5 Experimenteller Teil

↓130

5.1  Geräte

↓131

5.2 Chemikalien und Vergleichssubstanzen

5.2.1  Chemikalien und kommerziell erworbene Vergleichssubstanzen

Aceton (Merck), Acetonitril gradient grade (Merck), Amberlite® XAD-2 (VEB Chemiekombinat Bitterfeld), Ammoniak-Lösung (33 %) (Ferak), Ammoniumacetat (Laborchemie Apolda), Ammoniumchlorid (Laborchemie Apolda), basisches Bismutoxidnitrat (Fluka), Chloroform (Baker), Cyclohexan (Ferak), Deuterochloroform ≥ 99,5 % (Merck), Dichlormethan (Merck), Diethylether (Baker), 3,4-Dimethoxy-benzoesäure (Merck), Dimethylformamid (Ferak), Dimethylsulfat (Merck), Dioxan (Laborchemie Apolda), Essigsäure 100 % (Merck), Essigsäureethylester (Aldrich), Ethanol (Baker), Extrelut® (Merck), ß-Glucuronidase (30 U/ml)/Arylsulfatase (60 U/ml) (Merck), 3-Hydroxy-N-methylpiperidin 98 % (Aldrich), 4-Hydroxy-N-methylpiperidin 98 % (Aldrich), Isopropanol (Merck), Isovanillinsäure (ICN Biomedicals Inc.), Kaliumdihydrogenphosphat-Dihydrat (Laborchemie Apolda), Kaliumhexacyano-ferrat(III) (Laborchemie Apolda), Kaliumiodid (Merck), Kaliumpermanganat (Merck), Methanol (Baker), Methanol gradient grade (Merck), 3-Methoxybenzoesäure (Merck), 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) (Aldrich), Natrium (Merck), Natrium-carbonat (Merck), Natriumchlorid (Merck), Natrium-EDTA (isocommerz), Natrium-hydrogencarbonat (Merck), Natriumhydroxid (Chemapol), Natriumsulfat wasserfrei (Riedel-de-Haën), Perchlorsäure 70 % (Ferak), Petroleumbenzin 60 – 80 °C (Baker), Phenolphthalein (Merck), 3-Piperidinol (Fluka), 4-Piperidinol (Fluka), Quecksilber-II-acetat (VK Labor- und Feinchemikalien), Salzsäure 36 % (Baker), Schwefelsäure
95 - 97 % (Merck), Stickstoff (Air Liquide GmbH), Toluen (Merck), Vanillinsäure (ICN Biomedicals Inc.)

5.2.2 Synthetisierte Vergleichssubstanzen

5.2.2.1  (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (1) und verwandte Verbindungen

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (1)

↓132

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [ 3].

C22H27NO5

M r = 385,4 g/mol

↓133

F P:

108 – 110 °C (Diethylether)

HPLC:

R T = 10,7 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,46

FM II: R F = 0,85

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+385 (2), 243 (32), 165 (5), 137 (3), 105 (100), 99 (34), 98 (18), 97 (5), 96 (12), 77 (16)

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,66 und 1,81 (4H, CH2); 2,11 (3H, N-CH3); 2,15 und 2,25 (4H, N-CH2); 3,74 und 3,81 (je 3H, OCH3); 4,27 (1H, OH); 4,91 (1H, CH); 6,75 (1H, Ar-H, C-5); 6,89 und 6,93 (2H, Ar-H, C-2, C-6); 7,20 - 7,37 (5H, Ar-H)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 30,4 (CH2); 46,1 (N-CH3); 52,1 (N-CH2); 55,8 und 55,9 (OCH3); 80,7 (C*); 84,5 (CH); 110,2 (Ar-C-5); 110,7 (Ar-C-2); 119,9 (Ar-C-6); 127,4 (2 Ar-m-C); 127,9 (2 Ar-C); 128,0 (Ar-o-C); 128,0 (Ar-p-C); 134,4 (Ar-C); 142,2 (Ar-C-1); 148,5 (Ar-C-4); 148,7 (Ar-C-3); 174,0 (C=O)

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-hydroxy-3-methoxybenzilat (5)

Die Substanz erschien als Abbauprodukt bei Stabilitätsuntersuchungen und wurde von Vorwerk strukturaufgeklärt [ 3].

↓134

C21H25NO5

M r = 371,4 g/mol

HPLC:

R T = 6,5 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,44

FM II: R F = 0,75

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange), D (dunkelrot)

EI-MS:

m/z (Irel. in %): M+371 (1), 229 (37), 151 (9), 123 (3), 105 (100), 99 (27), 98 (18), 97 (4), 96 (14), 77 (19)

↓135

(R,S)-4-Piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (8)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [3].

C21H25NO5

↓136

M r = 371,4 g/mol

F P:

160 °C (Chloroform/Diethylether)

HPLC:

R T = 10,0 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,41

FM II: R F = 0,66

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+371 (2), 243 (54), 165 (6), 137 (1), 105 (100), 85 (23), 84 (12), 83 (1), 82 (6), 77 (21)

NMR:

s. [ 3, 4]

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat N-oxid (12) (beide Isomere)

↓137

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [ 4].

C22H27NO6

M r = 401,4 g/mol

↓138

HPLC:

R T = 11,7 und 12,1 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,20 und 0,36

FM II: R F = 0,25 und 0,36

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): kein M+ , 385 (1), 243 (26), 165 (30), 137 (4), 105 (100), 99 (23), 98 (14), 97 (3), 96 (10), 77 (36)

NMR:

s. [ 4]

(R,S)-N-Methyl-2-oxo-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (13)

0,60 g Kaliumpermanganat und 0,50 g Natriumcarbonat werden unter Eiskühlung in
30 ml Wasser gerührt. Dazu werden 0,50 g 1-HCl gegeben und bis zum Verschwinden der Violettfärbung gerührt. Der Braunstein wird abfiltriert und die Lösung dreimal mit je 20 ml Ether extrahiert. Die Etherphase wird darauf dreimal mit je 20 ml 2 % Salzsäure ausgeschüttelt und im Vakuum eingeengt.

↓139

Ausbeute:

3 % (der Theorie)

C22H25NO6

M r = 399,4 g/mol

↓140

gelbes Öl

HPLC:

R T = 7,1 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,50

FM II: R F = 0,80

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 399 (1), 243 (27), 165 (30), 137 (11), 113 (13); 105 (100), 77 (51), 55 (10), 51 (15), 44 (17)

GC-MS:

R T = 17,2 min

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,92 (2H, N-CO-CH2); 2,44 und 2,63 (2H, N-CH2-CH2); 2,74 (3H, N-CH3); 3,00 und 3,39 (2H, N-CH2), 3,72 und 3,81 (je 3H, OCH3); 5,25 (1H, CH); 5,84 (1H, OH); 6,76 (1H, Ar-H, C-5); 6,87 und 6,91 (2H, Ar-H, C-2, C-6); 7,20 - 7,33 (5H, Ar-H)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 26,7 (N-CH2-CH2); 34,3 (N-CH3); 36,9 (N-CH2); 44,70 (N-CO-CH2), 55,9 (OCH3); 70,1 (CH); 80,7 (C); 110,2 (Ar-C-5); 110,7 (Ar-C-2); 119,9 (Ar-C-6); 127,1 (2 Ar-m-C); 127,1 (2 Ar-o-C); 128,3 (Ar-p-C); 133,9 (Ar-C); 141,8 (Ar-C-1); 148,8 (Ar-C-4); 148,9 (Ar-C-3); 166,4 (N-C=O); 173,8 (C=O)

(R,S)-3,4-Dimethoxybenzilsäure (16)

↓141

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [3].

C16H16O5

M r = 288,3 g/mol

↓142

F P:

92-96 °C (Wasser)

HPLC:

R T = 9,5 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,22

FM II: R F = 0,20

FM III: R F = 0,32

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+288 (3), 243 (17), 165 (7), 137 (1), 105 (100), 77 (26)

NMR:

s. [3, 4]

3,4-Dimethoxybenzophenon (20)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten nach [ 98] in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [4].

↓143

C15H14O3

M r = 242,3 g/mol

F P:

98-101 °C (Wasser-Ethanol-Gemisch)

HPLC:

R T = 16,2 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,75

FM II: R F = 0,90

FM III: R F = 0,95

Detektion: A, B (gelb)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+242 (25), 165 (100), 137 (14), 105 (55), 77 (73)

NMR:

s. [3, 4]

↓144

4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21)

Die biomimetische Synthese und Strukturaufklärung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [4].

C14H12O3

↓145

M r = 228,2 g/mol

HPLC:

R T = 14,4 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,55

FM II: R F = 0,47

FM III: R F = 0,42

Detektion: A, B (gelb), D (blaugrün)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 228 (29), 151 (100), 123 (37), 105 (27), 77 (42)

NMR:

s. [4]

(R,S)-Methyl 3,4-dimethoxybenzilat (35)

↓146

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [3].

C17H18O5

M r = 302,3 g/mol

↓147

F P:

88-90 °C (Ethanol/Wasser)

HPLC:

R T = 14,4 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,86

FM II: R F = 0,92

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+302 (4), 243 (17), 165 (7), 137 (2), 105 (100), 77 (28)

NMR:

s. [3]

Nicht nachgewiesen:

3-Hydroxy-4-methoxybenzophenon

↓148

Die biomimetische Synthese und Strukturaufklärung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [ 4].

C14H12O3

M r = 228,2 g/mol

↓149

HPLC:

R T = 14,4 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,55

FM II: R F = 0,77

FM III: R F = 0,42

Detektion: A, B (gelb), D (dunkelrot)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+228 (25), 151 (100), 123 (19), 105 (22), 77 (35)

NMR:

s. [4]

(R,S)-N-Formyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat

Die biomimetische Synthese und Strukturaufklärung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [ 4].

↓150

C22H25NO6

M r = 399,4 g/mol

HPLC:

R T = 13,1 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,50

FM II: R F = 0,89

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+399 (2), 243 (65), 165 (8), 137 (1), 113 (7), 105 (100), 77 (16), 55 (20), 42 (14)

GC-MS:

R T = 17,7 min

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,63 und 1,75 (4H, CH2); 3,16 und 3,45 (4H, N-CH2); 3,72 und 3,81 (je 3H, OCH3); 5,15 (1H, CH); 6,75 (1H, Ar-H, C-5); 6,87 und 6,93 (2H, Ar-H, C-2, C-6); 7,19 - 7,37 (5H, Ar-H); 7,91 (3H, N-CHO);

13 C-NMR:

δ [ppm]: 29,8/29,9 (CH2); 31,1/31,2 (CH2); 36,3/36,4 (N-CH2); 42,4/42,5 (N-CH2); 56,3 (OCH3); 72,1 (CH); 81,2 (C*); 110,7 (Ar-C-2); 111,1 (Ar-C-5); 120,1 (Ar-C-6); 127,7 (2 Ar-m-C); 128,5 (2 Ar-o-C); 128,7 (Ar-p-C); 134,4 (Ar-C); 142,2 (Ar-C-1); 149,1 (Ar-C-4); 149,3 (Ar-C-3); 161,0 (CHO); 174,2 (C=O)

↓151

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dihydroxybenzilat

Synthese und Analytik: s. [3]

C20H23NO5

↓152

M r = 357,4 g/mol

2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-phenylessigsäure

Synthese und Analytik: s. [3]

↓153

C16H16O4

M r = 272,3 g/mol

F P:

58-62 °C (Wasser-Ethanol-Gemisch)

↓154

3,4-Dihydroxybenzophenon

Synthese und Analytik: s. [3]

C13H10O3

↓155

M r = 216,2 g/mol

F P:

128-133 °C (Wasser-Ethanol-Gemisch)

5.2.2.2 (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (2) und verwandte
Verbindungen

(vgl. Kapitel 5.2.2.1)

↓156

(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (2)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [ 3].

C22H27NO5

↓157

M r = 385,4 g/mol

F P:

82 – 85 °C (Diethylether)

HPLC:

R T = 12,2 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,76

FM II: R F = 0,92

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 385 (1), 243 (8), 165 (6), 137 (3), 105 (65), 99 (15), 98 (25), 97 (100), 96 (12), 77 (27)

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,33 und 1,75 (2H, N-CH2-CH2-CH2); 1,47 und 1,63 (2H, N-CH2-CH2); 2,05 - 2,20 (je 1H, N-CH2 und O-CH-CH2); 2,13 (3H, N-CH3); 2,37 (1H, N-CH2); 2,59 (1H, O-CH-CH2); 3,74 und 3,81 (je 3H, OCH3); 4,55 (1H, OH); 4,91 (1H, CH); 6,74 (1H, Ar-H, C-5); 6,94 und 6,98 (2H, Ar-H, C-2, C-6); 7,19 - 7,34 (5H, Ar-H)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 22,3 (N-CH2-CH2); 28,4 (N-CH2-CH2-CH2); 46,2 (N-CH3); 55,1 (N-CH2); 55,79 und 55,84 (OCH3); 58,6 (O-CH-CH2); 72,1 (CH); 80,7 (C); 110,2 (Ar-C-5); 110,7 (Ar-C-2); 119,7 (Ar-C-6); 127,3 (2 Ar-m-C); 127,9 (2 Ar-o-C); 128,0 (Ar-p-C); 134,5 (Ar-C); 142,4 (Ar-C-1); 148,5 (Ar-C-4); 148,7 (Ar-C-3); 173,7 (C=O)

(R,S)-3-Piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (28)

↓158

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [ 4].

C21H25NO5

M r = 371,4 g/mol

↓159

HPLC:

R T = 11,6 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,56

FM II: R F = 0,62

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+371 (<1), 243 (9), 165 (7), 137 (1), 105 (100), 85 (22), 84 (13), 83 (18), 82 (7), 77 (37)

NMR:

s. [4]

(R,S)-N-Methyl-6-oxo-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (32)

0,98 g Quecksilber-(II)-acetat und 1,15 g Na-ED werden unter Rühren in 30 ml 1 % Essigsäure gelöst. Unter Einleiten von Stickstoff werden zu dieser heißen Lösung 0,42 g 2-HCl gegeben und 60 min unter Sieden erhitzt. Nach kurzer Zeit färbt sich die Lösung gelb und metallisches Quecksilber scheidet sich ab. Nach Abkühlen wird die Lösung filtriert, mit Natronlauge alkalisiert und dreimal mit je 25 ml Ether extrahiert. Die Etherphase wird darauf dreimal mit je 25 ml 2 % Salzsäure ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt.

↓160

Ausbeute:

33 % d. Th.

C22H25NO6

M r = 399,4 g/mol

↓161

gelbes Öl

HPLC:

R T = 10,3 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,58

FM II: R F = 0,78

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 399 (1), 243 (13), 165 (6), 137 (1), 113 (50) 105 (100), 98 (7), 77 (25), 55 (12), 44 (6), 42 (5)

GC-MS:

R T = 16,5 min

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,92 – 1,94 (2H, N-CO-CH2); 2,16 – 2,26 (2H, N-CO-CH2-CH2); 2,73 (3H, N-CH3); 3,14 - 3,18 und 3,42 - 3,46 (2H, N-CH2); 3,71 und 3,79 (je 3H, OCH3); 5,24 (1H, CH); 5,76 (1H, OH); 6,74 (1H, Ar-H, C-5); 6,81 - 6,83 (1H, Ar-H, C-6); 6,90 – 6,95 (1H, Ar-H, C-2); 7,20 - 7,30 (5H, Ar-H)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 25,1 (N-CO-CH2); 27,0 (N-CO-CH2-CH2); 34,3 (N-CH3); 52,6 (N-CH2); 55,7 (OCH3); 68,3 (CH); 80,8 (C); 110,2 (Ar-C-5); 110,4 (Ar-C-2); 119,7 (Ar-C-6); 126,9 (2 Ar-m-C); 128,0 (2 Ar-o-C); 128,0 (Ar-p-C); 133,7 (Ar-C-1); 141,5 (Ar-C); 148,5 (Ar-C-4); 148,7 (Ar-C-3); 168,7 (N-C=O); 173,7 (C=O)

Nicht nachgewiesen:

↓162

(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat N-oxid (beide Isomere)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [4].

C22H27NO6

↓163

M r = 401,4 g/mol

HPLC:

R T = 12,3 und 12,7 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,18 und 0,21

FM II: R F = 0,25 und 0,32

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): kein M+, 385 (<1), 243 (12), 165 (31), 137 (4), 105 (100), 99 (11), 98 (11), 97 (58), 96 (7), 77 (41)

NMR:

s. [4]

(R,S)-N-Formyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat

↓164

Die biomimetische Synthese und Strukturaufklärung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [4].

C22H25NO6

M r = 399,4 g/mol

↓165

HPLC:

R T = 12,9 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,80

FM II: R F = 0,95

Detektion: A, B (Raumtemperatur braun, Heizplatte hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 399 (1), 243 (22), 165 (5), 137 (1), 113 (28), 105 (100), 77 (23)

(R,S)-Methyl 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-phenylacetat

10 mmol 3,4-Dimethoxydiphenylessigsäure und 20 mmol Natriumhydrogencarbonat werden in einem 50 ml-Rundkolben in 15 ml Dimethylformamid suspendiert. Die Mischung wird nach Zugabe von 45 mmol Dimethylsulfat 10 min bei Raumtemperatur und dann 10 min auf dem Wasserbad bei 80 - 90 °C gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in 200 ml Wasser aufgenommen und nach dem Erkalten dreimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt.

↓166

Ausbeute:

69 % d. Th.

C17H18O4

M r = 286,3 g/mol

↓167

HPLC:

R T = 17,2 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,87

FM II: R F = 0,91

Detektion: A, B (Raumtemperatur gelblich, Heizplatte altrosa)

IR:

[cm-1]:1514, 1591 (C=C), 1737 (C=O), 2837 (OCH3)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 286 (13), 227 (100), 196 (17), 183 (9), 181 (16), 153 (14), 152 (17), 115 (24)

1 H-NMR:

δ [ppm]: 3,65 (3H, CH3); 3,74 und 3,76 (je 3H, OCH3); 4,90 (1H, CH); 6,71 (1H, Ar-H, C-5); 6,74 und 6,77 (2H, Ar-H, C-2, C-6); 7,22 (5H, Ar-H)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 52,1 (CH3); 55,7 (OCH3); 56,3 (CH); 110,9 (Ar-C-5); 111,7 (Ar-C-2); 120,7 (Ar-C-6); 127,1 (2 Ar-m-C); 128,2 (2 Ar-o-C); 128,4 (Ar-p-C); 130,8 (Ar-C); 138,7 (Ar-C-1); 148,1 (Ar-C-4); 148,8(Ar-C-3); 173,0 (C=O)

(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-phenylacetat

In einen Rundkolben werden 10 mmol (R,S)-Methyl 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-phenylacetat und 11,7 mmol N-Methyl-3-piperidinol in 70 ml Petroleumbenzin vorgelegt. Zur Entfernung von Wasserspuren werden 20 ml Lösungsmittel abdestilliert und anschließend 0,4 ml einer frisch bereiteten 10 %igen methanolischen Natriummethanolatlösung zugetropft. Die Destillationsgeschwindigkeit wird so eingestellt, dass innerhalb von 5 h das Petroleumbenzin sowie vorhandenes und entstandenes Methanol abgetrieben wird, wobei nach 3 h noch einmal eine Zugabe von Natriummethanolatlösung erfolgt.

↓168

Der Rückstand wird in 50 ml Chloroform aufgenommen und dreimal mit 10 %iger Weinsäure extrahiert. Die Weinsäurephasen werden vereinigt, mit 4 M Natriumhydroxid vorsichtig alkalisiert und sofort dreimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt und umkristallisiert.

Ausbeute:

82 % d. Th.

C22H27NO4

↓169

M r = 369,4 g/mol

F P:

73 – 75 °C (Diethylether)

HPLC:

R T = 14,3 min (Methode I)

DC:

FM I: R F = 0,80

FM II: R F = 0,94

Detektion: A, B (Raumtemperatur rosé, Heizplatte braun), C (orange)

IR:

[cm-1]:1515, 1591 (C=C), 1732 (C=O), 2786 (N-CH3), 2836 (OCH3), 2941 (CH2)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+369 (1), 227 (8), 196 (3), 183 (3), 181 (3), 153 (3), 152 (4), 115 (4), 99 (1), 98 (13), 97 (100), 96 (14)

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,35 und 1,69 (2H, N-CH2-CH2-CH2); 1,50 und 1,63 (2H, N-CH2-CH2); 2,07 und 2,11 (je 1H, N-CH2 und O-CH-CH2); 2,16 (3H, N-CH3); 2,35 (1H, N-CH2); 2,59 (1H, O-CH-CH2); 3,74 und 3,76 (je 3H, OCH3); 4,91 (1H, CH); 6,73 (1H, Ar-H, C-5); 6,77 und 6,80 (2H, Ar-H, C-2, C-6); 7,15-7,23 (5H, Ar-H)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 22,4 (N-CH2-CH2); 28,5 (N-CH2-CH2-CH2); 46,2 (N-CH3); 55,1 (N-CH2); 55,7 (OCH3); 56,3 (CH); 58,9 (O-CH-CH2); 70,1 (C); 110,9 (Ar-C-5); 111,7 (Ar-C-2); 120,7 (Ar-C-6); 127,0 (2 Ar-m-C); 128,2 (2 Ar-o-C); 128,4 (Ar-p-C); 131,1 (Ar-C); 138,9 (Ar-C-1); 148,1 (Ar-C-4); 148,8 (Ar-C-3); 171,9 (C=O)

5.2.2.3 N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (3) und verwandte Ver-bindungen

N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (3)

↓170

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [3].

C22H27NO5

M r = 385,4 g/mol

↓171

F P:

118 – 120 °C (Chloroform/Diethylether)

HPLC:

R T = 13,6 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,54

FM II: R F = 0,89

FM III: R F = 0,88

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+385 (3), 243 (24), 135 (100), 107 (27), 99 (59), 98 (70), 97 (17), 96 (68), 92 (15), 77 (16)

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,64 und 1,79 (4H, CH2); 2,08 (3H, N-CH3); 2,15 - 2,25 (4H, N-CH2); 3,68 (je 3H, OCH3); 4,51 (1H, OH); 4,89 (1H, CH); 6,76 (2H, Ar-H, C-4, C-4‘); 6,94 (2H, Ar-H, C-6, C-6‘); 6,95 (2H, Ar-H, C-2, C-2‘); 7,16 (2H, Ar-H, C-5, C-5‘)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 30,3 (CH2); 46,0 (N-CH3); 52,0 (N-CH2); 55,2 (OCH3); 72,2 (CH); 80,7 (C); 113,3 (Ar-C-2, Ar-C-2‘); 113,4 (Ar-C-4, Ar-C-4‘); 119,9 (Ar-C-6, Ar-C-6‘); 128,9 (Ar-C-5, Ar-C-5‘); 143,6 (Ar-C-1, Ar-C-1‘); 159,3 (Ar-C-3, Ar-C-3‘); 173,6 (C=O)

4-Piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (42)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [ 4].

↓172

C21H25NO5

M r = 371,4 g/mol

F P:

152-154 °C (Chloroform/Diethylether)

HPLC:

R T = 8,6 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,21

FM II: R F = 0,26

FM III: R F = 0,38

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+371 (1), 243 (32), 135 (100), 107 (35), 92 (19), 85 (65), 84 (55), 83 (12), 82 (35), 77 (21)

NMR:

s. [4]

↓173

(R,S)-N-Methyl-2-oxo-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (45)

Synthese:

s. Vergleichssubstanz (13), Rührtemperatur 5 – 10 °C

Ausbeute:

2 % d. Th.

C22H25NO6

↓174

M r = 399,4 g/mol

gelbes Öl

HPLC:

R T = 8,5 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,58

FM II: R F = 0,78

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+399 (1), 243 (15), 135 (100), 113 (73); 107 (20), 92 (11), 77 (17), 55 (18), 44 (11)

GC-MS:

R T = 17,2 min

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,95 (2H, N-CO-CH2); 2,48 - 2,66 (2H, N-CH2-CH2); 2,76 (3H, N-CH3); 3,01 und 3,59 (2H, N-CH2), 3,69 und 3,70 (je 3H, OCH3); 5,25 (1H, CH); 6,80 (2H, Ar-H, C-4, C-4‘); 6,88 (2H, Ar-H, C-6, C-6‘); 6,94 (2H, Ar-H, C-2, C-2‘); 7,19 (2H, Ar-H, C-5, C-5‘)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 26,7 (CH2); 34,4 (N-CH3); 36,8 (N-CH2); 44,8 (N-CO-CH2), 55,3 (OCH3); 70,2 (CH); 80,8 (C); 113,2 (Ar-C-2, Ar-C-2‘); 113,6 (Ar-C-4, Ar-C-4‘); 119,8 (Ar-C-6, Ar-C-6‘); 129,3 (Ar-C-5, Ar-C-5‘); 141,5 (Ar-C-1, Ar-C-1‘); 159,5 (Ar-C-3, Ar-C-3‘); 169,9 (N-C=O), 176,8 (C=O)

↓175

3,3‘-Dimethoxybenzilsäure (46)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [3].

C16H16O5

↓176

M r = 288,3 g/mol

F P:

105-106 °C (Ethanol)

HPLC:

R T = 3,4 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,23

FM II: R F = 0,28

FM III: R F = 0,36

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+288 (3), 243 (17), 135 (100), 107 (30), 92 (18), 77 (26)

NMR:

s. [3, 4]

3,3‘-Dimethoxybenzophenon (51)

↓177

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [4].

C15H14O3

M r = 242,3 g/mol

↓178

HPLC:

R T = 11,3 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,91

FM II: R F = 0,94

FM III: R F = 0,90

Detektion: A, B (gelb)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 242 (15), 135 (100), 107 (37), 92 (32), 77 (49)

NMR:

s. [4]

Methyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (68)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [3].

↓179

C17H18O5

M r = 302,3 g/mol

F P:

69-70 °C (Methanol/Wasser)

HPLC:

R T = 10,0 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,80

FM II: R F = 0,91

FM III: R F = 0,92

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 302 (1), 243 (22), 135 (100), 107 (29), 92 (15), 77 (23)

NMR:

s. [3]

↓180

Nicht nachgewiesen:

(R,S)-N-Formyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat

Die biomimetische Synthese und Strukturaufklärung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [4].

↓181

C22H25NO6

M r = 399,4 g/mol

HPLC:

R T = 9,0 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,60

FM II: R F = 0,92

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+ 399 (1), 243 (16), 135 (100), 113 (55), 107 (32), 92 (15), 77 (24), 55 (17), 42 (12)

GC-MS:

R T = 18,1 min

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,7 (4H, CH2); 3,14 und 3,48 (4H, N-CH2); 3,71 (je 6H, OCH3); 4,2 (1H, OH); 5,2 (1H, CH); 6,79 (2H, Ar-H, C-4, C-4‘); 6,90 (2H, Ar-H, C-6, C-6‘); 6,93 (2H, Ar-H, C-2, C-2‘); 7,2 (2H, Ar-H, C-5, C-5‘); 7,9 (3H, N-CHO);

13 C-NMR:

δ [ppm]: 29,3 (CH2); 30,7 (CH2); 35,8 (N-CH2); 42,0 (N-CH2); 55,2 (OCH3); 71,8 (CH); 80,8 (C*); 113,3 (Ar-C-2, Ar-C-2‘); 113,4 (Ar-C-4, Ar-C-4‘); 119,7 (Ar-C-6, Ar-C-6‘); 129,1 (Ar-C-5, Ar-C-5‘); 143,1 (Ar-C-1, Ar-C-1‘); 159,3 (Ar-C-3, Ar-C-3‘); 159,4 (CHO); 173,5 (C=O)

↓182

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat N-oxid (beide Isomere)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [4].

C22H27NO6

↓183

M r = 401,4 g/mol

HPLC:

R T = 8,3 und 8,5 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,23 und 0,35

FM II: R F = 0,30 und 0,37

FM III: R F = 0,48 und 0,62

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): kein M+, 243 (14), 135 (100), 107 (36), 99 (16), 98 (21), 97 (5), 96 (23), 92 (25), 77 (36)

NMR:

s. [4]

5.2.2.4 (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (4) und verwandte
Verbindungen

(vgl. Kapitel 5.2.2.3)

↓184

(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (4)

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB [3].

C22H27NO5

↓185

M r = 385,4 g/mol

F P:

66-70 °C (Methanol/Wasser)

HPLC:

R T = 11,5 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,74

FM II: R F = 0,89

FM III: R F = 0,89

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+385 (<1), 243 (5), 135 (24), 107 (12), 99 (4), 98 (14), 97 (100), 96 (13), 92 (12), 77 (8)

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,34 und 1,75 (2H, N-CH2-CH2-CH2); 1,49 und 1,61 (2H, N-CH2-CH2); 2,10 - 2,20 (je 1H, N-CH2 und O-CH-CH2); 2,11 (3H, N-CH3); 2,54 - 2,59 (je 1H, O-CH-CH2 und N-CH2); 3,67/3,68 (je 3H, OCH3); 4,92 (1H, CH); 6,75 (2H, Ar-H, C-4, C-4‘); 6,91 - 6,99 (4H, Ar-H, C-2, C-2‘, C-6, C-6‘); 7,15 (2H, Ar-H, C-5, C-5‘)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 22,2 (N-CH2-CH2); 28,4 (N-CH2-CH2-CH2); 46,0 (N-CH3); 55,0 (N-CH2); 55,2 (OCH3); 58,5 (O-CH-CH2); 72,0 (CH); 80,8 (C); 113,0 (Ar-C-2, Ar-C-2‘); 113,4 (Ar-C-4, Ar-C-4‘); 119,8 (Ar-C-6, Ar-C-6‘); 128,8 (Ar-C-5, Ar-C-5‘); 143,6 (Ar-C-1, Ar-C-1‘); 159,3 (Ar-C-3, Ar-C-3‘); 173,3 (C=O)

(R,S)-3-Piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (60)

↓186

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB.

C21H25NO5

M r = 371,4 g/mol

↓187

HPLC:

R T = 9,4 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,55

FM II: R F = 0,82

FM III: R F = 0,88

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+371 (<1), 243 (4), 135 (27), 107 (11), 92 (12), 85 (9), 84 (16), 83 (100), 82 (16)

Nicht nachgewiesen:

(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat N-oxid (beide Isomere)

↓188

Die Synthese und Struktursicherung erfolgten in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB.

C22H27NO6

M r = 401,4 g/mol

↓189

HPLC:

R T = 8,2 und 8,6 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,22 und 0,33

FM II: R F = 0,25 und 0,32

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

N-Methyl-6-oxo-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat

Synthese:

s. Vergleichssubstanz 32

Ausbeute:

13 % (der Theorie)

↓190

C22H25NO6

M r = 399,4 g/mol

gelbes Öl

↓191

HPLC:

R T = 8,2 min (Methode II)

DC:

FM I: R F = 0,54

FM II: R F = 0,79

Detektion: A, B (Raumtemperatur grün, Heizplatte grau), C (orange)

EI-MS:

m/z (I rel. in %): M+399 (>1), 243 (11), 135 (100), 113 (70); 107 (34), 98 (7), 92 (14), 77 (25), 55 (10), 42 (8)

GC-MS:

R T = 18,0 min

1 H-NMR:

δ [ppm]: 1,95 (2H, N-CO-CH2); 2,16 - 2,30 (2H, N-CO-CH2-CH2); 2,77 (3H, N-CH3); 3,23 und 3,46 (2H, N-CH2); 3,69 (je 3H, OCH3); 5,26 (1H, CH); 6,77-6,80 (2H, Ar-H, C-4, C-4‘); 6,86-6,93 (4H, Ar-H, C-2, C-2‘, C-6, C-6‘); 7,15 - 7,20 (2H, Ar-H, C-5, C-5‘)

13 C-NMR:

δ [ppm]: 25,1 (N-CO-CH2); 27,0 (N-CO-CH2-CH2); 34,6 (N-CH3); 52,9 (N-CH2); 55,2 (OCH3); 68,6 (CH); 80,9 (C); 113,3 (Ar-C-2, Ar-C-2‘); 113,5 (Ar-C-4, Ar-C-4‘); 119,5 (Ar-C-6, Ar-C-6‘); 129,1 (Ar-C-5, Ar-C-5‘); 142,8 (Ar-C-1, Ar-C-1‘); 159,4 (Ar-C-3, Ar-C-3‘); 168,9 (N-C=O); 173,3 (C=O)

5.3 Biotransformationsuntersuchungen

5.3.1  Tiermaterial

Die Biotransformationsuntersuchungen von 1, 2, 3 und 4 wurden an jeweils 16 männlichen Wistarratten mit einem Körpergewicht von 200 bis 400 g, die von der Tierzucht Schönwalde GmbH stammten, durchgeführt. Die Tiere wurden bei einer Lufttemperatur von 20 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 55 - 60 % im 12 h Hell-Dunkel-Rhythmus gehalten. Während der Versuche saßen sie zu zweit 48 h in Stoffwechselkäfigen, die eine getrennte Entnahme von Urin und Kot ermöglichten. Sie erhielten die ganze Zeit Altromin Standard-Diät für Ratten - Mäuse und Leitungswasser ad libitum.

5.3.2 Applikation und Gewinnung der biologischen Proben

Mittels Schlundsonde sind den Ratten im Abstand von 7 Tagen abwechselnd
200 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg des jeweiligen Benzilsäureesters als Hydrochlorid oder reines Leitungswasser in den Magen appliziert worden. Bei einer Dosierung von 200 mg/kg wurden 40 mg/ml Wasser gelöst und entsprechend dem Gewicht der Ratte verabreicht (eine 200 g schwere Ratte bekam 1 ml Wirkstofflösung). Bei den anderen Dosierungen wurden entsprechend verdünnte Lösungen benutzt. Urin und Kot sind getrennt in 24 h- und 48 h- Fraktionen gesammelt und bei –15 °C eingefroren worden.

5.3.3 Probenvorbereitung

5.3.3.1  Ermittlung der besten Reinigungsmethode

↓192

Drei Methoden wurden in ihrer Eignung zur Reinigung des biologischen Materials überprüft. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden 100 mg von 1, 2, 3 und 4 in 25 ml Eigenurin gelöst. 2,5 ml dieser Lösung wurden zu 25,0 ml Urin aufgefüllt.

5.3.3.1.1  Reinigung durch Flüssig-Flüssig-Extraktion

20,0 ml dieser Lösung wurden dreimal mit je 15 ml des jeweiligen Lösungsmittels extrahiert und aufgrund ungenügender Phasentrennung zentrifugiert. Nach Einengung der organischen Phasen und Aufnahme der Rückstände in 20,0 ml Wasser wurden die Wiederfindungen jeweils durch Dreifachbestimmung mittels HPLC ermittelt.

Wiederfindungsrate:

1

-

Dichlormethan

Essigsäureethylester

Diethylether

= 90,7 % (88,9 - 91,4 %)

= 88,3 % (87,8 - 89,2 %)

= 81,5 % (80,1 - 83,4 %)

2

-

Dichlormethan

Essigsäureethylester

Diethylether

= 87,7 % (87,3 - 88,5 %)

= 91,2 % (89,7 - 92,3 %)

= 81,5 % (80,8 - 82,3 %)

3

-

Dichlormethan

Essigsäureethylester

Diethylether

= 77,8 % (76,2 - 79,6 %)

= 80,2 % (80,1 - 80,4 %)

= 73,6 % (72,5 - 74,2 %)

4

-

Dichlormethan

Essigsäureethylester

Diethylether

= 79,5 % (79,1 - 80,4 %)

= 79,8 % (78,3 - 80,6 %)

= 70,6 % (69,8 - 71,0 %)

5.3.3.1.2 Reinigung durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mittels Extrelut®

↓193

20,0 ml der Lösung wurden auf Extrelut® 20-Säulen aufgegeben, 15 Minuten zum Einziehen belassen und danach mit 40 ml Essigsäureethylester eluiert. Die organische Phase wurde eingeengt und in 20,0 ml Wasser aufgenommen. Die Wiederfindung konnte durch Dreifachbestimmung mittels HPLC ermittelt werden.

Wiederfindungsrate:

1

-

= 98,5 % (98,1 - 98,8 %)

2

-

= 100,0 % (99,3 - 100,4 %)

3

-

= 95,2 % (94,4 - 95,7 %)

4

-

= 89,5 % (88,9 - 90,0 %)

5.3.3.1.3 Reinigung durch Flüssig-Fest-Extraktion mittels Amberlite® XAD-2

Bei der Aufarbeitung der Proben mit Hilfe des Adsorberharz Amberlite® XAD-2 erfolgte zunächst die Konditionierung des Materials. Dazu wurde das Harz in Wasser suspendiert und in eine Glassäule gefüllt (Innendurchmesser 10 mm, Länge 15 cm). Vor Auftragen der Urinprobe erfolgt eine Reinigung und Aktivierung des Materials durch Spülung der Säule nacheinander mit 50 ml Methanol, 50 ml Methanol/Salzsäure
(0,01 M) 1:1, 50 ml Salzsäure (0,01 M), 50 ml Natronlauge (0,01 M) und 50 ml destilliertem Wasser. Anschließend wurden 20,0 ml der Urinlösung aufgetragen und nach Einwirken mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit
50 ml Methanol. Diese Lösung wurde eingeengt und der Rückstand in 20,0 ml Wasser aufgenommen. Die Wiederfindung wurde durch Dreifachbestimmung mittels HPLC ermittelt. Auf die Angabe der Schwankungsbreiten wird aufgrund starker Abweichungen in den Werten verzichtet.

↓194

Wiederfindungsrate:

1

-

= 41,2 %

2

-

= 33,2 %

3

-

= 27,9 %

4

-

= 25,8 %

5.3.3.2 Aufarbeitung

Die Harn- und Kotproben wurden nach Lyophylisation viermal erschöpfend mit 30 °C warmen Methanol extrahiert. Dabei entsprach die Menge Lösungsmittel dem ursprünglichen Probengewicht vor der Gefriertrocknung. Die Filtrate wurden eingeengt und mit Wasser so aufgefüllt, dass ein Drittel der früheren Menge an Urin oder Kot erreicht wurde. Je 20 ml Konzentrat wurden 0,5 g Ammoniumchlorid zugesetzt und mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt. Diese Lösung wurde auf eine Extrelut® 20-Säule aufgebracht und nach 15minütigem Einziehen mit 40 ml Essigsäueethylester eluiert. Auf der Säule verbliebenes Elutionsmittel konnte durch Absaugen gewonnen werden. Durch anschließendes Einengen und Aufnahme in Methanol ist die Fraktion der unkonjugierten Säuren und Neutralstoffe erhalten worden. Mit einer Pumpe wurde Ammoniakdampf durch die Säulen gezogen. Das Ende der Äquilibration konnte aufgrund der basischen Reaktion einer Phenolphthaleinlösung, die hinter die Säule geschaltet war, indiziert werden. Nach Elution mit 40 ml Dichlormethan/Isopropanol (85:15) wurde die Fraktion der basischen unkonjugierten Metaboliten erhalten. Das ursprüngliche Urinkonzentrat konnte durch Aufgabe von 40 ml gesättigter Natriumchloridlösung wiedergewonnen werden, indem dieses zuerst das restliche Lösungsmittel und dann die aufgezogene wässrige Lösung verdrängte. Diese Lösung enthielt die konjugierten Metabolite. Sie wurde mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 5 eingestellt, mit 80 μl des Enzymgemischs von
ß-Glucuronidase/Arylsulfatase versetzt und 24 Stunden bei 37 °C zur Konjugatspaltung inkubiert. Zu 20 ml dieser Lösung wurden 0,5 g Ammoniumchlorid gegeben und, wie oben beschrieben, weiter verfahren. Es wurden nun die Fraktionen der ursprünglich konjugierten Metabolite gewonnen.

5.3.4 Trennung und Isolierung der Metabolite

Die sauren und basischen Metabolitenfraktionen in Methanol wurden bandenförmig auf DC-Alufolien oder PSC-Fertigplatten, Kieselgel 60 F254, 20 x 20 cm aufgetragen und eluiert. Die einzelnen Metabolitenbanden wurden ausgeschnitten oder ausgekratzt und mit Methanol extrahiert. Die filtrierten Rückstände konnten nun den weiteren analytischen Untersuchungen zugeführt werden.

5.4 Analytische Methoden

5.4.1  Dünnschichtchromatographie

5.4.1.1  Analytische Dünnschichtchromatographie

↓195

Für die analytische DC wurden DC-Alufolien, Kieselgel 60 F254, 20 x 20 cm (Merck) verwendet. Die Entwicklung erfolgte in Normalkammern nach 30minütiger Kammersättigung über eine Laufhöhe von 15 cm.

Fließmittelgemische:

I:

Dichlormethan/Cyclohexan/Methanol/Ammoniak – 50 : 35 : 15 : 1

II:

Dioxan/Cyclohexan/Ethylacetat/Ethanol/Ammoniak – 15 : 15 : 40 : 20 : 10

III:

Toluol/Isopropanol/Ammoniak – 30 : 60 : 10

↓196

Detektionsmittel:

A:

Fluoreszenzlöschung im UV (254 nm)

B:

konzentrierte Schwefelsäure, nach Besprühen 10 - 20 min auf der Heizplatte bei 120 °C

C:

Dragendorff-Reagenz, modifiziert [99]

D:

MBTH-Reagenz [8]

(Aufbewahren der Platte 10 min in einer mit Ammoniak gesättigten Kammer, nacheinander Besprühen mit 2 %iger methanolischer MBTH-Lösung und 8 %iger wässriger Kaliumhexacyanoferrat-(III)-Lösung)

§

außerdem: Emerson-Reagenz [ 27]

5.4.1.2 Präparative Schichtchromatographie

Für die präparative Schichtchromatographie wurden PSC-Fertigplatten, Kieselgel 60 F254, 20 x 20 cm, 2 mm Schichtdicke (Merck) und DC-Alufolien, Kieselgel 60 F254,
20 x 20 cm (Merck) verwendet. Die Entwicklung erfolgte in Normalkammern nach 30minütiger Kammersättigung über eine Laufhöhe von 16 cm. Die verwendeten Fließmittelgemische entsprachen denen der analytischen DC. Die Substanzbanden wurden detektiert, ausgekratzt oder ausgeschnitten, mit Methanol extrahiert und danach eingeengt.

5.4.2 HPLC

5.4.2.1  Analytische HPLC

↓197

Stationäre Phase:

LiChroCART® 125-4, LiChrospher® 60, RP-select B (5 μm) (Merck)

Detektion:

Dioden-Array-Detektor (bei 280 nm)

Injektionsvolumen:

25 μl

Methode I:

(nach Smolinka [ 4])

Mobile Phase:

Wässrige Ammoniumacetatlösung (0,05 M) wird mit 70 %iger Perchlorsäure auf einen pH-Wert von 2,3 eingestellt (Lösung A).

Lösung A / Acetonitril:

Gradient: lineare Erhöhung des Acetonitrilanteils von 20 % auf 27 % innerhalb 10 min, auf 50 % innerhalb 15 min, danach konstant 50 : 50;

Fluss: 1,2 ml/min

Methode II:

(nach Smolinka [4])

Mobile Phase:

Kaliumdihydrogenphosphatpuffer pH 7,5 /Acetonitril:

Gradient: 1 min 10 % Acetonitril, danach lineare Erhöhung des Acetonitrils auf 90 % innerhalb von 17 min;

Fluss: 1,5 ml/min

5.4.2.2 Präparative HPLC

Stationäre Phase:

LiChroCART® 250-10, LiChrosorb RP-18 (7 μm) (Merck)

Detektion:

UV-Detektor bei 280 nm

Injektionsvolumen:

100 μl

↓198

Die verwendeten mobilen Phasen entsprachen denen der analytischen HPLC.

5.4.3 UV -spektroskopische Untersuchungen

Die UV-Spektren der Metabolite wurden während der HPLC-Messungen mit Hilfe des Dioden-Array-Detektors aufgenommen. Die verwendeten Lösungsmittel entsprachen HPLCP-Qualität.

5.4.4 IR -spektroskopische Untersuchungen

Die IR-Spektren der Verbindungen wurden in einer Konzentration von ca. 10-3 mol/l als Kaliumbromid-Pressling oder in Chloroform als Film in Natriumchlorid-Zellen mit einer Schichtdicke von 0,266 mm aufgenommen.

5.4.5 Massenspektrometrische Untersuchungen

↓199

EI-Bedingungen: Ionenquelltemperatur 140 – 175 °C; Ionisationsenergie 70 eV

Die m/z-Werte sind den Massenspektren entnommen und mit den relativen Intensitäten (I rel. in %) aufgeführt.

5.4.6 GC -MS-Untersuchungen

GC-Säule:

HP 5 M.S., 30 m Länge, Innendurchmesser 0,25 mm, Filmdicke
0,25 μm

Trägergas:

Helium (0,8 ml/min)

Bedingungen:

Lösung der Substanz in Chloroform, Injektionsvolumen 1 μl

Temperaturverlauf:

2 min bei 120 °C, danach Anstieg von
20 °C/min bis auf 300 °C, danach isotherm

MS:

Elektronenstoßionisation mit 70 eV

5.4.7 Kernresonanzspektroskopische Untersuchungen

↓200

Ca. 5 - 10 mg Substanz wurden in 0,6 ml Deuterochloroform gelöst und in 5 mm Probenröhrchen bei 25 °C gegen Tetramethylsilan als internen Standard vermessen.

1H-NMR:

Frequenz 300,13 MHz, 0 – 14 ppm Messbreite, 16 – 32 Akkumulationen

Spektrenberechnung: ACD/HNMR 1.0

13C-NMR:

Frequenz 75,47 MHz, 0 – 240 ppm Messbreite, 120 - 240 Akkumulationen

Spektrenberechnung: ACD/CNMR 1.1


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26.09.2006