Untersuchungen zur Biotransformation neuer substituierter Piperidylbenzilate

DISSERTATION

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von Berit Eyrich
geboren am 21. Juli 1973 in Berlin

Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Dekan: Prof. Dr. Bernhard Ronacher
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Gutachter:
1. Gutachter: Prof. Dr. B. Göber
2. Gutachter: Prof. Dr. H.-H. Borchert
3. Gutachter: Prof. Dr. R. Stößer

Tag der mündlichen Prüfung: 30. April 2002

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung und Problemstellung
• 2 Biotransformation und biomimetische Umsetzung von Benzilaten - Literaturübersicht
• 3 Untersuchungen und Ergebnisse
  • 3.1  Applikationsdosis, Eliminationsdauer und Dosierungsschema
  • 3.2 Aufarbeitung des biologischen Materials
    • 3.2.1  Vergleich verschiedener Aufarbeitungsmethoden
    • 3.2.2 Reinigung der Proben
    • 3.2.3 Isolierung der Metabolite
  • 3.3 Analytische Charakterisierung der Metabolite
    • 3.3.1  DC-Untersuchungen
    • 3.3.2 HPLC - und UV-Untersuchungen
    • 3.3.3 MS -Untersuchungen
  • 3.4 Metabolisierung von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxy-benzilat (1)
    • 3.4.1  Analytische Charakterisierung der Metabolite
      • 3.4.1.1  DC -Untersuchungen
      • 3.4.1.2 HPLC - und UV-Untersuchungen
      • 3.4.1.3 MS-Untersuchungen
    • 3.4.2 Identifizierung der Metabolite
    • 3.4.3 Phase-II-Metabolite
    • 3.4.4 Kotmetabolite
  • 3.5 Metabolisierung von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxy-benzilat (2)
    • 3.5.1  Analytische Charakterisierung der Metabolite
      • 3.5.1.1 DC -Untersuchungen
      • 3.5.1.2 HPLC - und UV-Untersuchungen
      • 3.5.1.3 MS -Untersuchungen
    • 3.5.2 Identifizierung der Metabolite
    • 3.5.3 Phase-II-Metabolite
    • 3.5.4 Kotmetabolite
  • 3.6 Metabolisierung von N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxy benzilat ( 3)
    • 3.6.1  Analytische Chrakterisierung der Metabolite
      • 3.6.1.1  DC -Untersuchungen
      • 3.6.1.2 HPLC - und UV-Untersuchungen
      • 3.6.1.3 MS -Untersuchungen
    • 3.6.2 Identifizierung der Metabolite
    • 3.6.3 Phase-II-Metabolite
    • 3.6.4 Kotmetabolite
  • 3.7 Metabolisierung von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxy-benzilat (4)
    • 3.7.1  Analytische Chrakterisierung der Metabolite
      • 3.7.1.1 DC -Untersuchungen
      • 3.7.1.2 HPLC - und UV-Untersuchungen
      • 3.7.1.3 MS -Untersuchungen
    • 3.7.2 Identifizierung der Metabolite
    • 3.7.3 Phase-II-Metabolite
    • 3.7.4 Kotmetabolite
  • 3.8 Einfluss der Dosierung
  • 3.9 Synthese und analytische Charakterisierung der Lactame
    • 3.9.1  Synthese der Lactame
    • 3.9.2 Analytik der Lactame - im Vergleich zu den N-Formylderivaten
• 4 Diskussion
  • 4.1  Biotransformation unter Berücksichtigung der Reaktions-mechanismen
  • 4.2 Vergleich der Biotransformation der untersuchten Benzilsäureester
  • 4.3 Vergleich der Biotransformation mit verwandten Benzilaten
  • 4.4 Vergleich der Biotransformation von Benzilaten mit ihrer biomimetischen Umsetzung
  • 4.5 Metabolisierung und Wirksamkeit
• 5 Experimenteller Teil
  • 5.1  Geräte
  • 5.2 Chemikalien und Vergleichssubstanzen
    • 5.2.1  Chemikalien und kommerziell erworbene Vergleichssubstanzen
    • 5.2.2 Synthetisierte Vergleichssubstanzen
      • 5.2.2.1  (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (1) und verwandte Verbindungen
      • 5.2.2.2 (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (2) und verwandte Verbindungen
      • 5.2.2.3 N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (3) und verwandte Ver-bindungen
      • 5.2.2.4 (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (4) und verwandte  Verbindungen
  • 5.3 Biotransformationsuntersuchungen
    • 5.3.1  Tiermaterial
    • 5.3.2 Applikation und Gewinnung der biologischen Proben
    • 5.3.3 Probenvorbereitung
      • 5.3.3.1  Ermittlung der besten Reinigungsmethode
        • 5.3.3.1.1  Reinigung durch Flüssig-Flüssig-Extraktion
        • 5.3.3.1.2 Reinigung durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mittels Extrelut^®
        • 5.3.3.1.3 Reinigung durch Flüssig-Fest-Extraktion mittels Amberlite^® XAD-2
      • 5.3.3.2 Aufarbeitung
    • 5.3.4 Trennung und Isolierung der Metabolite
  • 5.4 Analytische Methoden
    • 5.4.1  Dünnschichtchromatographie
      • 5.4.1.1  Analytische Dünnschichtchromatographie
      • 5.4.1.2 Präparative Schichtchromatographie
    • 5.4.2 HPLC
      • 5.4.2.1  Analytische HPLC
      • 5.4.2.2 Präparative HPLC
    • 5.4.3 UV -spektroskopische Untersuchungen
    • 5.4.4 IR -spektroskopische Untersuchungen
    • 5.4.5 Massenspektrometrische Untersuchungen
    • 5.4.6 GC -MS-Untersuchungen
    • 5.4.7 Kernresonanzspektroskopische Untersuchungen
• 6 Zusammenfassung
• Danksagung
• Schemataverzeichnis
• Verzeichnis der verwendeten Substanzbezeichnungen (Teil I)
• Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
• Literatur
• Verzeichnis der verwendeten Substanzbezeichnungen (Teil II)
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Wöchentliches Dosierungsschema
• Tab. 2: Detektierbare Substanzmenge [μg] der Ausgangsverbindungen
• Tab. 3: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-di-methoxybenzilat (1) und Metaboliten
• Fortsetzung Tab. 3: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (1) und Metaboliten
• Tab. 4: EI-MS-Fragmente von 1 und Metaboliten; in ( ) relativen Intensitäten
• Tab. 5: Vergleich des gemessenen ¹³ C-NMR-Spektrums von 6 mit den berechneten Spektren isomerer Phenole
• Tab. 6: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-di-methoxybenzilat (2) und Metaboliten
• Fortsetzung Tab. 6: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (2) und Metaboliten
• Tab. 7: EI-MS-Fragmente von 2 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität
• Fortsetzung Tab. 7: EI-MS-Fragmente von 2 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität
• Tab. 8: DC, HPLC und UV-Maxima von N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxy-benzilat (3) und Metaboliten
• Tab. 9: EI-MS-Fragmente von 3 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität
• Fortsetzung Tab. 9: EI-MS-Fragmente von 3 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität
• Tab. 10: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimeth-oxybenzilat (4) und Metaboliten
• Fortsetzung Tab. 10: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (4) und Metaboliten
• Tab. 11: EI-MS-Fragmente der Metabolite von 4; in relativer ( ) Intensität
• Fortsetzung Tab. 11: EI-MS-Fragmente der Metabolite von 4; in relativer ( ) Intensität
• Tab. 12: Laufhöhen verschiedener 4-Piperidyl- und 3-Piperidylderivate von 1, 2, 3 und 4 in Abhängigkeit des Fließmittels
• Tab. 13: Vergleich des gemessenen ¹³ C-NMR-Spektrums von mit den berechneten Spektren der möglichen isomeren Lactame32 mit den berechneten Spektren der möglichen isomeren Lactame
• Tab. 14: Bedeutungen der metabolischen Abbaureaktionen bei der Biotransformation von 1, 2, 3 und 4
• Tab. 15: Vergleich der Metabolisierung und biomimetischen Umsetzung von 1, 2 und 3

Bilder

• Abb. 1: Piribenzil-methylsulfat (Metabolisierung in der Ratte und im Menschen)
• Abb. 2: Benactyzin (Metabolisierung in der Ratte)
• Abb. 3: Benapryzin (Metabolisierung in der Ratte und im Menschen)
• Abb. 4: Propiverin (Metabolisierung in der Ratte und im Menschen)
• Abb. 5: N-Methyl-4-piperidyl benzilat (Metabolisierung in der Ratte)
• Abb. 6: N-Ethyl-3-piperidyl benzilat, (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-methoxybenzilat (Metabolisierung in der Ratte)
• Abb. 7: Denaverin (Metabolisierung in der Ratte und im Menschen)
• Abb. 8: Epicainid (Metabolisierung in der Ratte und im Menschen)
• Abb. 9: Trospiumchlorid (Metabolisierung im Menschen)
• Abb. 10: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 1
• Abb. 11: 1H-NMR-Spektrum von 6
• Abb. 12: 13C-NMR-Spektrum von 6
• Abb. 13: Isomere Formen des N-Oxids; R – Benzilsäurerest
• Abb. 14: Mögliche Strukturen von 13
• Abb. 15: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 2
• Abb. 16: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 3
• Abb. 17: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 4
• Abb. 18: Artefakte bei der Metabolisierung von 4
• Abb. 19: Fragmention m und Fragmention n bei der Fragmentierung der Lactame bzw. N-Formylderivate von 1, 2, 3 und 4 im EI-MS
• Abb. 20: ¹ H-NMR-Spektrum von 32
• Abb. 21: ¹³ C-NMR-APT-Spektrum von 32