4 Diskussion

↓104

4.1  Biotransformation unter Berücksichtigung der Reaktions-mechanismen

↓105

Die Verbindungen 1, 2, 3 und 4 unterliegen nach oraler Applikation im Rattenorganismus vielfältigen Veränderungen unter Bildung zahlreicher Metabolite. Dabei treten folgende Funktionalisierungsreaktionen auf:

Phase I:

↓106

Phase II:

Die Ester werden im Körper schnell durch unspezifische Esterasen hydrolysiert. Dabei entstehen die entsprechenden Benzilsäuren und Aminoalkohole, wobei der Nachweis der letzteren nicht gelang, da sie vermutlich sehr schnell weiter abgebaut werden. Die Benzilsäuren selbst und die aus ihnen gebildeten Benzophenone stellen einen großen Teil der Metabolite dar, was auf eine hohe Esteraseaktivität schließen lässt. Bei verschiedenen Benzilsäureestern konnte die Hydrolysierbarkeit durch eine Schweine-leberesterase dokumentiert werden [ 58]. Vor einiger Zeit wurden auch oxidative Esterspaltungen mit Cyt P-450-Enzymen für einige Calcium-Kanal-Antagonisten vom Dihydropyridintyp nachgewiesen [ 59]. Welche Rolle sie jedoch allgemein bei der Biotransformation spielen, bleibt noch abzuwarten. Biomimetisch wurde die oxidative Esterspaltung für die Verbindung 1 nachgewiesen [4].

↓107

Oxidative N- und O-Dealkylierungen sind vielfach beschrieben. Dabei erfolgt zunächst, begünstigt durch den induktiven Effekt des Heteroatoms am α-C-Atom, eine durch Cyt P-450 vermittelte C-Oxigenierung unter Bildung eines Alkohols. Dieser ist nicht sehr stabil und zerfällt nichtenzymatisch in das dealkylierte Produkt und den Aldehyd (bzw. ein Keton) (Schema 13). Bei N-Dealkylierungen ist neben der Abspaltung des Aldehyds vom Carbinolamin noch eine weitere Reaktion denkbar – die Bildung von N-Formyl-derivaten durch Oxidation. Sie sind auch in verschiedenen Beispielen nachgewiesen,
u. a. auch bei den zwei Diphenylmethanderivaten Recipavrin [60] und Fenoctimin [61]. Bei diesen Metabolisierungsuntersuchungen tritt diese Veränderung jedoch nicht in Erscheinung.

Schema 13: Allgemeiner Mechanismus von Dealkylierungen am Heteroatom (X)

In einigen Fällen konnten Carbinolamine auch als stabile Metabolite nachgewiesen und isoliert werden, z. B. bei der Biotransformation von N-Methylcarbazol. Die Stabilität ist vermutlich durch die geringe Basizität des Stickstoffs bedingt [62].

↓108

Bei der N-Dealkylierung ist die Bildung der α-Hydroxyverbindung auf zwei, durch Cyt P-450 vermittelten Wegen, möglich. Auf dem Weg a) kommt es zu einer Abstraktion eines Wasserstoffatoms am α-C-Atom gefolgt entweder von der Oxigenierungsreaktion oder zunächst der Bildung des Iminiumions. Auf Weg b) dagegen erfolgt zuerst ein Elektronentransfer mit nachfolgender Deprotonierung oder Wasserstoff-Abstraktion und Bildung des Iminiumions. Durch Oxigenierung entsteht das Carbinolamin (Schema 14).

Schema 14: Mögliche Reaktionswege zur Bildung eines Carbinolamins bei der Dealkylierung am Beispiel eines tertiären Amins

Bei oxidativen N-Dealkylierungen wurden Nachweise für beide Mechanismen dokumentiert [63]. So konnten Übereinstimmungen gezeigt werden in den kinetischen Deuteriumisotopieeffekten bzw. Isotopieeffektprofilen der N-Demethylierung von N,N-Dimethylanilinen, ausgelöst durch ein tert-Butyloxyradikal, für die die Wasserstoffabstraktion als gesichert gilt, im Vergleich zu N-Dealkylierungsreaktionen an isolierten Cyt P-450-Isoenzymen. Daraus wurde geschlussfolgert, dass die N-Demethylierung durch eine Wasserstoffatomabstraktion initiert abläuft [ 64, 65].

↓109

Im Gegensatz dazu stehen Untersuchungen, die bei Vergleich von O-Dealkylierungen und N-Dealkylierungen Unterschiede in den kinetischen Isotopieeffekten aufweisen, was auf unterschiedliche Reaktionsmechanismen deutet [ 66, 67]. Die Ergebnisse wurden so interpretiert, dass O-Dealkylierungen über eine Wasserstoff- und N-Dealkylierungen über eine Elektronenabstraktion ablaufen. Dies wird weiterhin dadurch gestützt, dass bei Verringerung der Basizität z. B. durch elektronenziehende Gruppen eine Veränderung der kinetischen Isotopieeffekte erfolgt. Diese ähneln nun stark den Werten der O-Dealkylierung. Der daraus resultierende Reaktionsmechanismus der N-Dealkylierung unter Einbeziehung von Cytochrom P-450 ist in Schema 15 dargestellt [ 2].

Schema 15: Möglicher Mechanismus der N-Dealkylierung (PorFe - Cytochrom P-450)

Auf welchen Reaktionswegen die Bildung des Carbinolamins erfolgt, hängt demzufolge stark von der Situation im Molekül (Substituenten, aromatische, cyclische oder acyclische Bindung des Stickstoffs) ab.

↓110

Auch für O-Dealkylierungen werden substratabhängige Reaktionsmechanismen diskutiert [68]. Allgemein wird jedoch angenommen, dass diese Reaktion durch Abstraktion eines Wasserstoffradikals (Weg a) initiiert wird. Die Spaltung der p-Methoxy- und nicht der -Methoxygruppe bei der Metabolisierung von m-Methoxygruppe bei der Metabolisierung von 1 und 2 lässt sich anhand der elektronischen Verhältnisse im Molekül erklären. Das zentrale C-Atom kann formal als Alkylgruppierung und damit als Substituent 1. Ordnung aufgefasst werden, der die Ladungsdichte in o- und p-Stellung erhöht. Dadurch steigt die Elektronendichte am Ethersauerstoff der p-Methoxygruppe gegenüber der in m-Stellung und führt zu einer erhöhten Reaktivität dieser Methoxyfunktion.

Ein weiterer postulierter Mechanismus zur Bildung von N-Dealkylierungsprodukten führt über das N-Oxid. Dieses N-Oxid kann einer Umlagerung zum Carbinolamin unterliegen und unter Abspaltung des Aldehyds oder Ketons zum N-Dealkylierungsderivat reagieren [69, 70].

Am basischen N-Methyl-piperidinylrest konkurrieren neben der N-Demethylierung zwei weitere Reaktionen - die N-Oxid- und die Lactambildung.

↓111

Aus tertiären Aminen entstehen vermittelt durch Cyt P-450-abhängige NADPH-abhängige Monooxygenasen N-Oxide. Sie sind stark polar und werden in der Regel schnell eliminiert. Nur bei 1 konnte eine N-Oxidbildung nachgewiesen werden. Diese Bildung ist allerdings bei der Metabolisierung der anderen Substanzen nicht auszuschließen, da N-Oxide zu anderen Verbindungen weiterreagieren können. So ist ihre Rolle bei der Entstehung der Lactame und N-Dealkylierungsprodukte belegt [ 69, 70, 71, 72]. Unter Umlagerung des Sauerstoffes entstehen zunächst die jeweiligen Carbinolamine, die zu den entsprechenden Produkten weiterreagieren können. Es ist ebenfalls möglich, dass N-Oxide zur Ausgangsverbindung zurück reduziert werden.

Lactambildung wurde bisher bei vielen Untersuchungen von tertiären cyclischen Aminen festgestellt. Sie tritt u. a. bei der Biotransformation von Nicotin [73], N-Benzylpiperidin [74] und verschiedenene Phenothiazinen vom Piperidintyp auf [75, 76, 77, 78]. Auch bei den hier untersuchten Piperidylestern 1, 2, 3 und 4 wurden Lactame nachgewiesen. Zwei mögliche Bildungswege werden heute akzeptiert (Schema 16).

Schema 16: Reaktionsmechanismus zur Bildung von Lactamen

↓112

Der seit langem anerkannte obere Weg führt, ähnlich wie bei der N-Dealkylierung, über ein Carbinolamin, das durch eine schnell ablaufende Dehydrierung das 2-Oxoderivat bildet. Versuche mit N-(4-Fluorbenzyl)-pyrrolidin-18O-N-oxid brachten den Nachweis einer Konkurrenzreaktion über das N-Oxid, die ebenfalls zum Lactam führt [ 71, 72]. Der dabei von Oelschläger postulierte Mechanismus für den Frankfurt Shift ist übertragen auf einen Piperidinring in Schema 17 dargestellt.

Schema 17: Möglicher Mechanismus des Frankfurt Shift

Diese Reaktion erfolgt durch die Abstraktion eines Protons und zweier Elektronen vom N-Oxid vermutlich vermittelt durch CytP-45, wobei als kurzzeitiges Intermediat ein Oxaziridiniumion entsteht, das sich durch Abspaltung eines Protons zum Lactam stabilisiert. Eine nichtenzymatische Umwandlung von N-Oxiden zu Lactamen konnte ausgeschlossen werden.

↓113

Ringöffnungen nach Bildung des Lactams zu Aminosäuren wie z. B. bei Prolintan [ 79], werden selten beobachtet und treten bei der Metabolisierung von 1, 2, 3 und 4 nicht auf.

Eine weitere wichtige erfolgte Biotransformationsreaktion stellt die aromatische C-Oxi-genierung dar. Es sind zwei Reaktionsmechanismen bekannt, die zur Bildung phenolischer Produkte führen können. Sauerstoff kann, vermittelt durch CytP-45, direkt über radikalische Zwischenstufen in eine C-H-Bindung eingeführt werden. Für viele phenolische Metabolite wird jedoch ein anderer Mechanismus diskutiert, bei dem zunächst eine Epoxidierung der aromatischen Verbindung erfolgt. Die entstehenden Arenoxide können u. a. zu Phenolen umgelagert werden.

Nach Untersuchungen mit isotopenmarkierten Verbindungen wird dabei auch ein Additions-Umlagerungs-Mechanismus diskutiert, der als Zwischenprodukt ein Aren-oxid oder, ähnlich wie bei der Oxigenierung an Alkenen, ein Keton aufweist
(Schema 18) [ 2].

↓114

Schema 18: Möglicher Mechanismus zur Bildung von Phenolen (Additions-Umlagerungs-Mechanismus)

(PorFe – Cytochrom P-450)

Die als Zwischenprodukte entstehenden Arenoxide isomerisieren nichtenzymatisch zum Phenol. Dabei wandert das ursprünglich an der phenolischen Substitutionstelle gebundene Wasserstoffatom (D) zur Nachbarposition. Diese intramolekulare Wanderung wird als NIH-Shift bezeichnet [ 80] und ist auch für andere kleine Substituenten, z. B. Halogen oder Methylgruppen, nachgewiesen (Schema 19) [ 81].

Schema 19: NIH-Shift

↓115

In einer Konkurrenzreaktion zum NIH-Shift kann es zu einer Dedeuterierung kommen. Diese ist bevorzugt, wenn das intermediär gebildete Carbokation durch eventuelle Substituenten stabilisiert werden kann, z. B. bei Substituenten 1. Ordnung (Schema 20) [ 2].

Schema 20: Konkurrenzreaktion zum NIH-Shift

(B: Base)

Bei Biotransformationsuntersuchungen sind Arenoxide bisher direkt für polycyclische Aromaten nachgewiesen worden, z. B. das 1,2-Naphthalenepoxid [ 82]. Der Nachweis für Phenylarenoxide erfolgte aufgrund ihrer Instabilität nur indirekt [ 83, 84]. Es gibt jedoch verschiedene Kriterien, die bei einer C-Oxigenierung auf einen Mechanismus über Arenoxide deuten: die Bildung phenolischer Metabolite, das Auftreten von Glutathionkonjugaten bzw. von Mercaptursäurekonjugaten im Urin, die Bildung von trans-Dihydrodiolen und den daraus entstehenden Catecholstrukturen und ihren Konjugaten. Catechole werden bevorzugt aus Dihydrodiolen und weniger durch aufeinanderfolgende Hydroxylierung am aromatischen System gebildet [ 81]. Auch bei den innerhalb dieser Arbeit durchgeführten Biotransformationsuntersuchungen treten Catecholabkömmlinge, allerdings erst nach Methylkonjugation, auf und lassen damit eine über den Arenoxid-Mechanismus erfolgte Hydroxylierung sehr wahrscheinlich erscheinen.

↓116

Welcher der möglichen Reaktionswege jedoch hauptsächlich beschritten wird, hängt stark von den elektronischen Verhältnissen in den Molekülen selbst ab. Elektronenziehende Substituenten stabilisieren Arenoxide und führen zu einer vermehrten Bildung von Dihydrodiolen und Glutathionkonjugaten, z. B. bei Halogen-benzen. Auch polycyclische Aromaten stabilisieren die Arenoxide. Im Gegensatz dazu führen sehr instabile Arenoxide hauptsächlich zu phenolischen Derivaten [ 70]. Das erklärt, warum bei den vier in dieser Arbeit untersuchten Substanzen keine Dihydrodiolbildung beobachtet werden konnte. Sowohl das zentrale Kohlenstoffatom als auch die Methoxygruppen haben als Substituenten erster Ordnung keinen stabilisierenden Effekt auf Arenoxide. In Schema 21 sind die verschiedenen Reaktionsmöglichkeiten bei der Biotransformation von Benzen über den Arenoxidmechanismus dargestellt. Als ein weiteres mögliches monooxigeniertes Zwischenprodukt ist das Oxepin berücksichtigt [ 81].

Schema 21: Reaktionswege bei der Cyt P-450 vermittelten Oxigenierung von Benzen

Substituenten erster Ordnung dirigieren bevorzugt in p- und o-Stellung an den Phenylringen. Das zentrale C-Atom bei den untersuchten Benzilsäurederivaten kann formal als Alkylsubstituent betrachtet werden. Die o-Position ist bei den Benzilaten jedoch sterisch abgeschirmt und somit weniger reaktiv und angreifbar als die p-Position. Dies könnte eine Ursache für die Bildung der p-Hydroxyverbindungen sein. Einen weiteren Einfluss auf die Stellung der phenolischen Gruppierung im Molekül könnten außerdem sogenannte „bond orders“ haben, die ein Ausdruck für den Mehrfachbindungscharakter einer Bindung sind. Sie liegen zwischen 0 für eine Einfachbindung und 1 für eine Doppelbindung [70]. Da Monooxigenasen als leicht elekrophiles Agens agieren, findet die Arenoxidbildung bevorzugt an Bindungen mit größeren bond orders statt. Dies wurde für Naphthalen nachgewiesen [70].

↓117

Benzophenone entstehen durch Decarboxylierung der entsprechenden Benzilsäuren. Decarboxylierungen selbst spielen auch im Stoffwechsel des Körpers eine wichtige Rolle. So gehen biogene Amine aus Aminosäuren durch nichtoxidative Abspaltung von Kohlendioxid hervor. Die oxidative Decarboxylierung von α-Ketosäuren führt zur jeweils niedrigeren Carbonsäure und Kohlendioxid. Bei der Decarboxylierung der Benzilsäuren entstehen zunächst als Zwischenprodukte Benzhydrole. Diese werden durch unspezifische Dehydrogenasen zu den Benzophenonen oxidiert. Auch bei der Biotransformation verschiedener Benzhydrolether sind Benzophenone als Metabolite beobachtet worden, z. B. bei Diphenhydramin [ 85] und Bromazin [86].

Die Methylierung von Phenolen stellt eine Phase-II-Reaktion dar. Im Unterschied zu anderen Phase-II-Reaktionen führt diese jedoch nicht zu so deutlichen Löslichkeitsveränderungen der Substrate. Als Coenzym fungiert S-Adenosylmethionin und als Überträger werden Methyltransferasen aktiv. Größere Bedeutung kommt der COMT (Catechol-O-Methyltransferase) bei der Metabolisierung von Catecholaminen zu. Sie katalysiert Monomethylierungen von o-Diphenolen. Dabei erfolgt die O-Methylierung substituierter 3,4-Dihydroxyphenylverbindungen vorrangig in m-Position. Es gibt aber auch genügend Beispiele für eine in p-Stellung ablaufende Methylierung [87]. O-Methylierungen sind stark von den im Molekül gebundenen Gruppen abhängig, z. B. führen ionisierte Gruppen zu einem starken Übergewicht der m-O-Methylierung [88]. Solche Methylierungsreaktionen haben auch bei den untersuchten Benzilaten stattgefunden. Bei der Biotransformation von 1 und 2 sind am vorher unsubstituierten aromatischen Ring sowohl eine zusätzliche Hydroxy- als auch Methoxygruppierung nachgewiesen worden. Über ein Arenoxid könnten sich die Diphenole gebildet haben, die durch die COMT zu den isolierten Metaboliten abgebaut wurden.

Bei den Untersuchungen treten weitere Phase-II-Reaktionen in Form der Konjugation mit Glucuronsäure und/oder Schwefelsäure auf. Eine Differenzierung zwischen diesen beiden Phase-II-Reaktionen wurde nicht durchgeführt. Bei der Konjugation mit Glucuronsäure muss diese im Organismus zunächst aktiviert werden. Dabei wird aus α-D-Glucose-1-phosphat und UTP mit Hilfe einer Phosphorylase und nachfolgender Oxidation durch eine Dehydrogenase zunächst das Cosubstrat Uridin-5‘-diphospho-α-D-glucuronsäure (UDPG) gebildet. Die Übertragung dieser aktivierten Glucuronsäure erfolgt mit Hilfe von UDP-Glucuronosyltransferasen z. B. auf Alkohole, Phenole, Säuren und Amine [ 89, 90].

↓118

Auch bei der Konjugation mit Schwefelsäure erfolgt zunächst eine Aktivierung des Substrates. Dabei wird aus organischem Sulfat durch eine ATP-Sulfurylase das Adenosin-5‘-phophat (APS) gebildet, welches durch die APS-Phosphokinase zum Cosubstrat 3‘-Phospho-adenosin-5‘-phosphosulfat phosphoryliert wird. Durch Sulfotransferasen wird Sulfat auf ein Substrat, z. B. auf Alkohole und Phenole, unter Freisetzung von 3‘-Phospho-adenosin-5‘-phosphat übertragen [ 89, 90].

Häufig reagieren die Sulfo- und Glucuronosyltransferasen mit denselben Substraten und konkurrieren um sie. Dabei stellt die Glucuronidierung eine low-affinity/high-capacity- und die Sulfatkojugation umgekehrt eine high-affinity/low-capacity-Konjugation dar [91]. Die genauen Substitutionsstellen wurden bei den hier durchgeführten Biotransformationsstudien der Benzilate nicht untersucht.

4.2 Vergleich der Biotransformation der untersuchten Benzilsäureester

In Tab. 14 sind die Wichtungen der verschiedenen Abbauwege bei der Metabolisierung der Verbindungen 1, 2, 3 und 4 übersichtsweise und zusammengefasst dargestellt. Die Aussagen beziehen sich auf die Auswertungen der HPLC und DC, die gewisse quantitative Einschätzungen zulassen.

↓119

Die vier untersuchten Benzilsäureester unterliegen im Organismus der Ratte umfangreichen Veränderungen. In allen Fällen kann ein Teil der Ausgangsverbindung wiedergefunden werden, allerdings scheint diese Wiederfindungsrate Tendenzen aufzuweisen. So wurden die 3,3‘-Dimethoxyderivate 3 und 4 im Gegensatz zu den entsprechenden 3,4-Dimethoxyisomeren 1 und 2 in geringeren Mengen wieder-gefunden. Auch innerhalb des gleichen aromatischen Substitutionsmuster gibt es Unterschiede. Die N-Methyl-3-piperidinylester werden stärker verstoffwechselt als ihre N-Methyl-4-piperidinylanaloga. Daraus ergibt sich folgende Reihe, die die Wiederfindung und damit Stoffwechselstabilität der Ausgangssubstanzen charakterisiert: 1 > 2 > 3 > 4.

Tab. 14: Bedeutungen der metabolischen Abbaureaktionen bei der Biotransformation von 1, 2, 3 und 4

Metabolische Reaktion

Verbindung

1

2

3

4

Esterspaltung

+ +

+ + + (+)

+ + + +

+ + + + +

Aromatische C-Oxigenierung

+ + + + +

+ + + +

+ + +

+

O-Dealkylierung

+ +

+ +

+ + +

+ + + + +

N-Dealkylierung

+ + +

+ + +

+ +

+ +

Lactamisierung

+

+

+

+

N-Oxidation

+ +

-

-

-

Oxidation zum Benzophenon

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

Methylierung

+ +

+ +

+

+

Konjugation

+

+

+

(+)

- keine Umsetzung,
+ sehr geringe Umsetzungsrate ,
+ + geringe Umsetzungsrate,
+ + + mittlere Umsetzungsrate,
+ + + + hohe Umsetzungsrate,
+ + + + + sehr hohe Umsetzungsrate

Große Unterschiede ergeben sich in den Hauptbiotransformationswegen. Ist bei der Metabolisierung von 1 die aromatische Hydroxylierung dominant und stellen allgemein die Ester die Hauptmenge an Metaboliten, so lässt die Substanzmenge an Benzophenonen schon auf eine hohe Esteraseaktivität schließen. Es zeigt sich bei der Metabolisierung von 2, dass die Hydroxylierung auch hier einen wichtigen Metabolisierungsweg darstellt. Den Hauptmetaboliten selbst bildet jedoch die einfach, am zuvor unsubstituierten Ring, hydroxylierte Benzilsäure. Anscheinend führt die Veresterung mit dem N-Methyl-3-piperidinol zu weniger esterasestabilen Benzilsäurederivaten. Dies kann bei Vergleich der Biotransformationen von 3 und 4 bestätigt werden, wo letztere Verbindung eine wesentlich geringere Estermetabolitenmenge aufweist. Im Vergleich scheinen auch die 3,4-Di-methoxyderivate eine höhere Stabilität gegenüber esteratischen Angriffen zu haben als die 3,3‘-Dimethoxyisomeren. Die 3,3‘-Dimethoxyderivate weisen als einen Hauptmetabolisierungsweg die O-Dealkylierung auf, während 1 und 2 wie oben erwähnt starken Veränderungen durch C-Oxigenierung unterliegen. Die 3-Methoxy-substitution in einem Phenylring scheint die Aktivität für C-Oxigenierungen am Aromaten zu senken und die zur Etherspaltung zu erhöhen. Dies könnte an einer sterischen Abschirmung des aromatischen Ringes durch die Methoxyfunktion und einer besseren Angreifbarkeit dieser durch Cyt P-450 liegen. Bei Verbindung 3 besitzen
O-Dealkylierung und Hydroxylierung ähnliche Bedeutung. Bei der Biotransformation vom Benzilat 4 stellt neben der Esterspaltung die O-Dealkylierung der aromatischen Etherfunktionen den Hauptmetabolisierungsweg dar. Die C-Oxigenierungsreaktion ist stark zurückgedrängt. Ob das N-Methyl-3-piperidinylisomer allgemein eine größere Tendenz zur O-Dealkylierung besitzt als das N-Methyl-4-piperidinylderivat, kann bei den Substanzen 1 und 2 nicht bestätigt werden. Allerdings ist es bei diesen Verbindungen schwierig, bedingt durch das starke Übergewicht der Hydroxylierungsreaktion gegenüber der Etherspaltung, eine grundlegende Einschätzung zu treffen.

↓120

Einen weiteren wichtigen Metabolisierungsweg stellt bei allen vier Substanzen die N-Dealkylierung dar. Die Verhältnisse der unterschiedlich aromatisch substituierten N-demethylierten Derivate entsprechen annähernd denen der N-methylierten Ester. Diese sind mengenmäßig den dealkylierten Produkten jedoch immer überlegen.

Estermetabolite mit nur einer Strukturänderung gegenüber der Ausgangsverbindung treten quantitativ stärker auf als mehrfach veränderte Produkte. So bereitete es aufgrund geringer Substanzmengen häufig Schwierigkeiten, Metabolite, die sowohl hydroxyliert und am N und/oder O dealkyliert waren, zu identifizieren.

Die Bildung von N-Oxiden ist nur bei Verbindung 1 beobachtet worden. Dies muss jedoch kein Indiz für die Nicht-Bildung sein, da diese Verbindungen im Körper weiterreagieren können (vgl. 4.1).

↓121

Bei den Metabolisierungsuntersuchungen konnten Lactame nachgewiesen werden - bei 4 jedoch nicht das Lactam der Ausgangsverbindung sondern das des einfach O-de-alkylierten Esters. Die O-Dealkylierungen stellt hier, wie oben beschrieben, den Hauptmetabolisierungsweg am aromatischen System dar.

Zu den auffälligen Metaboliten gehören die vierfach substituierten Benzilsäurederivate. Besonders bei den Verbindungen 1 und 2 lässt ihr Auftreten auf einen Arenoxid-Mechanismus mit nachfolgender Umwandlung zu Catecholstrukturen schließen (vgl. 4.1). Die Bildung von zwei zusätzlichen Substitutionsstellen am Aromaten bei Biotransformationsuntersuchungen scheint in der Ratte nichts Ungewöhnliches zu sein und tritt in vielen Studien, u. a. bei verschiedenen Diphenylmethanen, auf [ 92, 93, 94]. Auch beim Menschen sind solche Aktivitäten bekannt [95].

Die Biotransformation zu Benzophenonen ist von der Rate der Esterhydrolyse zu Benzilsäuren abhängig, aus denen sie metabolisiert werden. Die Tendenz zur Benzophenonbildung scheint nicht in Abhängigkeit vom Substitutionsmuster der Aromaten aufzutreten und kommt bei allen Untersuchungen in ähnlichem Maße vor.

↓122

Phase-II-Metabolite konnten bei allen vier Metabolismusstudien nachgewiesen werden. Sie treten jedoch nur in geringen Mengen auf. Es handelt sich ausnahmslos um phenolische Derivate.

Über den Kot wird eine große Metabolitenmenge an Benzilsäureestern und Benzophenonen ausgeschieden. Benzilsäuren werden jedoch nicht mit der Faeces exkretiert. Ihre Ausscheidung erfolgt ausschließlich über den Urin.

Bei der Auswertung der Metabolitenextrakte wird nebenbei ein chemischer Aspekt auffällig. N-Methyl-3-piperidinylester unterliegen leichter Umesterungen als ihre
N-Methyl-4-piperidylisomere. Sowohl bei der Biotransformation von 2 als auch 4 können Methylester als Artefakte, vermutlich bedingt durch die Aufarbeitung, bestimmt werden. Solche Reaktionen wurden bei 1 und 3 nicht beobachtet.

4.3 Vergleich der Biotransformation mit verwandten Benzilaten

↓123

Die bei der Metabolisierung von 1, 2, 3 und 4 aufgetretenen Metabolisierungswege wurden bereits auch bei anderen Benzilatstudien beschrieben (vgl. 2). Es gibt allerdings kein Derivat, bei dem die Veränderungen während der Körperpassage so vielfältig waren wie bei den hier untersuchten Benzilsäureestern und alle geschilderten Reaktionen simultan auftraten.

Einen Hauptmetabolisierungsweg stellt die Esterspaltung (bzw. Amidspaltung) dar. Sie scheint ein allgemeiner Abbauweg der Benzilate zu sein. Einschätzungen der Esteraseaktivität in Abhängigkeit der Struktur (vgl. 4.2) können aufgrund fehlender Konzentrationsangaben, verschiedener Modellsysteme und Strukturen hier nicht getroffen werden.

Die aromatische Oxigenierung tritt nur in der Ratte auf. Beim Menschen kommt es zu nichtaromatischen C-Oxigenierungen bei Seitenkettenveretherung der alkoholischen Hydroxylgruppe. Hydroxy-Methoxy-Substitution an einem vorher unsubstituierten Phenylring wurden nur im Falle von Epicainid in der Ratte beobachtet [ 22].

↓124

N-Dealkylierungen treten sowohl bei der Ratte als auch im Menschen häufig auf.
O-Dealkylierungen werden bei Benzilaten unabhängig von der verwendeten Tierspezies beobachtet. Beim Menschen sind solche Untersuchungen nur hinsichtlich der
O-Dealkylierungen bei Seitenkettenveretherung der alkoholischen Funktion durch-geführt worden. Jedoch werden auch bei Nichtbenzilaten O-Dealkylierungen von aromatischen Methoxyfunktionen beschrieben [ 96, 97].

N-Oxide werden bei Biotransformationsuntersuchungen an Benzilaten sowohl in der Ratte als auch im Menschen nachgewiesen.

Die Lactambildung ist bisher nur beim Menschen an dem Benzilsäureamid Epicainid am Pyrrolidinring beobachtet worden [ 22]. Es konnte bei den hier durchgeführten Untersuchungen erstmals der Nachweis der Lactamisierung für Benzilsäurederivate in der Ratte geführt werden.

↓125

Benzophenonbildung scheint ein typischer Abbauweg für Benzilate in der Ratte zu sein und konnte im Menschen bisher nicht nachgewiesen werden.

Auf Konjugate wurde anderweitig selten geprüft. Wurden Glucuronide und Sulfatkonjugate nachgewiesen, so handelte es sich wie bei diesen Untersuchungen ausschließlich um phenolische Derivate.

4.4 Vergleich der Biotransformation von Benzilaten mit ihrer biomimetischen Umsetzung

(vgl. 2)

↓126

Ein Vergleich der Biotransformation mit der biomimetischen Umsetzung zeigt Übereinstimmung in einigen Funktionalisierungsreaktionen des Körpers. In Tab. 15 sind die metabolischen Veränderungen, die die Verbindungen 1, 2 und 3 während der Körperpassage in der Ratte erfahren haben, im Vergleich zu den Ergebnissen der biomimetischen Umsetzung dargestellt.

Tab. 15: Vergleich der Metabolisierung und biomimetischen Umsetzung von 1, 2 und 3

Reaktion

1

2

3

Ratte

Biom.

Ratte

Biom.

Ratte

Biom.

Esterspaltung

+

+

+

+

+

+

Aromatische C-Oxigenierung

+

-

+

-

+

-

O-Dealkylierung

+

-

+

-

+

-

N-Dealkylierung

+

+

+

+

+

+

Lactamisierung

+

-

+

-

+

-

N-Oxidation

+

+

-

+

-

+

Oxidation zum Benzophenon

+

+

+

+

+

+

Phenol-methylierung

+

-

+

-

-

-

Methylester-bildung

-

+

(+)1

+

-

+

Konjugation

+

-

+

-

+

-

N-Formylierung

-

+

-

+

-

+

Biom. – Biomimetik;
+ Reaktion;
- keine Reaktion;
1 keine metabolische Reaktion (Artefakt)

Die N-Dealkylierung, die Esterspaltung zu den Benzilsäuren und die nachfolgende Oxidation zu Benzophenonen stellen gemeinsame Abbauwege dar.

↓127

Der für die biomimetische Umsetzung von 1 nachgewiesene Weg der oxidativen Esterspaltung kann, aufgrund des Fehlens des dabei entstehenden N-Methyl-4-piperidon, bei der Biotransformation nicht bestätigt werden.

Auf biomimetischem Wege können die N-Oxide aller drei Verbindungen dargestellt werden. Dies steht jedoch nicht im Einklang mit den Ergebnissen der Biotrans-formation, wo nur der Nachweis vom N-Oxid von 1 erfolgte.

Bei den biomimetischen Untersuchungen konnten keine O-dealkylierten Derivate und Lactame nachgewiesen werden. Aromatische C-Oxigenierungen in p-Stellung finden nicht statt. Es wird nur ein C-oxigeniertes Benzophenon in o-Stellung des substituierten Aromaten gebildet. Zusätzlich wurden dagegen N-Formylprodukte identifiziert.

↓128

Bei vier weiteren Benzilsäurederivaten ist die Biotransformation mit der biomimetischen Umsetzung verglichen worden (vgl. 2). Auch bei diesen Umsetzungen erfolgte die Simulierung der Funktionalisierungsreaktionen Esterspaltung, N-Dealkylierung, Benzophenon- und N-Oxidbildung. Bei Propiverin und 1-Methyl-4-piperidyl benzilat konnten C-oxigenierte Produkte des Benzophenons und der Benzilsäure isoliert werden. Ebenfalls entsteht bei der Umsetzung von 1-Methyl-4-piperidyl 4-methoxybenzilat ein in 3-Stellung hydroxyliertes Derivat. Die C-Oxigenierung an einem unsubstituierten aromatischen Phenylring eines Benzilsäureesters gelang bisher jedoch nicht.

Die O-Dealkylierung mittels biomimetischer Systeme ist bei anderen Untersuchungen nachgewiesen worden. So erfolgte diese für aromatische Methoxygruppen am Beispiel von 1-Methyl-4-piperidyl 4-methoxybenzilat. Substitutionen mit einer 3,4-Dimethoxy-struktur bzw. 3-Methoxygruppierung scheinen dagegen, den Ergebnissen der biomimetischen Umsetzung von 1, 2 und 3 zufolge, die Etherstruktur zu stabilisieren und die Reaktivität zu senken.

Die Lactamisierung konnte bisher bei keiner biomimetischen Umsetzung von Benzilaten nachgewiesen werden.

↓129

Sulfat- bzw. Glucuronsäurekonjugationen sind von den biomimetischen Systemen ausgehend nicht möglich.

Die Simulierung von Esterspaltungen, N-Dealkylierungen, N-Oxid- und Benzophenonbildungen scheint in biomimetische Systemen bei der Umsetzung von Benzilsäurederivaten keine Schwierigkeiten zu bereiten. Schwieriger gestaltet es sich dagegen, mögliche Abläufe und das Substitutionsmuster der C-Oxigenierungsreaktionen nachzustellen. Es werden keine unsubstituierten Phenylringe der Ester oxigeniert. Ebenso erfolgen O-Dealkylierungen nur bei einfachen Strukturen. Einige Reaktionen, wie z. B. die Lactambildung, sind mit den bisherigen Systemen nicht zu simulieren.

Der Biomimetik gelingt es, wichtige Reaktionen der Biotransformation nachzustellen. Eine Simulierung aller Abbauschritte ist jedoch nicht möglich und kann nicht erwartet werden. Diese Methode ist jedoch gut geeignet, eventuelle Metabolite als Vergleichssubstanzen zur Verfügung zu stellen, die sonst nur schwer zugänglich wären.

4.5 Metabolisierung und Wirksamkeit

↓130

Aufgrund der von Vorwerk [ 3] abgeleiteten Struktur-Aktivitätsbeziehungen für Benzilate an Membranpräparationen von stabil transfizierten Chinese-hamster-ovary-Zellen mit humanen Muskarinrezeptorsubtypen lassen sich die pharmakologischen Wirksamkeiten hinsichtlich einer Antiparkinsonaktivität der Metabolite grob einschätzen. Die hier gezogenen Schlüsse beziehen sich jedoch nur auf die antimuskarinerge Rezeptoraffinität und nicht auf dopaminerge Wirkungen, da für letztere solche Aussagen aufgrund fehlender Zusammenhänge nicht getätigt werden können.

Generell kann den vorliegenden basischen Estern eine anticholinerge Wirksamkeit zugesprochen werden, wobei die Affintität zum Muskarinrezeptor bei Zunahme der Substitution am aromatischen System abnimmt. Bei einer recht hohen Esterspaltungsrate, wie sie bei 3 und besonders 4 auftritt, ist mit einer schnellen Wirkungsabnahme zu rechnen. Bei 1 und 2 ist die aromatische Hydroxylierung in
p-Position dominant. Für diese Substitutionstellung wird eine Zunahme an antimuskarinerger Wirksamkeit durch eine mögliche zusätzliche Bindungsstelle am Rezeptor diskutiert. Bei der Metabolisierung zu vierfach substituierten Benzilaten wird dagegen eine abgeschwächte Beziehung zu den aktiven Zentren im Rezeptor aufgrund Volumenzunahme der Substituenten vermutet. Auch die Verwendung des Aminoalkohols hat Einfluss auf die Affinität zu den Muskarinrezeptoren. So besitzen Ester des N-Methyl-4-piperidinols (Substanzen 1 und 3 und deren Metabolite) größere anticholinerge Aktivität als die entsprechenden N-Methyl-3-piperidylester (Substanzen 2 und 4 und deren Metabolite).

Ein direkter Vergleich der Wirksamkeit der vier Verbindungen ist aufgrund von verschiedenen Wirkungsstärken und -längen mit den bisherigen Untersuchungen nicht möglich. So besitzt 3 wegen des geringeren Substituentenvolumens eine größere Affinität als 1 zu den M-Rezeptoren, wird allerdings schneller esteratisch gespalten. Für weitere und bessere Aussagen wären pharmakologische Testungen am Ganztier notwendig.


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26.09.2006