Untersuchungen und Ergebnisse

Über die unterschiedlich ausgeprägten pharmakologischen Wirksamkeiten von substituierten basischen Benzilsäureestern, die als potentielle neue Wirkstoffe zur Therapie des Morbus Parkinson synthetisiert worden waren [ 3], lagen zu Beginn der Versuche noch keine Ergebnisse vor. Eine Auswahl wurde in Analogie von parallel durchgeführten biomimetischen Untersuchungen an Benzilaten getroffen [ 4], wo drei verschiedene Benzilsäureester untersucht wurden. Die Verbindungen unterscheiden sich durch die Substitution von Methoxygruppen an den aromatischen Ringen (3,4-Position oder 3,3‘-Position) und bei einer Substitution in 3,4-Position im basischen Amino-alkohol (N-Methyl-4-piperidinol oder N-Methyl-3-piperidinol) – Verbindung 1, 2 und 3. Um die Ergebnisse zu vervollständigen, wurde für die Untersuchung zur Biotransformation zusätzlich zu diesen drei Verbindungen der in 3,3‘-Position dimethoxylierte N-Methyl-3-piperidinyl benzilsäureester herangezogen – Verbindung 4.

Applikationsdosis, Eliminationsdauer und Dosierungsschema

Zu Beginn der Metabolismusstudien am Tier lagen keine Angaben zu den letalen Dosierungen der Verbindungen 1, 2, 3 und 4 vor. Daher wurden die Daten des verwandten Benzilates (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-methoxybenzilat zur Orientierung herangezogen, bei dem eine Dosierung von 150 mg/kg Körpergewicht der Ratte gewählt worden war [18]. Zunächst wurde eine Dosis von 50 mg/kg des Hydrochlorids mittels Schlundsonde an eine Ratte verabreicht und das Befinden des Tieres beobachtet. Bei allen vier Benzilaten wurde eine leichte Mydriasis beobachtet, aber es traten keine toxischen Symptome wie Sedierung, Relaxation oder motorische Störungen auf. Eine Erhöhung der Dosierung zunächst auf 100 mg/kg und dann auf 200 mg/kg führte zwar zu einer verstärkten und länger anhaltenden Mydriasis aber zu keinen Intoxikationserscheinungen. Wie spätere pharmakologische Untersuchungen von 1 an der Maus bestätigen, tritt Mydriasis bereits bei geringer Dosis auf, während toxische Anzeichen erst bei einer weitaus höheren Dosierung auftreten [ 3]. Für die weiteren Untersuchungen wurde deshalb die Dosis von 200 mg/kg des entsprechenden Benzilsäureesterhydrochlorids gewählt, mit der aus der Erfahrung heraus ausreichende Metabolitenmengen isoliert werden können. Auf eine weitere Erhöhung der Dosierung wurde verzichtet, um die noch größere Belastung der Tierorganismen zu vermeiden. Zusätzlich wurden in den einzelnen Versuchsreihen weiterhin Ratten mit einer Dosierung von 50 mg/kg und 100 mg/kg behandelt, um eventuelle Unterschiede der Biotransformation in verschiedenen Dosierungen aufzuzeigen, die z. B. auch durch eine zu hohe Belastung des Organismus mit einer Substanz auftreten können.

Zur Ermittlung des optimalen Sammelzeitraumes wurden die Ausscheidungsprodukte der Tiere nach Applikation von 200 mg/kg der jeweiligen Substanz über einen Zeitraum von 72 h gesammelt und mittels DC und HPLC überprüft. Danach wird der Hauptanteil der Metaboliten bei allen vier Verbindungen innerhalb der ersten 24 h ausgeschieden. Nach 48 h können nur noch geringe Metabolitenmengen, nach 72 h nur noch Spuren nachgewiesen werden. Für die Untersuchungen wurden daher die Fraktionen des ersten (24 h) und des zweiten Tages (48 h) getrennt gesammelt und analysiert.

Die orale Applikation der wässrigen Lösungen der Benzilsäurester erfolgte mittels Schlundsonde in den Magen der Tiere. Für jede Verbindung standen 16 Ratten zur Verfügung, wobei jeweils 4 Ratten eine wirkstofffreie Lösung erhielten und den Leerurin lieferten. Die Tiere wurden während der Versuche in Stoffwechselkäfigen gehalten, so dass eine getrennte Sammlung von Urin und Kot ermöglicht wurde. Die Gabe der Substanzen an die Ratten erfolgte im wöchentlichen Rhythmus. Dies gewährleistete eine Ruhezeit von 5 Tagen, und es konnten jeweils zwei Verbindungen gestaffelt in der Woche (Montag oder Mittwoch) verabreicht werden. Die Auswahl der Dosierungen für die einzelnen Tiere erfolgte nach einem sich wöchentlich verschiebenden Schema, so dass die Ratten die gleiche Anzahl an Applikationen mit Substanz und Placebo erhielten (Tab. 1).

Woche

Ratten

1-4

5-8

9-12

13-16

1

Placebo

50 mg/kg

100 mg/kg

200 mg/kg

2

200 mg/kg

Placebo

50 mg/kg

100 mg/kg

3

100 mg/kg

200 mg/kg

Placebo

50 mg/kg

4

50 mg/kg

100 mg/kg

200 mg/kg

Placebo

Tab. 1: Wöchentliches Dosierungsschema

Aufarbeitung des biologischen Materials

Vergleich verschiedener Aufarbeitungsmethoden

Einen limitierenden Faktor in Biotransformationsuntersuchungen stellt die trotz Aufarbeitung immer noch hohe Belastung der Proben an biologischem Material dar. Weiterhin geht bei der Aufarbeitung ein zusätzlicher Teil der von vornherein schon geringen Mengen an Metaboliten verloren. Mit Hilfe der Kopplung von HPLC oder GC mit der MS zur Identifizierung kann man diese Probleme einigermaßen umgehen, hat dann aber kaum Möglichkeiten, die Metaboliten in ausreichenden Mengen zu isolieren, um sie einer weiteren analytischen Chrakterisierung zu unterziehen. Es gilt also, ein möglichst schnelles, ökonomisches und substanzschonendes Reinigungs- und Trenn-system zu finden.

Zu den häufigsten Methoden der Reinigung von biologischem Material gehören die Extraktion mit organischem Lösungsmittel und der Gebrauch von Adsorbentien. Zur Beurteilung der Eignung für die Aufarbeitung der Proben von 1, 2, 3 und 4 wurden drei verschiedene Extraktionsmethoden miteinander verglichen. Als Kriterien galten die Wiederfindungsrate (s. 5.3.3.1) und die jeweilig verbleibenden Probenverunreinigungen an biologischem Material. Dafür wurde eine bestimmte Menge des jeweiligen Hydrochlorids des Benzilates in Eigenurin gelöst und mit den folgenden Methoden gereinigt. Die Wiederfindung und der Grad der Verunreinigungen wurden mit Hilfe der HPLC bestimmt. Die Verunreinigungen konnten weiterhin per DC und visuell beurteilt werden.

Zur Flüssigextraktion wurden verschiedene Lösungsmittel gewählt. Dabei konnten mit Dichlormethan und Essigsäureethylester Wiederfindungsraten von ca. 90 % für 1 und 2 und ca. 80 % für 3 und 4 erzielt werden. Allerdings war der Anteil an biologischen Verunreinigungen noch sehr hoch. Weitere Nachteile dieser Methode bildeten der hohe Verbrauch an Lösungsmitteln und eine schlechte Phasentrennung, die eine Zentrifugation nötig machte.

Als weiteres Verfahren der Flüssig-Flüssig-Extraktion wurde die Reinigung über Extrelut^®-Säulen geprüft. Als Matrix dient hier ein besonders aufgearbeites inertes Kieselgur mit hohem Porenvolumen, um das sich die wässrige Phase wie ein Film legt. Diese kann nun nachfolgend mit organischem Lösungsmittel extrahiert werden. Vorteile bestehen in einem kleinen Zeitaufwand und geringem Lösemittelverbrauch. Das Eluat ist frei von Emulsionen. Die Wiederfindungsrate betrug für 1 und 2 mit Essigsäureethylester nahezu 100 %, für 3 95 % und für 4 90 %. Die Proben waren noch immer mit biologischem Material durchsetzt, aber in einem wesentlich geringerem Maße als bei der ersten Methode der Flüssigextraktion.

Als drittes Verfahren wurde eine Flüssig-Fest-Extraktion über das Austauscherharz Amberlite^® XAD 2 gewählt. Dabei konnte für 1 die beste Wiederfindung mit 41 % bestimmt werden. Die verbleibenden Verunreinigungen mit biologischem Material waren wenig zufriedenstellend. Auf weitere diesbezügliche Optimierungsversuche wurde verzichtet, da die Resultate mit Extrelut^® befriedigend waren. Es wurde entschieden, die folgenden Aufarbeitungen mit Hilfe dieser letztgenannten Flüssig-Flüssig-Extraktion vorzunehmen.

Reinigung der Proben

(vgl. 5.3.3.2)

Das bei - 20 °C aufbewahrte biologische Material wurde bei - 80 °C tiefgefroren und einer Lyophylisation unterzogen. Die gefriergetrockneten Proben wurden mit 30 °C warmen Methanol erschöpfend extrahiert und bei 30 °C eingeengt.

Die Aufnahme der Rückstände erfolgte in einer Wassermenge, die einem Drittel der ursprünglichen Urinmenge bzw. Kotmenge entsprach. Die Vorreinigung über Extrelut^®-Säulen verbunden mit saurer und basischer Elution lieferte die beiden Fraktionen der unkonjugierten Metaboliten. Im sauren Extrakt erhält man Säuren und Neutralstoffe. Der in der basischen Fraktion durch Ammoniak erreichte pH-Wert von 9 hat den Vorteil, dass neben basischen Verbindungen auch Phenolbasen, die als Metabolite sehr wahrscheinlich sind, eluiert werden können. In den wiedergewonnenen wässrigen Lösungen erfolgte die Konjugatspaltung durch Inkubation bei pH 5 mit dem Enzymgemisch ß-Glucuronidase/Arylsulfatase bei 37 °C innerhalb von 24 Stunden. Diese Lösungen wurden ebenfalls über Extrelut^®-Säulen, wie beschrieben, aufgearbeitet und die sauren und basischen Metabolitenfraktionen der ursprünglichen Konjugate erhalten. (vgl. Schema 4)

Schema 4: Allgemeine Aufarbeitung der Urin- und Kotproben

Isolierung der Metabolite

Zur Isolierung der Metabolite standen zwei Verfahren zur Verfügung – die präparative HPLC und die präparative DC. Die präparative HPLC erwies sich jedoch gegenüber der DC hinsichtlich Trennleistung, Lösemittelverbrauch und Zeitaufwand als nachteilig. Durch Variation der Fließmittelgemische bei der DC konnten die Metabolite gut getrennt werden. Zur Separation wurden neben Dickschichtchromatographieplatten analytische DC-Alufolien benutzt, bei denen die Isolierung durch nachfolgendes Auschneiden der Banden erfolgte. Vorteil dieser präparativen DC-Methode stellt eine wesentlich bessere und klarere Trennung der Banden dar. Durch Methanolextraktion wurden die einzelnen Metabolite von der Kieselgelschicht gelöst und den analytischen Methoden zugeführt. Auf diese Weise konnten die Metabolite der jeweiligen basischen und sauren Fraktionen gewonnen werden.

Analytische Charakterisierung der Metabolite

DC-Untersuchungen

(vgl. 5.4.1)

Die DC dient in Biotransformationsstudien sowohl der Trennung als auch der qualitativen Analyse der Metabolite. Insbesondere die Detektierbarkeit von Substanzen lässt Schlüsse auf bestimmte Strukturelemente in den Verbindungen zu.

Die untersuchten Benzilate und ihre Metabolite wurden mit Hilfe von vier verschiedenen Detektionsmitteln charakterisiert. Zur Identifizierung der Substanz-banden wurde die Löschung des UV-Lichtes bei 254 nm auf DC-Platten mit Fluoreszenzindikator ausgewertet. Diese Fluoreszenzlöschung haben alle Benzilsäurederivate aufgrund der aromatischen Struktur gemein.

Eine positive Reaktion mit Dragendorff-Reagenz spricht für das Vorhandensein eines basischen Alkaloidrestes. Auf diese Weise können die basischen Benzilsäureester von den Benzilsäuren und Benzophenonen unterschieden werden. Die nach Esterspaltung entstehenden Aminoalkohole, die mit Dragendorff-Reagenz in einer blauvioletten Farbe detektierbar sind, wurden in keiner der Untersuchungen, vermutlich aufgrund eines schnellen Abbaus im Körper, nachgewiesen.

Die Fleckenfarbe nach Detektion mit konzentrierter Schwefelsäure gibt Auskunft über die Substitution an den aromatischen Ringen von Benzilsäurederivaten. Die Reaktionsmechanismen sind dabei nicht geklärt. Bei der Metabolisierung von 1 und 2 (3,4-Dimethoxystruktur) bedeutet eine braune Färbung in der Kälte und eine hellblaue in der Hitze einen unsubstituierten zweiten aromatischen Ring. Eine Methoxygruppenspaltung zeigt dabei keinen Einfluss auf die Färbung. Eine violette Färbung in der Kälte hingegen weist auf eine Hydroxylierung am vorher unsubstituierten Ring hin. Bei einer Zweifach-Substitution am ursprünglich unsubstituierten Phenylring tritt eine blaue Farbe auf. Alle Benzophenonderivate führen mit Schwefelsäure sowohl in der Kälte als auch in der Hitze zu einer gelben Färbung.

Anders reagieren dagegen die Metabolite von 3 und 4 (3,3‘-Dimethoxystruktur) mit Schwefelsäure. Eine grüne Färbung in der Kälte und eine graue in der Hitze sind typisch für Benzilsäurederivate mit einer 3,3‘-Dimethoxysubstitution, wobei eine Methoxygruppenspaltung konzentrationsabhängig zu einem orangen Kern innerhalb dieser Grünfärbung führt. Gleiche Reaktion zeigen Metabolite mit einer zusätzlichen phenolischen Hydroxylgruppe. Eine blaugrüne Färbung hingegen bedeutet eine Spaltung beider Methoxygruppen zum 3,3‘-Dihydroxybenzilsäureester. Ein blauer Fleck weist, ähnlich wie bei den Metaboliten von 1 und 2 beobachtet, auf eine Zweifach-Substitution an jedem der beiden Phenylringe hin. Benzophenonderivate reagieren mit Schwefelsäure in einer Gelbfärbung der Substanzbanden.

Da alle Metabolite mit konzentrierter Schwefelsäure und nachfolgendem Erhitzen auf der Heizplatte detektierbar sind, wurden die orientierenden Untersuchungen, vor allem hinsichtlich des Vorhandenseins von Metabolitensubstanz, mit Hilfe dieser Methode durchgeführt. Das Erhitzen führt bei den untersuchten Benzilsäurederivaten zu grauen oder bläulichen Banden, die aber wesentlich beständiger als die Färbungen direkt nach Ansprühen sind. Zur Orientierung wurden durch Verdünnungsreihen die Mengen an Substanz von 1 - 4 bestimmt, die bei dieser Detektion visuell bestimmbar sind (Tab. 2).

Detektion

Verbindung

1

2

3

4

UV (254 nm)

0,2

0,4

0,8

1,0

H₂SO₄

(in der Kälte)

3

1

0,2

0,2

H₂SO₄

(Heizplatte)

2

0,4

0,2

0,2

Tab. 2: Detektierbare Substanzmenge [μg] der Ausgangsverbindungen

N-Methyl-4-piperidinylderivate zeigen eine größere Empfindlichkeit bei der Detektion im UV als bei der Detektion mit Schwefelsäure. Bei den N-Methyl-3-piperidinylen verhält es sich entgegengesetzt.

Die Eignung von MBTH (Besthorn's-Reagenz) zum Nachweis von phenolischen Produkten und auch deren Substitutionstelle wurde von Fröhlich [8] für Benzophenone eingeführt und auf Benzilate ausgedehnt. Hiermit können im Gegensatz zu Emerson Reagenz auch p-substituierte Phenole nachgewiesen werden [27, 28]. Die phenolischen Metabolite von 1, 2, 3 und 4 reagieren bis auf zwei Ausnahmen mit einer roten Farbe. Es handelt sich dabei sowohl um in 3- als auch 4-Position hydroxylierte Aromaten, so dass eine Abhängigkeit der Färbung von der Substitutionstelle, ähnlich wie bei einfachen monohydroxylierten Benzophenonen und Benzilsäurederivaten [8], nicht bestätigt werden kann. Vermutlich beruhen die verschiedenen Färbungen bei einfacheren Phenolen auf unterschiedlichen Kupplungsmöglichkeiten, die hier wegen komplexerer Strukturen sterisch nicht möglich sind. Dies könnte auch die beiden Ausnahmen bei diesen Untersuchungen erklären, die mit einer blauen Farbe reagieren. Bei den Verbindungen ( 21 und 53) handelt es sich um Benzophenone, deren Aromaten im Verhältnis zu den gleichartig substituierten Benzilaten sterisch angreifbarer liegen und so zu weiteren Kupplungsmöglichkeiten führen können.

Insgesamt genügte der Einsatz von drei Fließmittelgemischen. Fließmittel I und II eignen sich besonders für die Trennung der basischen, Fließmittel II und III für die sauren Metabolitenfraktionen. Die Benzilsäuren zeigen stets kleinere R _F-Werte als die entsprechenden Piperidylbenzilate. Ester des N-Methyl-3-piperidinols weisen höhere R _F-Werte auf als ihre isomeren N-Methyl-4-piperidinylderivate.

Bei Vergleich der Metabolite mit Referenzsubstanzen wurden generell Misch-chromatogramme erstellt.

Alle mengenorientierten Rückschlüsse sind in Verbindung mit der HPLC getroffen worden und stellen grobe Schätzungen dar (vgl. 3.3.2).

HPLC - und UV-Untersuchungen

(vgl. 5.4.2.1)

Die HPLC wurde zur Charakterisierung der Metabolitenfraktionen und der isolierten Metabolite genutzt. Es wurde auf zwei von Smolinka entwickelte Methoden zur Trennung der Reaktionsprodukte bei der biomimetischen Umsetzung der Substanzen 1, 2 und 3 zurückgegriffen [ 4]. Bei den Metabolitenextrakten wird eine Basislinientrennung nicht erreicht. Da dies keine Rolle bei der Charakterisierung der isolierten Metaboliten spielt, ist auf eine Optimierung der Bedingungen verzichtet worden. So bleibt die direkte Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen der biomimetischen Umsetzungen erhalten.

Durch den Einsatz des DAD können Benzilsäure- und Benzophenonderivate anhand des UV-Spektrums unterschieden werden.

Die Aussagen zu den Mengenverhältnissen stellen aufgrund verschiedener Extinktionskoeffizienten nur grobe Schätzungen dar, die in Verbindung mit der DC durch Vergleich der Fleckengröße und -intensität abgeleitet werden. Sie sind nur als Näherungen anzusehen und spiegeln lediglich Tendenzen der Mengenverhältnisse wider.

Beim Vergleich der Metabolite mit Referenzsubstanzen wurden generell Misch-chromatogramme aufgenommen.

MS -Untersuchungen

Die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung stellte bei den Metabolismusstudien die MS dar. Dabei erfolgt die Strukturzuordnung anhand des typischen Fragmentierungsmusters der Benzilsäurederivate. Dieser Zerfall lässt Rückschlüsse auf das Substitutionsmuster der Ursprungsverbindung zu und wurde von Petersen et al. für aromatisch unsubstituierte Benzilate bewiesen [ 29]. Das allgemeine Fragmentierungsverhalten, übertragen auf das mögliche Substitutionsmuster der Metabolite der Verbindungen 1 - 4, ist in Schema 5 dargestellt. Durch α-Spaltung fragmentiert das Molekülradikalkation unter Austritt von Kohlendioxid und dem Rest R zu einem stabilen Benzophenonkation a. Dieses wird auch als Schlüsselfragment angesehen. Es zerfällt weiter in die Benzoylkationen b und d, welche durch Decarbonylierung in die entsprechenden Phenylkationen c und e übergehen. Handelt es sich bei diesen Phenylkationen um monomethoxylierte Derivate, so kann sich unter Abspaltung eines Methylradikals das Fragment f mit m/z 92 bilden (s. Schema 6) [30]. Dieses Bruchstück kann auch beim Zerfall monohydroxylierter Aromaten auftreten [30], spielt aber in den MS der Metabolite keine Rolle. Fragment f ist in der Lage, sich durch Austritt von Kohlenmonoxid zum Cyclopentadienylkation g zu stabilisieren. Letzteres scheint allerdings aufgrund sehr geringer Intensitäten in den MS der Metabolite von untergeordneter Bedeutung zu sein und wird bei der weiteren Auswertung nicht berücksichtigt.

Schema 5: Allgemeines Fragmentierungsmuster substituierter Benzilate
R – H, CH₃, verschiedene Piperidylreste (vgl. Schema 7)
R₁, R₂, R₃, R₄, R₅– H, OH, OCH₃

Schema 6: EI-MS-Fragmentierung von Monomethoxy- und -hydroxyphenylkationen

Die Piperidinole als alkoholische Komponenten der Estermetabolite unterliegen ebenfalls charakteristischen Fragmentierungsmustern [31]. Deuterierungsversuche haben gezeigt, dass durch Wanderung des Hydroxylwasserstoffes der Benzilsäure zur Bindungsstelle mit dem Piperidinring (hier C-4) und Aufspaltung der C-O-Einfachbindung neben Kohlendioxid und Benzophenon das Radikalkation h entsteht [ 32]. Alternativ bilden sich durch Bruch der Bindung am C-4 des Piperidinderivats neben dem Benzilsäureradikal Fragmentionen der Struktur i, die durch Abstraktion von Wasserstoff in die Dihydropyridylionen k übergehen können (vgl. Schema 7a) [ 29]. So entstehen beim Zerfall der N-Methyl-4-piperidinylderivate die Fragmentionen h, i und k in besonderem Maße, was sich an den Massen m/z 96, 98 und 99 mit hohen relativen Intensitäten ausdrückt.

Im Gegensatz dazu dominiert bei den 3-Piperidylbenzilaten das Ion l,das auch häufig den Basispeak bildet. Es wird angenommen, dass unter Wanderung eines H-Atoms der C-2-Position des Piperidinols zum Carbonylsauerstoff Benzilsäure abgespalten wird. Unter Ausbildung der Doppelbindung entsteht das Radikalkation l (Schema 7b) [ 29]. Entsprechend wird für ein N-Methyl-3-piperidylbenzilat der Fragmenttyp l mit m/z 97 in einer hohen relativen Intensität gebildet. Dies dient gleichzeitig der Unterscheidung zu N-Methyl-4-piperidylisomeren, bei denen Fragmentionen mit m/z 97 in sehr geringer relativer Intensität auftreten.

Eine N-Dealkylierung des basischen Restes kann an der Verringerung der Fragmentionenmassen um 14 ME entsprechend den Zerfallsschemata erkannt und zugeordnet werden.

Schema 7: Fragmentierung der Piperidylreste im EI-Massenspektrometer
(R₁ – H, CH₃; R₂, R₃ – Aryl)

Molekülionenpeaks basischer Benzilsäureester erscheinen oft mit einer geringen relativen Intensität, teilweise fehlen sie völlig. N-Methyl-3-piperidinyl benzilate weisen dabei größere Instabilität der Molekülionen auf als die N-Methyl-4-piperidinylisomere. Die Strukturaufklärung solcher Verbindungen erfolgte anhand der typischen Fragment-ionen. Im Gegensatz dazu bilden die Benzophenone stabile Molekülionenpeaks.

Isolierte Metabolite, die trotz Reinigung starke Verunreinigungen aufwiesen bzw. noch ein Metabolitengemisch darstellten, wurden einer GC-MS unterzogen.

Metabolisierung von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxy-benzilat (1)

Insgesamt konnten neben der Ausgangssubstanz 20 Metabolite isoliert und identifiziert werden. Diese wurden unter Einbeziehung von Vergleichssubstanzen analytisch untersucht. Mit Hilfe von DC- und HPLC-Mischchromatogrammen konnten folgende Verbindungen identifiziert werden:

die Ausgangsverbindung 1
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-hydroxy-3-methoxybenzilat (5)
(R,S)-4-Piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (8)
N-Oxid von (12)1 (12)
(R,S)-3,4-Dimethoxybenzilsäure (16)
3,4-Dimethoxybenzophenon (20)
4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21)

Die als Vergleichsubstanzen weiterhin herangezogenen Verbindungen (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dihydroxybenzilat, (R,S)-Methyl 3,4-dimethoxybenzilat (35), 2-(3,4-Di-methoxyphenyl)-2-phenylessigsäure, 3-Hydroxy-4-methoxybenzopenon, 3,4-Di-hydroxybenzophenon, 3,4-Dimethoxybenzoesäure, Vanillin- und Isovanillinsäure,
N-Methyl-4-piperidinol und 4-Piperidinol, die potentielle Metaboliten darstellen, konnten nicht nachgewiesen werden.

Analytische Charakterisierung der Metabolite

DC -Untersuchungen

(vgl. 3.3.1)

Eine von der Stellung der phenolischen Gruppe substitutionsabhängige Färbung mit MBTH (Detektionsmittel D) wird bei den Benzophenonen gefunden. So ist das
4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21) mit einer blaugrünen Fleckenfarbe gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu reagiert 3-Hydroxy-4-methoxybenzophenon dunkelrot. Diese Verbindung konnte jedoch nicht als Metabolit nachgewiesen werden.

Die Reaktion mit Emerson-Reagenz bleibt negativ, so dass das Substitutionsmuster bei phenolischen Metaboliten auf eine p-Hydroxygruppe hindeutet.

Tab. 3 zeigt die Retentionsfaktoren und die Detektion der isolierten Metabolite.

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
²⁾ RT = Raumtemperatur, H = Heizplatte (120 °C);
³⁾ n.d. - nicht detektiert
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

B ²⁾

C

D

1

0,46

0,85

RT-braun

H-hellblau

orange

10,7

278

5

0,44

0,75

RT-braun

H-hellblau

orange

dunkelrot

6,5

281

6

0,42

0,70

RT-violett

H-blau

orange

dunkelrot

5,0

278

7

0,26

0,57

RT-violett

H-hellgrau

orange

dunkelrot

3,4

281

8

0,41

0,66

RT-braun

H-hellblau

orange

10,0

278

9

0,22

0,56

RT-braun

H-hellblau

orange

dunkelrot

6,0

281

10

0,15

0,45

RT-violett

H-hellgrau

orange

dunkelrot

4,7

278

11

0,27

0,13

RT-violett

H-hellgrau

n.d.³⁾

n.d.³⁾

keine Zuordnung

12

beide Isomere

0,20/ 0,36

0,25/ 0,36

RT-braun

H-hellblau

orange

12,1/11,7

278

13

0,50

0,80

RT-braun

H-hellblau

orange

7,1

278

14

0,44

0,68

RT-blau

H-hellgrau

orange

dunkelrot

4,0

279

15

0,33

0,41

RT-blau

H-hellgrau

orange

dunkelrot

3,1

281

Tab. 3: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-di-methoxybenzilat (1) und Metaboliten

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
²⁾ RT = Raumtemperatur, H = Heizplatte (120 °C)
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

III

B ²⁾

D

16

0,22

0,20

0,32

RT-braun

H-hellblau

9,5

278

17

0,10

0,18

0,25

RT-braun

H-hellblau

dunkelrot

6,1

281

18

0,11

0,09

0,14

RT-violett

H-hellgrau

dunkelrot

5,5

278

19

0,04

0,06

0,07

RT-violett

H-hellgrau

dunkelrot

4,2

281

20

0,75

0,90

0,95

gelb

16,2

237, 282, 314

21

0,55

0,47

0,42

gelb

blau

14,4

240, 285, 315

22

0,42

0,61

0,68

gelb

dunkelrot

13,4

233, 282, 314

23

0,25

0,25

0,28

gelb

dunkelrot

13,1

235, 285, 317

24

0,31

0,30

0,29

gelb

dunkelrot

keine Zuordnung

Fortsetzung Tab. 3: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (1) und Metaboliten

HPLC - und UV-Untersuchungen

(vgl. 3.3.2)

In Abb. 10 a) ist das Chromatogramm dargestellt, das die aus Urin gewonnenen unkonjugierten Metabolite nach Reinigung über Extrelut^® zeigt. Hier erfolgte keine Trennung in eine saure und basische Fraktion. Im Gegensatz dazu ist in Abb. 10 b) das Chromatogramm der Fraktion der basischen unkonjugierten Metabolite dargestellt.

Abb. 10: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 1

a) Unkonjugierte Metabolite des Urinextraktes
b) Unkonjugierte Metabolite der basischen Urinextraktfraktion

Als Hauptmetabolit wird, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der DC, 6 bestimmt. Auch die N-Dealkylierung scheint ein Hauptabbauweg zu sein, so wird u. a. Verbindung 8 in relativ großem Maße gebildet. Die Benzilsäuren gehören nicht zu den Hauptmetaboliten, aber das starke Auftreten der Benzophenone (Verbindungen 20 – 23), als die weiteren Biotransformationsprodukte, deutet auf eine hohe Rate von Esterspaltungen bei der Metabolisierung hin.

Im UV-Spektrum führt eine Spaltung einer Methoxygruppierung zum Phenol zu einer bathochromen Verschiebung des UV-Maximums.

In Tab. 3 sind die Retentionszeiten und die UV-Absorptionsmaxima der Metabolite von 1 aufgeführt.

MS-Untersuchungen

(vgl. 3.3.3)

Tab. 4 zeigt die M ⁺ und Massenfragmente der isolierten Metabolite.

¹⁾vgl. 3.3.3
²⁾ geringe Menge
Metabolit

M⁺·

Fragmenttyp¹⁾

a

b

c

d

e

h

i

k

1

385 (1)

243 (27)

165 (4)

137 (1)

105 (100)

77 (23)

99 (42)

98 (21)

96 (13)

5

371 (2)

229 (35)

151 (8)

123 (5)

105 (100)

77 (28)

99 (54)

98 (39)

96 (30)

6

401 (1)

259 (34)

165 (9)

137 (3)

121 (100)

93 (13)

99 (39)

98 (38)

96 (75)

7

387 (3)

245 (47)

151 (8)

123 (4)

121 (100)

93 (11)

99 (40)

98 (51)

96 (61)

8

371 (1)

243 (23)

165 (10)

137 (2)

105 (100)

77 (24)

85 (20)

84 (13)

82 (8)

9

357 (<1)

229 (12)

151 (10)

123(5)

105 (83)

77 (30)

85 (23)

84 (15)

82 (18)

10

387 (<1)

259 (29)

165 (19)

137 (9)

121 (87)

93 (15)

85 (41)

84 (28)

82 (25)

11 ²⁾

kein M⁺·= 373

245 (7)

151(5)

123 (2)

121 (10)

93 (4)

85 (10)

84 (7)

82 (5)

12

(Isomer I)

kein M⁺= 401

M⁺-O = 385 (1)

243 (28)

165 (16)

137 (6)

105 (89)

77 (24)

99 (32)

98 (16)

96 (16)

12

(Isomer II)

kein M⁺ = 401

M⁺·-O = 385 (1)

243 (38)

165 (12)

137 (3)

105 (100)

77 (25)

99 (16)

98 (11)

96 (10)

Tab. 4: EI-MS-Fragmente von 1 und Metaboliten; in ( ) relativen Intensitäten

Fortsetzung Tab 4: EI-MS-Fragmente von 1 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität

¹⁾ vgl. 3.3.3
²⁾ vgl. 3.9.2
³⁾ geringe Menge
Metabolit

M⁺·

Fragmenttyp¹⁾

a

b

c

d

e

h

i

k

13

399 (2)

243 (37)

165 (18)

137 (11)

105 (80)

77 (25)

Fragment m ²⁾113 (20)

14 ³

431 (<<1)

289 (6)

165 (9)

137 (3)

151 (8)

123 (6)

99 (17)

98 (16)

96 (16)

15

417 (2)

275 (31)

151 (100)

123 (15)

99 (44)

98 (31)

96 (25)

16

288 (<<1)

243 (20)

165 (39)

137 (10)

105 (88)

77 (55)

17

kein M⁺ = 274

229 (4)

151 (11)

123 (3)

105 (100)

77 (71)

18

nicht rein isolierbar und sehr geringe Substanzmenge

19

245 (3)

245 (3)

151 (8)

123 (4)

121 (21)

93 (8)

20

165 (100)

137 (13)

105 (31)

77 (55)

21

151 (100)

123 (16)

105 (27)

77 (42)

22

165 (96)

137 (15)

121 (48)

93 (22)

23

151 (17)

123 (13)

121 (18)

93 (10)

24

nicht rein isolierbar und sehr geringe Substanzmenge

Bei den Benzilsäurederivaten stellen die Benzoylkationen d häufig die Basispeaks bzw. besitzen eine große relative Intensität in Abhängigkeit von der Metabolitenreinheit bzw. -konzentration. Bei den Benzophenonen dagegen scheint der Basispeak vom Benzoylkation b gebildet zu werden.

Das N-Oxid 12 zeigt keinen Molekülionenpeak. Allgemein erscheint stattdessen ein Peak mit einer Differenz von 16 ME aufgrund des Verlustes des Sauerstoffes [33]. Die weitere Fragmentierung entspricht der von 1.

Identifizierung der Metabolite

Das anhand der besprochenen analytischen Methoden identifizierte Metabolitenspektrum von 1 im Urin der Ratte ist in Schema 8 dargestellt.

Alle Ester wurden aus den basischen Metabolitenfraktionen isoliert.

Der Ausgangsstoff 1 ist in relativ großer Menge (vgl. Abb. 10) wiedergefunden worden.

Der Nachweis der p-Position der Hydroxygruppe bei 3,4-Hydroxy-Methoxy-Verbindungen gelingt indirekt durch das alleinige Vorhandensein von 4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21) als Metabolit. 3-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, das als Vergleichssubstanz ebenfalls vorliegt, konnte nicht nachgewiesen werden. Zur Unterscheidung der beiden Benzophenone ist die DC mit Fließmittel II und dem Detektionsmittel D (MBTH) durch unterschiedliche R _F-Werte und Anfärbbarkeit gut geeignet. Durch Nachweis der Übereinstimmung von 5 mit der Vergleichssubstanz (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-hydroxy-3-methoxybenzilat wird diese Annahme zusätzlich bestätigt. Die Reaktion der Hydroxy-Methoxy-Metabolite mit Emerson-Reagenz bleibt negativ, was auf die Substitution der p-Stellung zur phenolischen Funktion hinweist. Für alle folgenden Verbindungen wird deshalb trotz Fehlens eines Vergleiches oder eines NMR-Spektrums eine Substitution von 4-Hydroxy-3-methoxy- angenommen: 7, 9, 11,14, 15, 17, 19, 23 und 24.

Aufgrund der größten Peakfläche in der HPLC und der Fleckengröße und -intensität nach Ansprühen mit den verschiedenen Detektionsmitteln bei der DC wird Metabolit 6 als Hauptmetabolit angesehen. Durch die hohe Menge an isoliertem 6 erfolgte die Struktursicherung mit der NMR-Spektroskopie zusätzlich zur MS und insbesondere auch der Beweis der in p-Stellung abgelaufenen C-Oxigenierung am vorher

Schema 8: Metabolisierung von 1

unsubstituierten Phenylring (vgl. Abb. 11: und Abb. 12:)

Sowohl das ¹ H-NMR- als auch das ¹³ C-NMR-Spektrum von 6 und den zwei möglichen stellungsisomeren Phenolen (in o- oder m-Stellung) wurden im voraus berechnet. Diese ¹ H-NMR-Spektren unterscheiden sich jedoch kaum voneinander. Da schon bei den Betrachtungen zu 1 große Diskrepanzien zwischen dem berechneten und dem gemessenen Spektrum, insbesondere bei den Signalen der aromatischen Protonen, auftreten, wurde auf einen weiteren Vergleich verzichtet. Das berechnete ¹³ C-NMR-Spektrum dagegen zeigt gute Annäherungen an das gemessene Spektrum. In Tab. 5 sind die berechneten Werte des o- und m-Phenols im Vergleich zum berechneten und gemessenen Spektrums des in p-Stellung hydroxylierten Metaboliten 6 dargestellt.

gem. – gemessen;
ber. – berechnet;
¹ – Bezifferung vgl. Abb. 11:, Abb. 12;
² - (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 2‘-hydroxy-3,4-dimethoxybenzilat (Bezifferung C-10 ≅ C2‘-OH; C-12 ≅ C4‘);
³ - (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3‘-hydroxy-3,4-dimethoxybenzilat (Bezifferung C-10 ≅ C3‘-OH; C-11 ≅ C4‘)
C-Atom¹
6
o -Phenol²
m -Phenol³
C-Atom¹
6
o -Phenol²
m -Phenol³
gem.
ber.
ber.
ber.
gem.
ber.
ber.
ber.
1
134,4
130,4
125,2
130,9
12
128,9
123,5
128,7
109,5

2

110,8

110,8

111,3

110,8

13

80,4

79,6

76,7

79,6

3

148,7

151,2

151,2

151,2

14

174,3

173,4

173,2

173,4

4

148,3

148,5

148,5

148,5

15

75,0

74,2

74,2

74,2

5

110,3

114,3

114,3

114,3

16

30,1

29,3

29,3

29,3

6

119,9

117,9

118,4

117,9

17

52,1

52,7

52,7

52,7

7

133,7

134,1

123,8

135,6

18

45,8

46,1

46,1

46,1

8

128,9

123,5

127,8

112,7

19

52,1

52,7

52,7

52,7

9

115,0

116,0

120,6

129,4

20

30,1

29,3

29,3

29,3

10

156,3

157,3

153,3

158,9

21

55,9

56,0

56,0

56,0

11

115,0

116,0

118,0

115,6

22

55,9

56,0

56,0

56,0

Tab. 5: Vergleich des gemessenen ¹³ C-NMR-Spektrums von 6 mit den berechneten Spektren isomerer Phenole

Die geringsten Abweichungen vom gemessenen ¹³ C-NMR-Spektrum zeigt das berechnete Spektrums mit der p-Hydroxygruppe. Das entscheidende Indiz für die in p-Position stattgefundene C-Oxigenierung besteht in der Äquivalenz von C-8 und C-12 sowie C-9 und C-11 (vgl. auch Abb. 12).

Abb. 11: 1H-NMR-Spektrum von 6 Zum Vergleich – ¹H-NMR-Daten von 1:
C-16, C-20 - 1,66 und 1,81; C-18 – 2,11; C-17, C-19 – 2,15 und 2,25; C-22 - 3,74; C-21 – 3,81; C-15 – 4,91; C-5 – 6,75; C-2,C-6 – 6,89 und 6,93; C-8, C-9, C-10, C-11, C-12 – 7,20 bis 7,37

Abb. 12: 13C-NMR-Spektrum von 6 Zum Vergleich – ¹³C-NMR-Daten von 1:
C-16, C-20 – 30,4; C-18 – 46,1; C-17, C-19 – 52,1; C-21, C-22 – 55,8/55,9; C-15 – 84,5; C-13 – 80,7; C-5 – 110,2; C-2 – 110,7; C-6 – 119,9; C-9, C-11 – 127,4; C-8, C-12 – 127,9; C-10 – 128,0; C-7 – 134,4; C-1 – 142,2; C-4 - 148,5; C-3 - 148,7; C-14 – 174,0

Im ¹H-NMR-Spektrum ist im aromatischen Bereich neben einer unsymmetrischen Aufspaltung (3,4-dimethoxy-substituierter Phenylring) eine symmetrische Duplett-aufspaltung mit Dacheffekt zu beobachten (Abb. 11:), was durch die magnetische Äquivalenz von C-8 und C-12 sowie C-9 und C-11 erklärbar ist. Eine andere Substitution der phenolischen Gruppe würde zu unsymmetrischen Signalen führen.

Die zusätzliche phenolische Gruppe von 6 wirkt im Magnetfeld des ¹ H-NMR-Spektrometer abschirmend. Die Signale der aromatischen Protonen sind gegenüber 1 hochfeldverschoben. Im ¹³ C-NMR-Spektrometer führt der Einfluss der Hydroxygruppe wie erwartet zu einer Hochfeldverschiebung der Signale der o-Kohlenstoffatome [ 34], bei den m-atomen dagegen wenig ins Tieffeld. Aufgrund des Nachweises der in p-Stellung erfolgten C-Oxigenierung wird für die anderen hydroxylierten Metabolite dieses Substitutionsmuster ebenso angenommen.

Metabolit 7 kann mittels des MS mit M⁺ gut identifiziert werden. Durch seine beiden phenolischen Gruppen wird er in der HPLC relativ schnell eluiert.

Anhand der gegenüber N-methylierten Piperidinylbenzilaten um 14 ME verringerten Fragmente des Piperidinringes konnten die Metabolite 8, 9, 10 und 11 als N-De-methylierungsprodukte identifiziert werden. Mit Hilfe des Benzophenonkations als Schlüsselfragment und dessen Zerfallsprodukten erfolgte die Strukturzuordnung an den Phenylringen. Bei 8, 9 und 10 können ebenfalls die Molekülionen zur Identifizierung herangezogen werden. 11 tritt in so geringer Konzenration auf, dass dieser Metabolit nicht mit der HPLC sondern nur über DC mit Sprühreagenz B detektiert werden konnte.

Der Sauerstoff im N-Oxid kann in zwei struktrurisomeren Formen axial oder äquatorial angeordnet vorliegen, wobei angenommen wird, dass der sperrige Benzilsäurerest bevorzugt die äquatoriale Stellung einnimmt (12 kann in zwei struktrurisomeren Formen axial oder äquatorial angeordnet vorliegen, wobei angenommen wird, dass der sperrige Benzilsäurerest bevorzugt die äquatoriale Stellung einnimmt (Abb. 13) [ 35]. Die trans-Isomere sind zumeist polarer als die cis-Isomere [36].

Abb. 13: Isomere Formen des N-Oxids; R – Benzilsäurerest

Beide N-Oxid-Isomere können mit DC und HPLC unter Verwendung von Vergleichssubstanzen nachgewiesen werden, wobei das cis-Isomer etwa mit dreifacher Konzentration im Metabolitengemisch vorliegt.

Das MS von weist einen Molekülpeak mit m/z 399 auf. Das Benzophenonkation 13 weist einen Molekülpeak mit m/z 399 auf. Das Benzophenonkation a besitzt die Fragmentmasse m/z 243. Dies deutet auf eine zusätzliche Sauerstofffunktion am Piperidinring hin. Als mögliche Biotransformationsprodukte kommen dafür nur die N-Formylverbindung oder das Lactam von 1 in Frage (Abb. 14).

Abb. 14: Mögliche Strukturen von 13 Mit Hilfe von Vergleichssubstanzen erfolgte die Identifizierung des Metaboliten als Lactam (s. 3.9).

In geringer Menge treten die Metaboliten 14 und 15 auf. Bei der Detektion mit konzentrierter Schwefelsäure als Sprühreagenz der DC zeigen die Metabolitenbanden eine typische blaue Färbung, die schnell verblasst.

In der sauren Fraktion der Metabolite sind vier Benzilsäuren (16, 17, 18, 19) nachgewiesen worden. Es weist jedoch nur das 16 einen Molekülpeak auf. Die anderen Säuren können anhand der weiteren Fragmente identifiziert werden. 17 tritt als Abbauprodukt bei Stabilitätsuntersuchungen auf und konnte unter Zuhilfenahme von in der Literatur beschriebenen analytischen Vergleichsdaten strukturaufgeklärt werden [37]. Der Nachweis von 18 gestaltete sich aufgrund ungenügender Reinheit des Metaboliten als problematisch. Nach vorsichtiger basischer Hydrolyse des Esters 6 wurde diese Benzilsäure gebildet und diente als Referenz für DC und HPLC. Eine vierfach substituierte Benzilsäure (analog 14 und 15) ist nicht nachgewiesen worden.

Ebenfalls in den sauren Metabolitenfraktionen sind die fünf Benzophenone 20, 21, 22, 23 und 24 identifiziert worden. Die Substanzbanden reagieren in der DC mit konzentrierter Schwefelsäure (Detektionsmittel B) in einer Gelbfärbung. Typisch bei den untersuchten Benzophenonen ist das stabile Auftreten des Molekülions, dass für Benzilsäurederivate sonst nicht zu erwarten ist. Metabolit 24 konnte aufgrund sehr geringer Konzentration nicht sofort identifiziert werden. Er wird jedoch bei der Metabolisierung von 2 gebildet und diente als Referenz für DC und HPLC.

Phase-II-Metabolite

Nur ein geringer Teil der Metabolite wird in Form von Konjugaten ausgeschieden. Sie wurden nach Spaltung mit β-Glucuronidase/Arylsulfatase durch Vergleich mit den identifizierten authentischen Metaboliten über DC und HPLC bestimmt. Es konnten keine zusätzlichen Verbindungen detektiert werden.

Folgende Verbindungen wurden nachgewiesen:

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-hydroxy-3-methoxybenzilat (5)
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4‘-hydroxy-3,4-dimethoxybenzilat (6)
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4,4‘-dihydroxy-3-methoxybenzilat (7)
(R,S)-4-Piperidyl 4,4‘-dihydroxy-3-methoxybenzilat (11)
(R,S)-4‘-Hydroxy-3,4-dimethoxybenzilsäure (18)
(R,S)-4,4‘-Dihydroxy-3-methoxybenzilsäure (19)
4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21)
4‘-Hydroxy-3,4-dimethoxybenzophenon (22)
4,4‘-Dihydroxy-3-methoxybenzophenon (23)

Es konnten nur phenolische Derivate bestimmt werden.

Kotmetabolite

Die Kotmetabolite wurden durch DC- und HPLC-Vergleich mit den identifizierten authentischen Harnmetaboliten ermittelt. Zusätzliche, noch nicht identifizierte, Metabolite wurden nicht nachgewiesen. Durch Vergleich der Flächen der Peaks in den HPLC-Chromatogrammen kann eingeschätzt werden, dass ca. ein Viertel der Menge an basischen Estern über den Kot ausgeschieden wird. In der sauren Metabolitenfraktion konnte nur eine geringe Menge an Benzophenonen gefunden werden. Benzilsäuren treten nicht auf.

Folgende Verbindungen wurden identifiziert:

die Ausgangsverbindung 1
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-hydroxy-3-methoxybenzilat (5)
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4‘-hydroxy-3,4-dimethoxybenzilat (6)

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4,4‘-dihydroxy-3-methoxybenzilat (7)
(R,S)-4-Piperidyl 4,4‘-dihydroxy-3-methoxybenzilat (11)
3,4-Dimethoxybenzophenon (20)
4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21)
4‘-Hydroxy-3,4-dimethoxybenzophenon (22)
4,4‘-Dihydroxy-3-methoxybenzophenon (23)

Metabolisierung von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxy-benzilat (2)

Insgesamt konnten neben der Ausgangssubstanz 19 Metabolite und vermutlich 3 Artefakte, entstanden durch die Aufarbeitung, isoliert und identifiziert werden. Diese wurden unter Einbeziehung von Vergleichssubstanzen analytisch untersucht. Mit Hilfe von DC- und HPLC-Mischchromatogrammen konnten folgende Verbindungen identifiziert werden:

die Ausgangsverbindung 2
(R,S)-3-Piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (28)
(R,S)-3,4-Dimethoxybenzilsäure (16)
3,4-Dimethoxybenzophenon (20)
4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21)
(R,S)-Methyl 3,4-dimethoxybenzilat (35) (als Artefakt)

Die als Vergleichsubstanzen weiterhin herangezogenen Verbindungen (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat N-oxid,2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-phenylessig-säure, 3-Hydroxy-4-methoxybenzopenon, 3,4-Dihydroxybenzophenon, 3,4-Dimethoxy-benzoesäure, Vanillin- und Isovanillinsäure, N-Methyl-3-piperidinol und 3-Piperidinol, die potentielle Metaboliten darstellen, konnten nicht nachgewiesen werden.

Analytische Charakterisierung der Metabolite DC -Untersuchungen

(vgl. 3.3.1)

Die Reaktion mit Emerson Reagenz fiel bei allen Metaboliten negativ aus. Dies deutet auf p-hydroxylierte Phenolmetabolite hin.

Tab. 6 zeigt die Retentionsfaktoren und die Detektion der isolierten Metabolite.

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
²⁾ RT = Raumtemperatur, H = Heizplatte (120 °C);
³⁾n.d. - nicht detektiert
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

B ²⁾

C

D

2

0,76

0,92

RT-braun

H-hellblau

orange

12,2

278

25

0,63

0,86

RT-braun

H-hellblau

orange

dunkelrot

8,3

281

26

0,46

0,80

RT-violett

H-blau

orange

dunkelrot

5,9

278

27

0,36

0,65

RT-violett

H-hellgrau

orange

dunkelrot

4,8

281

28

0,56

0,62

RT-braun

H-hellblau

orange

11,6

278

29

0,25

0,25

RT-braun

H-hellgrau

n.d.³⁾

dunkelrot

keine Zuordnung

30

0,34

0,59

RT-violett

H-hellgrau

orange

dunkelrot

5,4

278

31

0,35

0,48

RT-violett

H-hellgrau

n.d.³⁾

dunkelrot

4,4

281

32

0,58

0,78

RT-braun

H-hellblau

orange

10,3

278

33

0,50

0,77

RT-blau

H-hellgrau

n.d.³⁾

dunkelrot

6,7

281

34

0,49

0,70

RT-blau

H-hellgrau

orange

dunkelrot

6,2

277

Tab. 6: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-di-methoxybenzilat (2) und Metaboliten

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
²⁾ RT = Raumtemperatur, H = Heizplatte (120 °C)
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

III

B ²⁾

D

16

0,22

0,20

0,32

RT-braun

H-hellblau

9,5

278

17

0,10

0,18

0,25

RT-braun

H-hellblau

dunkelrot

6,1

281

18

0,11

0,09

0,14

RT-violett

H-hellgrau

dunkelrot

5,5

278

19

0,04

0,06

0,07

RT-violett

H-hellgrau

dunkelrot

4,2

281

20

0,75

0,90

0,95

gelb

16,2

237, 282, 314

21

0,55

0,47

0,42

gelb

blaugrün

14,4

240, 285, 315

22

0,42

0,61

0,68

gelb

dunkelrot

13,4

233, 282, 314

23

0,25

0,25

0,28

gelb

dunkelrot

13,1

235, 285, 317

24

0,31

0,30

0,29

gelb

dunkelrot

12,7

235, 286, 316

35

0,86

0,92

RT-braun

H-hellblau

14,4

278

36

0,51

0,91

RT-braun

H-hellblau

dunkelrot

12,1

281

37

0,48

0,84

RT-violett

H-hellgrau

dunkelrot

7,8

278

Fortsetzung Tab. 6: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (2) und Metaboliten

HPLC - und UV-Untersuchungen

(vgl. 3.3.2)

In Abb. 15 a) ist das Chromatogramm dargestellt, das die aus Urin gewonnenen Metabolite der sauren unkonjugierten Fraktion nach Reinigung über Extrelut^®zeigt. Abb. 15 b) stellt dagegen die Metabolite der basischen unkonjugierten Urinfraktion dar.

Abb. 15: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 2

a) Unkonjugierte Metabolite der sauren Urinextraktfraktion
b) Unkonjugierte Metabolite der basischen Urinextraktfraktion

In Übereinstimmung mit der Einschätzung der Fleckenintensität bei der DC können die hydroxylierten Metabolite und 18 und als Hauptmetabolite angesehen werden. 26 als Hauptmetabolite angesehen werden. 18 selbst ist dabei das Hydrolyseprodukt von 26. Die Esterspaltung und damit die Bildung der verschieden substituierten Benzilsäuren stellt neben der aromatischen C-Oxigenierung den Hauptabbauweg dar. Auch die N-Dealkylierung, die u. a. zur Bildung von 30 führt, spielt eine bedeutende Rolle.

Die UV-Spektren der Metabolite mit Spaltung einer Methoxygruppierung zum Phenol zeigen bathochrome Verschiebungen der UV-Maxima.

In Tab. 6 sind die Retentionszeiten und die UV-Absorptionsmaxima der Metabolite von aufgeführt.2 aufgeführt.

MS -Untersuchungen

(vgl. 3.3.3)

Tab. 7 zeigt die M ⁺ und Massenfragmente der isolierten Metabolite.

Die Basispeaks bzw. Fragmente mit der größten relativen Intensität, in Abhängigkeit von der Metabolitenreinheit und -konzentration, werden bei den Benzilaten von den Benzoylkationen d bzw. bei den Benzophenonen auch von b gebildet. Bei den basischen Estern kann ebenfalls das Radikalkationenfragment l den Basispeak stellen.

¹⁾vgl. 3.3.3;
²⁾ geringe Menge;
³⁾ vgl. 3.9.2

Tab. 7: EI-MS-Fragmente von 2 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität

¹⁾vgl. 3.3.3;
²⁾ geringe Menge

Fortsetzung Tab. 7: EI-MS-Fragmente von 2 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität

Identifizierung der Metabolite

Das anhand der besprochenen analytischen Methoden identifizierte Metaboliten-spektrum von 2 im Urin der Ratte ist in Schema 9 dargestellt.

Schema 9: Metabolisierung von 2

Die Ausgangssubstanz ist eindeutig über die beschriebenen analytischen Methoden nachgewiesen worden.2 ist eindeutig über die beschriebenen analytischen Methoden nachgewiesen worden.

Bei den Metaboliten 17, 19, 24, 25, 27, 29, 31 und 33 wird an den substituierten aromatischen Ringen die 4-Hydroxy-3-Methoxy-Substitution und nicht die isomere 3-Hydroxy-4-Methoxy-Form angenommen. Dafür spricht das alleinige Vorhandensein von 4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21) als Metabolit, während das isomere 3-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, das als Vergleichssubstanz ebenfalls vorlag, nicht nachgewiesen werden konnte. Die Reaktion der Hydroxy-Methoxy-Verbindungen mit Emerson-Reagenz bleibt negativ, was ebenfalls auf die Substitution der p-Stellung zur phenolischen Funktion hinweist. 25 wurde als Abbauprodukt bei Stabilitätsuntersuchungen festgestellt. Die dabei erhaltenen analytischen Daten stimmen mit den hier ermittelten überein [ 37].

Aufgrund der in Kapitel 3.4.2 dargelegten Beweisführung wird eine in p-Position erfolgte Hydroxylierung am vorher unsubstituerten Phenylring bei den entsprechenden Metaboliten angenommen. Eine Bestätigung durch NMR war hier aufgrund unzureichender Substanzmengen nicht möglich.

Bei den Metaboliten 28, 29, 30 und 31 handelt es sich um N-demethylierte Produkte, wie aus den um 14 ME reduzierten Piperidinylfragmenten in der MS hervorgeht. Die Strukturzuordnung erfolgte mit Hilfe der Fragmentionen und z. T. anhand der Molekülionen.

32 fällt aufgrund seines Molekülpeaks von m/z 399 und des Benzophenonkations mit m/z 243 im MS auf. Dies deutet, wie schon bei 13, auf eine zusätzliche Sauerstofffunktion am Piperidinylrest, entweder als N-Formyl-Derivat oder als Lactam, hin. Mittels synthetisierter Vergleichssubstanz konnte der Metabolit als Lactam identifiziert werden (s. 3.9).

Mit 33 und 34 treten mehrfach am zuvor unsubsituierten Phenylring strukturveränderte Metabolite auf. Mit Hilfe der Molekülionen und Fragmentionen erfolgte die Strukturzuordnung an den aromatischen Ringen. Die genaue Substitution der Hydroxylgruppe bei 34kann nur aufgrund der negativen Reaktion mit Emerson- Reagenz bei der DC postuliert werden. Dies deutet auf eine Substitution in p-Stellung zur phenolischen Gruppe hin. Typisch ist die blaue Reaktion mit konzentrierter Schwefelsäure bei der DC-Detektion.

In der sauren Fraktion der Metabolite konnten die Benzilsäuren 16, , 17 , 18 und 19 nachgewiesen werden. Ähnlich, wie schon bei der Metabolisierung von 1, gibt nur 16 einen Molekülionenpeak, obwohl 18 als ein Hauptmetabolit anzusehen ist (vgl. 3.5.1.2). Dies ist auf eine wesentlich geringere Stabilität im EI-MS zurückzuführen. Die Benzilsäuren konnten anhand der Fragmentionen und mit Hilfe der authentischen Vergleichssubstanzen, die bei der Metabolisierung von 1 isoliert wurden, identifiziert werden.

In der sauren Metabolitenfraktion treten die Benzophenone 20, 21, 22, 23 und 24 auf. Bis auf 23 zeigen alle ein stabiles Molekülion im MS und können zusätzlich durch DC-Vergleich mit den authentischen Benzophenonmetaboliten von 1 identifiziert werden.

Weiterhin treten neben den genannten Metaboliten auch die Methylester einiger Benzilsäuren auf (35, 36, 37). Sie stellen vermutlich Artefakte dar, entstanden während der Aufarbeitung durch Umesterung in Gegenwart von Methanol, da sie nur in der Fraktion der Basen auftreten, eigentlich aber als Biotransformationsprodukte in der ersten eluierten Fraktion der sauren und neutralen Metabolite hätten erscheinen müssen. Theoretisch können sie im Körper aus Benzilsäuren mit Hilfe von Methyltransferasen gebildet werden.

Phase-II-Metabolite

Nur eine sehr geringe Metabolitenmenge konnte als Phase-II-Metabolite nach Konjugatspaltung bestimmt werden. Die Strukturzuordnung erfolgte über die DC durch Vergleich mit den im Harn identifizierten authentischen Metaboliten. Zusätzliche, noch nicht identifizierte, Metabolite konnten im Extrakt nicht nachgewiesen werden. Die HPLC konnte keine eindeutigen Aussagen liefern. Es wurden weder Benzilsäure- noch Benzophenonderivate sondern nur 2 Konjugate von phenolischen N-dealkylierten basischen Estern gefunden.

Folgende Verbindungen sind nachgewiesen worden:

(R,S)-3-Piperidyl 4‘-hydroxy-3,4-dimethoxybenzilat (30)
(R,S)-3-Piperidyl 4,4‘-dihydroxy-3-methoxybenzilat (31)

Kotmetabolite

Die Kotmetabolite wurden durch DC- und HPLC-Vergleich mit den identifizierten Harnmetaboliten ermittelt. Zusätzliche, noch nicht identifizierte, Metabolite konnten nicht nachgewiesen werden. Durch Vergleich der Peakflächen in den HPLC-Chromatogrammen und der Fleckenintensität in der DC kann eingeschätzt werden, dass ca. ein Drittel der Menge an basischen Estern über den Kot ausgeschieden wird. Die Verbindungen 30 und bilden die Kothauptmetaboliten. In der sauren Metabolitenfraktion treten keine Benzilsäuren und nur eine geringe Menge an Benzophenonen auf. Die Ausgangsverbindung 26 bilden die Kothauptmetaboliten. In der sauren Metabolitenfraktion treten keine Benzilsäuren und nur eine geringe Menge an Benzophenonen auf. Die Ausgangsverbindung 2 selbst wurde nicht gefunden.

Folgende Verbindungen wurden nachgewiesen:

(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 4-hydroxy-3-dimethoxybenzilat (25)
(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 4‘-hydroxy-3,4-dimethoxybenzilat (26)
(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 4,4‘-dihydroxy-3-methoxybenzilat (27)
(R,S)-3-Piperidyl 4‘-hydroxy-3,4-dimethoxybenzilat (30)
(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 4‘-hydroxy-3, 3‘,4 –trimethoxybenzilat (33)
3,4-Dimethoxybenzophenon (20)
4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (21)
4‘-Hydroxy-3,4-dimethoxybenzophenon (22)

Metabolisierung von N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxy
benzilat ( 3)

Insgesamt konnten neben der Ausgangssubstanz 19 Metabolite isoliert und identifiziert werden. Diese wurden unter Einbeziehung von Vergleichssubstanzen analytisch untersucht. Mit Hilfe von DC- und HPLC-Mischchromatogrammen konnten folgende Verbindungen identifiziert werden:

die Ausgangsverbindung 3
4-Piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (42)
3,3‘-Dimethoxybenzilsäure (46)
3,3‘-Dimethoxybenzophenon (51)

Die als Vergleichsubstanzen weiterhin herangezogenen Verbindungen N-Methyl-
4-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat N-oxid,Methyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (68),
3-Methoxybenzoesäure, N-Methyl-4-piperidinol und 4-Piperidinol, die potentielle Metaboliten darstellen, konnten nicht nachgewiesen werden.

Analytische Chrakterisierung der Metabolite

DC -Untersuchungen

(vgl. 3.3.1)

Bei der Detektion mit Detektionsmittel D (MBTH) reagieren die phenolischen Metabolite mit roter Farbe. Eine Ausnahme stellt das Benzophenon dar, das mit einer blauen Färbung reagiert.53 dar, das mit einer blauen Färbung reagiert.

Tab. 8 zeigt die Retentionsfaktoren und die Detektion der isolierten Metabolite.

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
²⁾ RT = Raumtemperatur, H = Heizplatte (120 °C);
³⁾grün- mit orangem Kern;
⁴⁾ n.d. - nicht detektiert
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

III

B ²⁾

C

D

3

0,54

0,89

0,88

RT-grün

H-grau

orange

13,6

276/282

38

0,43

0,69

0,79

RT-grün

H-grau

orange

dunkelrot

10,7

277/283

39

0,40

0,64

0,78

RT-grün³⁾

H-grau

orange

dunkelrot

10,2

277/283

40

0,31

0,45

0,54

RT-grün³⁾

H-grau

orange

dunkelrot

7,7

281

41

0,26

0,47

0,58

RT-blaugrün

H-blaugrau

orange

dunkelrot

8,1

277/283

42

0,21

0,26

0,38

RT-grün

H-grau

orange

8,6

276/282

43

0,05

0,28

0,26

RT-grün³⁾

H-grau

orange

dunkelrot

6,7

277/283

44

0,04

0,04

0,02

RT-grün

H-grau

n.d.⁴⁾

dunkelrot

3,7

277/283

45

0,58

0,78

0,81

RT-grün

H-grau

orange

8,5

276/282

15

0,33

0,41

0,49

RT-blau

H-hellgrau

orange

dunkelrot

7,2

281

Tab. 8: DC, HPLC und UV-Maxima von N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dimethoxy-benzilat (3) und Metaboliten

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
²⁾ RT = Raumtemperatur, H = Heizplatte (120 °C)
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

III

B ²⁾

D

46

0,23

0,28

0,36

RT-grün

H-grau

3,4

276/282

47

0,15

0,23

0,22

RT-grün

H-grau

dunkelrot

2,7

277/283

48

0,08

0,18

0,16

RT-grün

H-grau

dunkelrot

2,0

277/283

49

0,02

0,10

0,08

RT-grün

H-grau

dunkelrot

1,8

281

50

0,12

0,18

0,22

RT-grün

H-grau

dunkelrot

1,5

277/283

51

0,91

0,94

0,90

gelb

11,3

221, 258, 311

52

0,56

0,88

0,86

gelb

dunkelrot

9,3

221, 258, 313

53

0,59

0,40

0,42

gelb

blau

8,6

237, 287, 317

54

0,40

0,39

0,39

gelb

dunkelrot

6,6

237, 287, 317

55

0,38

0,23

0,32

gelb

dunkelrot

7,1

219, 261, 313

HPLC - und UV-Untersuchungen

(vgl. 3.3.2)

Abb. 16 a) zeigt das Chromatogramm der Metabolite der sauren unkonjugierten Urin-fraktion, Abb. 16 b) das der basischen unkonjugierten Urinfraktion und Abb. 16 c) das der basischen Metabolitenfraktion im Kot jeweils nach Reinigung über Extrelut^®.

Abb. 16: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 3

a) Unkonjugierte Metabolite der sauren Urinextraktfraktion
b) Unkonjugierte Metabolite der basischen Urinextraktfraktion
c) Unkonjugierte Metabolite der basischen Kotextraktfraktion

In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus der DC stellt die Esterspaltung den dominanten Metabolisierungsweg dar. Verbindung bildet, als das Hydrolyseprodukt von 46 bildet, als das Hydrolyseprodukt von , den Hauptmetaboliten. Die anderen Benzilsäuren treten im Vergleich dazu in weitaus geringerer Menge auf. Es lässt sich abschätzen, dass ca. ein Drittel der Menge an Estern über Urin und zwei Drittel über den Kot ausgeschieden werden. In der Faeces treten dabei besonders die O-dealkylierte Verbindung 2, den Hauptmetaboliten. Die anderen Benzilsäuren treten im Vergleich dazu in weitaus geringerer Menge auf. Es lässt sich abschätzen, dass ca. ein Drittel der Menge an Estern über Urin und zwei Drittel über den Kot ausgeschieden werden. In der Faeces treten dabei besonders die O-dealkylierte Verbindung und das C-oxigenierte Produkt 38 und das C-oxigenierte Produkt in Erscheinung. Die Ausgangsverbindung 39 in Erscheinung. Die Ausgangsverbindung 3 kann über die HPLC nicht mehr detektiert werden, wird aber in der DC mit konzentrierter Schwefelsäure (DetektionsmittelB) noch schwach nachgewiesen.

Die UV-Spektren der Benzilatmetabolite zeigen in der Regel ein zweigeteiltes Maximum. Eine Ausnahme bilden Metabolite mit zwei phenolischen Gruppen im Molekül, die einheitliche Maxima aufweisen. Es fallen geringe bathochrome Verschiebungen nach Spaltung der Etherfunktionen bzw. bei zusätzlicher phenolischer Hydroxylgruppe auf.

In Tab. 8 sind die Retentionszeiten und die UV-Absorptionsmaxima der Metabolite von 3 aufgeführt.

MS -Untersuchungen

(vgl. 3.3.3)

Tab. 9 zeigt die M ⁺ und Massenfragmente der isolierten Metabolite.

Die Basispeaks bzw. Peaks mit den größten relativen Intensitäten, in Abhängigkeit von der Metabolitenreinheit und -konzentration, werden von den Benzoylkationen b und d gebildet. Bei den basischen Estern weisen außerdem die Piperidinylfragmente h, i und k hohe relative Intensitäten auf.

Die Molekülionen der basischen Benzilatmetabolite von 3 zeigen im Vergleich mit den entsprechenden Metaboliten von 1, 2 und 4 die höchste Stabilität, was sich in den größten relativen Intensitäten dieser Ionen ausdrückt.

¹⁾vgl. 3.3.3;
²⁾ geringe Menge;
³⁾ vgl. 3.9.2

Tab. 9: EI-MS-Fragmente von 3 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität

¹⁾vgl. 3.3.3;
²⁾ geringe Menge

Fortsetzung Tab. 9: EI-MS-Fragmente von 3 und Metaboliten; in ( ) relativer Intensität

Identifizierung der Metabolite

Das anhand der besprochenen analytischen Methoden identifizierte Metabolitenspektrum von 3 im Urin der Ratte ist in Schema 10 dargestellt.

Bei den Metaboliten mit zusätzlicher aromatischer Hydroxylgruppe wird die -Position angenommen, da sie allgemein die bei Biotransformationen bevorzugte C-Oxi-genierungsstellung darstellt und die p-Position angenommen, da sie allgemein die bei Biotransformationen bevorzugte C-Oxi-genierungsstellung darstellt und die o- und m-Positionen abgeschirmt bzw. wenig reaktionsfähig sind. Die Annahme wird weiterhin durch die negative Reaktion dieser Verbindungen mit Emerson-Reagenz bestätigt.

Der Ausgangsstoff 3 wird nur in relativ geringer Konzentration wiedergefunden. Im HPLC-Chromatogramm ist er nicht identifizierbar, jedoch in der DC mittels Vergleichssubstanz nachweisbar. Trotzdem gelang es, eine für die Aufnahme eines MS ausreichende Menge rein zu isolieren.

Die Identifizierung der Metabolite 42, 43 und 44 als N-demethylierte Benzilsäureester erfolgte anhand des MS durch die Molekülionen und die um 14 ME verringerten Piperidinylfragmente. Die aromatische Substitution wurde aufgrund der Benzilatfragmente zugewiesen.

Verbindung 15 tritt ebenfalls bei der Metabolisierung von 1 auf. Die Identität beider Metabolite konnte durch Mischchromatogramme sowohl in der DC, mit gleichartiger Detektion, als auch in der HPLC bestätigt werden.

Metabolit 45 tritt mit dem Molekülion m/z 399 in Erscheinung. Die Fragmentierung deutet auf eine zusätzliche Sauerstofffunktion am Piperidinylrest entweder in Form eines Lactams oder des N-Formylderivats von 3 hin. Mit Hilfe von synthetisierter Vergleichssubstanz konnte diese Verbindung als Lactam identifiziert werden (s. 3.9).

In der sauren Metabolitenfraktion können die Benzilsäuren 46, 47, 48 und 49 mit Hilfe von Vergleichsubstanz und des MS bestimmt werden. Nur bei Verbindung 46 tritt im EI-MS ein Molekülpeak auf. Metabolit 50 konnte zunächst nicht in ausreichender Menge und Reinheit isoliert werden, um eindeutige Aussagen mit Hilfe des MS treffen zu können. Er wurde allerdings bei der Biotransformation von 4 identifiziert. Anhand dieser Referenz erfolgte der Nachweis von 50 im nachhinein.

Die Identifizierung der Benzophenone 51, 52, 53, 54 und 55, die ebenfalls in der sauren Metabolitenfraktion auftreten, erfolgte mit Hilfe der MS. Die Fragmentierungsmuster weisen deutliche Molekülpeaks auf.

Schema 10: Metabolisierung von 3

Phase-II-Metabolite

Nur eine sehr geringe Metabolitenmenge konnte als Phase-II-Metabolite nach Konjugatspaltung bestimmt werden. Mittels HPLC waren keine eindeutigen Aussagen möglich, so dass die Strukturen dieser Metabolite durch DC-Vergleich mit den vorher identifizierten authentischen Harnmetaboliten aufgeklärt wurden. Zusätzliche, noch nicht identifizierte, Metabolite wurden im Extrakt nicht nachgewiesen. Es konnten keine Benzophenonderivate gefunden werden.

Folgende Verbindungen wurden nachgewiesen:

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (39)
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3‘,4-dihydroxy-3-methoxybenzilat (40)
(R,S)-3-Hydroxy-3‘-methoxybenzilsäure (47)
(R,S)-4-Hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilsäure (48)

Es konnten nur phenolische Derivate bestimmt werden.

Kotmetabolite

Die Kotmetabolite wurden durch DC- und HPLC-Vergleich mit den identifizierten Harnmetaboliten ermittelt. Zusätzliche, noch nicht identifizierte, Metabolite wurden nicht nachgewiesen. Wie schon in Abb. 16 c) ersichtlich wird eine relativ große Menge an basischen Estern über den Kot ausgeschieden (ca. ²/₃ der Gesamtmenge dieser Verbindungen – siehe Kapitel 3.6.1.2), wobei 38 und 39 die Hauptmetaboliten darstellen. Die Ausgangssubstanz 3 konnte nicht nachgewiesen werden. In der sauren Metabolitenfraktion ist nur eine geringe Menge an Benzophenonen gefunden werden. Benzilsäuren treten nicht auf.

Folgende Verbindungen wurden nachgewiesen:

(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-hydroxy-3‘-methoxybenzilat (38)
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (39)
(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3‘,4-dihydroxy-3-methoxybenzilat (40)
N-Methyl-4-piperidyl 3,3‘-dihydroxybenzilat (41)
(R,S)-4-Piperidyl 3-hydroxy-3‘-methoxybenzilat (43)
(R,S)-4-Piperidyl 4-hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (44)
N-Methyl-4-piperidyl 4,4‘-dihydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (15)

3,3‘-Dimethoxybenzophenon (51)
3-Hydroxy-3‘-methoxybenzophenon (52)
4-Hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzophenon (53)
3,3‘-Dihydroxybenzophenon (55)

Metabolisierung von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxy-benzilat (4)

Insgesamt konnten 22 Metabolite und vermutlich 3 Artefakte, entstanden durch die Aufarbeitung, neben der Ausgangssubstanz 4 isoliert und identifiziert werden. Diese wurden unter Einbeziehung von Vergleichssubstanzen analytisch untersucht. Mit Hilfe von DC- und HPLC-Mischchromatogrammen konnten folgende Verbindungen identifiziert werden:

die Ausgangsverbindung 4
(R,S)-3-Piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (60)
3,3‘-Dimethoxybenzilsäure (46)
3,3‘-Dimethoxybenzophenon (51)
Methyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (68) (als Artefakt)

Die als Vergleichsubstanzen weiterhin herangezogenen Verbindungen N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat N-oxid,3-Methoxybenzoesäure, N-Methyl-3-piperidinol und 3-Piperidinol, die potentielle Metaboliten darstellen, konnten nicht nachgewiesen werden.

Analytische Chrakterisierung der Metabolite DC -Untersuchungen

(vgl. 3.3.1)

Tab. 10 zeigt die Retentionsfaktoren und die Detektion der isolierten Metabolite.

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

III

B ²⁾

C

D

4

0,74

0,89

0,89

RT-grün

H-grau

orange

11,5

276/282

56

0,47

0,62

0,70

RT-grün

H-grau

orange

dunkelrot

7,8

277/283

57

0,42

0,60

0,80

RT-grün

H-grau

orange

dunkelrot

10,9

277/283

58

0,38

0,58

0,72

RT-grün

H-grau

orange

dunkelrot

5,6

281

59

0,34

0,56

0,73

RT-blaugrün

H-blaugrau

orange

dunkelrot

7,1

277/283

60

0,55

0,82

0,88

RT-grün

H-grau

orange

9,4

276/282

61

0,43

0,52

0,67

RT-grün

H-grau

orange

dunkelrot

6,0

277/283

62

n.d.³⁾

n.d.³⁾

5,2

277/283

63

n.d.³⁾

n.d.³⁾

keine Zuordnung

64

0,36

0,44

0,63

RT-blaugrün

H-blaugrau

orange

dunkelrot

5,1

277/283

65

0,40

0,59

0,74

RT-blau

H-hellgrau

orange

dunkelrot

7,3

281

66

0,23

0,44

0,50

RT-blau

H-hellgrau

n.d.³⁾

n.d.³⁾

keine Zuordnung

67

0,44

0,55

0,67

RT-grün

H-grau

orange

dunkelrot

6,8

277/281

Tab. 10: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimeth-oxybenzilat (4) und Metaboliten

¹⁾ vgl. 5.4.1.1;
²⁾ RT = Raumtemperatur, H = Heizplatte (120 °C);
³⁾grün - mit orangem Kern;
⁴⁾ n. nachg. - nicht isoliert nachgewiesen (analytische Daten aus Metabolisierung von 3)
Metabolit

DC

HPLC

R _T [min]

UV-Maxima [nm]

R _F-Wert

Fließmittel¹⁾

Detektion¹⁾

I

II

III

B ²⁾

D

46

0,23

0,28

0,36

RT-grün

H-grau

3,4

276/282

47

0,15

0,23

0,22

RT-grün³⁾

H-grau

dunkelrot

2,7

277/283

48

0,08

0,18

0,16

RT-grün

H-grau

dunkelrot

2,0

277/283

49

(n. nachg.⁴⁾)

0,02

0,10

0,08

RT-grün

H-grau

dunkelrot

1,8

281

50

0,12

0,18

0,22

RT-blaugrün

H-blaugrau

dunkelrot

1,5

277/283

51

0,91

0,94

0,90

gelb

11,2

221, 258, 311

52

0,56

0,88

0,86

gelb

dunkelrot

9,2

221, 258, 313

53

0,59

0,40

0,42

gelb

blau

8,4

237, 287, 317

54

0,40

0,39

0,39

gelb

dunkelrot

6,4

237, 287, 317

55

0,38

0,23

0,32

gelb

dunkelrot

6,9

219, 261, 313

68

0,80

0,91

0,92

RT-grün

H-grau

9,9

276/282

69

0,52

0,82

0,84

RT-grün

H-grau

dunkelrot

8,0

277/283

Fortsetzung Tab. 10: DC, HPLC und UV-Maxima von (R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (4) und Metaboliten

HPLC - und UV-Untersuchungen

(vgl. 3.3.2)

Abb. 17 a) zeigt das Chromatogramm der Metabolite der sauren unkonjugierten Urinfraktion, Abb. 17 b) das der basischen unkonjugierten Urinfraktion jeweils nach Reinigung über Extrelut^®.

Abb. 17: HPLC-Chromatogramme verschiedener Metabolitenextrakte von 4

a) Unkonjugierte Metabolite der sauren Urinextraktfraktion
b) Unkonjugierte Metabolite der basischen Urinextraktfraktion

In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der DC stellen die Benzilsäure 46, als Hydrolyseprodukt von 4, und die O-dealkylierte Säure 47 die Hauptmetaboliten dar. Im Gegensatz dazu kommt den Estermetaboliten, bezogen auf die Gesamtmetabolitenmenge, nur eine untergeordnete Rolle zu. Dabei bilden die durch einfache Etherspaltung entstandenen phenolischen Ester 56, 61 und auch das Lactam 67 die Hauptmetaboliten. Aus ihnen kann durch Umesterung das Artefakt 69 entstehen. Im Kot stellen das N-dealkylierte Produkt 60 und das hydroxylierte Derivat 57 die Hauptmetaboliten dar. Insgesamt wird ca. ein Drittel der basischen Ester über die Faeces ausgeschieden.

Eine Etherspaltung und eine zusätzliche phenolische Gruppe führen in den UV-Spektren zu geringen bathochromen Verschiebungen der UV-Maxima. Diese weisen häufig eine Zweiteilung auf. Nur Metabolite mit zwei phenolischen Gruppen zeigen ein einheitliches Maximum.

In Tab. 10 sind die Retentionszeiten und die UV-Absorptionsmaxima der Metabolite von 4 aufgeführt.

MS -Untersuchungen

(vgl. 3.3.3)

Tab. 11 zeigt M ⁺ und Massenfragmente der isolierten Metabolite.

Die Basispeaks bzw. Peaks mit den größten relativen Intensitäten, in Abhängigkeit von der Metabolitenreinheit und -konzentration, werden von den Benzoylkationen b und d gebildet. Bei den basischen Benzilsäureestern kann auch das Radikalkationenfragment l den Basispeak stellen.

¹⁾ vgl. 3.3.3;
²⁾ geringe Menge;
³⁾ vgl. 3.9.2

Tab. 11: EI-MS-Fragmente der Metabolite von 4; in relativer ( ) Intensität

¹⁾vgl. 3.3.3

Fortsetzung Tab. 11: EI-MS-Fragmente der Metabolite von 4; in relativer ( ) Intensität

Identifizierung der Metabolite

Das anhand der besprochenen analytischen Methoden identifizierte Metabolitenspektrum von 4 im Urin der Ratte ist in Schema 11 dargestellt.

Bei den Metaboliten mit zusätzlicher aromatischer Hydroxylgruppe wird die p-Position angenommen, da sie allgemein die bei Biotransformationen bevorzugte C-Oxi-genierungsstellung darstellt und die o- und m-Positionen abgeschirmt bzw. wenig reaktionsfähig sind. Die Annahme wird weiterhin durch die negative Reaktion dieser Verbindungen mit Emerson-Reagenz bestätigt.

Die Ausgangssubstanz 4 selbst konnte nur im Kot nachgewiesen werden und wurde mit Hilfe eines Vergleiches über DC und HPLC bestimmt.

Die Identifizierung der Ester erfolgte anhand der Fragmentionen in der MS. Die N-demethylierten Verbindungen wurden durch die um 14 ME verminderten Piperidylfragmente nachgewiesen. Die Molekülpeaks sind nur wenig stabil und fehlen bei den nicht so konzentrierten Metaboliten z. T. völlig.

67 weist mit seinen Fragmentionen auf eine 3-Hydroxy-3‘-methoxy-Substitution hin. Der Molekülpeak besitzt eine Masse m/z 385. Dies deutet auf eine zusätzliche Sauerstofffunktion am Piperidinylrest entweder in Form eines Lactams oder einer N-Formylverbindung hin. Aufgrund der in den Metabolisierungsuntersuchungen von 1, 2 und 3 nachgewiesenen Lactambildung wird diese hier ebenfalls angenommen. Das Lactam vom Ausgangsstoff selbst konnte nicht nachgewiesen werden.

In der sauren Metabolitenfraktion konnten die 4 Benzilsäuren 46, 47, 48 und 50 anhand der MS bestimmt werden. Im EI-MS treten nur bei 46 und 47 Molekülpeaks auf. Die Identifizierung von 49 gelang aufgrund der Isolierung dieser Benzilsäure bei der Metabolisierung von 3. Mit Hilfe der Referenz erfolgte ein Vergleich über DC mit dem sauren Urinextrakt, da 49 aus diesem nicht rein und in ausreichender Konzentration isoliert werden konnte.

Ebenfalls in der sauren Fraktion konnten 5 Benzophenone identifiziert werden. Alle weisen im Massenspektrum deutliche Molekülpeaks auf.

Sowohl für die Benzilsäuren , 46, 47, 48, 49 und 50 als auch für die Benzophenone 51, 52, 53, 54 und 55 konnte anschließend die Übereinstimmung mit den bei der Metabolisierung von 3 gebildeten authentischen Verbindungen über Mischchromatogramme der DC gezeigt werden.

Schema 11: Metabolisierung von 4

Zusätzlich zu den genannten Metaboliten treten die Methylester zweier Benzilsäuren auf (68 , 69) (Abb. 18).

Abb. 18: Artefakte bei der Metabolisierung von 4

Sie stellen vermutlich Artefakte dar, die während der Aufarbeitung durch Umesterung in Gegenwart von Methanol entstehen. Als Biotransformationsprodukte hätten sie in der ersten eluierten Fraktion der sauren und neutralen Metabolite erscheinen müssen und dürften nicht in der Fraktion der Basen auftreten. Theoretisch können sie im Körper aus Benzilsäuren mit Hilfe von Methyltransferasen gebildet werden.

Phase-II-Metabolite

Nur eine geringe Metabolitenmenge konnte als Phase-II-Metabolite nach Konjugat-spaltung bestimmt werden. Sie wurden über DC und HPLC mit identifizierten authentischen Harnmetaboliten als Vergleich nachgewiesen. Zusätzliche, noch nicht identifizierte, Metabolite konnten im Extrakt nicht bestimmt werden.

Es konnten nur phenolische Konjugate identifiziert werden.

Folgende Verbindungen wurden nachgewiesen:

(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 4-hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (57)
(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3‘,4-dihydroxy-3-methoxybenzilat (58)
(R,S)-3-Piperidyl 4-hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (62)
(R,S)-4-Hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilsäure (48)
3,3‘-Dihydroxybenzilsäure (50)
3-Hydroxy-3‘-methoxybenzophenon (52)

Kotmetabolite

Die Kotmetabolite wurden über DC und HPLC durch Vergleich mit den identifizierten authentischen Harnmetaboliten ermittelt. Zusätzliche, noch nicht identifizierte, Metabolite wurden nicht nachgewiesen. Anhand der Ergebnisse der HPLC und DC wird eingeschätzt, dass ca. ein Drittel der Menge an basischen Estern über den Kot ausgeschieden wird. Die Verbindungen 60 und 57 stellen die Kothauptmetaboliten dar. In der sauren Metabolitenfraktion konnte nur eine geringe Menge an Benzophenonen gefunden werden, Benzilsäuren treten nicht auf.

Folgende Verbindungen wurden nachgewiesen:

die Ausgangsverbindung 4
(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 3-hydroxy-3‘-methoxybenzilat (56)
(R,S)-N-Methyl-3-piperidyl 4-hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (57)
(R,S)-3-Piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat (60)
(R,S)-3-Piperidyl 3-hydroxy-3‘-methoxybenzilat (61)
(R,S)-3-Piperidyl 4-hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzilat (62)
3,3‘-Dimethoxybenzophenon (51)
3-Hydroxy-3‘-methoxybenzophenon (52)
4-Hydroxy-3,3‘-dimethoxybenzophenon (53)
3,3‘-Dihydroxybenzophenon (55)

Einfluss der Dosierung

Bei den Untersuchungen zur Biotransformation der Benzilate 1, 2, 3 und 4 konnte keine Abhängigkeit des Metabolitenspektrums aufgrund unterschiedlicher Dosierungen (50, 100 und 200 mg/kg Ratte) festgestellt werden. Die Produkte treten in den Extrakten bei den dosisabhängigen Untersuchungen in gleichen Verhältnissen nur unterschiedlich konzentriert auf. Damit ist eine Beeinflussung der Metabolisierung aufgrund von zu hoher Substanzbelastung in der Studie auszuschließen.

Synthese und analytische Charakterisierung der Lactame

Synthese der Lactame

Bei den Biotransformationsuntersuchungen von 1, 2, 3 und 4 treten als typische Metabolite Verbindungen mit einer zusätzlichen Sauerstofffunktion am Piperidinring auf. Die MS dieser Produkte liefern keine eindeutigen Strukturbeweise hinsichtlich einer Unterscheidung von möglichen N-Formylverbindungen oder Lactamen. Es war notwendig, die Lactame auf synthetischem Wege darzustellen, um den direkten Vergleich mit den Metaboliten zu ermöglichen.

Die Lactame der Verbíndungen 1 – 4 sind bisher nicht beschrieben worden. Beim Literaturstudium trifft man auf verschiedene Ansätze zur möglichen Synthese. Vielversprechend erscheint dabei deren Darstellung durch Dehydrierung der tertiären Amine mittels Quecksilber-II-EDTA [ 38, 39, 40, 41, 42]. Auf diese Weise erfolgte durch Möhrle u. a. die Synthese des Lactams vom N-Methyl-3-piperidinyl benzilat [43]. Mit Hilfe der Kernresonanzspektren und Synthese von Vergleichssubstanz konnte dem gebildeten Lactam die Struktur des 6-Piperidons und nicht, wie zuerst angenommen, die des 2-Piperidons zugewiesen werden [ 44, 45]. Voraussetzung für die Reaktion ist eine Hydroxyfunktion in geeigneter Entfernung und sterischer Stellung von der Dehydrierungsstelle. Diese alkoholische Gruppe wirkt durch Bildung eines cyclischen intramolekularen Zwischenzustandes über den Sauerstoff mit dem Primärprodukt der Oxidation, einer elektrophilen Iminiumstruktur, stabilisierend [46, 47]. Mit dieser Methode erfolgte die Synthese der Lactame der N-Methyl-3-piperidyl-ester und 2 und 4 problemlos.

Die Darstellung der Lactame der N-Methyl-4-piperidinylester ist auf dem Weg der Dehydrierung durch Quecksilber-II-EDTA nicht möglich. Aufgrund einer anderen Stereochemie und einer damit ungünstigen Stellung der Hydroxylgruppe gelingt es wahrscheinlich nicht, ein über eine Sauerstoffbrücke stabiles Intermediärprodukt zu bilden. Auch die in der Literatur beschriebenen Variationen der Synthesebedingungen durch pH-Veränderungen oder Verwendung anderer Dehydrierungsmittel blieben erfolglos [47, 48, 49, 50]. Die Lactamisierung ausgehend vom Alkohol selbst, dem N-Methyl-4-piperidinol, gelang ebenfalls nicht.

Es war nötig, weitere Darstellungswege von Lactamen zu untersuchen. In einer der Biomimetik ähnlichen Umsetzung wird die Lactamisierung mittels Iodosobenzen beschrieben [ 51]. Bei der Reaktion mit 1 entsteht jedoch ein Produktgemisch, von dem keine der Verbindungen eine Lactamstruktur aufweist.

Unter Verwendung verschiedener Oxidationsmittel erfolgte die Lactamisierung einiger Alkaloide [ 52, 53, , 55]. Bei der Umsetzung von 1 und 3 mit KMnO₄ entstehen neben den entsprechenden Benzilsäuren und Benzophenonen auch in geringer Ausbeute die Lactame. Diese Reaktion ist stark temperaturabhängig und wird unter Eiskühlung bzw. bei 5 – 10 °C durchgeführt. Bei zu hoher Temperatur wird nur das Benzophenon gebildet, während eine weitere Abkühlung die Reaktion zum Stillstand bringt. Der Einsatz anderer Oxidationsmittel brachte keinen Erfolg. Bei Verwendung von K₃[Fe(CN)₆] entstehen nur die Hydrolyseprodukte und die Benzophenone.

Bei den hier synthetisierten Lactamen handelt es sich um gelbe Öle, die nicht zur Kristallisation neigen. Die Strukturen wurden mit Hilfe von spektroskopischen Methoden aufgeklärt (vgl. 3.9.2, 5.2.2).

Analytik der Lactame - im Vergleich zu den N-Formylderivaten

Bei den Biotransformationsuntersuchungen wurden Metabolite isoliert, deren MS auf eine Lactam- oder N-Formylstrukur hinwies. Nach Synthese der Lactame (vgl. 3.9.1) wurden diese Verbindungen mit Hilfe verschiedener analytischer Methoden, u. a. auch im Vergleich mit den N-Formylderivaten, die durch biomimetische Umsetzung der Ausgangsverbindungen 1, 2 und 3 gewonnen wurden [ 4], charakterisiert. Auf diese Weise konnten die Metabolite eindeutig als Lactame identifiziert werden.

DC lassen sich die Verbindungen gut unterscheiden. Tab. 12 zeigt die Laufhöhen von 1, 2, 3 und 4 im Vergleich zu den Lactam- bzw. N-Formylderivaten in unterschiedlichen Fließmitteln geordnet nach ansteigenden R_F-Werten.

Fließmittel I¹⁾

Fließmittel II¹⁾

4-Pip²⁾

3-Pip³⁾

4-Pip²⁾

3-Pip³⁾

R_F -Wert

(ansteigend)

N-Formyl

Lactam

1/ 3

N-Formyl

2/4

Lactame

N-Formyl

1/3

Lactam

N-Formyl

2/4

Lactame

Tab. 12: Laufhöhen verschiedener 4-Piperidyl- und 3-Piperidylderivate von 1, 2, 3 und 4 in Abhängigkeit des Fließmittels

Die N-Formylprodukte werden mit den Fließmitteln I und II am weitesten transportiert. Bei den 3-Piperidylderivaten folgen daraufhin die Ausgangsester und anschließend die Lactame mit den kleinsten R_F-Werten. Die Reihenfolge der 4-Piperidylderivate ist dagegen abhängig von der Basizität der Laufmittel. Im schwächer basischen Fließmittel I wird das Lactam weniger retardiert als der basische Ausgangsester, während sich diese Reihenfolge im stark basischen Fließmittel II umkehrt. Allgemein scheinen die 4-Piperidylester einen polareren Charakter als die entsprechende 3-Piperidylderivate zu besitzen, was sich an kleineren R_F-Werten dieser Isomere äußert. Die R_F-Werte der 3 verschiedenen Klassen (basischer Ester, Lactam, N-Formylverbindung) liegen bei allen untersuchten Verbindungen jedoch nicht weit entfernt.

Anhand der MS lassen sich die Lactame und N-Formylderivate nicht voneinander unterscheiden. Die Fragmentierung der Benzilsäurestruktur entspricht der unter 3.3.3. beschriebenen. Die Molekülionenpeaks erscheinen mit relativen Intensitäten um 1 %. Sowohl bei den Lactamen als auch den N-Formylderivaten von 1, 2, 3 und 4 (hier keine N-Formylverbindung) treten Fragmentionen des Piperidylrestes mit m/z 113 in hoher relativer Intensität auf (vgl. Abb. 19).

Abb. 19: Fragmention m und Fragmention n bei der Fragmentierung der Lactame bzw. N-Formylderivate von 1, 2, 3 und 4 im EI-MS

Die typischen Fragmentionen der Piperidinringe i, k und l treten nicht auf (vgl. 3.3.3).

Bei den Lactamen kommt es unter weiterem Zerfall von m zur Bildung der Fragmentkationen o mit m/z 55, p mit m/z 44 und q mit m/z 42. Die Bildung dieser Ionen war bei den Metabolismusstudien jedoch nicht zur Unterscheidung zu den N-Formylpiperidinylverbindungen geeignet, da einerseits die biologischen Verun-reinigungen in den isolierten Metabolitenfraktionen stören und andererseits die N-Formylverbindungen ebenfalls Fragmentionen mit diesen Massezahlen bilden. Zur Vollständigkeit soll die Entstehung der Fragmenionen dennoch kurz erläutert werden (Schema 12) [ 56, 57].

Schema 12: Weitere Fragmentierung des Lactamringes

a) Bildung des Fragments o
b) Bildung des Fragments p
c) Bildung des Fragments q

Die Bildung des Fragmentes o wird durch eine Ringspaltung gefolgt von einer Wanderung des Wasserstoffes von Position 3 eingeleitet. Durch Homolyse der Bindung zwischen Position 4 und 5 bildet sich dann das resonanzstabilisierte Ion (Schema 12 a).

Eine alternative Spaltung des Lactamringes, gefolgt von Wasserstofftransfer zum Stickstoff, führt zu Fragment p und einem resonanzstabilisierten Keten-Radikal (Schema 12 b).

Durch Wasserstofftransfer mit nachfolgender Abspaltung eines Ethylradikals und eines Ketens entsteht das Fragment q (Schema 12 c).

Bei GC-MS-Messungen fällt auf, dass sowohl die Lactame als auch die N-Formyl-verbindungen schwerer verdampfbar sind als ihre basischen N-Methyl-piperidinylester. Bei diesen Untersuchungen lassen sich die Lactame aufgrund kleinerer R_T-Werte gegenüber den N-Formylverbindungen unterscheiden (vgl. 5.2.2).

Die Strukturunterscheidung zwischen Lactamen und N-Formylbenzilaten ist eindeutig durch Kernresonanzspektroskopie möglich. So tritt im ¹ H-NMR-Spektrum das Signal der N-Formylgruppierung bei 7,9 ppm auf, während bei den Piperidinonen kein solches in diesem Bereich erscheint (vgl. 5.2.2; vgl. Abb. 20). Eine weitere Unterscheidungs-möglichkeit bietet sich aufgrund des Spektrums des Piperidinylrestes. Die N-Methyl-Gruppe aller Lactame gibt ein starkes Signal ~ 2,75 ppm und erscheint im Gegensatz zum entsprechenden Signal bei den Ausgangsestern 1, 2, 3 und 4 (~ 2,1 ppm) durch die Sauerstofffunktion entschirmt und tieffeldverschoben. Die N-Formylverbindungen können dieses Spektrum aufgrund des Fehlens der Methylgruppe nicht geben. Weitere Unterschiede im ¹ H-NMR-Spektrum der Lactame, N-Formyl-piperidinylbenzilate und Ausgangsester ergeben sich aus den Signalen der Protonen der Heterocyclen. Allgemein auffällig ist die Entschirmung und somit Tieffeldverschiebung der Protonensignale des Piperidinylrestes und der Hydroxylgruppe der Lactame gegenüber den Ausgangsverbindungen. Abb. 20 stellt beispielhaft das ¹ H-NMR-Spektrum des Lactams 32 (Lactam von 2) dar.

Die weitere Strukturzuordnung erfolgte mit Hilfe der ¹³ C-NMR-Spektroskopie. Die Unterscheidung ist anhand der Oxo-Signale der funktionellen Gruppen (N-Formyl- bzw. Lactam-) möglich. Obwohl diese Signale bei ähnlichen Verschiebungen auftreten (vgl. 5.2.2), ist die Differenzierung aufgrund der ¹³ C-NMR-APT-Aufnahmetechnik möglich. Mit dieser Methode können Aussagen über eine gerade oder ungerade Anzahl von Protonen am Kohlenstoff getroffen werden. In Abb. 21 ist das ¹³ C-NMR-APT-Spektrum des Lactams 32 (Lactam von 2) dargestellt. Bei der N-Formylverbindung weist das Signal der Oxogruppe des Aldehyds aufgrund eines Wasserstoffatoms nach oben. Beim Lactam dagegen ist das C=O-Signal des Amids (C-20) nach unten gerichtet, da kein Wasserstoff direkt gebunden ist. Zur weiteren Unterscheidung dient ebenfalls die N-Methyl-Gruppe, die als deutlicher Peak (C-19) im Lactamspektrum sichtbar ist.

Bei den Verbindungen 2 und 4 besteht theoretisch die Möglichkeit der Bildung eines isomeren Lactams - des N-Methyl-2-oxo-3-piperidyl benzilats - und nicht des N-Methyl-6-oxo-3-piperidyl benzilats. Dies konnte durch NMR-Untersuchungen widerlegt werden (vgl. 3.9.1, [45]). Zur Unterstützung wurden die ¹ H-NMR- und ¹³ C-NMR-Spektren dieser Isomere berechnet. Im ¹ H-NMR ist als Unterscheidungs-kriterium das Signal vom C-15 geeignet. Dieses liegt im berechneten Spektrum des N-Methyl-2-oxo-3-piperidyl benzilats bei 5,75 ppm und des N-Methyl-6-oxo-
3-piperidyl benzilats bei 5,16 ppm. Der gemessene Wert von 5,24 ppm weist damit auf das letzte Lactam. In Tab. 13 sind die berechneten und gemessenen Verschiebungen der möglichen Isomere im ¹³ C-NMR-Spektrum dargestellt.

gem. - gemessen; ber. - berechnet;
¹⁾ - Bezifferung vgl. Abb. 20, Abb. 21
²⁾ - (R,S)-N-Methyl-6-oxo-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat
³⁾ - (R,S)-N-Methyl-2-oxo-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (C-18 und C-20 in Bezifferung vertauscht)
C-Atom¹⁾

32
(gem.)

I²⁾
(ber.)

II³⁾
(ber.)

C-Atom¹⁾

32
(gem.)

I²⁾
(ber.)

II³⁾
(ber.)

1

133,7

130,1

130,8

12

128,0

126,0

125,3

2

110,4

111,1

110,5

13

80,8

79,6

84,0

3

148,7

151,2

151,2

14

173,7

172,0

173,7

4

148,5

148,5

148,5

15

68,3

71,4

77,2

5

110,2

114,3

114,3

16

27,0

27,8

29,0

6

119,7

118,2

117,6

17

25,1

26,9

20,7

7

141,5

140,4

141,2

18

52,6

52,2

49,6

8

128,0

126,0

125,3

19

34,3

34,7

34,3

9

126,9

128,7

128,7

20

168,7

168,8

167,5

10

128,0

128,3

128,3

21

55,7

56,0

56,0

11

126,9

128,7

128,7

22

55,7

56,0

56,0

Tab. 13: Vergleich des gemessenen ¹³ C-NMR-Spektrums von mit den berechneten Spektren der möglichen isomeren Lactame32 mit den berechneten Spektren der möglichen isomeren Lactame

Anhand der Näherung zum gemessenen ¹³ C-NMR-Spektrum im besonderen bei den Atomen C-13, C-15 und C-17 und aufgrund der Ergebnisse der ¹ H-NMR wird die Verbindung als (R,S)-N-Methyl-6-oxo-3-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat identifiziert. Das synthetisierte Lactam von 4 wurde auf diese Weise als N-Methyl-6-oxo-3-piperidyl 3,3‘-dimethoxybenzilat identifiziert, tritt jedoch nicht bei den Metabolisierungsuntersuchungen in Erscheinung. Bei den Estern 1 und 3 ist das Vorkommen von strukturisomeren Lactamen nicht möglich.

Mit Hilfe dieser strukturgesicherten Vergleichssubstanzen erfolgte die Strukturzuordnung der Metabolite 13, 32 und 45.

Abb. 20: ¹ H-NMR-Spektrum von 32

Abb. 21: ¹³ C-NMR-APT-Spektrum von 32