zellen in vitro [99]. Die humanen respiratorischen Epithelzellen ließen sich gut in der Monolayerkultur vermehren. Mögliche Kontaminationen durch Fibroblasten konnten in Monolayerkulturen durch die deutlichen Morphologieunterschiede zwischen den respiratorischen Epithelzellen und den Fibroblasten durch Phasenkontrastmikroskopie überwacht und ausgeschlossen werden. Die typische „kopfsteinpflasterartige“ Form der respiratorischen Epithelzellen, die die Zellen nach ca. drei Tagen annahmen, wurde in der Literatur bereits beschrieben [17] und konnte in den beschriebenen Experimenten dieser Arbeit bis zur Passage 4 beobachtet werden, wobei in unseren Monolayerkulturen die Größe der einzelnen Zellen von Passage zu Passage zunahm. Typischerweise verloren die respiratorischen Epithelzellen in Monolayerkultur ihre Zilien, wie es bereits in der Literatur beschrieben wurde [79]. Verschiedene Ursachen für den Zilienverlust wie z.B. zu geringe initiale Aussaatdichten und ungenügende Supplementierung des Kulturmediums mit Wachstumsfaktoren, wie Vitamin A wurden bereits diskutiert [40;100;101]. Zusätzlich wurden die respiratorischen Epithelzellen durch enzymatischen Verdau von der Basalmembran abgelöst, die wahrscheinlich einen regulatorischen Effekt auf die Differenzierung von Epithelzellen besitzt [102]. Ein Lösungsansatz wäre die Kultivierung von kleinen Gewebestücken aus dem respiratorischen Epithel [17], wobei zunächst Fibroblasten auswandern und Zilienzellen sich auf dieser Fibroblastenschicht vermehren. Allerdings ist die Zellausbeute in diesen Kulturen für spätere Tissue Engineering Anwendungen zu gering.

Naheliegend ist der Versuch, die Kultivierung im Monolayer, in der eine gute Proliferation beobachtet werden konnte, mit der Gewebekultur, die zur Differenzierung geeignet scheint, zu kombinieren. Hierfür bietet sich die Methode des Air-Liquid-Interface an, in der die physiologische Umgebung der respiratorischen Epithelzellen in vitro simuliert wurde [103]. Die Basalmembran wurde entweder durch eine Kollagenmembran oder einem Gemisch aus Kollagen und Fibronektin ersetzt, die zwei Kompartimente, die Gasphase (simuliert das Lumen) und die nährstoffreiche flüssige Phase voneinander trennt. Diese Kultivierungsmethode findet mittlerweile eine breite Anwendung z.B. für in vitro Toxizitätstests [104], Differenzierungversuche an respiratorischen Epithelzellen [56] und Frequenzmessungen an Zilien [105].

Ein weiterer in der Literatur sehr kontrovers diskutierter Punkt ist die Frage nach den respiratorischen Vorläuferzellen. Neben dem traditionellen Verständnis, dass alle im respiratorischen Epithel vorhanden Zellarten den Basalzellen (auch „Reserve-Zellen“ genannt) entstammen [22;106], wird in einigen älteren Studien jedoch postuliert, dass im respiratorischen Epithel keine Vorläuferzellen existieren [107]. Im starken Kontrast zu der Vorläuferzell-Theorie steht demnach die Hypothese, das sowohl Basalzellen als auch sekretorische Zellen im respiratorischen Epithel durch Dedifferenzierung und erneuter Redifferenzierung in der Lage sind, sich in unterschiedliche Zelltypen zu entwickeln [107]. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in der Literatur kein ausreichender Nachweis für Stammzellen im respiratorischen Trakt beschrieben ist, bzw. das keine spezifischen Marker für Stammzellen im respiratorischen Epithel gefunden wurden [108]. Ferner zeigt die neuere Literatur, dass sich anscheinend doch die Basalzellen durch Differenzierung in alle drei Zellarten des respiratorischen Epithels entwickeln können [20;109;110]. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher versucht, die Basalzellen als respiratorische Progenitorzellen im Epithel zu identifizieren und aus dem Epithelzellgemisch zu isolieren. Zur spezifischen Anfärbung von Basalzellen im nativen Gewebe wurden die Antikörper 34ßE12, CD44v6, CD49f und CD104 gewählt.

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Die in der Literatur häufig beschriebenen und verwendeten Lectine [23;24;111] wurden in dieser Arbeit nicht verwendet, da es in der Literatur sehr widersprüchliche Angaben zur Bindungsspezifität gibt. Bals et al beschreiben eindeutig, dass die Bindung an eine oder mehrere Epithelzellarten blutgruppenabhängig ist [112]. Daher wurde in dieser Arbeit versucht, durch Antikörperfärbung Basalzellen zu identifizieren. Der in der Literatur als basalzellspezifisch und parabasalzellspezifisch beschriebene Marker 34ßE12 [65] zeigte in der Färbung von nativem Nasenmuschelgewebe jedoch eindeutig eine Anfärbung von Basal- und Becherzellen. Erst die Färbung von nativen Gewebeschnitten mit CD44v6 [113;114], CD49f und CD104 [82] zeigte eine spezifische Bindung an Basalzellen. Da die Bindung von CD44v6 an die Basalzellen als schwach beschrieben wurde [113], erschien es sinnvoller für die FACS Methode, die Antikörper gegen CD49f und CD104 zu verwenden. Mittels dieser beiden Antikörper ist es gelungen, jeweils eine Zellpopulation zu identifizieren und durch das Sortieren von Zellgemischen CD104 positive Zellen aus primären respiratorischen Epithelzellen zu isolieren. Die Isolation der Basalzellen im FACS mit den Antikörpern CD104 und CD49f ist bisher nicht in der Literatur beschrieben. In der Literatur ist die Isolation von Basalzellen aus nasalen Polypen und Nasenmuscheln bisher mittels GSI-B4 (Griffonia simplicifolia isolectin B4) durchgeführt worden [25]. Die Autoren zeigten, dass etwa 80% der Zellsuspension GSI-B4 positiv waren. Eine immunhistochemische Färbung der isolierten Zellen mit verschiedenen Integrinen zeigte jedoch, dass nicht alle diese als Basalzellen bezeichneten Zellen gefärbt wurden. Die unterschiedlichen Färbeergebnisse wurden durch eine Heterogenität der Basalzellschicht erklärt. Desweiteren wurde beschrieben, dass diese Basalzellschicht neben Basalzellen auch aus so genannten Stamm- und Progenitorzellen besteht, sowie einer Subpopulation von Basalzellen, die Integrine stärker exprimieren. Diese Subpopulation spielt eine große Rolle bei der Bindung der Basalzellen an die Basalmembran. Obwohl keine Mengenangaben zu den gefärbten Zellen gemacht wurden, unterstützen diese Beobachtungen die Ergebnisse dieser Arbeit. Im Rahmen dieser Arbeit waren lediglich 8,8% der vitalen Zellen CD104 positiv (entspricht der ß4-Kette des α6ß4-Integrinrezeptors). Im Gegensatz zu der Arbeit von Hicks et al wurden zusätzlich unspezifische Bindungen durch die Verwendung des blutzellspezifischen Antikörpers Anti-Maus CD3 (bindet nicht an respiratorische Epithelzellen) ausgeschlossen und gleichzeitig eine Isotypenkontrolle durchgeführt. Zudem war der prozentuale Anteil der antikörpermarkierten und unmarkierten toten Zellen mit 18,3% relativ hoch. Sowohl die Färbeprozedur mit ihren Wasch- und Färbeschritten, als auch die Scherkräfte innerhalb der sehr dünnen Kapillaren des FACS Gerätes haben eine zellschädigende Wirkung auf die empfindlichen Zellen.

Es kann geschlussfolgert werden, dass nur ein geringer Anteil der Basalzellen des respiratorischen Epithels isoliert wurde, nämlich der Teil, der den Lamininrezeptor α6ß4 stark exprimiert. Das erklärt auch die starke Anfärbung der Zellen in den Monolayerkulturen. Im Verhältnis zu den durch die Zellsortierung isolierten Basalzellen, konnte man durch die Färbung mit CD44v6 im Monolayer von einer weitaus größeren Anzahl an Basalzellen in der Kultur bzw. in den primärisolierten Zellsuspension ausgehen, die sich durch die FACS Untersuchungen mit den AK CD104 und CD49f nicht bestätigte. Zur Überprüfung der Ergebnisse der Forschergruppe um Hicks hätte der Nachweis der Basalzellen mit GSI-B4 erfolgen müssen. In unserem Laboratorium konnte jedoch eine spezifische Bindung des Lektins an Basalzellen in nativen respiratorischen Epithelgeweben nicht nachgewiesen werden (unveröffentlichte Daten aus der Arbeitsgruppe).

Zur Charakterisierung der respiratorischen Epithelzellen, insbesondere der Basalzellen in der Monolayerkultur und im Air-Liquid-interface, konnte auch eine Genexpressionsanalyse von epithelspezifischen Zytokeratinen auf RNA-Ebene durchgeführt werden.

5.1 Molekularbiologische Charakterisierung der hREC

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Die Genexpressionsanalysen der Differenzierungskulturen und der ALI-Kulturen mit dem Zytokeratinpaar CK5 und CK14, die als typische Marker für mitotisch aktive Basalzellen verschiedener mehrschichtiger Epithelien bekannt sind, zeigten, dass CK14 nahezu nicht reguliert wird. Lediglich am Tag 4 in der Differenzierungskultur konnte eine marginale Erhöhung festgestellt werden. CK5 dagegen wurde in der Differenzierungskultur bis Tag 4 induziert und zeigte danach bis Tag 12 eine Repression. In der ALI Kultur wurde das Zytokeratinpaar über den gesamten Beobachtungszeitraum von 12 Tagen nicht reguliert. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass sich die Basalzellen sowohl in der Differenzierungskultur als auch in der ALI Kultur vermehren und einen Multilayer bilden.

Obwohl CK13 in Basalzellen des mehrreihigen nasalen Oberflächenepithels und in Epithelien mit Baslazellhyperplasie exprimiert wird, wird CK13 ebenfalls bei der Plattenepithel-Metaplasie exprimiert [67]. Die ansteigende Expression von CK13 in der Differenzierungskultur bis zum Tag 12 deutet auf eine Entwicklung zu einem Plattenepithel oder einer Basalzellhyperplasie hin. Im Gegensatz dazu zeigt die Expression von CK13 in ALI Kulturen ein Maximum am Tag 8 und eine Abnahme am Tag 12, die auf eine Differenzierung der Zellen zu kolumnaren Zellen hinweist [66]. Die Genexpression von CK18 zeigte einen gegenteiligen Verlauf in der Differenzierungskultur, wobei ein Anstieg um das ca. 30fache am Tag 8 verglichen mit Tag 0 zu sehen war, um am Tag 12 wieder abzufallen. Auch in der ALI Kultur zeigte sich ein Maximum am Tag 8. Jedoch nahm auch hier die Expression von CK18 am Tag 12 ab. CK18 wird von Jetten et al zusammen mit den Zytokeratinen 7, 8 und 19 als die am stärksten exprimierten Zytokeratine beschrieben [66].

Die Ergebnisse zeigen, dass sich die hREC in der Differenzierungskultur nicht ohne weiteres differenzieren lassen, sondern tendenziell zur Basalzellhyperplastie neigen. Dagegen zeigt das Expressionsmuster der hREC in der ALI-Kultur eine Differenzierung in Richtung eines respiratorischen Epithels. Zilien konnten unter dem Elektronenmikroskop nur bei einer Probe an einer einzelnen Zelle beobachtet werden. Eine Alcianfärbung der ALI Kulturen war nicht möglich, da die Färbelösung die Membran schädigte, sodass keine Zellen mehr erkennbar waren.

5.2 Co-Kulturen

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Eine Vielzahl von Co-Kultursystemen mit respiratorischen Epithelzellen werden in der Literatur beschrieben. Dabei handelt es sich jedoch häufig um Systeme zur Testung von toxischen Substanzen und ihre Wirkung auf Becher- und Zilienzellen. Die Co-Kulturen dienen der Simulation des nativen Gewebes in vitro. Sie können Aufschluss über Zell-Zellinteraktionen, Matrixproduktion und Differenzierung von Geweben geben. Die Co-Kulturen stellen einen wichtigen Schritt in Richtung Tiermodell dar.

In dieser Arbeit sollte unter anderem überprüft werden, ob es möglich ist, ein Transplantat bestehend aus einer Gerüst- oder Trägerstruktur und einem funktionellen respiratorischen Epithel herzustellen. Zunächst wurde ein relativ einfaches System gewählt, wobei humane Gelenkknorpelchips als Träger für kultivierte hREC fungieren sollten. Es ist bekannt, dass Epithelzellen bevorzugt auf einer extrazellulären Matrixunterlage adhärieren, wobei Kollagene den Hauptteil ausmachen [28]. Knorpel mit seiner kollagenreichen Matrix sollte die Basis für die hREC darstellen.

In diesem Versuch zeigte sich, dass es möglich ist, die hREC ohne Klebersubstanzen auf die Chips aufzubringen, wo sie anwuchsen und eine dünne Epithelschicht bildeten. Die histologischen und immunhistochemischen Färbungen konnten jedoch keinen Beweis für eine Differenzierung der Zellen liefern. Vielmehr färbten sich alle Zellen in der Epithelschicht mit dem basalzellspezifischen Antikörpern CD44v6 und 34ßE12 an.

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In einer zweiten Co-Kultur sollten mittels Tissue Engineering hergestellte Knorpelpellets als Trägerstruktur dienen. Dazu wurden Hochdichte-Pelletkulturen aus isolierten humanen Chondrozyten aus Nasensepten hergestellt [115] und 21 Tage mit supplementiertem Medium kultiviert. Nach einer Woche konnte bereits die Matrixbildung durch Alcian-Blau-Färbung nachgewiesen werden. Durch die Besiedelung mit hREC und der gleichzeitigen Umstellung der Co-Kulturen auf AECG-Medium nahm jedoch der Matrixgehalt in den Pellets ab, was durch erneute histologische Färbungen mit Alcian-Blau gezeigt wurde. Zudem löste sich häufig die hREC Zellschicht von den Pellets ab. Da Kollagene, wie schon erwähnt, für das Adhäsionsverhalten der hREC eine große Rolle spielen, kann die Abnahme der Matrixkomponenten im Pellet mit dem Ablösen der hREC Zellschicht in Verbindung gebracht werden.

In einem dritten Co-Kultursystem bestehend aus hREC und humanen nasalen Chondrozyten, die jeweils auf die Ober- oder Unterseite einer
Kollagen IV-Membran ausgesät wurden, wurde konditioniertes Medium von einer Fibroblastenkultur (ebenfalls aus Nasenmuscheln gewonnen) verwendet. Goto et al konnte bereits 1999 zeigen, dass die Co-Kultivierung mit Fibroblasten durch den Einsatz von konditioniertem Fibroblasten-Medium ersetzt werden kann [116]. Bei dem Einsatz dieser speziellen Kollagenmembranen ist es möglich, die hREC auf der Oberseite der Membran mit Medium zu versorgen (Immersionskultur), oder aber das Medium oberhalb zu entfernen und die hREC der Luft zu exponieren (Air-Liquid Interface). Bei der Durchführung einer Immersionskultur induzierte das verwendete konditionierte Medium die Proliferation der hREC. Im Air-Liquid-Interface zeigten die Färbungen der Kryoschnitte, dass sich ein mehrschichtiges respiratorisches Epithel ausgebildet hatte, welches nicht nur, wie bei den anderen Co-Kultursystemen aus Basalzellen besteht, sondern auch durch die Alcian-Blau-Färbung gefärbte Zellen (blau weist auf Mukopolysaccharide hin) in der Epithelschicht zu erkennen waren, die somit als Becherzellen identifiziert werden konnten.

Die Co-Kulturversuche zeigten, dass nicht nur Wachstumsfaktoren, wie EGF für die Differenzierung allein verantwortlich sind, sondern auch Zell-Zell-Interaktionen, Zell-Matrix-Interaktionen, sowie die Umgebung der Zellen, in diesem Fall das Air-Liquid Interface, eine große Rolle bei der Differenzierung der respiratorischen Epithelzellen spielen. Obwohl es nur ansatzweise gelungen ist eine Ziliogenese zu induzieren und nachzuweisen, sind diese Co-Kulturen ein erster Schritt in Richtung Transplantatentwicklung. Aufbauend auf diese Ergebnisse könnte weiterführend die Ziliogenense durch Erhöhung der Retinolsäurekonzentration im konditionierten Medium induziert werden [117;118].

5.3 Ausblick und Perspektiven

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Das Tissue Engineering eröffnet neue Möglichkeiten zur Entwicklung von vitalen und funktionellen Transplantaten. Speziell im Bereich der Atemwege müssen jedoch noch viele grundlegende Probleme gelöst werden, bevor ein in vitro hergestelltes Gewebe die Anforderungen des klinischen Einsatzes erfüllt. Unter Funktionalität ist hier neben der Mukusproduktion, die weder übermäßig noch zu gering ausfallen sollte, auch die Ausbildung von Kinozilien gemeint. Diese sollen durch den simultanen Zilienschlag den Mukus und andere Partikel in Richtung Kopf transportieren. Nicht allein die Funktionalität des respiratorischen Epithels, sondern auch die biomechanische Belastbarkeit des gesamten Transplantats, stellt einen wichtigen Faktor dar. Sowohl die Längselastizität des Transplantats, als auch Beugebewegungen und Torsionsbewegungen müssen gewährleistet sein. Weiterhin muss die Formstabilität gesichert sein, ohne die es zur Einengung des Lumens oder sogar zum Kollabieren der Trachea kommen kann. Hier könnten mittelfristig in vivo Versuche am Tier weitere Erkenntnisse über den Einsatz kleinerer Transplantate (ca. 2x3cm) bestehend aus tissue engineerten Knorpelträgern in Kombination mit einer aufliegenden respiratorischen Epithelzellschicht liefern.

Da es möglich ist, End-zu-End-Anastomosen von bis zu vier Zentimetern Länge bei 90%iger Erfolgsquote [119] und Resektionen bis zur halben Länge der Trachea, etwa sechs Zentimeter, durchzuführen [41], stellt sich die Frage, ob ein bioartifizieller Gewebeersatz in absehbarer Zeit eine Alternative zu den bisherigen Methoden darstellen kann. Langfristig ist jedoch die Überbrückung von langstreckigen Trachealstenosen und großen Defekten z.B. nach Tumorresektion durch bioartifizielle Transplantate denkbar.

Operationsmethoden, bei denen Trachealprothesen dauerhaft verwendet werden, gelten bislang nicht als etabliert [41]. Es ist zwar gelungen solide oder auch poröse Prothesen zu entwickeln. Diese reizen jedoch durch die unzureichende oder gar fehlende Epithelisierung immer wieder das umgebende Gewebe, sodass es zur Bildung von Narbengewebe und Stenosen kommt [36;37]. Hier bietet die Epithelisierung dieser Prothesen kurzfristig einen ernsthaften Lösungsansatz. Das respiratorische Epithel übernimmt hierbei eine doppelte Schutzwirkung: Zum Einen, indem sie das Risiko der exzessiven Bildung von Granulationsgewebe vermindert, zum Anderen bildet das Epithel einen effektiven Infektionsschutz [37].

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Die Forschungsergebnisse dieser Arbeit bilden prospektiv gesehen die erforderlichen Grundlagen, um einen autologen Trachealersatz in vitro zu konstruieren und diesen klinisch anzuwenden.


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23.11.2005